Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een rattenmodel met droge ogen bij traanklierdisfunctie veroorzaakt door scopolamine

3.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66036

⸱

9 februari 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Eye Hospital, Jinan University, 2Shenzhen Eye Institute, 3Shenzhen Research Institute, Wuhan University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier stellen we een rattenmodel op van traanklierdisfunctie om een basis te leggen voor de studie van waterdeficiënte droge ogen.

Samenvatting

Waterige-deficiënte droge ogen (ADDE) is een vorm van droge ogen die kan leiden tot een vermindering van de hoeveelheid en kwaliteit van de traanafscheiding. Langdurige abnormale traanproductie kan leiden tot een verstoring van het oogoppervlak, waaronder beschadiging van het hoornvlies en ontsteking. In ernstige gevallen kan ADDE verlies van gezichtsvermogen of zelfs blindheid veroorzaken. Momenteel is de behandeling van droge ogen beperkt tot oogdruppels of fysiotherapie, die alleen de symptomen van oogongemak kan verlichten en het droge-ogen-syndroom niet fundamenteel kan genezen. Om de functie van de traanklier in droge ogen te herstellen, hebben we een diermodel gemaakt van traanklierdisfunctie bij ratten veroorzaakt door scopolamine. Door de uitgebreide evaluatie van de traanklier, hoornvliezen, bindvlies en andere factoren, streven we ernaar een volledig inzicht te geven in de pathologische veranderingen van ADDE. Vergeleken met het huidige muismodel met droge ogen, bevat dit ADDE-diermodel een functionele evaluatie van de traanklier, wat een beter platform biedt voor het bestuderen van traanklierdisfunctie bij ADDE.

Inleiding

In 2021 heeft ongeveer 12% van de mensen aanzienlijk last van drogeogen1, waardoor het een van de meest voorkomende chronische oogziekten is. Droge ogen kunnen worden onderverdeeld in twee soorten: droge ogen met watertekort (ADDE) en droge ogen met verdamping (EDE)2, afhankelijk van de verschillende factoren die de ziekte beïnvloeden. ADDE is verder onderverdeeld in het syndroom van Sjögren (SS) en niet-SS, maar de meerderheid van de patiënten met droge ogen zijn niet-SS-patiënten in klinische3. Chronische symptomen van droge ogen hebben een ernstige invloed op de visuele kwaliteit van patiënten. Momenteel omvat de conventionele behandeling van DED het aanbrengen van kunsttranen om het oogoppervlak te smeren en fysiotherapie van de oogleden. Het droge-ogen-syndroom biedt in veel gevallen echter geen volledige genezing. Daarom is het bestuderen van de pathogenese van droge ogen cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën en medicijnen. Diermodellen van het droge-ogen-syndroom bieden een basis voor verder onderzoek.

Er zijn veel manieren om diermodellen van het droge-ogen-syndroom4 te construeren, waaronder het veranderen van de traansecretieniveaus door de hormoonspiegels te veranderen. Het verwijderen van de teelballen van ratten kan bijvoorbeeld de androgeensecretie verminderen, de traansecretie verhogen en de concentratie van vrije secretoire component (SC) en IgA intranen verlagen. Een andere methode is om auto-immuunreacties in de traanklier aan te geven door de oogoppervlakzenuwen te verwijderen die de klier aansturen. Bovendien kan het direct verminderen van de traanafscheiding worden bereikt door de traanklier operatief te verwijderen7. Veranderende omgevingsomstandigheden kunnen ook de verdamping van tranen versnellen. Het kweken van dieren in omstandigheden met een lage luchtvochtigheid en droge ventilatie kan bijvoorbeeld een model van overmatige verdamping vandroge ogen tot stand brengen8, dat kan worden gecombineerd met andere methoden om de ernst van droge ogen te vergroten. De belangrijkste geneesmiddelen die worden gebruikt om experimentele modellen voor droge ogen te induceren, zijn atropine en scopolamine-9. Als parasympathische remmers kunnen beide farmacologische blokkade van cholinerge (muscarine) receptoren in de traanklier induceren en de traansecretie remmen. Vergeleken met droge ogen veroorzaakt door atropinespierinjectie10, heeft scopolamine een sterker remmend effect op de secretieklieren, een langere duur van de geneesmiddelwerking en zwakkere effecten op hart-, kleine darm- en bronchiale gladde spieren. Het is een van de meest volwassen medicijnen voor diermodellen met droge ogen.

