Methodenartikel

Kwantitatieve analyse van mitochondriën-geassocieerde endoplasmatisch reticulummembraan (MAM) stabilisatie in een neuraal model van de ziekte van Alzheimer (AD)

DOI:

10.3791/66129

⸱

10 januari 2025

 ,  ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Alzheimer's Disease Research Laboratory, Department of Neuroscience, Tufts University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we het meten van de axonale transportsnelheid van constitutieve stabilisatoren van mitochondriën-geassocieerde endoplasmatisch reticulum (ER) membranen (MAM's) door de neurotoxische β-amyloïde (Aβ) generatie van neuronen van de ziekte van Alzheimer (AD) in realtime te verhogen of te behouden om te dienen als een directe en kwantitatieve metriek om MAM-stabilisatie te meten en de ontwikkeling van AD-therapieën te ondersteunen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een methode om de stabilisatie van mitochondriën-geassocieerde endoplasmatisch reticulummembranen (MAM's) in een 3-dimensionaal (3D) neuraal model van de ziekte van Alzheimer (AD) te kwantificeren, wordt hier gepresenteerd. Om te beginnen worden verse menselijke neuro-voorlopercellen die β-amyloïde voorlopereiwit (APP) tot expressie brengen dat familiale ziekte van Alzheimer (FAD) of naïeve ReN-cellen bevat, gekweekt in dunne (1:100) met Matrigel gecoate weefselkweekplaten. Nadat de cellen samenvloeiing hebben bereikt, worden deze geëlektropoleerd met expressieplasmiden die coderen voor rood fluorescentie-eiwit (RFP)-geconjugeerde mitochondriën-bindende sequentie van AKAP1(34-63) (Mito-RFP) die mitochondriën of constitutieve MAM-stabilisatoren MAM 1X of MAM 9X detecteert die respectievelijk strakke (6 nm ± 1 nm kloofbreedte) of losse (24 nm ± 3 nm kloofbreedte) MAM's stabiliseren. Na 16-24 uur worden de cellen geoogst en verrijkt met een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS). Een gelijk aantal met FACS verrijkte cellen wordt gezaaid in de 3-dimensionale matrix (1:1 Matrigel) en mag gedurende 10 dagen differentiëren tot rijpe neuronen. Live celbeelden van de 10-daagse gedifferentieerde cellen die de RFP-geconjugeerde MAM-stabilisatoren tot expressie brengen, worden vastgelegd onder een fluorescerende microscoop die is uitgerust met een live-cell beeldvormingskweekkamer die de CO2 (5%), temperatuur (37 °C) en vochtigheid (~90%) handhaaft. Daartoe hebben we beeldvorming van levende cellen en kymografische analyses uitgevoerd om de beweeglijkheid te meten van vrije mitochondriën gelabeld met Mito-RFP of ER-gebonden mitochondriën van krappe of losse openingen gestabiliseerd door respectievelijk MAM 1X of MAM 9X, in het meest uitgebreide neuronale proces van elk ReN GA-neuron dat ten minste 500 nm lang is, waarbij deze als axonen worden beschouwd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opkomend bewijs suggereert dat de gespecialiseerde mitochondriën-geassocieerde endoplasmatisch reticulumcontacten (MERC's), biochemisch geoogst als mitochondriën-geassocieerde ER-membranen, vaak aangeduid als MAM's 1,2, een rol spelen bij verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder AD 3,4. Deze MAM's zijn samengesteld uit cholesterolrijke lipidevlot-achtige microdomeinen in het ER en het buitenmembraan van mitochondriën, verbonden door een reeks eiwitten die structurele en functionele diversiteit creëren tussen de MAM's 5,6,7. De recent bedachte MAM-hypothese stelt dat de toename van MAM's leidt tot een verhoogde Aβ-productie en de pathogene cascade van AD, waaronder de vorming van neurofibrillaire tangle (NFT), calciumdyshomeostase en neuro-inflammatie 3,8. Ongeveer 5%-20% van de mitochondriën maakt fysiek contact met het ER om MAM's9 te vormen. De spleetbreedte van MAM's wordt bepaald door de gladde en ruwe ER (respectievelijk sER en rER). De variabele kloofbreedte tussen sER-mitochondriën (10-50 nm) en rER-mitochondriën (50-80 nm) suggereert dat de kloofbreedte van MAM's een lang spectrum heeft dat varieert van strak (~10 nm) tot los (~80 nm)10,11,12,13. De breedte van de MAM-kloof bepaalt MAM-functies, zoals calciumhomeostase en lipidentransport 1,14. Een recent rapport heeft aangetoond dat de MAM's gevormd tussen nauw (~ 10 nm) verbonden ER en mitochondriën, volledige MAM's genoemd, apoptotisch zijn. Daarentegen zijn MAM's gevormd tussen losjes verbonden (~25 nm) ER en mitochondriën, defecte of medium MAM's genoemd, anti-apoptotisch 14,15,16. Stabilisatie van MAM's met een spleetbreedte van 6 nm ± 1 nm verhoogde de Aβ-generatie van een nieuw 3-dimensionaal (3D) neuraal cultuurmodel van AD. Daarentegen heeft de stabilisatie van MAM's met een spleetbreedte van 24 nm ± 3 nm geen effect op Aβ generatie17. Deze bevinding suggereert voor het eerst dat het reguleren van de mate van MAM-stabilisatie, maar het niet destabiliseren van MAM's, de sleutel is tot het reguleren van Aβ-generatie. Een poging om MAM's volledig te destabiliseren kan ongewenste gevolgen hebben, omdat MAM's verschillende cellulaire gebeurtenissen in stand houden die cruciaal zijn voor de overleving van cellen12.

