Goedkope kleurstoffen gebruiken om glycogeenaccumulatie en darmintegriteit bij Caenorhabditis elegans te visualiseren

Samenvatting

Het onderwijs in biologische wetenschappen kan voor studenten stimulerender worden gemaakt door het gebruik van experimenten. Dit manuscript presenteert twee verschillende maar complementaire protocollen die in de klas kunnen worden gebruikt om studenten aan te moedigen hypothesen te formuleren en te testen met betrekking tot calorierijke diëten, uithongering en veroudering.

Samenvatting

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een transparante, niet-parasitaire nematode met een eenvoudige biologie, waardoor het een geweldig hulpmiddel is voor het onderwijs in de biologische wetenschappen door de kleuring van de cellen of hun moleculaire inhoud. Lugol-kleurstof (jodium-kaliumjodide-oplossing) wordt veel gebruikt in de biochemie om glycogeenvoorraden te kleuren. In deze context is het mogelijk om verschillen waar te nemen tussen gevoede en uitgehongerde dieren, naast de effecten van verschillende omstandigheden, zoals verschillende diëten en zuurstofniveaus. Erioglaucine is een blauwe kleurstof die het verlies van de darmbarrière aangeeft. Wanneer de darmbarrière intact is, kleurt de blauwe kleurstof in het lumen; Wanneer deze integriteit echter wordt verstoord, lekt de kleurstof in de lichaamsholte. Met behulp van een stereomicroscoop of een microscoop kunnen leraren fysiologische en biochemische veranderingen aantonen, of ze kunnen studenten aanzetten tot het stellen van een wetenschappelijke vraag en het veronderstellen en testen van hun hypothese met behulp van deze tests. Dit protocol beschrijft twee kleuringstechnieken bij C. elegans die gemakkelijk door studenten kunnen worden uitgevoerd.

Inleiding

Lesgeven in biologische wetenschappen op de middelbare school is een voortdurende uitdaging. Met name de toegang tot en het gebruik van technologie hebben belangrijke vooruitgang geboekt in het onderwijsleerproces, maar tools zoals chatbots met kunstmatige intelligentie maken het rationaliseren en zoeken naar bewijs moeilijker vanwege gemakkelijke (en soms onjuiste) antwoorden die worden verkregen¹. Daarom is het gebruik van een wetenschappelijke methode met praktische experimenten in een onderzoekende benadering in de klas een belangrijke strategie om kritisch denken, creativiteit en technische vaardigheden bij de leerlingen te ontwikkelen of te stimuleren².

In deze context is de vrijlevende nematode Caenorhabditis elegans met succes gebruikt in experimenten voor onderwijsdoeleinden³ vanwege de bijzondere voordelen: het is geen parasiet en de Escherichia coli die voor voeding wordt gebruikt, is bioveiligheidsniveau-1, waardoor het biologische gevaar bijna nul is; Het heeft een elegante en kwantificeerbare voortbewegingsbeweging, die interessant is voor studenten om te observeren; En het is transparant, wat orgaanobservatie mogelijk maakt, maar ook kleuring met pigmenten die kunnen wijzen op de aanwezigheid van biomoleculen of het optreden van fysiologische veranderingen⁴. Daarom is het mogelijk om in de klas eenvoudige stellingen te veronderstellen en te testen die verband houden met biochemie en fysiologische veranderingen zoals veroudering.

Glycogeen is een opslagkoolhydraat, gevormd door een lange en vertakte keten van glucosemoleculen gevormd door glucosylresiduen met (1→4)-α glycosidische lineaire bindingen en (1→6)-α glycosidische bindingen op vertakkingspunten en is vooral belangrijk voor spiercontractie, celdifferentiatie^{en behoud van} glycemie. Glycogeen wordt gesynthetiseerd na het voeden als gevolg van insuline-activering van het enzym glycogeen-synthase. Tijdens inspanning of vasten activeren respectievelijk epinefrine of glucagon glycogeenfosforylase en breken daardoor het polysacharide af om glucose-6-fosfaat aan de spiercellen te leveren of vrije glucose vrij te geven om hypoglykemie te omzeilen ^6,7. Veranderingen in glycogeenspiegels beïnvloeden celdifferentiatie, signalering, redoxregulatie en stamvorming onder verschillende fysiologische en pathofysiologische omstandigheden, waaronder kanker⁸. Bij C. elegans wordt glycogeen vooral aangetroffen in de slokdarmspier, hypodermis, darm, neuronen en vooral in de lichaamswandspieren⁹. Het glycogeengehalte kan worden gemeten met behulp van de jodiumoplossing van Lugol, aangezien jodium zich bindt aan de spiraalvormige spoelen en een jodium-glycogeencomplex vormt, waardoor een zichtbare scherpe blauwzwarte of bruinzwarte kleur ontstaat, die met succes is gebruikt om het glycogeengehalte in C. elegans¹⁰ aan te tonen. Het is aangetoond dat glycogeenophoping veroorzaakt door voeding met veel glucose de levensduur van wormen kan verkorten, waardoor het verouderingsproces wordt versneld ^11,12. Bovendien kunnen metabole stoornissen, andere hormonen en blootstelling aan xenobiotica ook het glycogeenmetabolisme veranderen^13,14. Daarom is experimenteren met het glycogeengehalte in C. elegans best interessant, omdat verschillende factoren het metabolisme kunnen verstoren en een klassikale discussie kunnen stimuleren over basisbiochemie die verband houdt met transversale thema's zoals lichaamsbeweging, diëten, ziekten en veroudering.

