Methodenartikel

Real-time High Throughput-techniek om de vorming van extracellulaire neutrofielen in menselijke neutrofielen te kwantificeren

DOI:

10.3791/66051

⸱

1 december 2023

 ,  , 
1Systemic Autoimmunity Branch, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS), National Institutes of Health (NIH)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een geautomatiseerde high-throughput methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te kwantificeren met behulp van het live cell analysesysteem, gekoppeld aan een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofielen zijn myeloïde afstammingscellen die een cruciaal onderdeel vormen van het aangeboren immuunsysteem. Het afgelopen decennium heeft extra sleutelrollen aan het licht gebracht die neutrofielen spelen in de pathogenese van kanker, auto-immuunziekten en verschillende acute en chronische ontstekingsaandoeningen door bij te dragen aan het initiëren en bestendigen van immuunontregeling via meerdere mechanismen, waaronder de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's), die structuren zijn die cruciaal zijn voor antimicrobiële afweer. Beperkingen in technieken om NET-vorming op een onbevooroordeelde, reproduceerbare en efficiënte manier te kwantificeren, hebben ons vermogen beperkt om de rol van neutrofielen in gezondheid en ziekten beter te begrijpen. We beschrijven een geautomatiseerde, real-time, high-throughput methode om neutrofielen te kwantificeren die NET-vorming ondergaan met behulp van een live cell imaging platform in combinatie met een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering met behulp van twee verschillende DNA-kleurstoffen om intracellulair en extracellulair DNA in beeld te brengen. Deze methodologie kan helpen bij het beoordelen van de fysiologie van neutrofielen en het testen van moleculen die zich kunnen richten op NET-vorming.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) zijn webachtige chromatinestructuren die uit neutrofielen worden geëxtrudeerd als reactie op verschillende ontstekingsstimuli. NET's zijn samengesteld uit DNA, histonen en verschillende antimicrobiële eiwitten/peptiden, die infectieuze ziekteverwekkers vangen en doden en ontstekingsreacties oproepen.

Hoewel NET's gunstig zijn voor de verdediging van de gastheer tegen ziekteverwekkers, hebben ze de aandacht getrokken als een potentiële aanjager van verschillende auto-immuunziekten2, trombose3, stofwisselingsziekten4 en gemetastaseerde groei van kankers5. Als zodanig is remming van NET-vorming een potentiële therapeutische optie voor deze ziekten. Ondanks enkele veelbelovende NET-gerichte moleculen in ontwikkeling6, is er nog steeds geen goedgekeurde therapie die specifiek op dit mechanisme van invloed is. Dit is, althans gedeeltelijk, toe te schrijven aan het ontbreken van objectieve, onbevooroordeelde, reproduceerbare en kwantificeringsmethoden met een hoge doorvoer voor NET-vorming.

We hebben een nieuwe methode ontwikkeld en gerapporteerd met behulp van een tweekleurig live-cell beeldvormingsplatform 7,8. Time-lapse-beelden van neutrofielen gekleurd met membraandoorlatende nucleaire kleurstof en membraanondoordringbare DNA-kleurstof worden geanalyseerd door de software en het aantal pre- en post-NET-vormende neutrofielen wordt op meerdere tijdstippen geteld. Aangezien de integriteit van het plasmamembraan verloren gaat tijdens NET-vorming door de regulatie van PKCα-gemedieerde Lamin B- en CDK4/6-gemedieerde Lamin A/C-demontage9, worden NET-vormende neutrofielen gekleurd door membraanondoordringbare DNA-kleurstof, terwijl gezonde neutrofielen dat niet zijn. Deze methode lost de problemen op van eerder gerapporteerde technieken om NET-vorming te kwantificeren en biedt onbevooroordeelde, high-throughput, reproduceerbare en nauwkeurige NET-kwantificering op een geautomatiseerde manier.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofielen van gezonde proefpersonen werden verkregen nadat geïnformeerde toestemming was gegeven volgens het door de National Institutes of Health (NIH) goedgekeurde protocol van de Institutional Review Board (IRB). Het protocol volgt de richtlijnen van de NIH-commissie voor ethiek van menselijk onderzoek.