De modulatie van MAM's is een opkomend onderzoeksgebied met mogelijke implicaties voor verschillende aandoeningen, waaronder kanker, stofwisselingsstoornissen en neurodegeneratieve ziekten18. Ondanks de beschikbaarheid van veel MAM-modulatoren, is er tot nu toe geen grote poging gedaan om hun vermogen te testen om MAM's te destabiliseren en AD-pathologie te verlagen, voornamelijk omdat de structurele diversiteit van MAM's ze tot een zeer complex systeem maakt om zich op te richten bij het ontdekken van geneesmiddelen. Maar de nieuw ontwikkelde farmacologie van structurele systemen, die rekening houdt met de specifieke eigenschappen van de medicijndoelen en hun omgeving18,19 zou de moeilijkheden moeten overwinnen en zeer krachtige medicijnen moeten ontwikkelen die gericht zijn op MAM's of MAM-geassocieerde eiwitten bij AD. De zoektocht naar een effectieve modulator van MAM-stabilisatie vereist echter methoden om de mate van MAM-stabilisatie nauwkeurig te kwantificeren. Traditionele technieken zoals elektronenmicroscopie (EM) of superresolutiemicroscopie hebben beperkingen bij het bepalen van MAM-stabilisatie. Om deze uitdagingen te overwinnen, zou waarschijnlijk de ontwikkeling van nieuwe, meer dynamische beeldvormingstechnieken of biochemische tests nodig zijn die kwantitatieve metingen van MAM-stabilisatie in levende cellen kunnen bieden. Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) van primaire neuronen onthulde dat het ER de neiging heeft om een netwerk rond mitochondriën te vormen dat de mitochondriale motiliteit waarschijnlijk beperkt20,21. De verstoring van mitochondriale transportsystemen, retrograde, anterograde of beide, had een diepgaande invloed op de synaptische en neuronale functie22. De nieuwe beeldvorming van levende cellen en op kymografie gebaseerde analyse van de axonale snelheid van ER-gebonden mitochondriën, hier beschreven als een metriek om MAM-stabilisatie kwantitatief te meten, zal dus de identificatie van MAM-modulator(en) vergemakkelijken die de MAM-stabilisatiedrempel kunnen omschakelen naar een drempel die de Aβ-generatie handhaaft of mogelijk verlaagt, in tegenstelling tot verhoging.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AD neurale cultuur modellen: Deze studie maakte gebruik van neuronen afgeleid van menselijke neurale voorlopercellen ReN-cellen [naïeve ReN (Millipore)] of ReN-cellen die familiale AD (fAD)-mutaties tot expressie brengen in het amyloïde voorlopereiwit (APP)-gen (APPSwe/Lon), ReN GA-cellen. Het driedimensionale (3D) kweeksysteem van ReN-GA recapituleert AD-pathologie, namelijk Aβ-oligomeer-aangedreven neurofibrillaire knopen (NFT's) 23,24. Naïeve ReN-cellen zijn in de handel verkrijgbaar. ReN GA-lijnen werden verkregen van Dr. Doo Y. Kim, universitair hoofddocent, Massachusetts General Hospital (MGH)23,24,25.

