Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Multiplex cyclische fluorescerende immunohistochemie

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66136

⸱

26 januari 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University & Yunnan Cancer Hospital, 2Department of Gastroenterology, Wu Han NO.1 Hospital, 3Department of Neurosurgery, The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University & Yunnan Cancer Hospital, 4Departments of Biomedical Research Center, The Affiliated Calmette Hospital of Kunming Medical University & The First Hospital of Kunming, 5School of Medical, Yunnan University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Multiplex, cyclische immunohistochemie, maakt in situ detectie van meerdere markers tegelijk mogelijk met behulp van herhaalde antigeen-antilichaamincubatie, beeldscanning en beelduitlijning en -integratie. Hier presenteren we het operationele protocol voor het identificeren van immuuncelsubstraten met deze technologie in longkanker en gepaarde hersenmetastasemonsters.

Samenvatting

De micro-omgeving van de tumor omvat interacties tussen gastheercellen, tumorcellen, immuuncellen, stromale cellen en vasculatuur. Het karakteriseren en ruimtelijk organiseren van subsets van immuuncellen en doeleiwitten is cruciaal voor prognostische en therapeutische doeleinden. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van multiplexed immunohistochemie kleuringsmethoden. Multiplex-fluorescentie-immunohistochemie maakt de gelijktijdige detectie van meerdere markers mogelijk, waardoor een uitgebreid begrip van de celfunctie en intercellulaire interacties mogelijk wordt. In dit artikel beschrijven we een workflow voor de multiplex cyclische fluorescerende immunohistochemietest en de toepassing ervan in de kwantificeringsanalyse van lymfocytensubsets. De multiplex cyclische fluorescerende immunohistochemische kleuring volgt vergelijkbare stappen en reagentia als standaard immunohistochemie, waarbij antigeenextractie, cyclische antilichaamincubatie en kleuring op een in formaline gefixeerde paraffine ingebedde (FFPE) weefselglaasje betrokken zijn. Tijdens de antigeen-antilichaamreactie wordt een mengsel van antilichamen van verschillende soorten bereid. Omstandigheden, zoals de ophaaltijd van het antigeen en de concentratie van antilichamen, worden geoptimaliseerd en gevalideerd om de signaal-ruisverhouding te verhogen. Deze techniek is reproduceerbaar en dient als een waardevol hulpmiddel voor onderzoek naar immunotherapie en klinische toepassingen.

Inleiding

Hersenmetastasen (BM) vertegenwoordigen de meest voorkomende tumoren van het centrale zenuwstelsel (CZS) en komen voor in bijna de helft van de gevallen van niet-kleincellige longkanker (NSCLC), met een slechte prognose1. Naar schatting 10%-20% van de NSCLC-patiënten heeft al BM op het moment van de eerste diagnose, en ongeveer 40% van de NSCLC-gevallen zal BM ontwikkelen in de loop van behandeling2. De tumormicro-omgeving (TME) is nauw verbonden met het voorkomen van NSCLC en BM, inclusief verschillende componenten, zoals bloedvaten, fibroblasten, macrofagen, extracellulaire matrix (ECM), lymfoïde, van beenmerg afgeleide immuuncellen en signaalmoleculen 3,4. Micro-omgevingsimmuuncellen spelen een cruciale rol bij het beïnvloeden van de groei en ontwikkeling van kankercellen. Hersenmetastasen presenteren tal van potentiële behandelingsdoelen die worden gekenmerkt door complexe immunologische micro-omgevingen en signaleringsprocessen. PD-1-remmers hebben bijvoorbeeld klinische werkzaamheid aangetoond voor patiënten met hersenmetastasen van longkanker (LCBM) als immuuncheckpointremmer (ICI). De frequentie van reacties op PD-1-therapie varieert echter tussen primaire NSCLC en LCBM5, wat suggereert dat de immuunmicro-omgeving van de tumor fungeert als een kritische ICI-regulator.

Immunohistochemie (IHC) is een hulpmiddel van onschatbare waarde op het gebied van biologie, basisgeneeskunde en pathologie6. Deze detectiemethode visualiseert antigeenexpressie door de interactie van antigeen-antilichaam op een weefselglaasje7. IHC wordt gebruikt voor het diagnosticeren van voorspellende markers, het evalueren van prognostische markers, het begeleiden van gerichte therapieën en het onderzoeken van de biologische functies van tumorcellen8. De traditionele IHC-methode kan echter maar één biomarker tegelijk detecteren. Om deze beperking aan te pakken, heeft de innovatie van immunohistochemische technologie geleid tot de ontwikkeling van multiplex fluorescentie immunohistochemie (mfIHC), die de gelijktijdige identificatie van meerdere eiwitmarkers op hetzelfde weefselglaasje mogelijk maakt, zowel in het heldere veld als in het fluorescerende veld9. Deze vooruitgang biedt een nauwkeurige analyse van de celsamenstelling en moleculaire interacties tussen stromale cellen, immuuncellen en kankercellen binnen de TME.