1. Kleuring van de neutrofielen en voorbereiding van de testplaat

  1. Neem perifeer bloed af met de juiste schriftelijke geïnformeerde toestemming volgens de richtlijn van elk instituut en isoleer neutrofielen met behulp van elke gewenste methode. De Ficoll-dexter-methode10,11 is bijvoorbeeld een veelgebruikte methode voor het isoleren van neutrofielen uit menselijk perifeer bloed.
    OPMERKING: Hoewel de hier besproken methode menselijke neutrofielen gebruikt, kunnen neutrofielen van muizen ook worden geanalyseerd met behulp van een soortgelijk protocol.
  2. Resuspendeer neutrofielen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI; zie Tabel met materialen) 1640 medium bij 2,0 x 106 neutrofielen/ml en plaats neutrofielensuspensie in de centrifugebuis van 1,5 ml.
    OPMERKING: We voegen meestal geen foetaal runderserum (FBS) toe aan de kweekmedia omdat albumine in FBS NET-vorming12 kan verminderen en hittestabiele nuclease in FBS NET kan afbreken13.
  3. Voeg membraandoorlatende rode DNA-kleurstof toe (zie materiaaltabel) in een dosis van 1 μl per 1,5 ml neutrofielensuspensie.
  4. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Centrifugeer op 2500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.
  5. Resuspendeer neutrofielen in 1 ml RPMI, centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 2500 x g en verwijder supernatant. Herhaal 2x (wastotaal 3x).
  6. Resuspendeer neutrofielen in 1 ml RPMI en tel met behulp van een celteller. Verdun neutrofielensuspensie tot 1,5 x 105 neutrofielen/ml.
  7. Voeg 4 μl 1:100-voorverdunde, membraanondoordringbare groene DNA-kleurstof (zie materiaaltabel) toe per 1 ml neutrofielensuspensie.
  8. Doe 100 μl neutrofielensuspensie per putje in een heldere, met weefselkweek behandelde plaat met 96 putjes (zie materiaaltabel). Stel elke voorwaarde in drievoud in.
    OPMERKING: We hebben eerder aangetoond7 dat er geen verschil is in NET-vorming en -kwantificering met deze methode als neutrofielen worden geplaatst in platen met of zonder poly-L-lysinecoating. Daarom is het gebruik van een met weefselkweek behandelde plaat voldoende voor deze methode.
  9. Voeg 100 μL RPMI-bevattende stimulusreagentia toe met of zonder remmer, of een ander reagens dat van belang is in de respectieve putjes. Gebruik altijd positieve controleputjes door 500 nM phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) of 2,5 μM calciumionofoor (A23187) toe te voegen, hier werd 30 μM AKT-remmer gebruikt.
  10. Plaats de plaat in het levende celanalysesysteem (zie Materiaaltabel) dat is ondergebracht in een 5% CO2 -incubator.
    NOTITIE: Enkele minuten na deze stap kan er condensatie verschijnen aan de boven- en onderkant van de plaat. Dit kan een goede beeldvorming belemmeren. Veeg en verwijder condens grondig voordat u begint met scannen. Plaats de plaat in de machine, start de software, voer het scanprotocol in en veeg de plaat schoon vlak voor de eerste scan.