Expressie plasmiden: AKP1 (34-63) en ER-targeting-sequentie van Ubc 6 (283-303) eiwitten die rechtstreeks verband houden met RFP (Mito-RFP-ER aangeduid als MAM 1X) of een 9-aminozuurlinker bevatten (Mito-9X-RFP-ER aangeduid als MAM 9X) ontworpen om MAM's van 6 nm ± 1 nm of 24 nm + 3 nm kloofbreedtes te stabiliseren, respectievelijk15,26 (Figuur 1A).

1. Elektroporatie

  1. Transfecteren van de cellen met MAM-stabilisatoren (1-2 uur)
    NOTITIE: Volg het protocol dat is beschreven door de fabrikant van de nucleofectorkit (Tabel met materialen). Voordat u begint, bereidt u 6-puts met glasbodem cultuurschalen die voorgecoat zijn met DMEM/F12 met 1% Matrigel (hierna aangeduid als basaalmembraanmatrix [BMM]). Gebruik 2 ml BMM om elk putje te coaten. Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C. BMM, media, pipetpunten en pipetten moeten allemaal worden voorgekoeld voordat u ze mengt om te voorkomen dat BMM stolt.
    1. Zuig het BMM-mengsel op. Vervang door 2 ml kamertemperatuur (RT) DMEM/F12 in elk putje.
    2. Combineer Nucleofector met Supplement 1 in een verhouding van 4,5:1 (82 μL:18 μL Nucleofector/Supplement verhouding voor 100 μL oplossing). Voor elke gewenste transfectie is 100 μL Nucleofector nodig.
    3. Vortex DNA. Voeg vervolgens 1-5 μg DNA (per behandeling) toe in microcentrifugebuizen van 1 ml voor elke transfectie.
    4. Gebruik acustase om een plaat met gezonde ReN-GA-cellen te oogsten.
      OPMERKING: Plaatcellen in expansiemedia (tabel 1) in weefselkweekschaaltjes van 100 mm en wacht tot de samenvloeiing 70-80% bereikt.
      1. Zuig de bestaande media op en was één keer met 10 ml PBS.
      2. Voeg 1 ml acutase rechtstreeks aan de cellen toe en incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 °C.
      3. Maak cellen los van de schaal door zachtjes op de zijkant van de schaal te tikken. Controleer onder een microscoop om er zeker van te zijn dat de cellen loskomen en vrij kunnen stromen.
      4. Neutraliseer acutase met 10 ml DMEM/F12 en breng over naar een schone tube van 15 ml.
      5. Centrifugeer het vereiste aantal cellen bij 274 x g gedurende 5 minuten en zuig het bovenstaande op om dode cellen te verwijderen. Resuspendeer de pellet vervolgens in 10 ml DMEM/F12.
    5. Tel de cellen om de dichtheid te bepalen.
      OPMERKING: In dit onderzoek werd een geautomatiseerde cellenteller gebruikt om het aantal cellen te tellen. Per elektroporatie zijn 3-5 X 106 cellen nodig (bijv. voor 5 behandelingen zijn 15-25 X 106 cellen nodig).
      1. Neem 10 μL van de zwevende cellen en voeg toe aan kant A van een celtelkamer. Voeg vervolgens 10 μL toe aan kant B.
        OPMERKING: Voeg de celsuspensie toe door de pipet opzij te kantelen. Voorkom luchtbellen door niet verder te duwen dan de eerste stop op de zuiger van de pipet.
      2. Breng de gevulde telkamer naar de cellenteller en steek kant A in de hoofdgleuf aan de voorkant.
      3. Noteer na het drukken op Meten het aantal cellen per ml.
      4. Haal de kamer eruit, draai naar kant B en herhaal stap 1.1.5.2-1.1.5.3.
      5. Tel deze twee getallen bij elkaar op, deel ze vervolgens door 4 (als je geen Trypan Blue gebruikt) en vermenigvuldig het getal vervolgens met de milliliter vloeistof waarin de cellen zijn gesuspendeerd om het totale aantal cellen in de suspensie te krijgen.
    6. Centrifugeer het vereiste aantal cellen bij 274 x g gedurende 5 minuten en aspireer het supernatant op.
    7. Resuspendeer de pellet in 100 μL Nucleofector mix per elektroporatie. (bijv. 500 μL voor 5 behandelingen).
      OPMERKING: Als u de cellen langer dan 15 minuten in de Nucleofector-oplossing laat, kan dit de levensvatbaarheid van de cellen en de algehele werkzaamheid verminderen.
    8. Voeg 100 μl van de celsuspensie toe aan een van de buisjes met DNA en meng door te pipetteren.
    9. Breng het DNA-mengsel over in een elektroporatiecuvet en sluit af met het meegeleverde deksel. Om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan, kantelt u de cuvet naar beneden en pipett u langzaam.
    10. Selecteer het Nucleofector-programma dat geschikt is voor het apparaat dat wordt gebruikt. Voor het apparaat dat in deze studie wordt gebruikt, gebruik programma A-033 voor transfectie. Probeer alle 5 Nucleofector-programma's om te bepalen welke het meest geschikt is voor elk celtype.
      OPMERKING: Een bevestiging van een succesvolle elektroporatie is zichtbaar schuim aan de bovenkant van het mengsel.
    11. Voeg onmiddellijk met behulp van de meegeleverde steriele pipetten ~500 μL DMEM van de voorgevulde plaat met 6 putjes toe aan de cuvet. Meng één keer voorzichtig en breng vervolgens de geëlektroporeerde cellen en het medium over naar de bijbehorende put.
      OPMERKING: Na elektroporatie zijn de cellen extreem gevoelig, dus het is essentieel om de media snel over te brengen en voorzichtig te pipetteren.
    12. Herhaal stap 1.1.8-1.1.11 voor alle resterende DNA-behandelingen.
    13. Incubeer de cellen een nacht bij 37 °C in aanwezigheid van CO2 (5%).
    14. Vervang de volgende dag media met verse differentiatiemedia (tabel 2) en laat de cellen gedurende 10 dagen differentiëren. Vervang elke 2-3 dagen door verse media.