In deze studie presenteren we een protocol voor multiplex cyclische immunohistochemie om de ruimtelijke verdeling van immuuncellen te analyseren. Twee primaire antilichamen van verschillende soorten, zoals konijn en rat, worden tegelijkertijd gekozen voor incubatie, gevolgd door fluorescentie-gelabelde secundaire antilichamen. Het ophalen van antigeen wordt uitgevoerd na elke antigeen-antilichaamreactie. Autofluorescentie wordt geblokkeerd en 4', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) wordt gebruikt voor het kleuren van de kernen. Het panel omvat sequentiële detectie van CD3, CD8, CD20 en CK, cellen worden gecategoriseerd volgens de markers: tumorcellen (CK+), rijpe T-cellen (CD3+), cytotoxische T-cellen (CD3+CD8+), B-cellen (CD20+)10,11.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het onderzoek werd goedgekeurd door de medisch-ethische commissie van het Yunnan Cancer Hospital/het Third Affiliated Hospital van de Kunming Medical University. Alle proefpersonen/wettelijke voogden ondertekenden geïnformeerde toestemming.

1. Voorbereiding van de objectglaasjes

  1. Snijd met behulp van een microtoom secties van gepaarde paraffineblokken met primaire longtumor- of longkankerhersenmetastasencellen met een dikte van 4 μm. Verwijder secties in water en scheid met een pincet, kies de beste en plak deze op het met polylysine gecoate objectglaasje.
  2. Plaats de glaasjes tissues gedurende 30 minuten in een oven op 65 °C om de hechting van de weefsels te verbeteren.
  3. Dompel de glaasjes onder in xyleen door middel van drie wisselingen, die elk 10 minuten duren.
  4. Verlaag geleidelijk de alcoholconcentratie en incubeer glaasjes in 100% ethanol gedurende 5 minuten, 90% ethanol gedurende 5 minuten, 75% ethanol gedurende 5 minuten en in gedeïoniseerd water gedurende 3 minuten.

2. Warmte-geïnduceerde epitoop ophalen (HIER)

  1. Verdun 100x natriumcitraatbufferoplossing (pH 6,0) tot 1x (10 mM) in gedeïoniseerd water en bereid voldoende bufferoplossing voor om de objectglaasjes volledig onder te dompelen.
  2. Plaats de objectglaasjes in een snelkookpan en stel ze gedurende 2 minuten bloot aan hoge temperaturen (100 °C) en druk (~30 psi). Laat de glaasjes na het opwarmen 3 minuten afkoelen tot kamertemperatuur in gedestilleerd water.
  3. Los een pakje van 52 g fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; poedervormig) op in 5 l gedeïoniseerd water voor de bereiding van PBS-bufferoplossing (pH 7,0). Plaats de objectglaasjes gedurende 5 minuten in PBS-bufferoplossing, met 3 wisselingen.

3. Peroxidase blokkeren

  1. Bedek de secties met 3% waterstofperoxide en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de glaasjes af in PBS, 3x gedurende 5 min.
  2. Gebruik filtreerpapier om overtollig water weg te absorberen van de omtrek van het weefsel. Zorg er ondertussen voor dat het weefsel vochtig is.

4. Primaire antilichaamincubatie voor de eerste ronde

  1. Bereid een werkmengsel van de primaire antilichamen voor CD8 (monoklonaal antilichaam van konijnen, kloon SP16) en CD20 (monoklonaal antilichaam van muizen, kloon L26), verdund 1:50 in het verdunningsmiddel van het primaire antilichaam van Bond.
  2. Voeg het antilichaamcomplex toe aan de secties en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  3. Bereid een oplossing van 0,1% Tween/fosfaatgebufferde zoutoplossing: 1 ml Tween in 1 L PBS-bufferoplossing.
  4. Was de secties met 0,1% Tween/fosfaat-gebufferde zoutoplossing, 3x gedurende 5 min. Gebruik filtreerpapier om overtollig water weg te trekken van de omtrek van het weefsel, zorg er ondertussen voor dat het weefsel vochtig is.