2. Scanplaat om NET-vormende neutrofielen te visualiseren

  1. Start de software (zie Materiaaltabel voor softwaredetails). Start Add Vessel door op + in de linkerbovenhoek te drukken.
  2. Kies Scannen volgens schema. Kies Nieuw.
    OPMERKING: Zodra dit is gemaakt, voert u hetzelfde scanprotocol uit door Vorige kopiëren te kiezen en opgeslagen protocol op het volgende scherm te selecteren.
  3. Kies Standaard. Stel scaninstellingen in als: Cel-voor-cel opties: Geen; Beeldkanalen: Fase, Groen (acquisitietijd: 200 ms), Rood (acquisitietijd: 400 ms); Objectief: 20x.
  4. Kies de plaat die wordt gebruikt uit de lijst. Selecteer de locatie van het vat waar u de plaat op de lade van het live cell imaging-systeem wilt plaatsen.
  5. Selecteer putjes waar monsters aanwezig zijn en bepaal hoeveel foto's je per put wilt maken. Genereer op basis van het aantal afbeeldingen per putje een geschatte scanduur voor de plaat. Meestal zijn 4 beelden per put voldoende; Dit kan echter variëren afhankelijk van de omstandigheden en de frequentie van scans.
  6. Voer de informatie van elk putje in (bijv. celtype en verbinding) door te klikken op Plaatkaart maken om een naam voor het onderzoek op te geven.
    OPMERKING: De plaatkaart kan van tevoren worden voorbereid en opgeslagen met behulp van de plaatkaarteditor in de software. De opgeslagen plaatkaartgegevens kunnen tijdens deze stap worden geïmporteerd. Indien gewenst kan het invoeren van plaatkaartinformatie worden overgeslagen en later worden uitgevoerd. Gegevens kunnen ook worden verkregen zonder informatie over de lay-out van de plaat in te voeren. Het wordt echter aanbevolen om plaatinformatie in te voeren om de daaropvolgende analyse te vergemakkelijken.
  7. Selecteer in het volgende scherm Basisanalysator als analysetype en kies Analyseprotocol in de vervolgkeuzelijst, waarin eerder gebruikte analysedefinities worden weergegeven (geen scanprotocollen). Spectrale ontmenging voor zowel groen als rood kan op 0,0 % worden gelaten.
    OPMERKING: Deze stap kan desgewenst worden overgeslagen.
  8. Scan plannen. Voor het experiment hier, scan elke 15-20 min gedurende 8 uur . Stel de starttijd van de scan in door de witte en grijze balk boven aan het scherm te slepen.
    NOTITIE: Vermijd te vaak scannen, anders werkt de machine mogelijk niet goed door oververhitting. De scantijd mag niet langer zijn dan 12 uur per 24 uur. Mogelijk ziet u een waarschuwing als er te vaak wordt gescand.
  9. Controleer de scaninstelling op het volgende scherm en druk op Toevoegen aan schema om te beginnen met scannen. Wacht tot de eerste set afbeeldingen is gescand om te bevestigen of alles goed werkt.
    1. Soms zijn cellen niet goed gefocust. Controleer in dat geval of er condens aanwezig is (en veeg dienovereenkomstig af), of de plaat correct op de bak is geplaatst, of de positie van de plaat correct is gespecificeerd, enz. Als de cellen nog steeds drijven en niet op de bodem van de put zijn neergedaald, wacht dan ongeveer 5 minuten voordat u gaat scannen.