2. Live beeldvorming van cellen

  1. Preparaat van cellen voor levende celmicroscopie (30 min)
    1. Bereiding van de levende celkamer (voordat de cellen naar de kamer worden verplaatst)
    2. Zorg ervoor dat de CO2 -tank en luchtbevochtiger aan de kamer zijn bevestigd, de kleppen open zijn en de tanks gevuld zijn.
    3. Stel de temperatuur in op 37 °C, de CO2 op 5% en de luchtvochtigheid op 95%. (Dit kan enige tijd duren voordat de niveaus in evenwicht zijn).
    4. Plaats een plaat met 6 putjes met cellen in de kamer en pas de focus van de microscoop aan totdat de cellen zichtbaar worden.
    5. Zet de laser aan (Materiaaltabel).
    6. Om het RFP-signaal vast te leggen, exciteert u de fluorofoor met behulp van een laser van 594 nm en gebruikt u een emissie van 570-640 nm. Gebruik voor GFP een laser van 488 nm voor excitatie en emissie van 510-540 nm.
    7. Gebruik het ingebouwde fluorescerende filter om de signaalintensiteit aan te passen totdat het achtergrondsignaal is verdwenen (moet bijna effen zwart zijn).
  2. Live video van axonen vastleggen (10 uur-15 uur in totaal)
    OPMERKING: Een Nikon C2 Eclipse Ti2 omgekeerde confocale microscoop werd gebruikt om fluorescerende beelden vast te leggen met behulp van NIS Element AR-software. Gebruik een vergroting van 60x bij een resolutie van 512 pixels, waarbij video's met 1 frame per seconde gedurende 3 minuten schonere kymografen worden geproduceerd.
    1. Zoek een cel die RFP-biosensoren tot expressie brengt. Exporteer een afbeelding van de cel voor later gebruik voordat u een video maakt.
    2. Snijd het scangebied bij zodat het rond het axon past. Het gebruik van een kleiner scangebied verkort de verwerkingstijd van de microscoop en maakt het genereren van kymografie veel eenvoudiger.
    3. Schakel alle lasers uit om de software soepeler te laten werken. Houd er rekening mee dat wanneer het programma wordt uitgevoerd met alle lasers actief, niet alle frames worden vastgelegd.
      OPMERKING: Het rode fluorescerende signaal van de soma is veel helderder dan in het axon. Daarom is de soma uitgesloten om de algehele signaalintensiteit in het axon te verhogen. Ga naar het tabblad Tijdmeting .
    4. Stel het interval in op 1 frame per seconde en stel de totale tijd in op 181 s.
    5. Klik op Uitvoeren.
    6. Sla dit bestand op als een .nds-bestand (correct gelabeld) en herhaal het proces ~10 keer per MAM-stabilisatoren (MAM 1X of MAM 9X).
      OPMERKING: De sterkte van de laser veroorzaakte soms een merkbaar blekend effect op het RFP-signaal als het te lang werd gescand. Snel werken om video's vast te leggen is belangrijk om te overwegen.