5. Secundaire antilichaamincubatie voor de eerste ronde

  1. Bereid een mengsel van fluorescentie-gelabeld geitenanti-konijn-antilichaam (excitatie (Excitatie: 495 nm) en geiten-anti-muis-antilichaam (Ex: 578 nm), verdund 1:50 in fosfaatbufferzoutoplossing. Het anti-konijn-antilichaam van de geit hecht zich aan het primaire antilichaam van CD8 en het anti-muisantilichaam van de geit hecht zich aan het primaire antilichaam van CD20.
  2. Voeg het secundaire antilichaammengsel druppelsgewijs toe en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.

6. Warmte-geïnduceerde epitoopextractie en peroxidaseblokkering

  1. Verdun 100x natriumcitraat (pH 6,0) tot 1x (10 mM) in gedeïoniseerd water en bereid voldoende bufferoplossing voor om de objectglaasjes volledig onder te dompelen.
  2. Plaats de glaasjes in een snelkookpan en stel ze gedurende 1 minuut bloot aan hoge hitte (100 °C) en druk (~30 psi). Plaats de glaasjes na het opwarmen in gedestilleerd water om 3 minuten af te koelen tot kamertemperatuur.
  3. Voer peroxidaseblokkering uit zoals beschreven in stap 3.

7. Primaire antilichaamincubatie voor de tweede ronde

  1. Bereid een werkmengsel van de primaire antilichamen voor CD3 (Rabbit monoklonal antilichaam, kloon SP7) en CK (monoklonaal antilichaam van muizen, MX005), verdund 1:50 in primair antilichaamverdunningsmiddel.
  2. Voeg het antilichaamcomplex toe aan de secties en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  3. Wassen met 0,1% Tween/fosfaatgebufferde zoutoplossing, 3x gedurende 5 min. Gebruik filtreerpapier om overtollig water weg te trekken van de omtrek van het weefsel, zorg er ondertussen voor dat het weefsel vochtig is.

8. Secundaire antilichaamincubatie voor tweede ronde

  1. Bereid een mengsel van geitenanti-konijnen (bijv.: 652 nm) en geitenanti-muisantilichamen (bijv. 590 nm) in verdunning 1:50 in fosfaatbufferzoutoplossing. Het anti-konijn-antilichaam van de geit hecht zich aan het primaire antilichaam van CD3 en het anti-muisantilichaam van de geit hecht zich aan het primaire antilichaam van CK.
  2. Voeg het secundaire antilichaammengsel druppelsgewijs toe, incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Wassen met 0,1% Tween/fosfaatgebufferde zoutoplossing, 3x gedurende 5 min.

9. Autofluorescentie-afschrikking en DAPI-kleuring

  1. Voeg reagens (0,15 M/L KMnO4) toe aan de weefselsectie gedurende 1 min. Spoel af met stromend water gedurende 5 min.
    LET OP: KMnO4 is giftig en beschadigt de huid. Zorg ervoor dat u handschoenen draagt bij het hanteren van de dia's. Als de vloeistof op de huid druppelt, veeg deze dan snel af met schone servetten en spoel deze door met stromend water.
  2. Droog het objectglaasje met toenemende concentraties alcohol (70%, 90%, 100%), gedurende 3 minuten in elke concentratie.
  3. Voeg DAPI en dekglaasje toe voor multispectrale beeldvorming. De hoeveelheid DAPI is afhankelijk van de weefselgrootte. Zorg ervoor dat het weefsel volledig bedekt is met DAPI nadat het dekglaasje is toegevoegd.