3. Vaststelling van de analysedefinitie om NET's te kwantificeren

  1. Open het onderzoek (vat) dat moet worden geanalyseerd op het tabblad Weergave. Druk op Analyse starten aan de linkerkant van het scherm. Kies Nieuwe analysedefinitie maken.
    1. Als er eerder een analyse is uitgevoerd, gebruikt u dezelfde analysedefinitie met kleine wijzigingen door Bestaande analysedefinitie kopiëren te selecteren. Ga in dit geval naar stap 3.3. Als u de analyse zonder enige wijziging gebruikt, selecteert u Bestaande analysedefinitie gebruiken; Dit wordt niet aanbevolen omdat het fluorescentieniveau kan variëren tussen testen op verschillende dagen, en er zijn meestal enkele kleine correcties nodig.
  2. Selecteer Basic Analyzer. Gebruik alle afbeeldingskanalen: Fase, Groen, Rood en Overlapping.
    OPMERKING: Hoewel we meestal groene en rode objectmaskers gebruiken om NET's te tellen, is overlappend objectmasker handig wanneer vuil belangrijk is. In dergelijke gevallen wordt het aantal overlappende objecten gebruikt als tellers in plaats van het aantal groene objecten (zie stap 3.9). Als overlappende objecten worden geteld in plaats van groene objectentelling, moeten alle rode signalen correct worden geteld. Pas de instelling van het rode signaal aan om alle rode objecten met een laag rood signaal te tellen in foto's die op latere tijdstippen zijn gemaakt, maar niet om vuil te tellen.
  3. Kies 6 - 8 representatieve voorbeeldafbeeldingen voor training. Voeg hier de volgende afbeeldingen toe voor het experiment:
    Beelden gemaakt tussen 0 en 20 minuten om de instelling van het groene signaal te optimaliseren om te compenseren voor subtiele groene signalen die kunnen worden gegenereerd in niet-NET-vormende neutrofielen
    Beelden van maximale NET's met positieve controle, genomen tussen 3-6 uur (tijd varieert afhankelijk van de gebruikte stimulatie) om de groene signaalinstelling te optimaliseren om NET-vormende neutrofielen te definiëren
    Foto's gemaakt rond het tijdstip van 1 uur om het totale aantal cellen te tellen (gekleurd met rode kleurstof), aangezien het nucleaire rode signaal het sterkst is rond het tijdstip van 1 uur (wanneer alle cellen zich op de bodem van de put hebben gevestigd) en geleidelijk afneemt als gevolg van celdood.
    Afbeeldingen die puin bevatten, om uit te sluiten dat ze worden geteld.
  4. Stel de analysedefinitie in. Rode objecten en groene objecten corresponderen met kernen van respectievelijk alle neutrofielen en neutrofielen die NET's vormen. Begin met het volgende voorbeeld van en druk op Voorbeeld van huidig of Alles bekijken en moduleer elke parameter om de resultaten te optimaliseren:
    Voor Groen: Segmentatie - Achtergrond aftrekken: Hoge hoed; Straal: 100 μM; Drempelwaarde: 0,3 GCU; Rand splitsen: Aan; Randgevoeligheid: -20; Opruimen - Gaten vullen: 100 μm2; Pas de grootte van 0 pixels aan; Filters- Oppervlakte: min 20 μm2, max 500 μm2; Excentriciteit: max 0,97; Gemiddelde intensiteit: min 1.00
    Voor rood: segmentatie - achtergrondaftrekking: hoge hoed; Straal: 10 μM; Drempelwaarde: 1.0 GCU; Rand splitsen: AAN; Randgevoeligheid: -50; Cleanup-Hole vulling: 50 μm2; Pas de grootte van 0 pixels aan; Filters- Oppervlakte: min 20 μm2, max 400 μm2; Gemiddelde intensiteit: min 1,5.
    1. Als er een overmatig groen signaal verschijnt in neutrofielen die geen NET's zouden moeten vormen (bijv. niet-gestimuleerde neutrofielen na 0 min met gelobde kernen), kan dit te wijten zijn aan overloop van het rode signaal dat in het groene kanaal wordt gedetecteerd. Ga in dat geval terug naar stap 3.1, open Afbeeldingslagen aan de linkerkant van het scherm en verwijder de rode signalen van het groene kanaal met behulp van Spectral Unmixing.
    2. Een andere optie is om een putje in te stellen voor enkelvoudige kleuring met nucleaire rode kleurstof om te verduidelijken hoeveel van het rode signaal uit het groene kanaal moet worden verwijderd. Aan de andere kant heeft het groene signaal dat in het rode kanaal bloedt meestal geen invloed op de analyses.
      OPMERKING: Het maakt niet uit of de gevoeligheid voor een rood signaal laag is en niet alle rode signalen worden vastgelegd in de beelden die op latere tijdstippen worden gemaakt (bijv. 6 uur). Het maximale aantal rode objecten in elke afbeelding wordt beschouwd als het totale aantal neutrofielen in de afbeelding en wordt gebruikt als noemer bij stap 3.9. Gewoonlijk pieken nucleaire rode signalen rond het tijdstip van 1 uur en nemen ze geleidelijk af als gevolg van celdood (Figuur 1B). Pas daarom de instelling van het rode signaal aan om rode objecten in de afbeeldingen met maximale rode signalen correct te tellen.
  5. Selecteer scantijden en putjes die moeten worden geanalyseerd. Gewoonlijk moeten alle tijdstippen en putten worden geanalyseerd. Geef een label op voor de analysedefinitie.
