Methodenartikel

Demonstratie van zelf-geassembleerde celbladcultuur en handmatige generatie van een 3D-pees/ligament-achtige organoïde met behulp van menselijke dermale fibroblasten

3.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66047

⸱

21 juni 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Musculoskeletal Tissue Regeneration, Orthopaedic Hospital König-Ludwig-Haus, University of Würzburg, 2Laboratory for Experimental Trauma Surgery, Department of Trauma Surgery, University Hospital Regensburg, 3Department of Orthopaedics, Orthopaedic Hospital König-Ludwig-Haus, University of Würzburg

In dit artikel

Samenvatting

Hierin demonstreren we een organoïdemodel in drie stappen (tweedimensionale [2D] expansie, 2D-stimulatie, driedimensionale [3D] rijping) dat een veelbelovend hulpmiddel biedt voor fundamenteel peesonderzoek en een potentiële steigervrije methode voor peesweefselmanipulatie.

Samenvatting

Pezen en ligamenten (T/L) zijn sterke hiërarchisch georganiseerde structuren die het bewegingsapparaat verenigen. Deze weefsels hebben een strikt gerangschikte collageen type I-rijke extracellulaire matrix (ECM) en T/L-lijncellen die voornamelijk in parallelle rijen zijn gepositioneerd. Na een blessure hebben T/L veel tijd nodig voor revalidatie met een hoog faalrisico en vaak onbevredigende reparatieresultaten. Ondanks recente vooruitgang in het onderzoek naar T/L-biologie, is een van de resterende uitdagingen dat het T/L-veld nog steeds geen gestandaardiseerd differentiatieprotocol heeft dat in staat is om het T/L-vormingsproces in vitro te recapituleren. Bot- en vetdifferentiatie van mesenchymale voorlopercellen vereist bijvoorbeeld alleen standaard tweedimensionale (2D) celcultuur en de toevoeging van specifieke stimulatiemedia. Voor differentiatie naar kraakbeen is driedimensionale (3D) pelletcultuur en suppletie van TGFß noodzakelijk. Celdifferentiatie naar pezen vereist echter een zeer geordend 3D-kweekmodel, dat idealiter ook onderworpen zou moeten zijn aan dynamische mechanische stimulatie. We hebben een 3-staps (expansie, stimulatie en rijping) organoïdemodel opgesteld om een 3D-staafachtige structuur te vormen uit een zelfgeassembleerd celvel, dat een natuurlijke micro-omgeving levert met zijn eigen ECM-, autocriene en paracriene factoren. Deze staafachtige organoïden hebben een meerlagige cellulaire architectuur binnen rijke ECM en kunnen vrij gemakkelijk worden gehanteerd voor blootstelling aan statische mechanische belasting. Hier hebben we het 3-stappenprotocol gedemonstreerd door gebruik te maken van in de handel verkrijgbare dermale fibroblasten. We zouden kunnen aantonen dat dit celtype robuuste en ECM-overvloedige organoïden vormt. De beschreven procedure kan verder worden geoptimaliseerd in termen van kweekmedia en geoptimaliseerd voor dynamische axiale mechanische stimulatie. Op dezelfde manier kunnen alternatieve celbronnen worden getest op hun potentieel om T/L-organoïden te vormen en zo T/L-differentiatie te ondergaan. Kortom, de gevestigde 3D T/L-organoïdebenadering kan worden gebruikt als model voor pezen basisonderzoek en zelfs voor steigervrije T/L-engineering.

Inleiding

Pezen en ligamenten (T/L) zijn vitale componenten van het bewegingsapparaat die essentiële ondersteuning en stabiliteit bieden aan het lichaam. Ondanks hun cruciale rol zijn deze bindweefsels vatbaar voor degeneratie en letsel, wat pijn en verminderde mobiliteitveroorzaakt1. Bovendien kunnen hun beperkte bloedtoevoer en trage genezingsvermogen leiden tot chronische verwondingen, terwijl factoren zoals veroudering, repetitieve bewegingen en onjuiste revalidatie het risico op degeneratie en letsel verder vergroten. Conventionele behandelingen, zoals rust, fysiotherapie en chirurgische ingrepen, zijn niet in staat om de T/L-structuur en -functie volledig te herstellen. In de afgelopen jaren hebben onderzoekers ernaar gestreefd om de ingewikkelde aard van T/L beter te begrijpen om effectieve behandelingen voor T/L-stoornissen te zoeken 3,4,5. T/L onderscheiden zich door een hiërarchisch georganiseerde, door extracellulaire matrix (ECM) gedomineerde structuur, die voornamelijk bestaat uit type I collageenvezels en proteoglycanen, een kenmerk dat moeilijk in vitro kan worden gerepliceerd 6. Traditionele tweedimensionale (2D) celcultuurmodellen slagen er niet in om de karakteristieke driedimensionale (3D) organisatie van T/L-weefsels vast te leggen, waardoor hun translationeel potentieel wordt beperkt en de innovatieve vooruitgang op het gebied van T/L-regeneratie wordt belemmerd.

