Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Immunoprecipitatie met een Anti-Epitope Tag Affinity Gel om eiwit-eiwitinteracties te bestuderen

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66085

⸱

5 januari 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Internal Medicine, Graduate School of Biomedical & Health Sciences, Hiroshima University

In dit artikel

Samenvatting

Eiwit-eiwitinteracties zijn belangrijk voor het ophelderen van de functie van doeleiwitten, en co-immunoprecipitatie (co-IP) kan PPI's gemakkelijk bevestigen. We transfecteerden tijdelijk een plasmide dat codeert voor een epitoop-gelabeld eiwit in HEK-293-cellen en ontwikkelden een immunoprecipitatiemethode om de binding van twee doeleiwitten gemakkelijk te bevestigen.

Samenvatting

Eiwit-eiwitinteracties (PPI's) spelen een cruciale rol in biologische fenomenen, zoals cellulaire organisatie, intracellulaire signaaltransductie en transcriptieregulatie. Daarom is het begrijpen van PPI's een belangrijk startpunt voor verder onderzoek naar de functie van het doeleiwit. In deze studie stellen we een eenvoudige methode voor om de binding van twee doeleiwitten te bepalen door zoogdierexpressievectoren in HEK-293-cellen te introduceren met behulp van de polyethylenimine-methode, de cellen te lyseren in zelfgemaakte eiwitlysisbuffer en de doeleiwitten op een epitoop-tag-affiniteitsgel naar beneden te trekken. Bovendien kan de PPI tussen de verschillende gefuseerde eiwitten van de epitooptag worden bevestigd door affiniteitsantilichamen tegen elke tag te gebruiken in plaats van de affiniteitsgel van de epitooptag. Dit protocol kan ook worden gebruikt om verschillende PPI's, waaronder nucleaire extracten, van andere cellijnen te verifiëren. Daarom kan het als basismethode worden gebruikt in een verscheidenheid aan PPI-experimenten. Eiwitten worden afgebroken door een verlengd tijdsverloop en herhaalde vries-dooicycli. Daarom moeten cellyse, immunoprecipitatie en immunoblotting zo naadloos mogelijk worden uitgevoerd.

Inleiding

Eiwitten spelen een belangrijke rol in alle cellulaire functies, waaronder informatieverwerking, metabolisme, transport, besluitvorming en structurele organisatie. Eiwitten bemiddelen hun functies door fysiek te interageren met andere moleculen. Eiwit-eiwitinteracties (PPI's) zijn belangrijk voor het bemiddelen van cellulaire functies, zoals het bemiddelen van signaaltransductie, het waarnemen van de omgeving, het omzetten van energie in fysieke beweging, het reguleren van de activiteit van metabole en signalerende enzymen en het handhaven van de cellulaire organisatie1. PPI's kunnen dus worden gebruikt om onbekende functies op te helderen2. Methoden voor het detecteren van PPI's kunnen worden ingedeeld in drie typen: in vitro, in vivo en in silico. Co-immunoprecipitatie (co-IP), affiniteitschromatografie, tandemaffiniteitzuivering, eiwitarrays, faagweergave, eiwitfragmentcomplementatie, röntgenkristallografie en nucleaire magnetische resonantiespectroscopie zijn gebruikt voor in vitro PPI-detectie3. Van deze methoden wordt co-IP veel gebruikt vanwege zijn eenvoud.

De fusietag FLAG bestaat uit acht aminozuren (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK), waaronder een enterokinase-splitsingsplaats, en is speciaal ontworpen voor immunoaffiniteitschromatografie4. DYKDDDDK-gelabelde eiwitten worden herkend en vastgelegd met behulp van een anti-DYKDDDDK-antilichaam. Daarom worden ze efficiënt naar beneden getrokken met behulp van DYKDDDDK bindende agarosekorrels5 om hun binding aan specifieke eiwitten op een eenvoudige manier te bevestigen. Immunoprecipitatie kan worden uitgevoerd in een verscheidenheid aan cellen en een breed scala aan PPI's kan worden bevestigd met behulp van antilichamen tegen het eiwit van belang. Immunoprecipitatie en peptide-elutie met anti-DYKDDDDK agarosekorrels zijn eerder gerapporteerd5.