Veroudering is een tijdsafhankelijke functionele achteruitgang die wordt veroorzaakt door cellulaire schade. Deze schade kan in verband worden gebracht met oxidatieve stress, telomeerslijtage, verlies van proteostase, ontsteking en zelfs door ophoping van onoplosbare polyglucosanlichamen¹⁵, om er maar een paar te noemen. Een van de kenmerken van veroudering is de vermindering van de darmintegriteit, geassocieerd met verschillende chronische aandoeningen die zich voordoen tijdens het leven van een organisme¹⁶. Behoud van intestinale homeostase hangt af van de integriteit van het darmepitheel, dat wordt ondersteund door junctionele eiwitten die een fysieke barrière vormen en aangrenzende epitheelcellen met elkaar verbinden. Wanneer er schade is aan dit epitheel, treedt lekkage van luminale inhoud in het interstitium op¹⁷. Op basis van dit mechanisme is de smurfentest gebruikt om de darmintegriteit in verschillende diermodellen te verifiëren, aangezien deze blauwe kleurstof Erioglaucine dinatriumzout het darmmembraan niet passeert en in het lumen¹⁸ blijft. Wanneer wormen zijn geïnfecteerd met een ziekteverwekker, besmet met sommige giftige stoffen of ouderdom, waardoor de interstitiële integriteit verandert, passeert de kleurstof de barrière en verspreidt zich over de worm, die helemaal blauw wordt. Deze test maakt het mogelijk om te discussiëren over de fysiologie van veroudering en te experimenteren met factoren die dit proces kunnen versnellen of vertragen door wormen bloot te stellen aan verschillende omstandigheden. De protocollen hier beschrijven in detail deze twee, op kleurstof gebaseerde methoden die gemakkelijk in de klas kunnen worden gedaan om studenten aan te zetten en te stimuleren om hypothesen met betrekking tot biochemie en fysiologie te formuleren en te testen.

Het eerste deel van het protocol toont de toepasbaarheid ervan om het glycogeengehalte in C. elegans model¹⁰ kwalitatief en kwantitatief te analyseren. Het doel van het tweede deel van het protocol is om de integriteit van de darm van C. elegans te beoordelen. Deze techniek maakt het mogelijk om de veroudering van C. elegans te monitoren door de integriteit van de darmmembranen te evalueren. Bovendien kan worden beoordeeld of een stof veroudering versnelt of vertraagt en of er stoffen zijn die toxisch potentieel hebben voor de darmbarrière¹⁹.

De C. elegans-stam die voor de huidige studie werd gebruikt, was Bristol N2 wildtype. De procedure kan echter worden gerepliceerd met behulp van stammen die vergelijkbare groeisnelheden vertonen, of de methode moet worden aangepast op basis van de noodzaak van vervanging van de apparatuur, aangezien ze dezelfde of een vergelijkbare functie hebben, of, afhankelijk van de gebruikte stam, aangezien bepaalde stammen specifieke onderhouds- en/of gevoeligheidsvereisten hebben; deze informatie kan worden verkregen van het Caenorhabditis Genetics Center (CGC) of de website van WormBase. Deze wijzigingen mogen geen invloed hebben op de reproduceerbaarheid van de methode.

Protocol

OPMERKING: Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) bacteriën en Bristol N2 wildtype stammen kunnen worden verkregen bij de CGC, Universiteit van Minnesota, VS of door donatie van een C. elegans laboratorium. Voor de veiligheid van onderzoekers is het absoluut noodzakelijk om persoonlijke beschermingsmiddelen te gebruiken. Hoewel de concentraties van reagentia zoals hypochloriet en natriumhydroxide laag zijn, is het essentieel om de aanbevolen persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen, zoals benadrukt in het manuscript, om mogelijke risico's in verband met deze chemicaliën te minimaliseren.