Onlangs heeft de ontwikkeling van 3D-organoïdemodellen nieuwe mogelijkheden geboden voor het bevorderen van fundamenteel onderzoek en steigervrije weefselengineering van verschillende weefseltypen 7,8,9,10,11,12,13. Om bijvoorbeeld myotendineuze junctie te onderzoeken, ontwikkelden Larkin et al. 2006 3D-skeletspierconstructies samen met zelfgeorganiseerde peessegmenten afgeleid van rattenstaartpees10. Bovendien hebben Schiele et al. 2013, door gebruik te maken van micromachinale fibronectine-gecoate groeikanalen, de zelfassemblage van menselijke dermale fibroblasten geleid om cellulaire vezels te vormen zonder de hulp van een 3D-steiger, een benadering die de belangrijkste kenmerken van de ontwikkeling van embryonale pezen kan vastleggen11. In de studie van Florida et al. 2016 werden beenmergstromale cellen eerst uitgebreid tot bot- en ligamentlijnen, vervolgens gebruikt om zelfgeassembleerde monolaagse celvellen te genereren, die vervolgens werden geïmplementeerd om een multifasische bot-ligament-botconstructie te creëren die de oorspronkelijke voorste kruisband nabootst, een model gericht op een beter begrip van ligamentregeneratie12. Om peesmechanotransductieprocessen op te helderen, gebruikten Mubyana et al. 2018 een steigervrije methodologie waarbij enkele peesvezels werden gecreëerd en onderworpen aan mechanisch belastingsprotocol13. Organoïden zijn zelfgeorganiseerde 3D-structuren die de oorspronkelijke architectuur, micro-omgeving en functionaliteit van weefsels nabootsen. 3D-organoïdeculturen bieden een fysiologisch relevanter model voor het bestuderen van weefsel- en orgaanbiologie en pathofysiologie. Dergelijke modellen kunnen ook worden gebruikt om weefselspecifieke differentiatie van verschillende stam-/voorloperceltypen te induceren14,15. Daarom wordt het implementeren van 3D-organoïdemodellen op het gebied van T/L-biologie en weefselmanipulatie een zeer aantrekkelijke benadering 9,16. Alternatieve celbronnen kunnen worden geïmplementeerd voor de organoïde-assemblage en worden gestimuleerd in de richting van tenogene differentiatie. Een relevant celtype dat voor demonstratie in deze studie is gebruikt, zijn dermale fibroblasten 7,17,18. Deze cellen zijn gemakkelijk toegankelijk via een huidbiopsieprocedure, die minder invasief is in vergelijking met beenmergpunctie of liposuctie en door hun goede proliferatieve capaciteit vrij snel tot grote aantallen kan worden vermenigvuldigd. Daarentegen zijn meer gespecialiseerde celtypen, zoals T/L-residente fibroblasten, moeilijker te isoleren en uit te breiden. Daarom werden dermale fibroblasten ook gebruikt als uitgangspunt voor celherprogrammeringstechnologieën in de richting van geïnduceerde pluripotente embryonale stamcellen19. Het onderwerpen van dermale fibroblasten aan specifieke 3D-kweekomstandigheden en signaleringssignalen, zoals transformerende groeifactor-bèta 3 (TGFß3), waarvan is gemeld dat het fungeert als een belangrijke regulator van verschillende cellulaire processen, waaronder de vorming en het onderhoud van T/L, kan hun in vitro tenogene differentiatie versterken, wat leidt tot de expressie van peesspecifieke genen en de afzetting van T/L-typische ECM20, 21. okt.

Hier beschrijven en demonstreren we een eerder vastgesteld en geïmplementeerd 3-stappen (2D-expansie, 2D-stimulatie en 3D-rijping) organoïdeprotocol met behulp van in de handel verkrijgbare normale menselijke huidfibroblasten voor volwassenen (NHDF's) als celbron, en bieden we een waardevol model voor het bestuderen van in vitro tenogenese7. Ondanks het feit dat dit model niet gelijk is aan in vivo T/L-weefsel, biedt het nog steeds een meer fysiologisch relevant systeem dat kan worden gebruikt voor het onderzoeken van cellulaire differentiatiemechanismen, het nabootsen van T/L-pathofysiologie in vitro en het opzetten van T/L-gepersonaliseerde geneeskunde en platforms voor het screenen van geneesmiddelen. Bovendien kunnen studies in de toekomst evalueren of de 3D-organoïden geschikt zijn voor steigervrije T/L-engineering door verdere optimalisatie en bruikbaar zijn voor de ontwikkeling van opgeschaalde mechanisch robuuste constructies die sterk lijken op de afmetingen en structurele en biofysische eigenschappen van native T/L-weefsels.

Protocol

OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van aseptische technieken.

