Organoïden die afkomstig zijn van maagpatiënten worden steeds vaker gebruikt in onderzoek, maar formele protocollen voor het genereren van menselijke maagorganoïden uit eencellige digesten met gestandaardiseerde zaaidichtheid ontbreken. Dit protocol presenteert een gedetailleerde methode voor het betrouwbaar maken van maagorganoïden uit biopsieweefsel dat is verkregen tijdens de bovenste endoscopie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Vaststelling en karakterisering van van patiënten afgeleide maagorganoïden uit biopsieën van goedaardig maaglichaam en antraal epitheel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Organoïden van maagpatiënten (BOB's) bieden een uniek hulpmiddel voor het bestuderen van maagbiologie en pathologie. Deze BOB's worden dan ook steeds vaker gebruikt in een breed scala aan onderzoekstoepassingen. Er bestaat echter een tekort aan gepubliceerde benaderingen voor het produceren van maag-BOB's uit eencellige digesten met behoud van een gestandaardiseerde initiële celzaaidichtheid. In dit protocol ligt de nadruk op het initiëren van maagorganoïden uit geïsoleerde afzonderlijke cellen en het aanreiken van een methode om organoïden door fragmentatie te laten passeren. Belangrijk is dat het protocol aantoont dat een gestandaardiseerde benadering van de initiële dichtheid van het zaaien van cellen consequent maagorganoïden oplevert uit goedaardig biopsieweefsel en een gestandaardiseerde kwantificering van organoïdegroei mogelijk maakt. Ten slotte ondersteunt bewijs de nieuwe observatie dat maag-BOB's verschillende vormings- en groeisnelheden vertonen, afhankelijk van het feit of de organoïden afkomstig zijn van biopsieën van het lichaam of antrale gebieden van de maag. In het bijzonder wordt onthuld dat het gebruik van antrale biopsieweefsel voor het initiëren van organoïden resulteert in een groter aantal gevormde organoïden en een snellere groei van organoïden over een periode van 20 dagen in vergelijking met organoïden die worden gegenereerd uit biopsieën van het maaglichaam. Het hierin beschreven protocol biedt onderzoekers een tijdige en reproduceerbare methode voor het succesvol genereren van en werken met maag-BOB's.
Inleiding
Organoïden zijn miniatuur driedimensionale (3D) cellulaire structuren die lijken op de architectuur en functionaliteit van de organen waarvan ze zijn afgeleid 1,2. Deze in het laboratorium gekweekte modellen worden gemaakt door stamcellen of weefselspecifieke cellen te kweken in een gecontroleerde omgeving die deze cellen in staat stelt zichzelf te organiseren en te differentiëren in verschillende celtypen 1,2,3. Een van de belangrijkste voordelen van organoïden is hun vermogen om de menselijke biologie nauwkeuriger te recapituleren dan traditionele tweedimensionale (2D) celculturen 1,2,3. In het bijzonder is aangetoond dat menselijke organoïden de genetische diversiteit van hun weefsel van oorsprong behouden 3,4,5. Organoïden bieden een unieke kans om de ontwikkeling van menselijke organen te bestuderen, ziekten te modelleren en potentiële therapieën te testen in een gecontroleerde laboratoriumomgeving. Bovendien kunnen organoïden worden afgeleid van individuele patiëntmonsters, waardoor gepersonaliseerde geneeswijzen en de mogelijke ontwikkeling van geïndividualiseerde behandelingen mogelijk worden 3,6,7.
Onderzoekers hebben menselijke maagorganoïden gebruikt om verschillende aspecten van maagbiologie en pathologie te onderzoeken. Prominente voorbeelden zijn het gebruik van van patiënten afgeleide organoïden (BOB's) om de chemotherapierespons op maagkankerte voorspellen 8,9,10 en de epitheliale respons op Helicobacter pylori-infectie te modelleren 11,12,13. Menselijke maagorganoïden bestaan uit verschillende celtypen die in de maag worden aangetroffen, waaronder nekcellen, pitcellen en andere ondersteunende cellen 11,14. Maagorganoïden kunnen worden gegenereerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) of stamcellen die rechtstreeks zijn geïsoleerd uit maagweefsel dat is verkregen via biopsieën of uit maagresectiemonsters11,14. Het isoleren van maagstamcellen uit maagweefsel wordt gewoonlijk gedaan door het isoleren en kweken van maagklieren of het enzymatisch verteren van weefselmonsters om afzonderlijke cellen vrij te maken 9,13,15. Belangrijk is dat is aangetoond dat de differentiatie van cellen in maagorganoïden die met een van deze technieken zijn gegenereerd, vergelijkbaar is13. Het hierin beschreven protocol richt zich op een eencellige digestie.