1. Glycogeengehalte

1. Voorbereiding van testplaten
   1. Bereid zes NGM-agarplaten van 60 mm x 15 mm²⁰ (10 ml nematodengroeimedia-agar, NGM, zoals beschreven in aanvullende tabel 1) per wormstam en laat ze 1 dag bij kamertemperatuur drogen. Houd de platen gesloten om besmetting te voorkomen.
   2. Voeg 200 μL E. coli OP50 vloeibare cultuur (met een optische dichtheid = 0,600, ongeveer bij een golflengte van 600 nm) per plaat toe om in totaal vier NGM-platen van 60 mm x 15 mm per stam in de stroomkap te inoculeren. Laat de gesloten platen voor gebruik 1 dag incuberen bij 37 °C.
      OPMERKING: Bereid zes platen voor (stap 1.1), maar inoculeer er slechts 4 met E. coli OP50-bacteriën. Bewaar de overige twee borden bij 4 °C voor later gebruik wanneer u de wormen onder hongeromstandigheden plaatst. Deze analyse kan in tweevoud worden uitgevoerd.
   3. Voeg op de testdag 200 μL 0,025 M D-glucose toe aan twee (6 mm x 15 mm) NGM-agarplaten per stam die eerder waren gezaaid met E. coli OP50-bacteriën. Laat de platen op kamertemperatuur drogen in de doorstroomkap.
      OPMERKING: De NGM-agarplaten die zijn bezaaid met E. coli OP50-bacteriën kunnen ook in de buurt van alcohollampen worden gedroogd als alternatief voor het gebruik van een stroomkap.
2. Synchronisatie
   1. Breng ongeveer 3 dagen voor de synchronisatie 3-4 brokken (3 cm x 3 cm) over van een onderhouds-NGM-agar met C. elegans Bristol N2 (wildtype) in verschillende stadia (ongeveer 500 wormen per stuk) naar een nieuwe plaat (150 mm x 90 mm) die eerder is ingezaaid met E. coli OP50-bacteriën.
   2. Plaats de nieuwe plaat met wormen in een gecontroleerde omgeving bij 20 °C en houd de luchtvochtigheid gedurende 3 dagen >95% (72 uur laat de meeste wormen het drachtige volwassen stadium bereiken).
      OPMERKING: De groeitemperatuur moet mogelijk worden aangepast, afhankelijk van de C. elegans-stam (men) die worden gebruikt.
   3. Verzamel met een pasteurpipet de wormen van de voorbereide plaat met gedistilleerd H₂O en breng ze over in een centrifugebuis van 50 ml.
   4. Wacht op de bezinking van de wormen door de zwaartekracht (ongeveer 15 minuten) en verwijder dan het supernatant. Herhaal dit proces 3x om de bacteriën te elimineren. Verlaag na de laatste wasbeurt het volume tot 5 ml.
   5. Voeg 10 ml bleekoplossing toe (aanvullende tabel 1) en schud krachtig met de handen gedurende ongeveer 6 minuten.
   6. Onmiddellijk nadat het schudden is voltooid, vult u de buizen tot een capaciteit van 50 ml met M9-buffer.
   7. Centrifugeer op 1400 x g gedurende 3 minuten, verwijder het supernatans tot 5 ml en voeg dan opnieuw 45 ml M9-buffer toe. Herhaal dit proces 4x.
   8. Verminder na de laatste wasbeurt het volume tot 15 ml en houd het ongeveer 14 uur op een gecontroleerde temperatuur (20 °C) en vochtigheid (>95%).
      OPMERKING: Het synchronisatieproces kan worden vervangen door het verkrijgen van eieren door middel van ovipositie: Breng ongeveer 20 volwassen zwangere wormen over naar een NGM-plaat (6 mm x 15 mm) die eerder is bezaaid met 200 μL E. coli OP50. Laat de wormen 1 dag eieren leggen. Verwijder daarna de zwangere wormen en wacht tot de eieren uitkomen.
3. Bereiding van wormen
   1. Voeg met behulp van een automatische pipet 10 μl van de gesynchroniseerde wormen (stap 1.2.8) toe aan een microscoopglaasje en tel het aantal wormen. Bereken hoeveel volume er moet worden gepipetteerd om 500-1000 wormen/μL te verkrijgen.
   2. Breng 500-1000 gesynchroniseerde wormen van L1 (stap 1.2.8) over naar NGM-agarplaten (150 mm x 90 mm, aanvullende tabel 1) die zijn ingezaaid met E. coli OP50-bacteriën als voedselbron, totdat ze bij 20 °C het larvenstadium 4 (L4) bereiken.
      OPMERKING: Wormen kunnen worden overgebracht met behulp van een automatische pipet. Als er geen automatische pipet beschikbaar is, gebruik dan een glazen pasteurpipet en de volumes kunnen worden geregeld met behulp van microbuisetiketten of glazen maatpipetten.
   3. Na 48 uur synchronisatie²⁰: verzamel de L4-larven van de platen met M9-buffer (aanvullende tabel 1), met behulp van een plastic pasteurpipet op een schone conische buis 50 ml en was ze 3x met verse M9-buffer of herhaal de wasbeurten totdat alle resterende E. coli OP50-bacteriën volledig zijn verwijderd (bij kamertemperatuur).
      OPMERKING: De wasstap is belangrijk omdat sommige wormen tijdens de procedure verhongeren.