1. Cultuur en pre-uitbreiding van NHDF's

  1. Ontdooi de cryoflacon met volwassen gecryopreserveerde normale menselijke dermale fibroblasten (NHDF's, 1 x 106 cellen) bij 37 °C snel totdat ze bijna ontdooid zijn.
  2. Voeg langzaam 1 ml voorverwarmd fibroblastgroeimedium 2 (kant-en-klare kit met basaal medium, 2% foetaal kalfsserum (FCS), basisch fibroblastgroeifactor (bFGF) en insuline) aangevuld met 1% penicilline/streptomycine (pen/streptokokken) (NHDF-medium), voorverwarmd bij 37 °C toe aan de cellen.
  3. Breng de cellen over in een centrifugebuisje van 15 ml. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  4. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de celpellet in 12 ml voorverwarmd NHDF-medium.
  5. Breng de cellen over in een T-75-kolf en schud kort kruiselings. Plaats de T-75 kolf bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.
  6. Vervang het medium elke 2 dagen. Bekijk de NHDF's onder een microscoop totdat ze 70% - 80% samenvloeiing bereiken.

2. 2D-uitbreiding

  1. Haal de T-75-kolf uit de incubator en verwijder het NHDF-medium. Was de cellen met voorverwarmde fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS).
  2. Voeg 3 ml 0,05% trypsine-EDTA toe aan de cellen. Incubeer de cellen bij 37 °C in een 5% CO2 -bevochtigde incubator totdat de cellen loskomen van de kolf (ongeveer 3 min).
  3. Voeg 6 ml voorverwarmd NHDF-medium toe om de trypsinewerking te neutraliseren. Breng de cellen over in een centrifugebuisje van 15 ml.
  4. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT en verwijder het supernatant.
  5. Resuspendeer de celpellet in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) lage glucose aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1x MEM aminozuren, 1% pen/streptokokken, voorverwarmd op 37 °C.
  6. Schaal de NHDF's in een 10 cm aanhangend celkweekschaaltje met een dichtheid van 8 x 103 NHDF's/cm2 (in totaal 4,4 x 105 NHDF's per 10 cm schaaltje). Schud zachtjes kruiselings.
  7. Plaats het 10 cm celkweekschaaltje bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator. Vervang het medium elke 2 dagen
  8. Bewaak de cellen onder een microscoop totdat ze 100% confluentie bereiken (ca. 5 dagen).

3. 2D stimulatie

  1. Haal de 10 cm celkweekschaaltjes met de NHDF's (uit stap 2.6 en 2.7) uit de couveuse. Verwijder het kweekmedium en was de cellen met voorverwarmd PBS.
  2. Voeg 10 ml DMEM high glucose medium toe, aangevuld met 10% FBS, 50 μg/ml ascorbinezuur en 1% pen/streptokokken, voorverwarmd tot 37 °C.
  3. Plaats de petrischaal op 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer. Vervang het medium elke 2 dagen.
  4. Bewaak de NHDF's gedurende 14 dagen onder een microscoop.