Organoïden vertegenwoordigen een wetenschappelijke innovatie die de kloof overbrugt tussen traditionele celkweek en hele organen. Naarmate het onderzoek in het veld vordert, staan organoïden klaar om bij te dragen aan de ontwikkeling van effectievere behandelingen en therapieën voor een breed scala aan toepassingen. Gezien het toenemende gebruik van maag-BOB's, is er tijdig behoefte aan een gestandaardiseerde aanpak voor het genereren ervan. Hier wordt het protocol beschreven voor het genereren van BOB's in de maag van de menselijke maag uit afzonderlijke cellen die zijn geïsoleerd uit goedaardig maagbiopsieweefsel dat is verkregen tijdens de bovenste endoscopie. Belangrijk en uniek is dat een gestandaardiseerd aantal afzonderlijke cellen wordt bepaald voor zaaien om op betrouwbare wijze maag-BOB's te genereren en daaropvolgende karakterisering mogelijk te maken. Met behulp van deze techniek worden betrouwbare verschillen aangetoond in de vorming en groei van organoïden die worden gegenereerd uit biopsieën van het maaglichaam of maagantrum.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Al het menselijk weefsel dat in dit protocol wordt gebruikt, is verzameld van personen die geïnformeerde toestemming hebben gegeven voor weefselverzameling via een onderzoek naar het verzamelen van maagweefsel dat is goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB #842961) van de Universiteit van Pennsylvania. Deelnemers aan deze studie moesten een bovenste endoscopie ondergaan als onderdeel van hun routinematige zorg, ten minste 18 jaar oud zijn en geïnformeerde toestemming kunnen geven. Al het uitgevoerde onderzoek voldeed aan de richtlijnen van de Universiteit van Pennsylvania.
1. Experimentele voorbereiding
- Bereid geconditioneerde L-WRN-media voor zoals eerder beschreven16. Hoewel niet verplicht, kunnen de concentraties van Wnt-3A, R-spondine en noggin in de geconditioneerde media worden gecontroleerd met behulp van een in de handel verkrijgbare ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
- Bereid RPMI-antibiotica (RPMI-ABX), PBS-antibiotica (PBS-ABX), PBS-Dithiothreitol (PBS-DTT), spijsverteringsbuffer en maagorganoïde media voor (zie aanvullende tabel 1 voor gedetailleerde samenstelling). Maagorganoïde media zijn gedurende 1 week stabiel bij 4 °C.
- Autoclaaftang, fijndissectieschaar en buisjes van 1,5 ml.
- Begin met het ontdooien van de basaalmembraanmatrix (Matrigel) op ijs.
- Begin met het ontdooien van de spijsverteringsbuffer en trypsine-EDTA in een waterbad van 37 °C.
- Stel een orbitale schudder van de couveuse in op 37 °C en 200 tpm.
2. Isoleren van afzonderlijke cellen uit het biopsieweefsel
- Verzamel maagbiopten tijdens een bovenste endoscopie17 volgens het institutionele klinische protocol, waarschijnlijk met behulp van een jumbotang. Gebruik een naald met stompe punt om weefselmonsters uit de pincet te extraheren en plaats ze in een conische buis van 15 ml met RPMI-ABX-media. Bewaar de buis op ijs voor een snelle overdracht naar het laboratorium.
OPMERKING: Er moeten minimaal 2-4 biopsieën worden verzameld. - Laat het biopsieweefsel zich op de bodem van de conische buis nestelen. Gebruik een pipet om het medium op te zuigen en was de biopsieën twee keer met 1 ml PBS-ABX-buffer. Centrifugeren is niet nodig, omdat de weefselstukjes zich op natuurlijke wijze in de conische buis nestelen.
