Method Article

Identificatie van micro-omgevingspopulaties in het beenmerg bij myelodysplastisch syndroom en acute myeloïde leukemie

DOI:

10.3791/66093

⸱

November 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Wilmot Cancer Institute, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 3Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 4Genomics Research Center, University of Rochester Medical Center, 5Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, University of Rochester Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd om micro-omgevingspopulaties in het beenmerg te isoleren en te karakteriseren op basis van muizenmodellen van myelodysplastische syndromen en acute myeloïde leukemie. Deze techniek identificeert veranderingen in de niet-hematopoëtische beenmergniche, inclusief de endotheliale en mesenchymale stromale cellen, met ziekteprogressie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De micro-omgeving van het beenmerg bestaat uit verschillende celpopulaties, zoals mesenchymale stromale cellen, endotheelcellen, osteolineagecellen en fibroblasten, die ondersteuning bieden aan hematopoëtische stamcellen (HSC's). Naast het ondersteunen van normale HSC's, speelt de micro-omgeving van het beenmerg ook een rol bij de ontwikkeling van hematopoëtische stamcelaandoeningen, zoals myelodysplastische syndromen (MDS) en acute myeloïde leukemie (AML). MDS-geassocieerde mutaties in HSC's leiden tot een blokkade in differentiatie en progressief beenmergfalen, vooral bij ouderen. MDS kan vaak evolueren naar therapieresistente AML, een ziekte die wordt gekenmerkt door een snelle accumulatie van onrijpe myeloïde blasten. Het is bekend dat de micro-omgeving van het beenmerg veranderd is bij patiënten met deze myeloïde neoplasmata. Hier wordt een uitgebreid protocol beschreven voor het isoleren en fenotypisch karakteriseren van micro-omgevingscellen in het beenmerg van muizenmodellen van myelodysplastisch syndroom en acute myeloïde leukemie. Het isoleren en karakteriseren van veranderingen in de nichepopulaties van het beenmerg kan helpen bij het bepalen van hun rol bij het ontstaan en de progressie van de ziekte en kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapieën die gericht zijn op kankerbevorderende veranderingen in de stromale populaties van het beenmerg.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De micro-omgeving van het beenmerg bestaat uit hematopoëtische cellen, niet-hematopoëtische stromale cellen en de extracellulaire matrix 1,2. Deze micro-omgeving kan de zelfvernieuwing van hematopoëtische stamcellen bevorderen, de differentiatie van de afstamming reguleren en structurele en mechanische ondersteuning bieden aan het botweefsel 1,2,3,4,5. De stromale niche omvat osteolineagecellen, fibroblasten, zenuwcellen en endotheelcellen6, terwijl de hematopoëtische niche bestaat uit de lymfoïde en myeloïde populaties 1,2,3. Naast het ondersteunen van normale HSC's, kan de micro-omgeving van het beenmerg ook een rol spelen bij de ontwikkeling van hematopoëtische stamcelaandoeningen zoals MDS en AML 7,8,9,10,11. Van mutaties in osteolineagecellen is aangetoond dat ze de ontwikkeling van MDS, AML en andere myeloproliferatieve neoplasmata bevorderen 10,12,13,14.

Myelodysplastische syndromen zijn een groep pre-leukemische aandoeningen die voortkomen uit mutaties in hematopoëtische stamcellen. MDS wordt vaak geassocieerd met een blokkade in HSC-differentiatie en de productie van dysplastische cellen, wat vaak kan leiden tot beenmergfalen. MDS is het meest gediagnosticeerde myeloïde neoplasma in de Verenigde Staten en wordt geassocieerd met een 3-jaarsoverleving van 35%-45%15. MDS wordt vaak geassocieerd met een hoog risico op transformatie naar acute myeloïde leukemie. Dit kan een fatale complicatie zijn, aangezien MDS-afgeleide AML resistent is tegen de meeste therapieën en waarschijnlijk terugvalt. AML dat de novo ontstaat als gevolg van translocaties of mutaties in hematopoëtische stam en voorlopercellen is ook vaak resistent tegen standaard chemotherapie16,17. Aangezien MDS en AML voornamelijk ouderenziekten zijn, waarvan de meerderheid ouder dan 60 jaar wordt gediagnosticeerd, komen de meeste patiënten niet in aanmerking voor curatieve beenmergtransplantaties. Er is dus een grote behoefte om nieuwe regulatoren van ziekteprogressie te identificeren. Aangezien de micro-omgeving van het beenmerg ondersteuning kan bieden aan kwaadaardige cellen14, kan het definiëren van veranderingen in de beenmergniche met ziekteprogressie leiden tot de identificatie van nieuwe therapieën die gericht zijn op het remmen van de remodellering van tumorniches. Er is daarom een grote behoefte aan het identificeren van nieuwe regulatoren van ziekteprogressie. Daartoe is het van cruciaal belang om veranderingen in de stromale celpopulaties van het beenmerg te identificeren en te karakteriseren die ondersteuning kunnen bieden aan de kwaadaardige cellen.