4. 3D rijping

  1. Haal het 10 cm celkweekschaaltje uit de incubator en verwijder het DMEM high glucose medium.
  2. Maak het gevormde celvel voorzichtig en snel los van de schaal met een celschraper. Terwijl u het losmaakt, rolt u het celvel tegelijkertijd op tot een 3D-staafachtige organoïde.
  3. Pak de NHDF-organoïden op en plaats ze in een 10 cm niet-klevende (voor cellen) petrischaal. Dit type schotel wordt gebruikt om celuitmigratie van de organoïde naar het plastic te voorkomen.
  4. Verzamel op dit tijdstip of een dag erna (dag 0 of dag 1 van de 3D-rijping) enkele van de organoïden voor verdere analyses zoals nat gewicht, histologische evaluatie (organoïden op dag 1 hebben de voorkeur omdat ze compacter worden), RNA- en eiwitisolatie.
  5. Bevestig de randen van de organoïde als volgt met metalen pinnen:
    1. Houd een kant van de organoïde voorzichtig vast met een pincet en pas met een ander pincet voorzichtig handmatig rekken van ongeveer 10% axiale rek toe. Om de axiale rek van 10% te schatten, gebruikt u een millimeterpapier of liniaal.
    2. Pak vervolgens een metalen pin op met het pincet en druk deze handmatig door de rand van de organoïde in de plastic schaal om deze te bevestigen. Herhaal deze procedure met de tweede pin op de tweede rand van de organoïde.
  6. Voeg 10 ml DMEM high glucose medium toegevoegd met 10% FBS, 1x MEM-aminozuren, 50 μg/ml ascorbinezuur, 10 ng/ml TGFß3 en 1% pen/streptokokken, voorverwarmd op 37 °C.
  7. Plaats de schaal van 10 cm op 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 . Vervang het medium elke 2 dagen.
  8. Controleer de organoïden regelmatig gedurende 14 dagen.
    OPMERKING: Pinnen kunnen losraken en worden daarom opnieuw bevestigd met dezelfde techniek als beschreven in stap 4.5.
  9. Verwijder na 14 dagen het DMEM high glucose medium uit de organoïden. Was de organoïden met voorverwarmde PBS.
  10. Meet organoïden voor nat gewicht op dag 0 en dag 14 met behulp van een precisieweegschaal.
    1. Plaats een leeg schaaltje van 10 cm op de weegschaal en tarreer het gewicht tot nul om ervoor te zorgen dat alleen het gewicht van de organoïden wordt gemeten. Haal het kweekmedium volledig uit de schaal van 10 cm en meet één voor één het natgewicht van de organoïde.
      OPMERKING: In dit onderzoek werden op dag 0 drie organoïden per donor en op dag 14 twee organoïden per donor gewogen.
  11. Afhankelijk van de onderzoeksdoeleinden, implementeer enkele van de NHDF-organoïden in verdere histologische analyses of vries ze onmiddellijk in vloeibare stikstof in met behulp van steriele DNA/RNA-vrije buisjes voor daaropvolgende DNA-, RNA- en eiwitisolatie en bewaar ze vervolgens bij -80 °C.
  12. Voor histologisch onderzoek fixeert u elke organoïde in 5 ml voorgekoeld (4 °C) 4% paraformaldehyde in PBS (aangepast aan neutrale pH) gedurende 45 minuten op ijs, gevolgd door PBS-wassen op RT (elk 2 x 5 minuten).
  13. Cryobescherm de gefixeerde organoïden met behulp van een sucrosegradiënt door de organoïden in glazen potten te plaatsen voor histologie. Incubeer de organoïden in 10% sucrose in PBS-oplossing gedurende 2 uur bij 4 °C, gevolgd door 20% sucrose/PBS gedurende 2 uur bij 4 °C en ten slotte 30% sucrose/PBS-incubatie 's nachts bij 4 °C. Vervang de sucroseoplossingen door eerst uit te pipetteren en vervolgens te vullen met de nieuwe oplossing.
  14. Veranker de organoïden in cryo-medium.
    1. Leg een koperen plaat op droogijs in een piepschuimdoos en laat 10 minuten afkoelen.
    2. Plaats vervolgens een plastic cryomal, voorgevuld met cryo-medium, op de koperen plaat en druk de organoïde voorzichtig met een pincet op de bodem van de cryomal. Wacht tot het cryomedium volledig is bevroren.
    3. Voor lange organoïden snijd je ze eerst doormidden met een scalpel en leg je de twee helften evenwijdig aan elkaar in de cryomal. Herhaal de procedure voor elke organoïde die bedoeld is om histologische analyse te ondergaan.
  15. Bewaar de monsters bij -20 °C tot cryosectie.
  16. Snijd met behulp van een cryotoom de organoïden in de lengterichting in stukken van 10 μm dik en onderhevig aan histologische kleuring zoals hematoxyline en eosine (H&E) volgens standaardprotocol8.

Resultaten

Het 3D T/L organoïdemodel is hier eerder vastgesteld en gedemonstreerd door commercieel aangekochte NHDF te implementeren (n=3, 3 organoïden per donor, NHDF werden gebruikt bij passages 5-8). De werkstroom van het model is samengevat in figuur 1. Figuur 2 toont representatieve fasecontrastbeelden van de NHDF-cultuur tijdens de pre-expansie in T-75 kolven (Figuur 2A) en aan het begin en na 5 dagen cultuur in de 2D-expansiestap in 10 cm celkweekschalen (Figuur 2B). Figuur 2C (representatieve fasecontrastbeelden) toont de samenvloeiing van NHDF's tijdens 2D-stimulatie na 14 dagen kweek in de 10 cm celkweekschaaltjes. Vervolgens werden de celvellen handmatig losgemaakt en tegelijkertijd gerold tot 3D-staafachtige organoïden (op dag 0 is de organoïde lengte ongeveer 6 cm, breedte ongeveer 0,4 cm), die gedurende 14 dagen onder 10 % statische spanning werden gekweekt (Figuur 3, dag 0 en dag 14, representatieve macroscopische beelden). Op dag 14 van het 3D-rijpingsproces vertoonden de organoïden een glinsterend wit uiterlijk, trokken ze samen en leken ze dichter dan de oorspronkelijke organoïden. Het natte gewicht van de organoïden werd gemeten op het moment van vorming (dag 0) en opnieuw op dag 14 van de 3D-rijpingsstap (Figuur 4). Er werd een significante vermindering van het natte gewicht waargenomen, wat wijst op contractie en structurele reorganisatie van de ECM binnen de organoïden gedurende de tijdspanne van deze protocolstap. Naast de gewichtsverandering nam door de samentrekking ook de organoïdelengte af (op dag 14 is de organoïdelengte ongeveer 3,5 cm en de breedte ongeveer 0,3 cm). In dit proces raakten de metalen pinnen los en moesten ze opnieuw worden vastgezet; daarom raden we aan om tijdens de 14 dagen van 3D-rijping de organoïden regelmatig te controleren. Om de morfologie van de organoïden te evalueren, werden longitudinale coupes verkregen van NHDF-organoïden die op dag 1 en dag 14 van de 3D-rijpingsstap waren verzameld en onderworpen aan H&E-kleuring (Figuur 5). Op dag 1 vertoonden de organoïden losgekoppelde lagen, voornamelijk samengesteld uit cellen omgeven door lage hoeveelheden ECM. Bovendien waren de cellen in de organoïdelagen niet uitgelijnd langs de longitudinale organoïde-as die werd gebruikt als richting voor de uitgeoefende statische trekbelasting. De NHDF-kernen vertoonden een ronde vorm met verschillende maten en vormen. H&E-analyse van organoïden op dag 14 onthulde een merkbare toename van het eosinesignaal, wat wijst op ECM-afzetting tijdens het 3D-rijpingsproces. Op dit tijdstip vertoonden de organoïden versmolten lagen, met gebieden die uitgelijnde cellen bevatten. Cellen waren vaak in groepen; Ze waren echter op sommige locaties ook georganiseerd in celrijen. De meeste kernen hadden een vergelijkbare grootte en waren soms langwerpig.