- Breng minimaal 20 mg biopsieweefsel over in een buisje van 1,5 ml met 1 ml PBS-DTT.
- Gebruik een fijne dissectieschaar om het weefsel in stukjes van 1-2 mm of kleiner te knippen.
- Gebruik een minicentrifuge op tafel gedurende 15 seconden om weefselstukjes op de bodem van de buis samen te voegen en zoveel mogelijk supernatant op te zuigen. Een klein restvolume PBS-DTT is acceptabel.
- Voeg 5 ml vers opgewarmde digestiebuffer toe aan een conische buis van 50 ml. Om de kleine stukjes weefsel over te brengen zonder weefsel te verliezen, neemt u 500 μL van de verteringsbuffer en voegt u deze toe aan het buisje van 1,5 ml met het weefsel. Wijzig vervolgens de punt van een pipetpunt van 1000 μl met een schaar om de diameter van de punt te vergroten, zodat weefselstukjes gemakkelijk kunnen worden opgezogen en overgebracht naar de conische buis van 50 ml met de verteringsbuffer.
- Incubeer de verteringsbuffer en het weefselmengsel bij 37 °C gedurende 30 minuten met orbitaal schudden bij 200 omw/min.
- Voeg 5 ml opgewarmde trypsine met 0,25% EDTA toe aan de spijsverteringsbuffer en incubeer nog eens 10 minuten bij 37 °C met orbitaal schudden bij 200 tpm.
- Neutraliseer de digestiebuffer en trypsine door een gelijk volume Advanced (Adv.) DMEM/F12-media toe te voegen en de oplossing door een celzeef van 70 μm te leiden.
- Pelleteer de cellen door centrifugeren bij 1400 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C. Afhankelijk van de aanvankelijke grootte van het biopsieweefsel kan een kleincellige pellet al dan niet zichtbaar zijn.
- Resuspendeer de celpellet in 1 ml Adv. DMEM/F12-media en tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van Trypan Blue en een hemocytometer.
- Pelleteer de cellen opnieuw door middel van centrifugeren bij 1400 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant.
OPMERKING: Figuur 1 geeft een schematische weergave van het proces voor het isoleren van afzonderlijke cellen uit het biopsieweefsel.
3. Inbedding van enkele cellen in een "koepel" van een basaalmembraanmatrix
- Bereken op basis van het getelde aantal levensvatbare cellen het volume van de basaalmembraanmatrix dat nodig is om een uiteindelijke concentratie van 105 levensvatbare cellen per 50 μL basale membraanmatrix te bereiken.
- Voer het volgende snel uit om te voorkomen dat de basaalmembraanmatrix polymeriseert voordat u gaat plateren. Verwijder de ontdooide basaalmembraanmatrix van ijs, voeg het eerder berekende volume van de basaalmembraanmatrix toe aan de cellen en meng voorzichtig door ongeveer 10 s op en neer te pipetteren.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om tijdens deze stap geen luchtbellen te creëren. Verdun de basaalmembraanmatrix niet. - Pipetteer snel 50 μL aliquots van de basale membraanmatrix/celmix in het midden van individuele putjes in een weefselkweekplaat met 24 putjes.
- Dek de plaat met 24 putjes onmiddellijk af en draai de plaat in één vloeiende beweging ondersteboven. Plaats de omgekeerde plaat gedurende 35 minuten in een weefselkweekincubator van 37 °C om de basaalmembraanmatrix te laten polymeriseren.
OPMERKING: Het omkeren van de plaat is essentieel om te voorkomen dat de cellen naar de bodem van de plaat zinken en om de basale membraanmatrix in staat te stellen te polymeriseren tot een 3D "koepelvorm". - Voeg 500 μL voorverwarmde maagorganoïde media toe aan elk putje en zorg ervoor dat de bovenkant van elke "koepel" volledig ondergedompeld is in het medium. Doseer de media langs de zijkant van elke put om te voorkomen dat de "koepel" wordt verstoord.
- Vervang de media elke 2-3 dagen.