4. De test uitvoeren
   1. Breng 500-1000 L4-wormen over (stap 1.3.1) van elk van de nieuwe NGM-agarplaten (60 mm x 15 mm) die eerder zijn bereid (stappen 1.1.2 en 1.1.3). Houd ze 48 uur op 20 °C tot de testdag. Dit schema zal resulteren in drie experimentele groepen als volgt, in tweevoud (Figuur 1):
      A- (uithongering): wormen groeien op gewone NGM-agarplaten zonder E. coli OP50-bacteriën;
      B- (regulier): wormen groeien op gewone NGM-agarplaten die zijn ingezaaid met E. coli OP50-bacteriën;
      C- (hoge glucose): wormen groeien op NGM-agarplaten die zijn bezaaid met E. coli OP50-bacteriën en die 0,025 M D-glucose bevatten.
   2. Op de testdag (na 48 uur): verzamel de wormen en spoel ze drie keer kort in de M9-buffer (stappen 1.2.2 en 1.2.3)
      OPMERKING: Bereid hier NGM-agarplaten voor met toevoeging van D-glucose (stap 1.3) en zet ze opzij tot het tijd is om de wormen toe te voegen.
      1. Jodiumkleuring: bereid een 5% (v/v) Lugol's jodiumoplossing (jodium/kaliumjodide-oplossing) met verse M9-buffer.
         OPMERKING: De jodiumoplossing van Lugol is verkrijgbaar bij lokale leveranciers van reagentia of apotheken, daarom kan de aanvangsconcentratie variëren. Bereken indien nodig om een 5% (v/v) oplossing te verkrijgen.
   3. Breng ongeveer 100 μl gewassen wormen (stap 4.2) van elke groep over naar het 1,5 ml microbuisje met verdunde Lugol-oplossing (5% v/v). Breng met een automatische pipet in een verhouding van 1:5 100 μl wormen over op 400 μl Lugol-oplossing, gevolgd door voorzichtig roeren in een mixer gedurende 5 minuten.
      OPMERKING: Als er geen mixer beschikbaar is, is het mogelijk om de microbuisjes voorzichtig met de handen te schudden.
   4. Centrifugeer direct na deze 5 minuten de microbuis van 1,5 ml (wormen + Lugol-oplossing) op 1400 x g gedurende 3 minuten.
      OPMERKING: Als deze test wordt uitgevoerd op wormen uit het L4-stadium of daarna, is het mogelijk om zwaartekrachtsedimentatie te bereiken in plaats van een centrifuge te gebruiken. Laat de microbuisjes 10 minuten open in rekken op het werkblad totdat alle wormen zich op de bodem van de microbuis hebben genesteld.
   5. Verwijder het supernatans en was de wormen met 1,0 ml verse M9-buffer. Herhaal de waswas totdat al het resterende jodium uit de oplossing is verwijderd (minimaal 3x).
   6. Verwijder na de laatste wasstap het supernatans, met uitzondering van een restant van ongeveer 100 μl. Gebruik dit om de wormen voorzichtig te resuspenderen en voor microscopische analyse.
   7. Breng ongeveer 50 μl van de geresuspendeerde wormoplossing over op microscopieobjectglaasjes en dek ze af met afdekglaasjes. Bekijk de heldere veldbeelden met een stereomicroscoop (bij 1,5x).
      OPMERKING: Als er geen stereomicroscoop beschikbaar is, kan een gewone microscoop worden gebruikt en kunnen beelden worden vastgelegd met een camera van een mobiele telefoon (bij 3.4x) met behulp van een adapter. Om fouten door licht/helderheid/belichting te voorkomen, is het van cruciaal belang dat alle camera-instellingen van mobiele telefoons consistent blijven voor alle foto's.
5. Controle van de gegevens
   1. Kwantitatieve gegevens: Bereken het glycogeengehalte op basis van de jodiumkleuring van wormen.
      1. Sla afbeeldingen van de stereomicroscoop met minimaal 10 wormen per groep op als een .jpeg bestand voor verdere verwerking. Download hiervoor de gratis ImageJ-software. Details zijn te vinden in Aanvullend Bestand 1, Aanvullende Figuur 1, Aanvullende Figuur 2.
      2. Open de .jpeg afbeelding met behulp van de ImageJ-software (die gratis kan worden gedownload bij https://imagej.nih.gov/ij/download.html). Klik op Gesegmenteerde lijn en schets de worm (één worm tegelijk). Klik op Analyseren en selecteer vervolgens Meten om de vlekkwantificering te verkrijgen. De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde in de tabel. Gemiddelde geeft de gegevens aan die zijn berekend op basis van de kleuringsdichtheid per wormgebied.
   2. Kwalitatieve gegevens: Verkrijg beelden van de stereomicroscoop van elke groep en vergelijk visueel de kleuring van de wormen. Maak indien nodig een scoresysteem om de kleuring te analyseren: 0 kleurloos; 1 licht gekleurd; 2 gebeitst en 3 zwaar gebeitst. Tel met behulp van de stereomicroscoop handmatig ongeveer 10 wormen per groep (minimaal) met een handteller.