Er kunnen verschillende methoden worden gebruikt om droge ogen op te wekken met scopolamine, zoals subcutane injectie, medicijnpomp of pleistertoepassing 4,11,12. Om de frequentie van medicijntoediening aan proefdieren te verminderen, brengen veel onderzoekers transdermale pleisters aan op de staarten van muizen of gebruiken ze medicijnpompen. Beide methoden hebben echter beperkingen. Bij de absorptie van transdermale pleisters moet bijvoorbeeld rekening worden gehouden met de individuele absorptie van muizen, wat kan leiden tot een inconsistente dosering van het geneesmiddel. Hoewel medicijnpompen de dosering van elke toediening nauwkeurig kunnen regelen, zijn ze niet altijd compatibel met het medicijn dat wordt toegediend of de concentratie die wordt gebruikt. Ze moeten ook operatief worden geplaatst - wat invasiever is voor het dier, waarvoor een verdoving nodig is, en er is kans op postoperatieve complicaties zoals dehiscentie. Subcutane injectie, hoewel omslachtiger, kan zorgen voor een nauwkeurige dosering voor elke toediening en consistentie in de toediening van geneesmiddelen bij verschillende ratten behouden. Tegelijkertijd heeft het lagere kosten en is het geschikt voor het uitvoeren van een groot aantal dierproeven.

Deze studie past herhaalde subcutane injectie van scopolamine toe om een rattenmodel met droge ogen op te stellen. We analyseren indicatoren voor droge ogen, zoals hoornvliesdefecten, traansecretieniveaus en pathologische morfologie van het hoornvlies, het bindvlies en de traanklier. Door geneesmiddelconcentratie, pathologische manifestaties en symptomen van droge ogen te combineren, werken we het droge-ogen-rattenmodel verder in detail uit, waardoor we nauwkeurigere experimentele gegevens opleveren voor de studie van de behandeling van droge ogen en pathologische mechanismen. We beschrijven het modelleringsproces ook in detail voor toekomstige onderzoekers.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven die volgens dit protocol worden uitgevoerd, worden uitgevoerd onder goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Voorbereiding van dieren

  1. Bereid 12 gezonde vrouwelijke ratten met SPF Wistar van 6 weken oud met een gewicht van 160 g ± 20 g.
  2. Gebruik een spleetlamp en oftalmoscoop om de oogaandoeningen van alle ratten te onderzoeken en zorg ervoor dat er geen voorste segment- of netvliesaandoeningen zijn.
  3. Voed alle ratten gedurende 1 week op met voldoende voedsel- en waterbronnen.
  4. Willekeurig verdeeld alle ratten in normale, scopolamine-geneesmiddelconcentratie 2,5 mg/ml, scopolamine-geneesmiddelconcentratie 5 mg/ml en scopolamine-geneesmiddelconcentratie 7,5 mg/ml, met drie dieren in elke groep.

2. Bereiding van de oplossing

  1. Bereid scopolaminehydrobromide door het op te lossen in 0.9% natriumchloride-oplossing om een oplossing te maken met concentraties van 7.5 mg/ml, 5 mg/ml en 2.5 mg/ml.
  2. Bereid een 0,9% natriumchloride-oplossing zonder scopolaminehydrobromide voor gebruik als injectie voor de controlegroep van ratten.