Er zijn verschillende muizenmodellen van AML en MDS gegenereerd die kunnen worden gebruikt om veranderingen in de micro-omgeving van het beenmerg te bestuderen tijdens het begin en de progressie van de ziekte 6,1,19,20,21,22. Hier worden protocollen beschreven om veranderingen in de stromale celpopulaties van het beenmerg te identificeren met behulp van muizenmodellen van retroviraal geïnduceerde AML 6,20, evenals het in de handel verkrijgbare Nup98-HoxD13 (NHD13)-model van MDS naar AML-transformatie met een hoog risico19. Muizen die zijn getransplanteerd met de novo AML-cellen bezwijken binnen 20-30 dagen aan de ziekte. De NHD13-muizen ontwikkelen cytopenieën en beenmergdysplasie rond 15-20 weken, die uiteindelijk verandert in AML, en bijna 75% van de muizen bezwijkt rond 32 weken aan de ziekte. Om de micro-omgevingspopulaties van het muizenmodel in het beenmerg te analyseren, worden botten geoogst, worden beenmerg en botspicules verteerd met behulp van enzymatische spijsvertering en worden de cellen vervolgens verrijkt voor CD45-/Ter119-niet-hematopoëtische populaties door magnetische sortering. Hoewel vergelijkbare analyses eerder zijn beschreven 11,13,22,23,24,25, richten ze zich vaak op het beenmerg of het bot en nemen ze geen cellen uit beide bronnen op in hun analyses. De gecombineerde karakterisering van deze populaties, in combinatie met genexpressie-analyses, kan een uitgebreid inzicht verschaffen in hoe de cellulaire hematopoëtische micro-omgeving ondersteuning biedt voor het ontstaan en de progressie van de ziekte (Figuur 1). Hoewel het hieronder beschreven protocol zich richt op retroviraal geïnduceerd AML-model en een genetisch MDS-model, kunnen deze strategieën gemakkelijk worden aangepast om veranderingen in de beenmergniche van elk muizenmodel van belang te bestuderen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door de University of Rochester University Committee on Animal Resources. Muizen werden gefokt en onderhouden in de dierenverzorgingsfaciliteiten van de Universiteit van Rochester. Om MDS met een hoog risico te modelleren, wordt het in de handel verkrijgbare NHD13-muizenmodel19 gebruikt. In dit model worden stromale beenmergcellen geanalyseerd bij vrouwelijke NHD13-muizen op de leeftijd van 8 weken, vóór het begin van de ziekte. De novo AML wordt gegenereerd zoals eerder beschreven 6,11,20. De oncogenen die worden gebruikt om AML te induceren, zoals MLL-AF9 en NRas, zijn gelabeld met GFP of YFP, waardoor de analyse van de niet-leukemische GFP-beenmergpopulaties mogelijk is met behulp van flowcytometrie. In het kort, vrouwelijke C57BL/6J-muizen van 10 weken oud worden getransplanteerd met muizen GFP/YFP+ AML-cellen en het beenmerg wordt 2 weken na de transplantatie geoogst. Hoewel vrouwelijke muizen in dit onderzoek worden gebruikt voor demonstratiedoeleinden, kan dit protocol worden uitgevoerd met zowel mannelijke als vrouwelijke muizen. Het kan ook worden uitgevoerd met één dijbeen of alle lange botten.

1. Oogsten van beenmerg

OPMERKING: Voor details over het protocol voor het dissectien van dieren, zie Amend et al.26.