  6. Controleer de samenvatting en start de analyse. Het duurt een paar uur voordat de analyse is voltooid (de duur is afhankelijk van het aantal tijdstippen en putten). Eenmaal gestart, wordt de naam van de analysedefinitie weergegeven onder de naam van het onderzoek op het tabblad Weergave en wordt de volledige datum weergegeven wanneer het is voltooid.
  7. Nadat het is voltooid, opent u het geanalyseerde onderzoek door te dubbelklikken op de naam van de analysedefinitie. Open Lagen aan de linkerkant van het scherm en controleer of elke cel correct is gemarkeerd. Als het niet correct is gemarkeerd, gaat u terug naar stap 3.1 en herhaalt u de volgende stappen.
  8. Klik op Grafiekstatistieken aan de linkerkant van het scherm om de gegevens te exporteren. Selecteer Groen aantal, Rood aantal of Aantal overlappingen (per afbeelding) en kies vervolgens de tijdstippen en putten die u wilt exporteren. Selecteer voor het selecteren van groepering de optie Plaatkaartreplicaten als alle putten correct zijn opgegeven wanneer het scannen is voltooid.
  9. Exporteer de gegevens. Bereken het percentage NET-vormende cellen voor elke voorwaarde/elk tijdstip met behulp van de volgende vergelijking met behulp van geschikte software.
    figure-protocol-1
    OPMERKING: De reden waarom de noemer het maximale aantal rode objecten is, is dat het aantal rode objecten piekt rond 1 uur en geleidelijk afneemt als gevolg van de celdood.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methode biedt fasecontrast, rood fluorescerende (membraandoorlatende kleurstof) en groen fluorescerende (membraanondoordringbare kleurstof) beelden die op elk tijdstip zijn gemaakt. Samen met het NET-vormingsproces worden morfologische veranderingen waargenomen in fasecontrast en rode fluorescerende beelden, en zodra het membraan is doorbroken, kan groene fluorescentie worden waargenomen (Figuur 1). In deze test zijn NET-vormende neutrofielen over het algemeen rond, in plaats van een we...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige methoden om NET's ex vivo te kwantificeren hebben verschillende nadelen die ons vermogen beperken om neutrofielen, NET's en potentiële therapeutische doelen op een onbevooroordeelde en high-throughput manier te bestuderen10,14. Het direct tellen van NET-vormende cellen na immunofluorescerende kleuring, dat wordt beschouwd als de gouden standaard voor het kwantificeren van NET's, heeft bijvoorbeeld een lage doorvoer en is afhankelijk van de sub...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken de Light Imaging Section van het Office of Science and Technology van het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases van de National Institutes of Health. Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramural Research Program van het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases van de National Institutes of Health (ZIA AR041199).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AKT-remmerCalbiochem124028
Doorzichtige 96-wellsplaatCorning3596
Systeem voor analyse van levende cellenSartoriusN/AIncucyte Software (v2019B)
Membraan-impermeable DNA groene kleurstof Thermo Fisher ScientificS7020
Nucleaire rode kleurstofEnzoENZ-52406Neutrofielpellet wordt blauwachtig na kleuring.
RPMIThermo Fisher Scientific11835030RPMI met fenolrood kan worden gebruikt.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).
  3. Wagner, D. D., Heger, L. A. Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).
  4. Njeim, R., et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).
  5. De Meo, M. L., Spicer, J. D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Semin Immunol. 57, 101595(2021).
  6. Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations. J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).
  7. Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
  8. Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method. Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).
  9. Singh, J., et al. Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control. Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).
  10. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Induction and quantification of NETosis. Curr Protoc Immunol. 115, 14.41.11-14.41.14 (2016).
  11. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. J Vis Exp. (175), 62837(2021).
  12. Neubert, E., et al. Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Front Immunol. 10, 12(2019).
  13. von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
  14. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
  15. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

NET vorminghigh throughput kwantificeringlive cell imagingdubbele DNA kleuringenmembraanpermeabiliteitfasecontrastbeeldvormingdrugscreeninggeautomatiseerde analyse

Gerelateerde artikelen