3. Uitrusting en materiaalvoorbereiding

  1. Maak een microscoop voor kleine dieren.
  2. Bereid materialen voor het experiment voor, waaronder een wegwerpspuit van 1 ml met naald (26 G); fluoresceïne natrium oogheelkundige strips; Schirmer scheur teststrip; absolute ethanol; 4% paraformaldehyde; Xyleen; neutrale balsem; hematoxyline, eosine; en periodieke zuur-Schiff-kleuringskit.

4. Subcutane injectie

OPMERKING: Deze procedure vereist hulp van een tweede persoon om de ratten te helpen beveiligen.

  1. Houd het lichaam van de rat stil en vang en strek zijn linker (of rechter) achterpoten.
    OPMERKING: Een assistent kan helpen bij het vasthouden van het dier.
  2. Reinig de injectieplaats met alcohol.
  3. Steek de wegwerpspuit van 1 ml met naald (26 G) aan de basis van de huidplooi tussen duim en vinger.
  4. Zuig de spuit op door de zuiger van de spuit terug te trekken. Bloed in de spuit duidt op een onjuiste plaatsing van de naald; Verwijder de naald en verplaats deze.
  5. Dien 0,9% natriumchloride-oplossing met of zonder scopolaminehydrobromide toe in een constante, vloeiende beweging.
  6. Injecteer alle ratten volgens verschillende concentraties, waarbij elke keer 0,5 ml en vier keer per dag (om 9.00 uur, 12.00 uur, 15.00 uur en 18.00 uur) gedurende een aaneengesloten periode van 19 dagen wordt geïnjecteerd, afwisselend met linker- en rechterledematen.
    OPMERKING: De groepen worden als volgt genoemd:
    Groep zonder scopolaminehydrobromide: 0 groep (controle)
    Groep met scopolaminehydrobromide 2,5 mg/ml: 2,5 groep
    Groep met scopolaminehydrobromide 5 mg/ml: groep 5
    Groep met scopolaminehydrobromide 7,5 mg/ml: 7,5 groep
  7. Breng het dier terug naar zijn kooi en houd de ademhaling en het gedrag gedurende 5-10 minuten in de gaten.

5. De test van de scheursecretie (Schirmer-traantest, STT)

  1. Maak een aangepaste strook filterpapier voor ratten11. Knip de helft van de strook filtreerpapier die voor mensen wordt gebruikt langs de middellijn (1 mm × 15 mm) en snijd de kop van de strook af om deze glad te maken.
    NOTITIE: Voordat u de traansecretietest uitvoert, moet u het lichaam van de rat handmatig in bedwang houden om beweging te voorkomen en ervoor te zorgen dat de ogen van de rat worden blootgesteld.
  2. Plaats de strook filtreerpapier op de buitenste 1/3 van de conjunctivale zak van het onderste ooglid van de rat.
  3. Time de test gedurende 5 minuten. Controleer de sluiting van de ogen van de rat tijdens de procedure.
  4. Gebruik na het meten een pincet om de strook filtreerpapier in een microcentrifugebuisje te klemmen en registreer het traanvolume door een markering op de wand van het buisje te maken.
  5. Meet de traanafscheiding op dag 0, dag 1, dag 3, dag 5, dag 7, dag 11, dag 15 en dag 19.

6. Hoornvliesfluoresceïnekleuring

  1. Laat 0,5 μl 0,5% fluoresceïnenatriumoplossing in de inferieure conjunctivale zak van elke rat vallen.
  2. Observeer het hoornvlies onder blauw licht gedurende 3 minuten na fluoresceïne-instillatie.
  3. Noteer de fluorescentiekleuring van het hoornvlies van elke rat en observeer of er een hoornvliesdefect is.
  4. Voer corneafluoresceïnekleuring uit op dag 0, dag 1, dag 3, dag 5, dag 7, dag 11, dag 15 en dag 19.

