Gif extraheren uit de sluipwesp Trichogramma dendrolimi met behulp van een kunstmatige gastheer

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het extraheren van gif uit Trichogramma dendrolimi met behulp van een kunstmatige gastheer gemaakt met polyethyleenfilm en aminozuuroplossing.

Samenvatting

Sluipwespen zijn een diverse groep vliesvleugelige insecten die van onschatbare waarde zijn voor de biologische bestrijding van plagen. Om succesvol parasitisme te garanderen, injecteren sluipwespen gif in hun gastheren om de immuniteit van hun gastheren te onderdrukken, de ontwikkeling, het metabolisme en zelfs het gedrag van gastheren te moduleren. Met meer dan 600.000 geschatte soorten overtreft de diversiteit van sluipwespen die van andere giftige dieren, zoals slangen, kegelslakken en spinnen. Sluipwespengif is een onderbelichte bron van bioactieve moleculen met potentiële toepassingen in ongediertebestrijding en geneeskunde. Het verzamelen van sluipwespif is echter een uitdaging vanwege het onvermogen om directe of elektrische stimulatie te gebruiken en de moeilijkheid bij dissectie vanwege hun kleine formaat. Trichogramma is een geslacht van kleine (~0,5 mm) ei-sluipwespen die veel worden gebruikt voor de biologische bestrijding van lepidoptera-plagen in zowel de landbouw als de bossen. Hier rapporteren we een methode voor het extraheren van gif uit T. dendrolimi met behulp van kunstmatige gastheren. Deze kunstmatige gastheren worden gemaakt met polyethyleenfilm en aminozuuroplossingen en vervolgens geënt met Trichogramma-wespen voor parasitisme. Het gif werd vervolgens verzameld en geconcentreerd. Deze methode maakt de extractie van grote hoeveelheden Trichogramma-gif mogelijk, terwijl besmetting van andere weefsels veroorzaakt door dissectie wordt vermeden, een veelvoorkomend probleem in dissectieprotocollen voor gifreservoirs. Deze innovatieve aanpak vergemakkelijkt de studie van Trichogramma-gif en maakt de weg vrij voor nieuw onderzoek en mogelijke toepassingen.

Inleiding

Sluipwespen zijn parasitaire vliesvleugelige insecten die belangrijke bronnen zijn voor biologische bestrijding¹. Er is een grote verscheidenheid aan sluipwespen, met naar schatting meer dan 600.000 soorten². De diversiteit van sluipwespen is veel groter dan die van andere giftige geleedpotigen, zoals slangen, kegelslakken, spinnen, schorpioenen en bijen. Gif is een belangrijke parasitaire factor bij sluipwespen. Voor succesvol parasitisme wordt gif in de gastheer geïnjecteerd, waardoor het gedrag, de immuniteit, de ontwikkeling en het metabolisme van de gastheer worden gemoduleerd^. Bovendien vertoont het gif van sluipwespen een opmerkelijke diversiteit in zijn moleculaire structuren, doelen en functies, wat een weerspiegeling is van complexe co-evolutie met hun gastheren. Parasitair gif is dus een waardevolle en ondergewaardeerde hulpbron van actieve moleculen voor insectendodende of medische doeleinden⁴. In tegenstelling tot het gif van slangen, kegelslakken, spinnen, schorpioenen en bijen, kan sluipwespengif niet worden verzameld door directe stimulatie of elektrische stimulatie⁵. De huidige methode om sluipwespengif te extraheren is het ontleden van het gifreservoir. Sluipwespen zijn echter vaak klein en de dissectie van sluipwespen vereist hoge technische vaardigheden. Daarom, als we een manier kunnen vinden om het gif van sluipwespen efficiënt en gemakkelijk te verzamelen, zal het een grote hulp zijn om het gif van sluipwespen te onderzoeken.

Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) is een geslacht van sluipwespen uit de familie sluipwespen (~0,5 mm). Deze wespen behoren tot de meest gebruikte biologische bestrijdingsmiddelen, met name gericht op eieren van verschillende lepidoptera-plagen in zowel de landbouw als de bossen. T. dendrolimi, een van de meest gebruikte Trichogramma-soorten in China, is bijvoorbeeld op grote schaal toegepast om een verscheidenheid aan land- en bosbouwplagen te bestrijden, zoals Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis en Chilo suppressalis. Eerdere studies toonden aan dat Trichogramma-wespen hun eieren in kunstmatige gastheren konden injecteren⁷. Kunstmatige gastheren kunnen worden gemaakt met materialen zoals was⁸, agar⁹, Parafilm¹⁰ en plastic film¹¹. De oplossing in kunstmatige gastheren die voldoende ovipositie voor Trichogramma induceert, kan eenvoudig zijn, zoals aminozuren of anorganische zouten¹². Op basis van de eigenschap dat T. dendrolimi kunstmatige gastheren kan parasiteren, biedt deze studie een nieuwe methode om gif uit sluipwespen te extraheren met behulp van kunstmatige gastheren. Deze aanpak is gericht op het aanpakken van de tekortkomingen van lage opbrengst, lage zuiverheid en gevoeligheid voor verontreiniging in de huidige extractietechnieken. Door deze methode te gebruiken, kan een grote hoeveelheid zeer zuiver gif uit T. dendrolimi worden geëxtraheerd, wat voldoet aan de behoeften van wetenschappelijk onderzoek en screening van bioactieve moleculen voor insectendodende of medische doeleinden.

Protocol

1. Insectenkweek

1. Voer Corcyra cephalonica op maïsmeel bij een temperatuur van 26 ± 1°C en een relatieve luchtvochtigheid van 40% ± 10%.
2. Kweek de T. dendrolimi-stam uit de Jilin-insect binnenshuis met de eieren van Corcyra cephalonica als gastheer. Voer wespenvolwassenen 10% sucrosewater in Drosophila-buizen bij een temperatuur van 26 ± 1 °C, relatieve vochtigheid van 70% ± 10%, licht (L): donker (D) periode van 14 uur: 10 uur.

2. Bereiding van eierkaarten van polyethyleen plastic folie

1. Neem een polyethyleen plastic folie met een lengte van 16 cm, een breedte van 12 cm en een dikte van 20 μm. Druk 30 halfronde uitsteeksels met een diameter van 2-3 mm en een hoogte van ongeveer 3 mm uit met behulp van een glazen slijpstaaf volgens de standaard PCR-plaatlay-out van 96 gaten.
   NOTITIE: Het proces van het uitpersen van 30 halfronde uitsteeksels met behulp van een glazen slijpstaaf moet worden gedaan met inachtneming van de druk, omdat een te harde pers het plastic zal doorboren en de geëxtraheerde giftige slijpstaaf zal verontreinigen.
2. Desinfecteer de geperste polyethyleen plastic folie door beide zijden gedurende 1 uur bloot te stellen aan ultraviolet (UV) licht.
3. Voeg een kleine hoeveelheid 10% polyvinylalcohol toe aan het halfronde oppervlak.

3. Trichogramma dendrolimi parasitisme

1. Plaats na CO₂ -anesthesie T. dendrolimi vrouwelijke wespen in een verzameldoos en het aantal wespen was ~ 3000.
2. Plaats de bolle kant van de filmeierkaart in de richting van de opvangbak en zet de randen vast met een elastiekje.
3. Voeg 4 μl aminozuuroplossing (6 g/l leucine, 4 g/l fenylalanine, 4,25 g/l histidine) toe aan elk halfcirkelvormig uitsteeksel. Bedek het met een platte polyethyleen plastic folie van 16 cm lang en 12 cm breed. Gebruik een elastiekje om de opvangbak goed af te dekken met twee vellen plastic.
4. Laat T. dendrolimi wespen 4-8 uur vrij parasiteren en geef 10% sucrosewater door bevochtigd katoen.