3. Nabewerking (7 dagen)

OPMERKING: Om transport te analyseren en kymografen te genereren, werden Fiji ImageJ-macro's gebruikt. Blaasjes die minder dan 0,1 mm/s bewogen, werden gecategoriseerd als stationair. De frequentie van de beweging van de deeltjes werd berekend door het aantal deeltjes dat in een bepaalde richting (anterograde, retrograde) of niet beweegt (stationair) te delen door het totale aantal deeltjes dat in de kymograaf is geanalyseerd. De tijd die elk blaasje besteedde aan pauzeren of bewegen, werd berekend door het gemiddelde te nemen van het percentage van de tijd dat in elke toestand werd doorgebracht voor alle blaasjes in elk geanalyseerd neuron. De frequentieverdeling voor snelheid en looplengte werd berekend met behulp van alleen bewegende blaasjes voor elke experimentele conditie. De analyse werd gedurende 3 minuten uitgevoerd op axonale banen van 100 mm.

  1. Een kymograaf genereren
    1. Open het .nds-bestand in Fiji ImageJ.
    2. Ga naar het tabblad Afbeelding en klik op Eigenschappen. Noteer de pixel-micronverhouding. Dit is nodig voor de berekening later.
    3. Klik op Bestand > Opslaan als > Tiff om het bestand als .tiff op te slaan in de map (de macro slaat automatisch alles op wat in deze map wordt gegenereerd).
    4. Sleep de Kymo-macro naar ImageJ. De code wordt verstrekt in aanvullend coderingsbestand 1. Klik op Uitvoeren.
    5. Druk niet op OK. Schakel over naar het MAX_raw venster. Klik handmatig met de linkermuisknop langs het axon en dubbelklik om het volgen te beëindigen.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u het axon volgt vanaf de soma, dus de axon-terminal. Op deze manier zullen de anterograde en retrograde berekeningen correct zijn.
    6. Druk op command T of Add op de ROI-manager.
    7. Klik nu op OK. Er wordt een kymograaf gegenereerd in de eerder gemaakte map. (De X-as is de axonlengte in micron en de Y-as is de tijd in seconden).
  2. De kymograaf volgen
    1. Sleep de kymograaf naar Fiji Image J (deze zou automatisch in de eerder gemaakte map moeten worden geplaatst).
    2. Sleep de Track-macro naar Afbeelding J.
    3. Klik bij de volgende prompt op OK. Als u het werk van eerder hervat, voert u het nummerpunt in om verder te gaan en drukt u vervolgens op OK.
    4. Selecteer met het gereedschap Rechthoek in het deelvenster Selecteren een gebied in het midden van de kymograaf met een hoogte van 60 pixels en een diameter van altijd 100 μm. Deel hiervoor 100 door de pixel-tot-microverhouding die in stap 3.1.2 is vastgelegd.
    5. Nadat u een gebied hebt geselecteerd, drukt u op Ctrl T om i t toe te voegen aan de ROI en de ROI op te slaan in de map waarin wordt gewerkt (druk op Meer in het ROI-menu en vervolgens op Opslaan).
      OPMERKING: Als u het geselecteerde gebied omkeert door op Ctrl+Shift+I te drukken, wordt het gemakkelijker om te volgen.
    6. Als u de beweging van een individueel blaasje wilt volgen, houdt u Ctrl ingedrukt terwijl u met de linkermuisknop van boven naar beneden klikt.
    7. Om klaar te zijn, houdt u Ctrl ingedrukt terwijl u met de rechtermuisknop klikt en er verschijnt een venster dat laat zien waar de axonen worden gevolgd. Als dit er goed uitziet, drukt u op OK.
    8. Om verder te gaan en een ander blaasje te selecteren, klikt u op Ja en herhaalt u het proces uit de stappen 3.2.6-3.2.8. Zodra elk zichtbaar blaasje is gevolgd, drukt u op Nee. Hiermee wordt de met de hand gevolgde overlay automatisch opgeslagen in dezelfde map.
  3. Meten van de kymograafgegevens
    1. Maak een nieuwe map. Sleep elk gegenereerd tekstbestand naar de map.
    2. Open het kymograafbestand en noteer de afmetingen.
    3. Sleep de macro Meten naar Afbeelding J.
    4. Voer de eerder opgenomen micron-pixelverhouding in PixelScale in.
    5. Verander de snelheidslimiet laag in 0.1. (Blaasjes die onder deze limiet bewegen, worden als stationair beschouwd).
    6. Voer de eerder geregistreerde kymograafafmetingen in. Het samenvattingsbestand wordt automatisch gegenereerd in de gemaakte tekstmap. Elke overzichtsvulling bevat %, Afgelegde tijd, Totale snelheid (μm/s), Totale afstand, Gemiddeld afgelegd segment, Aantal keren gestopt en Aantal keren omgekeerd. De code voor het genereren, volgen en meten van de kymograafgegevens wordt geleverd als aanvullend coderingsbestand 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beeldvorming van levende cellen en kymografische analyses werden uitgevoerd om de beweeglijkheid te meten van vrije mitochondriën gelabeld met Mito-RFP of ER-gebonden mitochondriën van strakke (6 nm ± 1 nm) of losse (24 nm ± 3 nm) contactbreedtes gestabiliseerd door respectievelijk MAM 1X of MAM 9X, in het langste neuronale proces van elk ReN GA (AD) of ReN (naïef) neuron dat ten minste 500 nm lang is, dit beschouwen als een axon (Figuur 1 en