  1. Reinig de vijzel en stamper met 70% ethanol, spoel ze af met gekoelde FACS-buffer (tabel 1) en leg ze op ijs om af te koelen voordat je met de oogst begint. Plaats ook de MACs-buffer (tabel 1) op de bank om deze op kamertemperatuur te laten komen.
  2. Euthanaseer het dier volgens de richtlijnen en protocollen voor institutionele dierenverzorging en -gebruik.
  3. Spuit de muis op het werkblad grondig in met 70% ethanol totdat zijn vacht nat is. Til met een pincet en een gebogen schaar de huid op de buik op en maak twee incisies van ongeveer 0,5 mm lang aan beide zijden van de muis, lateraal van de buik. Maak vervolgens een incisie van 0,5 mm distaal van de buik. Trek naar beneden om de huid en vacht van de poten van de muis te verwijderen.
  4. Plaats een schaar loodrecht op het bekken, druk naar beneden terwijl u het dijbeen met een tang omhoog trekt. De heupkop moet loskomen van het bekken. Scheid het dijbeen en het scheenbeen bij het patellofemorale gewricht. Leg de botten in FACS-buffer in een bord met 6 putjes op ijs.
  5. Verwijder weefsel van de botten met behulp van weefsel van laboratoriumkwaliteit en plaats de gereinigde botten in een nieuwe plaat met 6 putjes met verse FACS-buffer op ijs.
  6. Plaats alle botten in de vijzel met 2-5 ml FACS-buffer zodat alle botten in de buffer worden ondergedompeld (pas het volume van de buffer aan op basis van het aantal botten dat u verwerkt). Plet en maal de botten met de stamper in een cirkelvormige beweging totdat het beenmergweefsel vrijkomt.
  7. Gebruik een spuit van 3 ml om het beenmerg te homogeniseren door de vloeistof uit de mortel omhoog te trekken en weg te spoelen.
  8. Trek met een spuit van 3 ml de vloeistof uit de vijzel en filtreer deze door een celzeef van 70 μm in een buis van 50 ml op ijs. Spoel de bot-/weefselbrokken van het filter terug in de mortel met FACS-buffer en keer terug naar stap 1.7 om een tweede keer te homogeniseren en te zeven. Dit vormt de beenmergfractie.
  9. Spoel de resterende botstukken (spicules) terug in de mortel met FACS-buffer en spoel ze in een buis van 15 ml met FACS-buffer om een maximale celopbrengst te garanderen. Dit is de botsplinterfractie.

2. Vertering van beenmerg

  1. Centrifugeer het beenmerg bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Decanteer en gooi het supernatant weg.
  2. Resuspendeer het beenmerg in 2 ml van het beenmergverteringsmengsel (tabel 1) en breng het over in een buisje van 15 ml. Incubeer bij 37 °C gedurende 45 minuten op een rotator.
  3. Voeg 10 ml FACS-buffer toe om de enzymatische vertering te stoppen. Filtreer het mengsel door een celzeef van 70 μm in een nieuw buisje van 50 ml.
  4. Pellet het mengsel op 400 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C.
  5. Resuspendeer de beenmergkorrel in 1 ml RBC-lysisbuffer (zie materiaaltabel). Incubeer gedurende 4 minuten op ijs.
  6. Voeg 10 ml FACS-buffer toe om de lysis te stoppen. Filtreer het mengsel door een celzeef van 70 μm in een nieuw buisje van 50 ml.
  7. Pellet het mengsel op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatans en resuspendeer de pellet in 100 μL FACS-buffer.

3. Vertering van botspicules

  1. Draai de botspicules uit stap 1.9 en laat ze bezinken. Decanteer het supernatans en bewaar het bot aan de onderkant.
  2. Resuspendeer de botspicules in 1 ml van het botspicule-verteringsmengsel (tabel 1).
  3. Plaats de buizen gedurende 60 minuten op een buisrotator bij 37 °C.
  4. Voeg 10 ml FACS-buffer toe om de enzymatische vertering te stoppen. Filtreer het mengsel door een celzeef van 70 μm in het buisje van 50 ml met RBC-gelyseerd en verteerd beenmerg.

4. Kleuring

  1. Meng voorzichtig de botspicules en de beenmergcelsuspensie.
  2. Gebruik 10 μL van de celsuspensie om het aantal levende cellen op een hemocytometer te tellen met behulp van 0,4% kleuring op basis van trypanblauw, zoals beschreven in gepubliceerde protocollen27. Verzamel 50.000 cellen voor een ongekleurde controle van de celsuspensie.
  3. Centrifugeer de resterende cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatans en resuspendeer ze in 100 μL FACS-buffer.
    OPMERKING: Antilichamen kunnen worden getitreerd om de ideale verdunning te bepalen. De selectie van antilichamen (epitopen en fluorochromen) kan worden aangepast.
  4. Voor kleuring met antilichamen voor magnetische depletie voegt u FC Block (1 μL per 25 x 106 cellen), CD45-APC (10 μL per 25 x 106 cellen) en Ter119-APC (4 μL per 25 x 106 cellen) toe (zie Materiaaltabel).
  5. Incubeer 20 minuten op ijs. Wassen met FACS-buffer, 50.000 cellen (~50 μL) verwijderen voor de APC-gekleurde controle, centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en resuspenderen in 100 μL FACS-buffer.
  6. Voor het kleuren van de celsuspensie met microbeads voor magnetische depletie, voeg mIgG (8 μL per 25 x 106 cellen) en Anti-APC microbeads (20 μL per 25 x 106 cellen) toe (zie Tabel met materialen).
  7. Incubeer 20 minuten op ijs. Wassen met 10 ml FACS-buffer, centrifugeren op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.

