Real-time High Throughput-techniek om de vorming van extracellulaire neutrofielen in menselijke neutrofielen te kwantificeren

Summary

We presenteren een geautomatiseerde high-throughput methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te kwantificeren met behulp van het live cell analysesysteem, gekoppeld aan een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering.

Abstract

Neutrofielen zijn myeloïde afstammingscellen die een cruciaal onderdeel vormen van het aangeboren immuunsysteem. Het afgelopen decennium heeft extra sleutelrollen aan het licht gebracht die neutrofielen spelen in de pathogenese van kanker, auto-immuunziekten en verschillende acute en chronische ontstekingsaandoeningen door bij te dragen aan het initiëren en bestendigen van immuunontregeling via meerdere mechanismen, waaronder de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's), die structuren zijn die cruciaal zijn voor antimicrobiële afweer. Beperkingen in technieken om NET-vorming op een onbevooroordeelde, reproduceerbare en efficiënte manier te kwantificeren, hebben ons vermogen beperkt om de rol van neutrofielen in gezondheid en ziekten beter te begrijpen. We beschrijven een geautomatiseerde, real-time, high-throughput methode om neutrofielen te kwantificeren die NET-vorming ondergaan met behulp van een live cell imaging platform in combinatie met een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering met behulp van twee verschillende DNA-kleurstoffen om intracellulair en extracellulair DNA in beeld te brengen. Deze methodologie kan helpen bij het beoordelen van de fysiologie van neutrofielen en het testen van moleculen die zich kunnen richten op NET-vorming.

Introduction

Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) zijn webachtige chromatinestructuren die uit neutrofielen worden geëxtrudeerd als reactie op verschillende ontstekingsstimuli. NET's zijn samengesteld uit DNA, histonen en verschillende antimicrobiële eiwitten/peptiden, die infectieuze ziekteverwekkers vangen en doden en ontstekingsreacties oproepen^.

Hoewel NET's gunstig zijn voor de verdediging van de gastheer tegen ziekteverwekkers, hebben ze de aandacht getrokken als een potentiële aanjager van verschillende auto-immuunziekten², trombose³, stofwisselingsziekten

Protocol

Neutrofielen van gezonde proefpersonen werden verkregen nadat geïnformeerde toestemming was gegeven volgens het door de National Institutes of Health (NIH) goedgekeurde protocol van de Institutional Review Board (IRB). Het protocol volgt de richtlijnen van de NIH-commissie voor ethiek van menselijk onderzoek.

1. Kleuring van de neutrofielen en voorbereiding van de testplaat

1. Neem perifeer bloed af met de juiste schriftelijke geïnformeerde toestemming volgens de richtlijn van elk instituut en isoleer neutrofielen met behulp van elke gewenste methode. De Ficoll-dexter-methode^10,11

Results

Deze methode biedt fasecontrast, rood fluorescerende (membraandoorlatende kleurstof) en groen fluorescerende (membraanondoordringbare kleurstof) beelden die op elk tijdstip zijn gemaakt. Samen met het NET-vormingsproces worden morfologische veranderingen waargenomen in fasecontrast en rode fluorescerende beelden, en zodra het membraan is doorbroken, kan groene fluorescentie worden waargenomen (Figuur 1). In deze test zijn NET-vormende neutrofielen over het algemeen rond, in plaats van een we.......

Discussion

De huidige methoden om NET's ex vivo te kwantificeren hebben verschillende nadelen die ons vermogen beperken om neutrofielen, NET's en potentiële therapeutische doelen op een onbevooroordeelde en high-throughput manier te bestuderen^10,14. Het direct tellen van NET-vormende cellen na immunofluorescerende kleuring, dat wordt beschouwd als de gouden standaard voor het kwantificeren van NET's, heeft bijvoorbeeld een lage doorvoer en is afhankelijk van de sub.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AKT inhibitor	Calbiochem	124028
Clear 96-well plate	Corning	3596
Live cell analysis system	Sartorius	N/A	Incucyte Software (v2019B)
Membrane-impermeable DNA green dye	Thermo Fisher Scientific	S7020
Nuclear red dye	Enzo	ENZ-52406	Neutrophil pellet becomes bluish after staining.
RPMI	Thermo Fisher Scientific	11835030	Phenol red containig RPMI can be used.