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Remming van de sigma-1-receptor (S1R) verminderde de MAM-stabilisatie in de neuronale processen en verminderde dramatisch (~90%) Aβ-generatie uit axonen maar niet uit soma van een driedimensionaal (3D) kweeksysteem van menselijke neurale voorlopercellen (ReN) die familiale AD [FAD] mutaties tot expressie brengen in het amyloïde voorlopereiwit [APP] gen (ReN GA)23,24,25,27

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Dr. György Hajnóczky, professor, Thomas Jefferson University, Philadelphia voor het genereus verstrekken van expressieplasmiden die coderen voor RFP-Mito, MAM 1X, MAM 9X en MAM 18X. Een speciale dank aan Dr. Lai Ding, Senior Imaging Scientist, Brigham and Women's Hospital voor zijn hulp bij het schrijven van de code voor het genereren, volgen en meten van de kymograafgegevens. Deze studie werd ondersteund door het Cure Alzheimer's Fund aan RB en NIH-subsidie 5R01NS045860-20 aan RET.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
6 Well Glass Bottom PlateCellvisP06-1.5H-N
B-27 Supplement (50X), serum freeGibco/Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFR&D System 233-FB
BSAFisher Scientific501781532
Countess Cell Counting Chamber SlidesInvitrogenC10283
DMEM/F12 with L-glutamine Gibco/Thermo Fisher Scientific11320-033
EDTA  Life Technologies41116134
EGFSigma-Aldrich92090408
Falcon 6 Well Plates VWR International41122107
GAPDH Polyclonal AntibodyThermo Fisher ScientificPA1-988
Gelatin VWR International9000-70-8
Graphpad Prism N/APrism 9, version 9.5.0N/A
HeparinSigma-Aldrich H0200000
ImageJ Software ImageJ 1.53aN/A
Matrigel Basement Membrane Matrix  Corning356234
mCherry Polyclonal AntibodyInvitrogenPA5-34974
MS Excel  Microsoft Excel, version 2302N/A
Multi-array electrochemiluminescence assay kitMeso Scale Diagnostics (MSD)K15200E-2V-PLEX Aβ Peptide Panel 1 (6E10) kit
NaCl  Fisher Scientific7647145
NuPAGE 4–12% Bis-Tris gel  InvitrogenNP0321BOX
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Lonza 17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Rat Neuron Nucleofector KitLonzaVPG-1003
StemPro Accutase GibcoA1110501
Tris-HCL, pH 7.6  Boston BioProducts42000000
Triton X-100  Sigma-AldrichT8787
Tween 20Fisher Scientific501657287