figure-results-1
Figuur 1: Cartoon van een 3D T/L organoïde model bestaande uit 3 stappen: 2D expansie, 2D stimulatie en 3D rijping. Aanvankelijk werden NHDF's vooraf geëxpandeerd in een T-75-kolf totdat ze 70%-80% samenvloeiing bereikten. Vervolgens werden NHDF's gekweekt met behulp van Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) laag glucosemedium in een celkweekschaal van 10 cm gedurende 5 dagen (2D-expansie). De cellen werden vervolgens gestimuleerd met DMEM high glucose medium aangevuld met ascorbinezuur gedurende 14 dagen kweek (2D-stimulatie). Vervolgens werden NHDF losgemaakt van de 10 cm hechtende schaal, gerold tot een 3D-staafachtige organoïde, overgebracht en gefixeerd in een 10 cm niet-hechtende celcultuurschaal gevuld met DMEM hoog glucosemedium aangevuld met ascorbinezuur en transformerende groeifactor bèta 3 (TGFß3) gedurende 14 dagen (3D-rijping). De gevormde 3D-organoïden kunnen een beoordeling ondergaan van nat gewicht, histologische evaluatie, RNA- en eiwitisolatie en andere analyses (bijv. transmissie-elektronenmicroscopie, biomechanische metingen) op verschillende tijdstippen, zoals dag 0, 1 en 14. De cartoon is gegenereerd in BioRender-software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatieve fasecontrastbeelden van NHDF's tijdens pre-expansie, 2D-expansie en 2D-stimulatiestappen. (A) NHDF's tijdens pre-expansie in T-75-kolf. (B) NHDF's op dag 1 en 5 van de 2D-expansiestap in een celkweekschaaltje van 10 cm. (C) NHDF's op dag 1 en 14 van de 2D-stimulatiestap in een celkweekschaaltje van 10 cm. Schaal balken: 200 μm. De foto's werden gemaakt met een omgekeerde microscoop die was uitgerust met een camera met hoge resolutie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Bruto morfologie van NHDF 3D organoïden. Representatieve macroscopische beelden van NHDF-organoïden op dag 0 en 14 van de 3D-rijpingsstap. Schaal balk: 1 cm. De foto's zijn gemaakt met de camera van een mobiele telefoon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Analyse van het natgewicht van NHDF 3D-organoïden. De meting van het natte gewicht van organoïden was op dag 0 en dag 14, het einde van het 3D-rijpingsproces. De grafiek toont gemiddelde waarden en standaarddeviaties (NHDF n = 3, 3 organoïden/donor op dag 0 en 2 organoïden/donor op dag 14 vanwege 1 organoïde/donor genomen voor histologie op dag 1), elke stip vertegenwoordigt individuele organoïden, terwijl elke gekleurde vorm een andere individuele donor vertegenwoordigt. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie en er is een ongepaarde parametrische t-test gebruikt. Statistische verschillen: **p ≤0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Histologische analyse van NHDF 3D-organoïden. Representatieve beelden van met hematoxyline en eosine (H&E) gekleurde secties van NHDF-organoïden tijdens het 3D-rijpingsproces op dag 1 en 14. Rechter afbeelding - beelden met een lage vergroting, linker afbeelding - vergrote weergave met indicatoren als volgt: gele pijlen - niet-verbonden lagen; gele pijlpunten - kernen met verschillende maten en vormen; zwarte pijlen - gesmolten lagen en ECM-afzetting; zwarte pijlpunten - celrijen, kernen met vergelijkbare grootte en rek; zwarte sterren - cellen in groepen. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De resultaten die in deze studie zijn aangetoond, bieden waardevolle inzichten in de oprichting en karakterisering van het NHDF 3D-organoïdemodel voor het bestuderen van T/L-weefsels. Het 3-stappenprotocol leidde tot de vorming van 3D-staafachtige organoïden die typische kenmerken van de T/L-niche vertonen. Dit model werd eerder gerapporteerd in Kroner-Weigl et al. 20237 en hier tot in detail gedemonstreerd.