Hier bieden we een eenvoudige immunoprecipitatiemethode waarbij een plasmide dat codeert voor een DYKDDDDK-gelabeld eiwit tijdelijk in HEK-293-cellen wordt geïntroduceerd om de associatie van twee interessante eiwitten te bevestigen. Bepaalde DYKDDDDK-antilichamen kunnen binden aan zowel de N-terminus als de C-terminus van de fusie-eiwitten, maar niet aan andere6. Om verwarring te voorkomen, moet daarom het antilichaam worden gekozen dat de tag herkent die is gefuseerd met zowel N- als C-terminus. Bij het invoegen van een epitooptag kan het mogelijk zijn om conformatieveranderingen in het eiwit te voorkomen door 3 tot 12 basenparen tussen de epitooptag en het doeleiwit in te voegen. De ingevoegde sequentie moet echter een basenpaar in veelvouden van 3 zijn om frameshift te voorkomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Figuur 1 geeft een overzicht van het protocol.

1. Bereiding van oplossingen en buffers

  1. Eiwitlysebuffer: Bereid de eiwitlysisbuffer voor volgens een eerder gepubliceerd rapport7 (tabel 1).
  2. Eiwitlysebuffer + proteaseremmer (PI): Voeg proteaseremmer (zie materiaaltabel) toe aan de hierboven voorbereide buffer (stap 1.1). Bewaren bij -20 °C.
  3. Monsterbuffer: Meng 900 μL 4x Laemmli monsterbuffer (zie Materiaaltabel) en 100 μL 2-mercaptoethanol. Bewaren bij -20 °C.
  4. Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met polyoxyethyleen (20) sorbitaanmonolauraat (PBS-P): Meng 1,998 L PBS en 2 ml polyoxyethyleen (20) sorbitaanmonolauraat (zie Materiaaltabel). Bewaren bij kamertemperatuur.
  5. 1x Tris/Glycine/SDS-buffer: Meng 450 ml DDW en 50 ml 10x Tris/Glycine/SDS. Bereid op kamertemperatuur op de dag van gebruik.

2. Plasmide transfectie

  1. Kweek HEK-293-cellen in een met collageen beklede schaal van 10 cm tot subconfluentie (80%-95%) met behulp van Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine (10.000 eenheden/ml penicilline G en 10.000 μg/ml streptomycine) (zie materiaaltabel).
  2. Bereid per gerecht 1-10 μg plasmide7 om te transfecteren en maak een transfectiemix. Voeg 150 mM NaCl toe aan een eindvolume van 250 μL per gerecht. Draai het mengsel om en draai het naar beneden.
  3. Voeg 60 μL 1 mg/ml polyethylenimine (PEI, zie materiaaltabel) per gerecht toe, gevolgd door 150 mM NaCl tot een eindvolume van 250 μl PEI-oplossing.
  4. Voeg de PEI-oplossing toe aan de transfectiemix om een gemengde oplossing te maken. Onmiddellijk vortex (op topsnelheid gedurende 3-5 s, voer daarna hetzelfde uit) en draai naar beneden.
  5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15-30 min. Verander gedurende deze tijd het medium van HEK-293-cellen.
  6. Strooi 500 μL/schaaltje gemengde oplossing over de schaal met HEK-293-cellen en incubeer een nacht (13-14 uur).
  7. Voer de volgende dag een mediumwissel uit.

3. Cellyse en monstervoorbereiding

OPMERKING: Om eiwitafbraak te voorkomen, moeten de volgende stappen zoveel mogelijk worden uitgevoerd zonder conservering of vries-dooi van het monster.

  1. Was de cellen ongeveer 48 uur na transfectie driemaal met ijskoude PBS, voeg 500 μL/schaaltje eiwitlysisbuffer + PI toe en verzamel de cellen met een celschraper en een pipet in een buisje met lage eiwitadsorptie op ijs.
  2. Draai elke 5 minuten en broed de monsters 10 minuten op ijs uit.
  3. Centrifugeer bij 16.400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verzamel het supernatans en breng het over in een vers buisje van 1,5 ml met een lage eiwitadsorptie. De monsters kunnen worden bewaard bij -80 °C.
  4. Bepaal de eiwitconcentratie van de monsters met een meetkit voor de eiwitconcentratie volgens het protocol van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
  5. Scheid 200-1000 μg van dezelfde hoeveelheid eiwit in elk monster en voeg vervolgens eiwitlysisbuffer + PI toe om het totale volume aan te passen tot 500-1000 μL.
    OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd op ijs.