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Giacomello, M., Pellegrini, L. The coming of age of the mitochondria-ER contact: a matter of thickness. Cell Death Differ. 23 (9), 1417-1427 (2016).
  2. Degechisa, S. T., Dabi, Y. T., Gizaw, S. T. The mitochondrial associated endoplasmic reticulum membranes: A platform for the pathogenesis of inflammation-mediated metabolic diseases. Immun Inflamm Dis. 10 (7), e647(2022).
  3. Schon, E. A., Area-Gomez, E. Mitochondria-associated ER membranes in Alzheimer disease. Mol Cell Neurosci. 55, 26-36 (2013).
  4. Erpapazoglou, Z., Mouton-Liger, F., Corti, O. From dysfunctional endoplasmic reticulum-mitochondria coupling to neurodegeneration. Neurochem Int. 109, 171-183 (2017).
  5. Sala-Vila, A., et al. Interplay between hepatic mitochondria-associated membranes, lipid metabolism and caveolin-1 in mice. Sci Rep. 6, 27351(2016).
  6. Fujimoto, M., Hayashi, T. New insights into the role of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane. Int Rev Cell Mol Biol. 292, 73-117 (2011).
  7. Hung, V., et al. Proteomic mapping of cytosol-facing outer mitochondrial and ER membranes in living human cells by proximity biotinylation. eLife. 6, e24463(2017).
  8. Area-Gomez, E., Schon, E. A. On the pathogenesis of Alzheimer's disease: The MAM hypothesis. FASEB J. 31 (3), 864-867 (2017).
  9. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).
  10. Sukhorukov, V. S., et al. Molecular mechanisms of interactions between mitochondria and the endoplasmic reticulum: A new look at how important cell functions are supported. Mol Biol. 56 (1), 59-71 (2022).
  11. Zhang, P., Konja, D., Zhang, Y., Wang, Y. Communications between Mitochondria and endoplasmic reticulum in the regulation of metabolic homeostasis. Cells. 10 (9), 2195(2021).
  12. Ziegler, D. V., Martin, N., Bernard, D. Cellular senescence links mitochondria-ER contacts and aging. Commun Biol. 4 (1), 1323(2021).
  13. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).
  14. Cieri, D., et al. SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  15. Carpio, M. A., et al. BOK controls apoptosis by Ca(2+) transfer through ER-mitochondrial contact sites. Cell Rep. 34 (10), 108827(2021).
  16. Prudent, J., et al. MAPL SUMOylation of Drp1 stabilizes an ER/mitochondrial platform required for cell death. Mol Cell. 59 (6), 941-955 (2015).
  17. Zellmer, J. C., Tarantino, M. B., et al. Stabilization of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes regulates Abeta generation in a three-dimensional neural model of Alzheimer’s disease. Alzheimer’s Dement. , 1-20 (2024).
  18. Magalhaes Rebelo, A. P., et al. Chemical modulation of mitochondria-endoplasmic reticulum contact sites. Cells. 9 (7), 1637(2020).
  19. Berger, S. I., Iyengar, R. Role of systems pharmacology in understanding drug adverse events. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (2), 129-135 (2011).
  20. Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. J Cell Biol. 190 (3), 363-375 (2010).
  21. Wu, Y., et al. Contacts between the endoplasmic reticulum and other membranes in neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (24), E4859-E4867 (2017).
  22. Cagin, U., et al. Mitochondrial retrograde signaling regulates neuronal function. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (44), E6000-E6009 (2015).
  23. Choi, S. H., et al. A three-dimensional human neural cell culture model of Alzheimer's disease. Nature. 515 (7526), 274-278 (2014).
  24. Kim, Y. H., et al. A 3D human neural cell culture system for modeling Alzheimer's disease. Nat Protoc. 10 (7), 985-1006 (2015).
  25. Kwak, S. S., et al. Amyloid-beta42/40 ratio drives tau pathology in 3D human neural cell culture models of Alzheimer's disease. Nat Commun. 11 (1), 1377(2020).
  26. Csordas, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).
  27. Bhattacharyya, R., et al. Axonal generation of amyloid-beta from palmitoylated APP in mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes. Cell Rep. 35 (7), 109134(2021).
  28. Tebo, A. G., Gautier, A. A split fluorescent reporter with rapid and reversible complementation. Nat Commun. 10 (1), 2822(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mitochondria Associated MembranesMAM StabilizationAlzheimer s Disease ModelNeural Progenitor CellsLive Cell ImagingKymographic AnalysisElectroporation TechniqueFluorescence MicroscopyMito RFP LabelingAxonal Mitochondria Motility

Gerelateerde artikelen