5. Uitputting van het monster door magnetische sortering

NOTITIE: Deze stap wordt uitgevoerd met behulp van een in de handel verkrijgbare handmatige magnetische scheider volgens de instructies van de fabrikant. Deze stap kan ook worden uitgevoerd met een geautomatiseerde scheider (zie Tabel met materialen).

  1. Bereid de LD-kolom voor door deze te wassen met 2 ml MACs-buffer (tabel 1). Gooi het effluent weg en vervang de opvangbuis.
  2. Resuspendeer maximaal 1 x 108 cellen in MACs-buffer en filtreer ze door een reageerbuis van 5 ml met een celzeefdop van 35 μm.
  3. Plaats de LD-kolom op de magneetscheiderstandaard. Plaats een reageerbuis van 5 ml onder de kolom om het eluaat op te vangen.
  4. Voeg de celsuspensie toe aan de voorbereide LD-kolom. Laat de negatieve fractie doorstromen in de opvangbuis. Was de kolom twee keer met 1 ml MACs-buffer en verzamel het eluaat in dezelfde buis. Dit is de negatieve fractie die in stap 5.6 hieronder wordt gebruikt.
  5. Verwijder de LD-kolom van de magnetische scheidingsstandaard en plaats deze op een nieuwe reageerbuis van 5 ml. Gebruik een pipet om 3 ml buffer in de kolom te doseren om cellen die positief zijn gelabeld weg te spoelen met behulp van de kolomplunjer.
  6. Centrifugeer de negatieve en positieve fracties bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer ze in 100 μL FACS-buffer.
  7. Tel 10 μL van de negatieve en positieve fracties met 0,4% Trypanblauw. De volumes voor de onderstaande osteo-analyse/endotheelpaneelkleuring zijn gebaseerd op dit celgetal.
  8. Gebruik 50.000 levende cellen uit de positieve fractie voor flowcytometrie gating controles.

6. Osteo-analyse/endotheelpaneelvlek

OPMERKING: Compensatie moet worden uitgevoerd volgens standaard flowcytometrieprotocollen, inclusief alle geschikte kleurings- en gatingcontroles.

  1. Voor kleuring van de CD45/Ter119 negatieve fractie (1 μL van elk antilichaam per 1 x 106 cellen) voegt u CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE en CD140a-PE-Cy5 toe (zie Materiaaltabel).
  2. Incubeer 20 minuten op ijs. Wassen met 2 ml FACS-buffer en vervolgens centrifugeren op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  3. Voeg 1 ml FACS-buffer en een verdunning van 1:1000 PI toe voor levende/dode kleuring en filtreer het monster vervolgens door een reageerbuis van 5 ml met een celzeefdop van 35 μm.
  4. Analyseer de cellen op een meerkleurige flowcytometer.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een op flowcytometrie gebaseerde methode voor het analyseren van micro-omgevingspopulaties in het beenmerg, zoals de endotheel- en mesenchymale stromale cellen, uit MDS- en leukemie-muizenmodellen (Figuur 1). Figuur 2 toont de poortstrategie voor de detectie van populaties van belang, te beginnen met de selectie van cellen (P1) in de verteerde en CD45/Ter119 verarmde fractie via het voorwaartse en zijwaartse verspreidingsprofiel. Voorbeeld...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modellen voor leukemie bij muizen zijn op grote schaal gebruikt om intrinsieke en nichegestuurde signalen van cellen te identificeren die de progressie van agressieve myeloïde leukemie bevorderen 6,19,21. Hier wordt een uitgebreid op flowcytometrie gebaseerd protocol gepresenteerd om de cellulaire samenstelling van de micro-omgeving van het beenmerg in muizenmodellen van MDS en AML te definiëren.