4. Bereiding van drijfmest

OPMERKING: Bereid de dag voor of op de dag van immunoprecipitatie een 1:1 brij van proteïne G-gel en epitoop-affiniteitgel voor.

  1. Bereiding van een proteïne G-gel
    1. Meng met behulp van een punt waarvan het uiteinde is afgesneden, goed en scheid vervolgens de proteïne G-gel (zie Materiaaltabel) zodat 20 μL korrels per monster wordt bereid.
    2. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 20 s bij 4 °C en leg de korrels 1 minuut op ijs om de korrels te laten egaliseren. Gooi het supernatans weg met een pipet.
    3. Voeg 1 ml eiwitlysisbuffer + PI toe aan de in stap 4.1.2 bereide proteïne G-gel en meng door te tikken en om te keren. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 20 s bij 4 °C, leg de korrels 1 minuut op ijs zodat de korrels waterpas kunnen worden en gooi de supernatant weg.
    4. Herhaal stap 4.1.3 driemaal.
    5. Voeg een gelijk volume eiwitlysisbuffer toe aan de proteïne G-gel om een 1:1 proteïne G-gelslurry te maken. De eiwit G-gelslurry kan ongeveer 1 dag bij 4 °C worden bewaard.
  2. Bereiding van een epitoop tag affiniteitsgel
    1. Gebruik een punt waarvan het uiteinde is afgesneden, schud goed en scheid vervolgens de affiniteitgel van de epitooptag (zie Materiaaltabel) zodat 10-15 μL kralen per monster wordt bereid.
    2. Centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C en wacht 1 minuut op ijs om de korrels af te vlakken. Gooi het supernatans weg met een pipet.
    3. Voeg 1 ml eiwitlysisbuffer + PI toe aan de in stap 4.2.2 bereide epitoop-affiniteitsgel en meng door te tikken en om te keren. Centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C, leg de korrels 1 minuut op ijs zodat de korrels waterpas kunnen worden en gooi het supernatans weg met een pipet.
    4. Herhaal stap 4.2.3 twee keer.
    5. Voeg 500 μL 0,1 M glycine (pH 3,5) toe aan de in stap 4.2.4 bereide epitoop-affiniteitsgel en meng door te tikken en om te keren. Deze stap wordt uitgevoerd om vrije epitoop-tag-antilichamen te verwijderen. Centrifugeer binnen 20 minuten na de toevoeging van glycine bij 5.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C, leg de korrels 1 minuut op ijs zodat de korrels waterpas kunnen worden en gooi de supernatant weg.
    6. Voeg 500 μL eiwitlysisbuffer + PI toe aan de in stap 4.2.5 bereide epitoop-tag-affiniteitsgel en meng door te tikken en om te keren. Centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C, leg de parels 1 minuut op ijs om de kralen glad te laten komen en gooi de supernatant weg.
    7. Herhaal stap 4.2.6 driemaal.
    8. Voeg een gelijk volume eiwitlysisbuffer toe aan de epitoop tag affiniteitsgel om een 1:1 epitope tag affiniteitsgel slurry te bereiden. De epitoop tag affinity gel slurry kan ongeveer 1 dag bij 4 °C worden bewaard.

5. Preclearing met de proteïne G-gel en het vastleggen van eiwitcomplexen met de epitoop tag affiniteitsgel

  1. Meng 1:1 eiwit G-suspensie (bereid in stap 4) met een pipet met een gesneden punt en voeg 40 μl per keer toe aan het monster.
  2. Draai het monster gedurende 1 uur op een rotator (zie Materiaaltabel) in ongeveer 30 s per cyclus in een gekoelde kamer (4 °C).
  3. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 20 s bij 4 °C en leg de korrels 1 minuut op ijs om de korrels te laten egaliseren.
  4. Verzamel het supernatans en breng het over in een nieuwe tube van 1,5 ml met een lage eiwitadsorptie.
  5. Scheid het monster voor invoer van het monster in stap 5.4 en breng het over in een nieuw buisje van 1.5 ml.
  6. Voeg 20-30 μL 1:1 epitoop tag gel slurry toe aan het monster.
  7. Draai op een rotator gedurende ongeveer 30 s per cyclus in een gekoelde kamer (4 °C) gedurende 2 uur.
  8. Voeg monsterbuffer toe aan de in stap 5.5 voorbereide invoer om deze te verdunnen tot 4x en verwarm gedurende 10 minuten bij 98 °C. De input kan worden opgeslagen bij -80 °C.
    OPMERKING: Vanwege de mogelijkheid van eiwitafbraak door invriezen en ontdooien, moeten de volgende stappen worden uitgevoerd zonder het eiwit zoveel mogelijk te conserveren.