Figuur 1: Schema van het totale glycogeengehalte in C. elegans. Een schema van de experimentele die hier is uitgevoerd om de bepaling van het glycogeengehalte uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Evaluatie van de darmpermeabiliteit

1. Bereiding van wormen
   1. Breng ongeveer 14 uur na synchronisatie (stap 1.2.8) 500-1000 wormen (stap 1.3.1 en OPMERKING) in het eerste larvale stadium (L1) over naar elke nieuwe NGM-agarplaat (60 mm x 15 mm) die eerder is geprepareerd en houd ze op 20 °C tot de dag van de test. Dit schema leidt tot twee experimentele groepen die er als volgt uitzien (Figuur 2):
      A- (jong): wormen groeien op NGM-agarplaten die zijn ingezaaid met de bacterie E. coli OP50 tot larvale stadium 4 (L4);
      B- (oud): de wormen groeien op NGM-agarplaten bezaaid met de bacterie E. coli OP50 tot de 7e^{dag van} de volwassenheid.
      OPMERKING: De wormen die tot de 7e^{dag van} de volwassenheid worden onderhouden, moeten elke dag worden gewassen met M9-buffer en worden overgebracht naar nieuwe NGM-agarplaten (60 mm x 15 mm) met 200 μL E. coli OP50-bacteriën die eerder zijn gezaaid voor voedselvervanging en verwijdering van het nageslacht. Jongere wormen drijven tijdens het decanteren en kunnen worden gescheiden door supernatant te verwijderen. Het aandeel smurfenwormen neemt toe met de leeftijd. De evaluatie van de darmpermeabiliteit kan echter in elk stadium en op elke leeftijd worden uitgevoerd, afhankelijk van het doel van het onderzoek.
2. De test uitvoeren
   1. Verzamel op de testdag L4-wormen (2 dagen na stap 2.1.1) en volwassen wormen op de 7e^{dag (} nu op hun 9e^dag) met M9-buffer (aanvullende tabel 1) en breng over naar geëtiketteerde microbuisjes van 1.5 ml.
   2. Centrifugeer op 1400 x g gedurende 3 minuten, verwijder het supernatant, voeg 1,0 ml M9 toe en meng voorzichtig. Herhaal dit proces 3x om de bacteriën te verwijderen. Verminder na de laatste wasbeurt het volume tot 500 μL.
   3. Voeg met behulp van een automatische pipet 10 μL van het wormsediment toe aan een microscoopglaasje en tel het aantal wormen. Bereken het volume dat moet worden gepipetteerd om 100 wormen/μl te verkrijgen.
   4. Smurfkleuring: bereid een oplossing van 25% Erioglaucine-dinatriumzout (aanvullende tabel 1) met gedestilleerd water. Gebruik indien nodig de vortex voor een betere oplosbaarheid.
   5. Voeg in nieuwe, eerder geïdentificeerde microbuisjes met behulp van een automatische pipet het volume toe met 100 wormen, 100 μL 25% Erioglaucine dinatriumzoutoplossing, 200 μL E. coli OP50 en compleet met M9-buffer voor een eindvolume van 500 μL.
      OPMERKING: De hoeveelheden Erioglaucine dinatrium, E. coli en het aantal wormen staan vast. Het volume van de M9-buffer is variabel en kan worden gebruikt om het uiteindelijke volume op 500 μL te brengen.
   6. Incubeer gedurende 3 uur met roeren in een mixer, beschermd tegen licht, bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Als er geen mixer beschikbaar is, schud de microbuisjes dan elke 15 minuten voorzichtig met uw handen.
   7. Centrifugeer na 3 uur de microtube van 1,5 ml op 1400 x g gedurende 3 minuten. Verwijder 1,0 ml supernatans en was de wormen met 1,0 ml M9-buffer.