7. Histologische observatie van conjunctivaal weefsel

  1. Na voltooiing van de modelontwikkeling verdooft u de ratten diep met een intraperitoneale injectie van 0,4 ml/100 g 10% waterig chloraalhydraat om de spanning van de dieren te verlichten. Euthanaseer vervolgens de ratten door cervicale dislocatie.
  2. Neem het bulbaire bindvlies uit dezelfde regio's van elke rat, met een grootte van ongeveer 2 mm x 2 mm.
  3. Fixeer de weefsels onmiddellijk in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur en veranker ze in paraffine13.
  4. Snijd secties met een dikte van 5 μm en beits ze met hematoxyline en eosine (HE)14 en periodieke zuur-Schiff (PAS)-kleuring (volg de instructies van de fabrikant).

8. Histologische observatie van hoornvlies- en traanklierweefsel

  1. Na voltooiing van de modelontwikkeling euthanaseert u de rat zoals beschreven in stap 7.1.
  2. Neem het hoornvlies aan de rechterkant van elke rat en fixeer het onmiddellijk in 4% paraformaldehyde-oplossing.
  3. Snijd de cephalische epidermis en het onderhuidse weefsel langs de lijn die het oor en de buitenste ooghoek verbindt, breid de incisie naar beide zijden uit en isoleer de gelige extra orbitale klier verder.
  4. Verwijder de vacht van de rat grondig en scheid de extraorbitale klier met 0,9% natriumchloride-oplossing.
  5. Plaats de geïsoleerde extraorbitale klieren gedurende 24 uur in een 4% paraformaldehyde-oplossing en veranker ze in paraffine.
  6. Snijd doorlopende secties van ~5 μm dikte en kleurs ze met HE voor hoornvlies- en extraorbitale klierweefselmonsters.

9. Statistische analyse

  1. Gebruik geschikte software voor statistische analyse van de gegevens.
    1. Voer eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) uit om de gegevens te analyseren en de minst significante verschiltest (LSD) voor vergelijking tussen groepen. Stel het statistische significantieniveau in op α = 0,05, waarbij P < 0,05 statistische significantie aangeeft.
      OPMERKING: SPSS 20-software werd gebruikt voor statistische analyse van de experimentele gegevens.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Schirmer I test, SIT I
Het traanvolume van de ratten werd gemeten op dag 0, 3, 5, 7, 11, 15 en 19 na de start van het experiment. De experimentele resultaten toonden aan dat de traansecretie van de scopolaminegroep (2,5 groep, 5 groep, 7,5 groep), vergeleken met de controlegroep (0 groep), significant was afgenomen en dat het verschil statistisch significant was (P < 0,01). Er was geen statistische significantie tussen de 2,5-groep, de 5-groep en de 7,5-groep (P > 0,05). Er werd geen significant versc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Waterige-deficiënte droge ogen (ADDE) is een belangrijk type droge ogen, goed voor ongeveer 1/3 van de totale populatie droge ogen17, en de belangrijkste oorzaak van ADDE is pathologische schade en ontsteking van de traanklier13. Voor dit type droge ogen zijn de meest gebruikelijke klinische behandelingsmethoden kunstmatige tranen om de symptomen te verlichten of plaatselijke toepassing van steroïden of ciclosporine18, terwijl er weinig behandelingso...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen potentiële belangenconflicten met betrekking tot de medicijnen en materialen die in deze procedure worden gebruikt.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door Guangdong Provincial High-level Clinical Key Specialties (SZGSP014) en Shenzhen Natural Science Foundation (JCYJ20210324125805012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0,9% natriumchloride-oplossingSJZ No.4 PharmaceuticalH13023201
4% paraformaldehydeWuhan Servicebio Technology Co., LtdG1113
Absoluut ethanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10009218
Fluoresceïne natrium oogstripsTianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., LtdYN-YG-I
Hematoxyline en eosineNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteD006
Neutrale balsemBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. G8590
ParaffineBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.YA0012
Periodic Acid-Schiff KleuringskitBeyotime BiotechnologyC0142S
Schirmer traanteststripsTianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., LtdYN-LZ-I
ScopolaminehydrobromideShanghai Macklin Biochemical Co., LtdS860151
Klein dier microscoopHead Biotechnology Co., LtdZM191
XYleenSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10023418