6. Wassen en elueren van de neergeslagen eiwitten

  1. Stel de temperatuur van het warmteblok in op 98 °C.
  2. Centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C en wacht 1 minuut op ijs om de korrels af te vlakken. Gooi het supernatans weg met een pipet.
  3. Voeg 1 ml eiwitlysisbuffer + PI toe en meng door te tikken en om te keren. Draai op een rotator gedurende ongeveer 30 s per cyclus in een gekoelde kamer (4 °C) gedurende 5 min. Centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C, wacht 1 minuut op ijs om de korrels waterpas te laten worden en gooi het supernatant weg.
  4. Herhaal stap 6.3 5-10 keer.
  5. Voeg 10 μL monsterbuffer toe aan het in stap 6.4 bereide monster. Kook op 98 °C gedurende 10 min.
  6. Centrifugeer bij 5.000 x g bij 4 °C gedurende 30 s.
  7. Plaats een kolom in een nieuwe buis met een lage eiwitadsorptie en breng de gel over op de kolom met behulp van een pipet met een afgesneden punt. Een kolom wordt gebruikt om contaminatie van de gel te voorkomen.
  8. Centrifugeer bij 9.730 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C. Verzamel de doorstroom. Het monster kan worden bewaard bij -80 °C.
    OPMERKING: Als de afbraak van het monster een probleem is, moet de volgende immunoblotting worden uitgevoerd zonder bevriezing.

7. Immunoblotting

OPMERKING: Immunoblotting-procedures zijn gebaseerd op eerdere rapporten 7,8.

  1. Laad hele monsters op een natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegel (SDS-PAGE, zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Gebruik indien nodig large-well gels zodat het hele monster kan worden overgebracht. Hier werden gels met putjes van 50 μL gebruikt.
  2. Plaats de gels in de elektroforesekamer en voeg 1x Tris/Glycine/SDS-buffer toe (zie Materiaaltabel) tot het juiste volume rond de gels.
  3. Elektroforese gels bij 100 V en 400 mA.
  4. Overbrengen op membranen van polyvinylideenfluoride (PVDF, zie Tabel met materialen).
  5. Blokkeer de PVDF-membraanvlekken met 5% magere melk in PBS-P gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  6. Was het membraan driemaal met PBS-P op een shaker op topsnelheid gedurende 5 min. Voer daarna dezelfde procedure uit bij het wassen.
  7. Incubeer een nacht op een shaker met het primaire antilichaam (zie materiaaltabel) bij 4 °C.
  8. Was het membraan de volgende dag driemaal met PBS-P.
  9. Incubeer gedurende 1 uur met het secundaire antilichaam op een shaker bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Als het molecuulgewicht van het doeleiwit dicht bij de zware IgG-keten ligt, die een molecuulgewicht heeft van ongeveer 50 kDa, kan een lichteketenspecifiek secundair antilichaam worden gebruikt om overlapping van de doelband met de zware IgG-keten te voorkomen. In deze studie werd gebruik gemaakt van lichteketenspecifieke antilichamen7 of Veriblot als IP-detectiereagens (zie materiaaltabel).
  10. Identificeer banden van eiwitten met peroxidase lichtgevende substraten. Het membraan kan worden opgeslagen in PBS na twee keer wassen met PBS-P.
  11. Strip gedurende 10 minuten met een stripoplossing (zie Materiaaltabel).
  12. Was driemaal en blokkeer met 5% magere melk in PBS-P. Het protocol daarna is hetzelfde als in stap 7.6 en verder.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Thermogene adipocyten, ook bekend als bruine en beige adipocyten, hebben potentiële anti-obesitas en anti-glucose-intolerantie effecten. PR (PRD1-BF1-RIZ1 homoloog) domeinbevattend 16 (PRDM16) is een transcriptiecofactor die een belangrijke rol speelt bij het bepalen van de thermogene adipocytenidentiteit 9,10.