De fasecontrastbeelden in figuur 2 toonden de progressie van de NHDF-samenvloeiing en plaatvorming tijdens de expansie- en stimulatiestappen. Het 3D-rijpingsproces werd uitgevoerd door de celvellen handmatig tot 3D-staafachtige organoïden te rollen, die vervolgens gedurende 14 dagen onder statische spanning werden gekweekt. De organoïden vertoonden een glinsterend wit uiterlijk en een verhoogde dichtheid op dag 14, wat wijst op samentrekking en structurele reorganisatie binnen de organoïden. Dit gaf aan dat de rijpingsperiode van cruciaal belang is voor het bereiken van een meer georganiseerde en T/L-weefselnabootsende structuur.

Bovendien bleek uit de gewichtsanalyse dat het natte gewicht van organoïden tussen dag 0 en 14 aanzienlijk afnam, wat opnieuw wijst op een aanzienlijke samentrekking en ECM-reorganisatie binnen de organoïden tijdens het rijpingsproces. Belangrijk is dat metingen van nat gewicht kunnen variëren tussen experimenten als gevolg van hantering en restmedium in de organoïde of in de schalen. Bovendien kan de organoïde in het begin meer medium bevatten omdat, zoals hieronder wordt besproken, op dag 0 de lagen die worden gevormd door het rollen van het celvel zijn gescheiden en niet zijn versmolten. Na verloop van tijd voegden de lagen zich samen en werden ze compacter, en zo kon het medium worden geëxtrudeerd.

Morfologische evaluatie door H&E-kleuring leverde extra inzichten op in de structurele kenmerken van de organoïde. Op dag 1 vertoonden de organoïden losgekoppelde lagen, voornamelijk samengesteld uit cellen met ronde kernen omgeven door dunne pericellulaire ECM. Het gebrek aan celuitlijning parallel aan de as van de trekbelasting suggereerde dat verdere rijping nodig is om een meer georganiseerde cellulaire en ECM-architectuur van de organoïden te bereiken. Ondanks de contractie en de vermindering van het gewicht en de afmetingen van de organoïde tussen dag 1 en 14, vertoonde de H&E-kleuring een toename van eosine-positieve gebieden, wat wijst op een verhoogde ECM-afzetting. Bovendien waren er geen lagen meer zichtbaar en af en toe hadden de cellen langwerpige kernen en waren ze in parallelle celrijen geplaatst. Dit wees erop dat de cellen in de organoïden zelforganisatie ondergaan door hun eigen rangschikking te veranderen, evenals ECM-afzetting, structuur en uitlijning, waardoor het gedrag van de natuurlijke T/L-weefselvorming wordt nagebootst.

Over het algemeen benadrukken deze bevindingen het potentieel van het NHDF-organoïdemodel als een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van T/L-biologie, in vitro tenogenese en zelfs voor de verdere ontwikkeling van steigervrije T/L-engineering. Er zijn echter drie cruciale stappen voor een succesvolle omgang met het 3D-organoïdemodel: 1) De vorming van een strakke celplaat tijdens de 2D-stimulatiefase van het protocol. Bij het gebruik van primaire cellen hangt dit voornamelijk af van de eigenschappen van de donorcellen; Daarom is het belangrijk om meerdere donoren parallel te beoordelen; 2) Het handmatig walsen van de celplaat. Dit vereist het snel, maar tegelijkertijd voorzichtig rollen van het celvel met behulp van een celschraper. Daarom is het raadzaam om de eerste organoïden te plannen om deze procedure eerst te trainen; en 3) De stabiele fixatie van de pinnen aan de randen van de organoïde. Deze fixatie zorgt voor axiale rek van de organoïde en voorkomt misvormingen en het instorten tot een klompachtige structuur. Bovendien kunnen de pinnen tijdens de 3D-rijpingsfase, aangezien de organoïden hermodellering van de ECM ervaren, plotseling loskomen, daarom is het belangrijk om elke organoïde regelmatig te controleren en de pinnen opnieuw te bevestigen.