Voor...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten gemeld.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen de URMC Flow Cytometry Core bedanken. Dit werk werd ondersteund door de American Society of Hematology Scholar Award, de Leukemia Research Foundation Award en NIH-beurzen R01DK133131 en R01CA266617 toegekend aan JB.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL pipette Tips Genesee Scientific 24-165RL
1.7 mL Microcentrifuge TubesAVANTL211511-CS
10 µL pipette TipsGenesee Scientific 24-140RL
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological PipettesGlobe scientific1760
1000 mL Vacuum Filtration FlaskNEST344021
15 mL Centrifuge TubeVWR10026-076
2 mL Aspirating PipetteNEST325011
200 µL pipette TipsGenesee Scientific 24-150-RL
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological PipettesGlobe scientific1780
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological PipettesGlobe scientific1740
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube  12 x 75 mm styleFalcon352054
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm styleFalcon352235
50 mL Centrifuge TubeNEST602052
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation LidFalcon353046
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture BarrierVWR56616-031
APC MicroBeadsMiltenyi 130-090-855
autoMACS Pro SeparatorMiltenyi Biotec GmBH4425745
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences5531410.5 mg/mL 
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA790666.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)Invitrogen404-59810.2 mg/mL
C57BL/6J MiceJackson Laboratory 664
Carbon Dioxide Gas TankAirgasCD50
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7Invitrogen25-0311-820.2 mg/mL
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APCInvitrogen17-0451-820.2 mg/mL
Cell Strainer 70 µm Nylon Falcon352350
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mLCole-ParmerEW-63100-62
Collagenase from Clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138-500MG
Collagenase Type ISTEMCELL7415
Corning Mini CentrifugeCORNING6770
Corning Stripettor Ultra Pipet ControllerCorning4099
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-AldrichD4513
Dispase II, powderGibco117105041
DPBS 10xgibco14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis BufferInvitrogen00-4333-57
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)VWR89125-174
Fine scissors - sharpFine Science Tools14061-10
Foundation B Fetal Bovine SerumGeminiBio900-208
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter KitsFisherScientific F167370G
Graefe ForcepsFine Science Tools11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10xgibco14185-052
HemocytometerFisher02-671-10
Incubator BINDERC150-UL
KimwipesKIMTECHK222101
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety CabinetNuaireNU-425-400
LD ColumnsMiltenyi Biotec GmBH130-042-901
LSE Vortex MixerCORNING6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1Becton, Dickinson and Company647800L6
MACS MULTI STAND Miltenyi Biotec GmBH130-042-303
MACsmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmBH130-090-753
mIgGMillipore-Sigma18765-10mg2 mg/mL 
Nup98-HoxD13 (NHD13) MiceJackson Laboratory 010505
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)Biolegend1041060.2 mg/mL
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)Biolegend1359200.2 mg/mL
Penicillin-Streptomycin Gibco1514012210,000 U/mL
Plastipak 3 mL SyringeBecton, Dickinson and Company309657
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in WaterThermoFisher ScientificP3566
QuadroMACS  Separator Miltenyi Biotec GmBH130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Series CentrifugeThermo Scientific 75009521
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APCInvitrogen17-5921-820.2 mg/mL
Trypan Blue Solution 0.4%Gibco15-250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen15575-038

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  2. Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
  3. Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).
  4. Kfoury, Y., Scadden, D. T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche. Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).
  5. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  6. Bajaj, J., et al. Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia. Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).
  7. Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting. J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).
  8. Kim, Y. W., et al. Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease. Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).
  9. Walkley, C. R., et al. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency. Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).
  10. Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
  11. Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
  12. Raaijmakers, M. H., et al. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
  13. Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
  14. Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. Stem cells in cancer initiation and progression. J Cell Biol. 219 (1), e201911053(2020).
  15. Sekeres, M. A., Taylor, J. Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review. Jama. 328 (9), 872-880 (2022).
  16. Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W. Snapshot: Acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 22 (5), 698-698.e1 (2012).
  17. Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).
  18. Yoshimi, A., et al. Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis. Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).
  19. Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
  20. Kwon, H. Y., et al. Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia. Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).
  21. Bajaj, J., et al. An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia. Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).
  22. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  23. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).
  24. Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
  25. Balderman, S. R., et al. Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome. Blood. 127 (5), 616-625 (2016).
  26. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. JoVE. 110, e53936(2016).
  27. JoVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , JoVE. (2023).
  28. Passaro, D., et al. Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response. Blood. 128 (22), 2662(2016).
  29. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nat Commun. 9 (1), 2449(2018).
  30. Baccin, C., et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).
  31. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).
  32. Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. Collagen IV in normal skin and in pathological processes. N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bone Marrow MicroenvironmentMyelodysplastic SyndromeAcute Myeloid LeukemiaMesenchymal Stromal CellsFlow CytometryMagnetic SeparationEndothelial CellsOsteolineage CellsHematopoietic Stem CellsCell Population Isolation

Related Articles