   8. Herhaal wasbeurten totdat de resterende Erioglaucine-dinatriumzoutoplossing uit de oplossing is verwijderd. Verwijder na de laatste wasstap het supernatans, met uitzondering van een restant van ongeveer 250 μl. Gebruik dit om wormen voorzichtig te resuspenderen en te verwerken voor microscopische analyse.
   9. Breng ongeveer 50 wormen van geresuspendeerde wormoplossing over naar microscopieglaasjes en bedek ze met afdekglaasjes. Incubeer de microscopieglaasjes in de koelkast bij -20 °C gedurende 10 minuten om de wormen te verlammen.
      OPMERKING: Een ander alternatief om de wormen te verlammen is het toevoegen van 10 μL levamisolhydrochlorideoplossing (10 mM ; Aanvullende tabel 1) en dek ze af met dekglaasjes.
   10. Observeer en tel het totale aantal wormen en de volledig geverfde wormen met behulp van het heldere veld in een stereomicroscoop (bij 1,5x). Beelden kunnen worden verkregen van een camera van een mobiele telefoon (bij 3,4x) in combinatie met een adapter. Om fouten door licht/helderheid/belichting te voorkomen, is het van cruciaal belang dat alle camera-instellingen van mobiele telefoons consistent blijven voor alle foto's.
3. Controle van de gegevens
   1. Kwalitatieve gegevens: Verkrijg beelden van de stereomicroscoop van elke groep (L4 en 7e^{dag van} de volwassenheid) en vergelijk visueel de kleuring van de wormen.
   2. Tel het totale aantal wormen en het aantal smurfenwormen (blauwe wormen) met behulp van een stereomicroscoop.
   3. Druk de resultaten uit als het percentage smurfenwormen door de jonge wormen (L4, als controlegroep) en oude wormen (7e^{dag van} de volwassenheid) te vergelijken:
      A x X = 100 (%) x B
      X = 100 x B / A
      Waarbij, A = totaal aantal wormen
      B= aantal smurfenwormen

Figuur 2: Schema van de totale intestinale permeabiliteitstest in C. elegans. (A) Bereiding van C. elegans . (B) Kleuring met Erioglaucine-dinatriumzout. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

De glycogeengehaltetest biedt een robuuste en snelle methode voor het screenen van verschillende testomstandigheden, zoals vergelijkende studies van verschillende stammen die de glycogeensynthese of -afbraak kunnen beïnvloeden. In deze studie werden L4-wormen onderworpen aan drie verschillende testomstandigheden: vasten-, voedings- en glucoseverrijkte groepen. De test werd drie keer uitgevoerd, waarbij elke aandoening twee keer werd gerepliceerd in elke test; een representatief beeld wordt weergegeven in figuur 3. Na elke test werden wormen gekleurd met Lugol's jodiumoplossing geobserveerd met behulp van een stereomicroscoop en werd een kwalitatieve vergelijking gemaakt tussen de groepen met betrekking tot de kleuring van de wormen. In termen van visuele observatie vertoonden wormen in de nuchtere groep (uithongering) een minder intense vlek in vergelijking met de wormen die werden gevoed met E. coli OP50 (regulier), evenals degenen die werden gevoed met E. coli OP50 en D-glucose (hoge glucose). Bovendien vertoonden de wormen die werden gevoed met E. coli OP50 en D-glucose (hoge glucose) de meest intense kleuring.