4. T . dendrolimi gif verzamelen

1. Verkrijg de geparasiteerde aminozuuroplossing uit het binnenste uitsteeksel van de kunstmatige eikaart en breng deze over naar de dop van buisjes van 1,5 ml.
2. Bedek de buisdop met een nylon net van 10 μm met een diameter van 25 mm, maak het nylon net en de centrifugebuis stevig vast. Zet de centrifugebuis rechtop voor een korte centrifugatie met behulp van een minicentrifuge (1360 x g) gedurende 10 s en vang de gefilterde oplossing (~100 μL T. dendrolimi-gif ) op.
3. Meet de concentratie van het opgevangen T. dendrolimi-gif met behulp van een Bicinchoninic acid (BCA)-testkit (Tabel met materialen).
4. Bewaar het gif bij -80 °C voor verdere analyses.

5. SDS-PAGE-analyses

1. Voeg 30 μL T. dendrolimi gif toe aan 10 μL 4x natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) monsterlaadbuffer (Materiaaltabel) en verwarm gedurende 10 minuten op 95 °C.
2. Voer SDS-PAGE gel uit op 130 V gedurende 120 min.
3. Kleurs en ontkleuring van de SDS-PAGE-gel met behulp van het eiwitkleuringsapparaat (Materiaaltabel).

Resultaten

De eiwitconcentratie van representatieve gifmonsters werd gemeten met behulp van de eiwittestkit, met de resultaten weergegeven in tabel 1. De resultaten toonden aan dat de concentratie van gifeiwit die met deze methode werd verzameld, varieerde van 0,35 μg/μL tot 0,46 μg/μL, terwijl de negatieve controle van de aminozuuroplossing slechts een eiwitconcentratie had van 0,03 μg/μL tot 0,05 μg/μL. De concentratie gifeiwit die met deze methode wordt verzameld, is veel hoger dan die van negatieve controle, wa...

Discussie

Hier presenteren we een methode om gif uit T. dendrolimi te extraheren met behulp van kunstmatige gastheren. De belangrijkste punten in het experiment met het verzamelen van gif zijn als volgt. (1) Tijdens de bereiding moet T. dendrolimi snel worden verdoofd met een passende concentratie CO₂ . Als de CO_{2 -} concentratie te laag is, is deze onvoldoende om de Trichogramma snel te verdoven. Omgekeerd, als de concentratie te hoog is, kan Trichogramma afsterven, waardoo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10 μm Nylon Net	Millipore	NY1002500	Voor het filteren van de eieren
10% Polyvinyl alcohol	Aladdin	P139533	Voor het aantrekken  T. dendrolimi  om eieren te leggen
10% Sucrose water	Sinopharm Chemical Reagent	10021463	Voer Trichogramma dendrolimi
4x LDS loading buffer	Ace Hardware	B23010301	SDS-PAGE
Collectiebox	Deli	8555	Container voor T. dendrolimi parasitisme
Future PAGE  4–12% (12 wells)	Ace Hardware	J70236502X	SDS-PAGE
GenScript eStain L1 proteïnekleuringsapparaat	GenScript	L00753	SDS-PAGE
Glazen maalstaaf	Applygen	tb6268	Halfkringe vormen
L- Leucine	Solarbio	L0011	Kunstmatige gastheercomponenten
L-Histidine	Aladdin	A2219458	Kunstmatige gastheercomponenten
L-Phenylalanine	Solarbio	P0010	Kunstmatige gastheercomponenten
Mini-Centrifuges	Scilogex	D1008	Centrifuge
MOPS-SDS running buffer	Ace Hardware	B23021	SDS-PAGE
Omni-Easy Instant BCA-eiwitanalysekit	Shanghai Yamay Biomedical Technology	ZJ102	Voor schatting van de concentratie van het venom-eiwit
PCR-plaatindeling van 96 gaten	Thermo Fisher	AB1400L	Halfkringe vormen
Polyethyleen kunststoffolie	Suzhou Aopang Trading	001c5427	Kunstmatige eenkaart
Voorgekleurde kleurproteïnemarkering(10–180 kDa)	YiFeiXue Biotech	YWB007	SDS-PAGE
Rubberen band	Guangzhou qianrui biology science and technology	009	De kunststoffolie en de collectiebox strak zetten
Siliconen rubber septummat, 96-well, ronde gat	Sangon Biotech	F504416-0001	Halfkringe vormen