4. Routinematige doorgifte van organoïden via fragmentatie
- Zodra de organoïden klaar zijn om te passeren, verwijdert u de media uit elke aangewezen put.
OPMERKING: Om het juiste tijdstip voor het passeren te bepalen, raadpleegt u het gedeelte Representatieve resultaten. - Doseer 1 ml ijskoude Adv. DMEM/F12-media rechtstreeks op een "dome" van de basaalmembraanmatrix. Dit zou gemakkelijk het uiteenvallen van de "koepel" in gang moeten zetten. Ga door met opzuigen en doseren totdat alle fragmenten van de "koepel" loskomen van de plaat.
- Transporteer zowel de media als de gefragmenteerde basaalmembraanmatrix naar de volgende put en herhaal dit proces voor alle putten die gepland zijn voor passaging. Na het demonteren van de laatste "koepel" van de basaalmembraanmatrix, doseert u de media en het mengsel van organoïden en de basaalmembraanmatrix in een buis van 1,5 ml.
- Bevestig een tip van 1000 μl aan een P1000-pipet en steek deze tip vervolgens in een tip van 200 μl. Hierdoor ontstaat een pipetpunt met een diameter die klein genoeg is om de organoïden te fragmenteren, terwijl toch een groter volume kan worden opgezogen.
- Pipeteer het mengsel van organoïden en de basaalmembraanmatrix ongeveer 25 keer op en neer om de organoïden in kleine stukjes te fragmenteren.
- Centrifugeer het gefragmenteerde organoïdemengsel met behulp van een tafelcentrifuge bij 4 °C gedurende 30 s bij 2000 x g. Dit zal resulteren in een korrel van gefragmenteerde organoïden gescheiden van de basale membraanmatrix en media. Gebruik een pipet om de supernatant van de media en de basaalmembraanmatrix op te zuigen. Gebruik geen vacuüm om het supernatant op te zuigen, omdat de pellet los zit.
- Bereken het volume van de pas ontdooide basaalmembraanmatrix die nodig is, zodat het aantal putten/koepels wordt gesplitst in een verhouding van 1:2 (50 μL/koepel). Voeg de verse basaalmembraanmatrix toe en pipetteer voorzichtig op en neer om te mengen, zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.
- Breng snel 50 μl van het mengsel van organoïdefragmenten en basaalmembraanmatrix aan in afzonderlijke putjes van een plaat met 24 putjes.
- Dek de plaat af, draai hem ondersteboven en plaats hem gedurende 35 minuten in een weefselkweekincubator van 37 °C om de basaalmembraanmatrix te laten polymeriseren.
- Voeg 500 μL voorverwarmde maagorganoïdemedia toe aan elk putje.
OPMERKING: Figuur 2 geeft een schematisch overzicht van het passeren van organoïden afkomstig van maagpatiënten door fragmentatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De daaropvolgende representatieve resultaten zijn afgeleid van biopsieën genomen uit het goedaardige epitheel van zowel het maaglichaam als de maagantrumgebieden van de maag van vijf verschillende patiënten die een bovenste endoscopie ondergaan. Twee tot vier "koepels"/putjes werden per patiënt geplateerd en geanalyseerd voor zowel maaglichaam- als antrumbiopten. Organoïden werden met succes gegenereerd uit het maaglichaam en maagantrumbiopsieweefsel van alle vijf patiënten. Gemiddeld werden er 41 organoïden per "dome"/p...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hierin wordt een gedetailleerd protocol geschetst voor het betrouwbaar genereren van menselijke maagorganoïden uit afzonderlijke cellen geïsoleerd uit biopsieën van goedaardig epitheel uit het maaglichaam en antrum. Kritieke stappen in het protocol draaien om timing en het hanteren van de basaalmembraanmatrix. Om de levensvatbaarheid te behouden, is het essentieel om het protocol zo snel mogelijk na het verkrijgen van het biopsieweefsel te starten. Het doel is om binnen 30 minuten na de biopsie te beginnen met het verter...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen relevante openbaarmakingen.
Dankbetuigingen
Universiteit van Pennsylvania Genomic Medicine T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Men & BRCA-programma in het Basser Center for BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
Referenties
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020).
- Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359(2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255(2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819(2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519(2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151(2023).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