Figuur 3: Representatieve beelden van de glycogeengehaltebepaling. Glycogeenspiegels in C. elegans werden geëvalueerd door middel van jodiumkleuring. Microscopische afbeeldingen tonen representatieve C. elegans-wormen die gedurende 48 uur worden blootgesteld aan (A) uithongering, (B) regelmatige of (C) hoge glucoseomstandigheden. De wormen werden gekleurd door ze gedurende 5 minuten onder te dompelen in een oplossing van Lugol's jodium/M9-buffer (1%), volgens de procedure die in stap 1.4 is beschreven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De resultaten van de darmpermeabiliteit tonen het verschil in kleuring van jonge wormen (L4) met intacte darm en oude wormen (7e^{dag van} de volwassenheid) met beschadigde darmvliezen als gevolg van veroudering (Figuur 4). De darm van C. elegans is een weefsel dat van cruciaal belang is voor de gezondheid, omdat het een cruciale rol speelt bij de spijsvertering en het metabolisme en dient als een signaalcentrum voor stressrespons en verouderingsregulatie²¹. Bij jonge wormen bestaat de darm van C. elegans uit een sterke barrière die het lekken van darminhoud voorkomt. Naarmate deze wormen ouder worden, neemt de darmbarrièrefunctie echter af en wordt deze gevoeliger voor verstoring als gevolg van progressieve afbraak van cellen en microvilli en ophoping van bacteriën in de ouder wordende darm^21,22. Wanneer jonge C. elegans de kleurstof Erioglaucine dinatriumzout binnenkrijgen, wordt de darm van de nematode gekleurd (Figuur 4A). Aan de andere kant is het mogelijk om waar te nemen dat oude wormen een extravasatie van de kleurstof vertoonden, die het hele lichaam van de worm doordrong, wat wijst op schade aan het darmmembraan (Figuur 4B).

Figuur 4: Representatief beeld van C. elegans kleuring met Erioglaucine dinatriumzout. De microscopische afbeelding toont C. elegans met intacte darm (stadium L4) en wormen met gescheurde darm (7e^{dag van} de volwassenheid). De wormen werden gekleurd door onderdompeling in een 25% Erioglaucine dinatriumzoutoplossing gedurende 3 uur, volgens stap 2.2.4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: ImageJ screenshot voor het selecteren van de C. elegans contour. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: ImageJ screenshot voor het berekenen van het gemiddelde. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Media-, buffer- en cultuurrecepten. Samenstelling van verschillende media, buffers en culturen die in het huidige protocol worden gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 1: Gedetailleerde beschrijving van de ImageJ-software voor het kwantificeren van het glycogeengehalte in wormen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Samenvattend biedt dit protocol een kwalitatieve evaluatie van het glycogeengehalte in individuele C. elegans-wormen met behulp van Lugol-kleuring: een eenvoudige, robuuste en snelle test. Lugol-kleuring is een labelvrije en niet-invasieve benadering die de verwerving van moleculaire gegevens met subcellulaire resoluties vergemakkelijkt, waardoor fluctuaties in het glycogeengehalte binnen afzonderlijke wormen kunnen worden gecontroleerd¹⁰. Bovendien biedt de test het voordeel van kosteneffectiviteit vanwege de minimale apparatuurvereisten. Alleen een microscoop of stereomicroscoop is nodig om de beelden vast te leggen, die gemakkelijk kunnen worden verkregen met de camera van een mobiele telefoon, zolang dezelfde licht-/helderheids-/belichtingsinstellingen voor alle foto's worden gebruikt. Bovendien kunnen bepaalde procedurele aanpassingen de effectiviteit van dit protocol vergroten. Complexere laboratoriumapparatuur, zoals een stromingskap en centrifuge, kunnen worden vervangen door alcohollampen en zwaartekrachtbezinking. Deze alternatieven maken de methode nog budgetvriendelijker en toegankelijker voor een breed scala aan onderzoekers. Naast onderzoekers kunnen opvoeders deze test ook gebruiken voor educatieve doeleinden op scholen om veranderingen te illustreren die verband houden met glycogeenopslag en de biosynthese ervan.

Hoewel conventionele enzymatische assays glycogeenniveaus kunnen kwantificeren, is Lugol-kleuring veelbelovend als een gevoelige, nauwkeurige, kosteneffectieve en high-throughput methode voor het beoordelen van glycogeenvoorraden in C. elegans. In onze studie onthulden de gegevens merkbare verschillen in kleuring tussen de drie aandoeningen, wat wijst op een mogelijke correlatie tussen de voedingsomstandigheden en de intensiteit van de kleuring. Met andere woorden, het geeft variaties in het glycogeengehalte tussen de verschillende voedingsgroepen aan, aangezien de kleuringsintensiteit recht evenredig is met het glycogeengehalte. Met deze eerste observaties en bewijzen kunnen studenten onderzoeken en onderzoeken of verschillende factoren, zoals verschillende voedingsmiddelen, dranken of chemische reagentia, ook het glycogeengehalte in de nematoden kunnen beïnvloeden.

