Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Regulering van Schwann-celgroei door nanoseconde gepulseerd elektrisch veld voor perifere zenuwregeneratie in vitro

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66097

⸱

3 mei 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het toepassen van nanoseconde pulse electric field (nsPEF) om Schwann-cellen in vitro te stimuleren. De synthese en secretiecapaciteit van relevante factoren en veranderingen in celgedrag valideerden de succesvolle stimulatie met behulp van nsPEF. De studie geeft een positief beeld van de perifere zenuwregeneratiemethode.

Samenvatting

Schwann-cellen (SC's) zijn myeliniserende cellen van het perifere zenuwstelsel en spelen een cruciale rol bij de regeneratie van perifere zenuwen. Nanosecond Pulse Electric Field (nsPEF) is een opkomende methode die kan worden toegepast bij elektrische stimulatie van zenuwen en waarvan is aangetoond dat deze effectief is bij het stimuleren van celproliferatie en andere biologische processen. Om te beoordelen of SC's significante veranderingen ondergaan onder nsPEF en om het potentieel voor nieuwe methoden voor perifere zenuwregeneratie te onderzoeken, werden gekweekte RSC96-cellen onderworpen aan nsPEF-stimulatie bij 5 kV en 10 kV, gevolgd door voortgezette teelt gedurende 3-4 dagen. Vervolgens werden enkele relevante factoren die door SC's tot expressie werden gebracht, beoordeeld om de succesvolle stimulatie aan te tonen, waaronder het specifieke markereiwit, de neurotrofe factor, de transcriptiefactor en de myelinisatieregulator. De representatieve resultaten toonden aan dat nsPEF de proliferatie en migratie van SC's aanzienlijk verbeterde en het vermogen om relevante factoren te synthetiseren die positief bijdragen aan de regeneratie van perifere zenuwen. Tegelijkertijd duidde een lagere expressie van GFAP op de goedaardige prognose van perifere zenuwletsels. Al deze resultaten tonen aan dat nsPEF een groot potentieel heeft als een efficiënte behandelmethode voor perifere zenuwletsels door SC's te stimuleren.

Inleiding

Elk jaar worden miljoenen mensen getroffen door zenuwletsel waarbij zowel het perifere zenuwstelsel (PNS) als het centrale zenuwstelsel (CZS) betrokken zijn1. Studies hebben aangetoond dat de axonale herstelcapaciteit van het CZS vrij beperkt is na zenuwletsel, terwijl het PNS een verhoogde capaciteit vertoont vanwege de aanzienlijke plasticiteit van SC's2. Desalniettemin blijft het bereiken van volledige regeneratie na perifere zenuwbeschadigingen moeilijk en blijft het een aanzienlijke uitdaging vormen voor de menselijke gezondheid 3,4. Tegenwoordig zijn autotr....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Ontdooien van gecryopreserveerde RSC96-cellen

  1. Ontdooi de cryovial met 1 ml celsuspensie door deze snel te schudden in een waterbad van 37 °C, voeg het vervolgens toe aan een centrifugebuis met 4-6 ml compleet kweekmedium en meng goed.
  2. Centrifugeer bij 1000 x g gedurende 3-5 minuten, gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in 3 ml volledig kweekmedium.
  3. Voeg de celsuspensie toe aan een kweekkolf (of schaal) met 6-8 ml volledig kweekmedium en incubeer een nacht bij 37 °C.
  4. Bekijk de volgende dag de celgroei en -dichtheid onder een microscoop.

2. Cel pass....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Gepulseerde elektrische velden met lage intensiteit stimuleren de celproliferatie
Volgens de CCK-8-test was de proliferatiesnelheid van RSC96 in de 5 kV/cm-groep significant sneller dan die van de cellen in de controlegroep. Naarmate de parameters echter toenamen (20 kV/cm en 40 kV/cm), was de proliferatiesnelheid onstabiel, zelfs lager dan die van de controlegroep. De celproliferatiesnelheid van RSC96-cellen in de 40 kV/cm-groep was significant lager dan die van de controlegroep en de 5 kV/cm-groep, .......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In de afgelopen jaren heeft de toepassing van nsPEF een stimulerende groei doorgemaakt, zoals gemeld. nsPEF heeft een zeer gericht effect op alleen het gewenste gebied en levert voldoende energie om te behandelen zonder extra thermische schade te veroorzaken, waardoor het veiliger is voor het menselijk lichaam28. Deze kenmerken geven het veelbelovende translationele vooruitzichten in tumorbehandeling en zenuwregeneratie. Sommige studies hebben echter enkele beperkingen van nsPEF voorgesteld. In ve.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door het National Key Scientific Instrument and Equipment Development Project (NO.82027803).

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antifade mounting mediumWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1401
Anti-GFAP Mouse mAbWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB12100-100
Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAbWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB12144-100
Anti-S100 beta Mouse mAbWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB14146-100
BSAWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGC305010
CoverslipJiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD10212432C
CY3-labeled goat anti-mouse IgGWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB21302
DAPI Staining ReagentWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1012
Decolorizing shakerWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDDS-2S100
High Voltage Power Supply for nsPEFMatsutada Precision Inc.AU-60P1.6-L
Histochemical penWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG6100
Membrane breaking liquidWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1204
Microscope slideWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG6012
Palm centrifugeWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDMS6000
PBS powderedWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG0002
PipetteWuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
Positive fluorescence microscopeNikon, JapanNIKON ECLIPSE C1
Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibodyBeijing Bioss Biotechnology Co., LTDBS-20563R-AF488
RSC96 Schwann cellsWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDSTCC30007G-1
Scanister3DHISTECHPannoramic MIDI
Special cable for nsPEFTimes Microwave SystemsM17/78-RG217
Turbine mixerWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDMV-100

Referenties

  1. Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. ACS Chem Neurosci. 10 (1), 348-357 (2018).
  2. Nocera, G., Jacob, C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

RSC96-cellencelproliferatiecelmigratieCCK-8-assayscratch-assayS100-bèta-expressieSox10-expressie