EHMT1 (euchromatisch histon-lysine N-methyltransferase 1), ook bekend als GLP, katalyseert voornamelijk de mono- en dimethyler...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol lijkt bijna op de eerder gerapporteerde protocollen 5,7,14,15. Het belangrijke punt van dit protocol is dat we het experiment nooit stoppen van de cellysestap tot de immunoprecipitatiestap. Eiwitafbraak belemmert de detectie van PPI. Langere tijdsverloop en herhaalde vries-dooicycli breken eiwitten af. Elektroforese in SDS-PAGE moet ook op dezelfde dag van immunoprecipitatie worden...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

We verklaren dat geen van de auteurs belangenconflicten heeft met betrekking tot deze studie.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Number 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K08672 (H.O.), Japan Diabetes Society Research Grant for Young Investigators (G.N.) en MSD Life Science Foundation Research Grant for Young Investigators (G.N.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTA (pH8.0)Nippon gene311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µLBiorad4561034
10x Tris/Glycine/SDSBiorad1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigmaA2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab SheepGE HealthcareNA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab DonkeyGE HealthcareNA934-1ML
Cell Scraper MSumitomo BakeliteMS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mmIWAKI4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementInvitrogen10565042
D-PBS (-)FUJIFILM Wako045-29795
GlycerolFUJIFILM Wako072-00626
GlycineFUJIFILM Wako077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724Cell SignalingC29F4
Laemmli Sample bufferBio-Rad Laboratories161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography ColumnsBiorad7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast GelsBiorad1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouseSigmaF3165
NaClFUJIFILM Wako191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16This paperN/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1This paperN/A
pcDNA3.1-vectorThis paperN/A
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine HydrochloridePSI24765
Penicillin-streptomycin solutionFUJIFILM Wako168-23191
Pierce BCA Protein Assay KitThermo scientific23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl EtherFUJIFILM Wako168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan MonolaurateFUJIFILM Wako167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab PacksCytiva17061801
Protein LoBind Tubeseppendorf30108442
ROTATOR RT-5TAITECRT-5
skim milkMorinaga0652842 
Stripping SolutionFUJIFILM Wako193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer PackBiorad1704156B03
Trans-Blot Turbo SystemBioradN/A
Trizma baseSigmaT1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)HyCloneSH30910.03
VeriblotAbcamab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970Cell Signaling4970S

Referenties

  1. Braun, P., Gingras, A. History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks. Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).
  2. Yanagida, M. Functional proteomics; current achievements. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 771 (1-2), 89-106 (2002).
  3. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648(2014).
  4. Hopp, T. P., et al. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
  5. Gerace, E., Moazed, D. Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads. Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).
  6. Einhauer, A., Jungbauer, A. The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).
  7. Egusa, G., et al. Selective activation of PPARα maintains thermogenic capacity of beige adipocytes. iScience. 26 (7), 107143(2023).
  8. Nagano, G., et al. Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression. PLoS One. 10 (3), e0122584(2015).
  9. Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
  10. Kajimura, S., et al. Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex. Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).
  11. Shinkai, Y., Tachibana, M. H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP. Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).
  12. Able, A. A., Richard, A. J., Stephens, J. M. TNFα effects on adipocytes are influenced by the presence of lysine methyltransferases, G9a (EHMT2) and GLP (EHMT1). Biology. 12 (5), 674(2023).
  13. Ohno, H., Shinoda, K., Ohyama, K., Sharp, L. Z., Kajimura, S. EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex. Nature. 504 (7478), 163-167 (2013).
  14. Bian, W., et al. Protocol for establishing a protein-protein interaction network using tandem affinity purification followed by mass spectrometry in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (3), 101569(2022).
  15. Cristea, I. M., Chait, B. T. Affinity purification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).
  16. Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
  17. Holden, P., Horton, W. Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines. BMC Research Notes. 2, 243(2009).
  18. Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins. Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).
  19. Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Immunoprecipitatie-assayHEK 293-cellenproteïnelysebufferproteïne G-gelmammale expressievectorenWestern blottingaffiniteitsantilichaamSDS-PAGE
Immunoprecipitatie met een Anti-Epitope Tag Affinity Gel om eiwit-eiwitinteracties te bestuderen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.