Een nadeel van deze benadering komt voort uit het gebruik van handmatige procedures en subjectieve interpretatie. De subjectieve aard van de kleuringsbeoordeling, waarbij scores worden toegekend op basis van visuele observatie, kan leiden tot variabiliteit tussen verschillende analisten, waardoor mogelijk fluctuaties in de interpretatie van de resultaten kunnen optreden.

Dit rapport toont ook de evaluatie van de darmintegriteit van C. elegans met behulp van de kleurstof Erioglaucine dinatriumzout. Het is mogelijk om het verlies van de darmbarrièrefunctie bij C. elegans te evalueren door de wormen te voeden met een blauwe kleurstof die niet door de cuticula kan worden opgenomen. Deze test maakt het mogelijk om te controleren op lekkage van kleurstof uit de darm, een test die bekend staat als de smurfentest omdat de dieren blauw worden zoals de tekenfilm Smurfen²³. Deze methodologie werd eerder toegepast op Drosophila melanogaster en Danio rerio met behulp van een vergelijkbare methode voor darmevaluatie^24,25. In C. elegans gebruikten we hetzelfde principe van de techniek met het Erioglaucine-dinatriumzout, dat wordt beschouwd als een eenvoudige en reproduceerbare techniek om de darmintegriteit van C. elegans te verifiëren ^19,26.

Dit protocol kan worden gebruikt om de inductie of vertraging van veroudering van nematoden te evalueren en ook om het toxische potentieel van stoffen in de darm van C. elegans op een gemakkelijke en snelle manier te verifiëren, zonder de noodzaak om complexe apparatuur te gebruiken, wat de methode economisch levensvatbaar maakt^19,27. Naast het gebruik in wetenschappelijk onderzoek, kunnen leraren deze test ook gebruiken voor educatieve doeleinden in onderwijsinstellingen om veranderingen in de darmpermeabiliteit van C. elegans te onderzoeken. Met een eenvoudige test is het mogelijk om hypothesen over veroudering en het effect van chemische reagentia op de darmbarrière van nematoden te onderzoeken.

De test kan worden aangepast om andere C. elegans-stammen en larvale stadia te gebruiken, afhankelijk van het doel van het onderzoek, zolang de vervangingen dezelfde of een vergelijkbare functie vervullen om de reproduceerbaarheid van de methode te behouden. Voor een succesvolle analyse is het belangrijk dat de verouderde wormen gedurende 3 uur worden gekleurd, zoals vermeld in het protocol. Vervolgens zijn de wasbeurten om overtollige kleurstof te verwijderen een cruciale stap in de methode en moeten ze zorgvuldig worden uitgevoerd, zodat de wormen niet samen met de supernatant worden verwijderd. In het geval van het evalueren van stoffen is een van de beperkingen in het protocol de moeilijkheid om een gemakkelijk toegankelijke positieve controle te vinden die het darmmembraan van nematoden lyseert.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL microtubes	Lokale leveranciers	-
37-graads incubator	KS 4000i	97014-816
50 mL kegelbuis	Lokale leveranciers	-
6 cm Petri-schaaltjes	Lokale leveranciers	-
Bacteriologische agar	Dinâmica Química Contemporânea Ltda.	9002-18-0
C. elegans Bristol N2 (wild type)	Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)	-
CaCL2	Dinâmica Química Contemporânea Ltda.	10035-04-8
Cholesterol	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	57-88-5
D-(+)-Glucose anhydrous	Neon	50-99-7
Gedestilleerde H2O	Lokale leveranciers	-
Erioglaucine dinatriumzout	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	3844-45-9
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)	-
Flow hood	Mylabor
Incubator	Panasonic Healthcare company of North America, MIR-254-PA.	-
KH2PO4	Dinâmica Química Contemporânea Ltda.	7778-77-0
Levamisolhydrochloride	RIPERCOL L 150F	-
Lugol-oplossing	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	L6146
MgSO4	Synth	S1063-01-AH
Microcentrifuge	Centrifuge 5425R Eppendorf SE, Germany
Na2HPO4	Dinâmica Química Contemporânea Ltda.	7558-79-4
NaCl	Dinâmica Química Contemporânea Ltda.	7647-14-5
Nystatine	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	N6261
Bacteriologisch peptone	êxodo científica	91079-38-8
Stereomicroscoop	Leica S8 Apo Stereomicroscope (São Paulo, Brazil)
Streptomycinesulfaat	Estreptomax	-