Het huidige model heeft nog niet het niveau bereikt van in vivo nabootsing van T/L-weefsel en heeft een aantal beperkingen. Het vereist bijvoorbeeld een groot aantal cellen per organoïde en 35 dagen om de procedure te voltooien, terwijl de meeste differentiatieprotocollen, zoals het 3D-chondrogene pelletmodel, zijn ingesteld op 21 dagen22. De wasstappen in de protocolprocedure moeten bij voorkeur worden uitgevoerd met een fysiologisch uitgebalanceerde wasbuffer, bijvoorbeeld Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) of Earles Balanced Salt Solution (EBSS), in plaats van PBS, dat metabole gevolgen kan hebben voor primaire menselijke cellen die in vitro worden gekweekt. Wat betreft het kweekmedium dat wordt gebruikt in de 2D-stimulatie- en 3D-rijpingsfasen in de organoïde, is gekozen voor DMEM plus 10% FBS-formulering omdat dit de basis is van algemeen aanvaarde differentiatieprotocollen en met de bedoeling om verschillende celtypen te standaardiseren en te vergelijken op hun organoïdogene eigenschappen23. De reproductie van het 3-stappenprotocol in verschillende laboratoriumomgevingen kan worden beïnvloed door het gebruikte celtype, de celkwaliteit en -passage, evenals de eigenschappen van donorafhankelijke cellen. Variaties in de apparatuur, met name in de kwaliteit van de 10 cm celkweekschaaltjes24 die tijdens de 2D-stimulatiefase worden gebruikt, kunnen mogelijk van invloed zijn op de robuustheid van de celplaatvorming. Bovendien kan door ECM-contractie tijdens de 3D-rijping de axiale fixatie van de organoïden via pinnen losser worden; Daarom, zoals hierboven vermeld, wordt frequente controle aanbevolen. Het testen en selecteren van verschillende pinnen in termen van diameter en sterkte kan ook het risico op losraken van de pin verminderen25. Het gebruik van pinnen voor handmatig rekken is echter niet robuust en het is vatbaar voor variabiliteit bij het hanteren; Daarom is het van groot belang om in vervolgonderzoek een klemmechanisme te ontwikkelen voor het vasthouden van de organoïderanden, wat niet alleen kan resulteren in standaardisatie van deze stap, maar ook dynamisch rekken van de organoïden mogelijk kan maken. In het algemeen zal het interessant zijn om twee manieren van modelmodificatie van organoïden te onderzoeken, één verkleining - om het aantal cellen per organoïde en de proceduretijd te verminderen, waardoor het gebruiksvriendelijker wordt, vooral voor in vitro studies; en de tweede opschaling - om de afmetingen van de organoïden te vergroten om hun gedrag in grote diermodellen te testen als mogelijke peesvervangingsstrategie.

Het hier gedemonstreerde model kan een platform bieden voor het onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan peesontwikkeling, pathofysiologie en misschien herstel en regeneratie als de organoïden worden gecombineerd met verschillende celtypen en worden onderworpen aan microrupturen. Het is belangrijk om te vermelden dat de studie van Kroner-Weigl et al. 20237 verschillende beperkingen heeft geïdentificeerd met betrekking tot het NHDF-celtype, namelijk dat de door NHDF's gevormde organoïden groter en celleliger zijn dan die afgeleid van T/L-cellen, waardoor het een uitdaging is om celproliferatie en gedrag te beheersen. Met betrekking tot celapoptose toonde de op terminale deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) gebaseerde test geen bewijs van dode cellen in de organoïde op dag 147, wat wijst op een passende diffusie van voedingsstoffen, afval en zuurstof tijdens de 3D-rijpingsstap. Interessant is dat, ondanks de morfologische verschillen, pilotscreening door kwantitatieve PCR van een aantal T/L-gerelateerde genen (waaronder verschillende collageentypes, Scleraxis (SCX), Mohawk (MKX), enz.) vergelijkbare genexpressie suggereerde tussen NHDF- en T/L-organoïden7, een bevinding die verder moet worden onderzocht en ook op eiwitniveau moet worden gevalideerd. Daarom is voor dit celtype verdere optimalisatie nodig om de T/L-differentiatie te ondersteunen en kan deze worden gebaseerd op het aanpassen van het medium dat wordt gebruikt in 2D-stimulatie- en 3D-rijpingsstappen (bijv. serumconcentratie, groeifactoren, vitamines), het verlengen van de rijpingstijd of zelfs het onderwerpen van de organoïden aan dynamische mechanische rek. Het ontwikkelen van het protocol zou de samenstelling, structurele en functionele eigenschappen van de organoïde verder kunnen verbeteren, waardoor het model de complexe in vivo T/L-weefselniche beter kan nabootsen. Bovendien kunnen alternatieve celbronnen worden onderzocht op hun vermogen om T/L-organoïden te vormen en of ze T/L-differentiatie kunnen ondergaan. Yan et al. 20209, gebruikten het 3D-organoïdemodel door jonge/gezonde en oude/degeneratieve peesstam-/voorlopercellen (Y-TSPC's en A-TSPC's) te gebruiken om cellulair gedrag in 3D te onderzoeken en of het peesvormend vermogen verandert bij T/L-veroudering. Ze meldden dat A-TSPC 3D-organoïden een slechte weefselmorfologie vertonen en dat de cellen binnenin een lagere proliferatiesnelheid hebben, maar een hogere apoptose parallel loopt met verhoogde niveaus van senescentie-gerelateerde markers9. Daarom is het T/L 3D-organoïdemodel een veelbelovend platform voor het bestuderen van moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij peesveroudering en kan het verder worden gebruikt om nieuwe farmacologische therapieën voor peesherstel en -regeneratie te testen. In een andere benadering implementeerden Chu et al. 2021 tandheelkundige follikelcellen (DFC's) in het 3D-organoïdemodel om hun ligamentogene differentiatie te beoordelen. Dit celtype vormde zeer goed georganiseerde organoïden, waardoor DFC's werden gesuggereerd als een aantrekkelijke celbron om te differentiëren in parodontaal ligament (PDL) weefsel, wat op zijn beurt een veelbelovende therapeutische strategie voor parodontitis zou kunnen ontwikkelen8.