Referenties

  1. Papas, E. B. The global prevalence of dry eye disease: A Bayesian view. Ophthalmic Physiol Opt. 41 (6), 1254-1266 (2021).
  2. Sy, A., et al. Expert opinion in the management of aqueous deficient dry eye disease (DED). BMC Ophthalmol. 15 (1), 133(2015).
  3. Seo, Y., et al. Activation of HIF-1alpha (hypoxia inducible factor-1alpha) prevents dry eye-induced acinar cell death in the lacrimal gland. Cell Death Dis. 5 (6), 1309(2014).
  4. Rahman, M. M., Kim, D. H., Park, C. -K., Kim, Y. H. Experimental models, induction protocols, and measured parameters in dry eye disease: Focusing on practical implications for experimental research. Int J Mol Sci. 22 (22), 12102(2021).
  5. Sullivan, D. A., Bloch, K. J., Allansmith, M. R. Hormonal influence on the secretory immune system of the eye: androgen regulation of secretory component levels in rat tears. J Immunol. 132 (3), 1130-1135 (1984).
  6. Sullivan, D. A., Allansmith, M. R. Hormonal modulation of tear volume in the rat. Exp Eye Res. 42 (2), 131-139 (1986).
  7. Maitchouk, D. Y., Beuerman, R. W., Ohta, T., Stern, M., Varnell, R. J. Tear production after unilateral removal of the main lacrimal gland in squirrel monkeys. Arch Ophthalmol. 118 (2), 246-252 (2000).
  8. Barabino, S., et al. The controlled-environment chamber: a new mouse model of dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (8), 2766-2771 (2005).
  9. Viau, S., et al. Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (6), 857-867 (2008).
  10. Altinors, D. D., Bozbeyoglu, S., Karabay, G., Akova, Y. A. Evaluation of ocular surface changes in a rabbit dry eye model using a modified impression cytology technique. Curr Eye Res. 32 (4), 301-307 (2007).
  11. Daull, P., et al. Efficacy of a new topical cationic emulsion of cyclosporine A on dry eye clinical signs in an experimental mouse model of dry eye. Exp Eye Res. 153, 159-164 (2016).
  12. Dursun, D., et al. A mouse model of keratoconjunctivitis sicca. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (3), 632-638 (2002).
  13. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. 2008, (2008).
  14. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
  15. Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision. Sci Rep. 8 (1), 1483(2018).
  16. Ramos, M. F., et al. Nonproliferative and Proliferative Lesions of the Rat and Mouse Special Sense Organs(Ocular [eye and glands], Olfactory and Otic). J Toxicol Pathol. 31, (2018).
  17. Stapleton, F., et al. TFOS DEWS II Epidemiology report. Ocul Surf. 15 (3), 334-365 (2017).
  18. Foulks, G. N., et al. Clinical guidelines for management of dry eye associated with Sjogren disease. Ocul Surf. 13 (2), 118-132 (2015).
  19. Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Exp Ther Med. 22 (6), 1394(2021).
  20. Brayer, J. B., Humphreys-Beher, M. G., Peck, A. B. Sjogren's syndrome: immunological response underlying the disease. Arch Immunol Ther Exp (Warsz. 49 (5), 353-360 (2001).
  21. Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride). Mol Vis. 17, 257-264 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Scopolamine-inductietraansecretietesthoornvlieskleuringratmodelconjunctivale morfologieevaluatie van de traanklierschade aan het oogoppervlakinflammatoire veranderingen
Een rattenmodel met droge ogen bij traanklierdisfunctie veroorzaakt door scopolamine
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.