In de toekomst zou het model nog complexer kunnen worden door verschillende celtypen (bijv. myofibroblasten, macrofagen) op te nemen, wat nieuwe inzichten kan bieden in celspecifiek gedrag en cellulaire overspraak binnen organoïden en kan bijdragen aan een beter begrip van T/L-biologie, fysiologie en pathofysiologie 8,9,16,26.

De 3D-organoïdemodellen hebben verschillende voordelen voor toepassingen in weefselmanipulatie en regeneratieve geneeskunde. Ze bootsen de cellulaire samenstelling en organisatie na, evenals cel-tot-cel en cel-tot-matrix interacties van menselijke weefsels, en bieden daarmee een fysiologisch relevant platform voor het bestuderen van ziektemechanismen en geneesmiddelreacties27. Organoïden kunnen worden gebruikt als een high-throughput screeningplatform om de effectiviteit maar ook de mogelijke bijwerkingen van verschillende geneesmiddelen te beoordelen en een betrouwbaar en goedkoop alternatief te bieden voor dierproeven. Bovendien maken ze directe vergelijkingen mogelijk tussen gezonde en zieke aandoeningen, waardoor de ontdekking van belangrijke moleculaire en cellulaire veranderingen die verband houden met diverse pathologieën, identificatie van biomarkers voor vroege opsporing van ziekten mogelijk wordt, evenals het vergemakkelijken van een beter begrip van ziektemechanismen en de ontwikkeling van gerichte therapieën28,29.

Alles bij elkaar hebben we de stappen van het eerder vastgestelde 3D T/L-organoïdemodel tot in detail gedemonstreerd, dat een veelbelovend platform biedt voor het bestuderen van T/L-weefselbiologie en in vitro tenogene processen van verschillende celtypen. Verdere implementatie, optimalisatie en onderzoek van dit model worden sterk aangemoedigd, omdat ze kunnen leiden tot het bevorderen van steigervrije T/L-engineeringstrategieën, die op hun beurt kunnen bijdragen aan het verbeteren van T/L-therapie.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

D.D. en S.M.-D. erkenning van de BMBF-subsidie "CellWiTaL: Reproduceerbare celsystemen voor geneesmiddelenonderzoek - overdracht van laagvrije laserprinten van zeer specifieke afzonderlijke cellen in driedimensionale cellulaire structuren" Voorstel Nr. 13N15874. D.D. en V.R.A. erkennen de EU MSCA-COFUND Grant OSTASKILLS "Holistische training van next-generation Osteoarthritis onderzoeken" GA Nr. 101034412. Alle auteurs zijn dankbaar voor mevrouw Beate Geyer voor haar technische assistentie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ascorbic acid  Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Duitsland  A8960
10 cm adherent cell culture dishSigma-Aldrich, Taufkirchen,Duitsland CLS430167
10 cm non-adherent petrischaal Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Duitsland CLS430591
Cryo-mediumTissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Nederland  4583
Cryomold standard Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Nederland4557
D(+)-Sucrose AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, DuitslandA2211
DMEM high glucose medium Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Duitsland DMEM-HA
DMEM low glucoseCapricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Duitsland  DMEM-LPXA
Fetaal bovien serumAnprotec, Bruckberg, Duitsland AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2 PromoCell, Heidelberg, Duitsland  C-23020
H&E staining kitAbcamab245880
Inverteer microscoop met hoge resolutie cameraZeissNAZeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM aminozuren Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Duitsland  NEAA-B
Metalen pinnen EntoSphinx, Pardubice, Tsjechië 04.31
Normale humane dermale fibroblasten PromoCell, Heidelberg, Duitsland C-12302
ParaformaldehydeAppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Duitsland A3813
Penicilline/streptomycine Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Duitsland15140122
Fosfaat bufferoplossing Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Duitsland P4417
TGFß3 R&D Systems, Wiesbaden, Duitsland  8420-B3
Trypsine-EDTA 0,05% DPBS Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Duitsland  TRY-1B

Referenties

  1. Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
  2. Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844(2020).
  3. Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
  4. Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
  5. Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299(2022).
  6. Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. Biologics for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).
  7. Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772(2023).
  8. Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
  9. Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406(2020).
  10. Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
  11. Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
  12. Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
  13. Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
  14. Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
  15. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  16. Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272(2018).
  17. Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047(2020).
  18. Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
  19. Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
  20. Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
  21. Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
  22. Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936(2019).
  23. Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
  24. Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
  25. Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
  26. Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
  27. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  28. Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
  29. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

3D organo demodelpeesorgano deligamentorgano detissue engineeringscaffold vrije engineeringmatrixdepositiemechanische stimulatietenogene differentiatie

Gerelateerde artikelen