10. Dia scannen

  1. Plaats de glaasjes op een lade en duw totdat deze niet verder kan worden geduwd.
  2. Om het programma te starten, dubbelklikt u op het programmapictogram op het bureaublad. Tijdens het opstarten wordt het moduskeuzevenster weergegeven. Het selectievenster toont twee helderveld- en fluorescentiemodi: automatische modus en handmatige modus. Klik in de fluorescerende scanmodus op Automatische modus.
  3. Beweeg de muiscursor over ? knop om de informatie over de instellingen weer te geven. Klik op Filterinstelling > Kanaal filteren om het kanaalnummer > pseudokleur te kiezen. Definieer de kleur en sla op.
  4. Klik op Routinewerk > scanmodus > Volledig automatisch. Klik op Routinewerk > Dianaam om de dianaam voor uitvoer te definiëren. Klik op Routinewerk > Kanaalinstellingen om filters te kiezen.
  5. Klik op Routinewerk > Scanopties om de resulterende kwaliteit en opslaglocatie van de virtuele dia te bepalen.
  6. Klik op Voorbeeld voor het instellen van de drempelwaarde en het selecteren van het bereik dat moet worden gescand.
  7. Klik op Hardware > Filters > Live > Autofocus > Automatische belichting > Digitale versterking > Vink handmatige belichtingstijd gebruiken > Vink het vakje aan om het bereik > Stroom instellen te beperken.
  8. Klik op Routinewerk > Scan starten. Selecteer het vergrotingsniveau als 20x of 40x. Kies 20x voor de juiste bestandsgroottes. MRXS-extensie wordt gedefinieerd door een 3D Pannoramic MIDI-scanner. De afbeeldingsextensie kan ook worden gewijzigd in TIFF-afbeelding.
  9. Klik op Diaviewer > Multiview Toolbox om de afbeelding voor confocal te kiezen en vervolgens de afbeelding uit te lijnen en te integreren.

11. Kwantitatieve evaluatie van celdichtheden

  1. Kwantificeer percentages positieve immuuncellen (CD3+, CD3+CD8+, CD20+) in tumor- en stromagebieden met Halo 10-scannersoftware. Valideer CK-kleuring om tumorweefsel te definiëren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We presenteren een protocol voor cyclische antigeendetectie met behulp van 5-kleuren multiplex fluorescentie op een enkel objectglaasje. Door onze optimalisatie van de test maken we de incubatie van twee antilichamen van verschillende soorten mogelijk (Figuur 1). De benodigde apparaten voor de experimentprocedure zijn onder meer een snelkookpan en een immunokleuringsdoos (Figuur 2A).

Na voltooiing van de test definiëren we de pseudokl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben het proces beschreven voor multiplex cyclische fluorescentie immunohistochemische kleuring. De selectie van primaire antilichamen is een cruciaal aspect van de fluorescentie-immunohistochemische test, en monoklonale antilichamen worden aanbevolen voor een betere specificiteit en herhaalbaarheid. Om de werkconcentratie van het primaire antilichaam te optimaliseren, is een reeks verdunningen getest door middel van immunohistochemische experimenten. Zowel positieve controles (om de expressie van het doelantigeen t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die het werk in dit artikel zouden kunnen hebben beïnvloed.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NO.81860413, 81960455), Yunnan Science and Technology Department Fund (202001AY070001-080), Scientific Research Foundation of Education Department van de provincie Yunnan (2019J1274).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.15 mol/L KmnO4Maixin Biotechnology Co. Ltd.MST-8005
100x sodium citrate Maixin Biotechnology Co., LtdMVS-0100
3% hydrogen peroxideMaixin Biotechnology Co., LtdSP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI3D histech LtdPannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488Abcamab150113
Alexa Fluor 568 Abcamab175701
Alexa Fluor 594Abcamab150116
Alexa Fluor 647Abcamab150079
Bond primary antibody diluentLeciaAR9352
CD20Maixin Biotechnology Co., Ltdkit-0001
CD3Maixin Biotechnology Co., Ltd. kit-0003
CD8 Maixin Biotechnology Co., LtdRMA-0514
CKMaixin Biotechnology Co. Ltd.MAB-0671,
DAPIsig-maD8417
ethanolSinopharm Group Chemical reagent Co., LTD10009218
Histocore Multicutlecia2245
PBS(powder)Maixin Biotechnology Co., LtdPBS-0061
slide viwer 3D histech Ltd
xyleneSinopharm Group Chemical reagent Co., LTD10023418

Referenties

  1. Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755(2020).
  2. Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic. J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).
  3. Vilariño, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic. Cancer Treat Rev. 89, 102067(2020).
  4. Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746(2023).
  5. Goldberg, S. B., et al. Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).
  6. Sukswai, N., Khoury, J. D. Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection. Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).
  7. Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology. Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).
  8. Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry. J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).
  9. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).
  10. Wong, P. F., et al. Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).
  11. Sanchez, K., et al. Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer. Breast Cancer Res. 23 (1), 2(2021).
  12. Zhang, W., et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).
  13. Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue. MethodsX. 5, 1-7 (2018).
  14. McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone. J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).
  15. Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).
  16. Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J Immunother Cancer. 8 (1), 000155(2020).
  17. Clarke, G. M., et al. A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer. Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).
  18. Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).
  19. Ahrens, M. J., Dudley, A. T. Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity. J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).
  20. Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Multiplex immunohistochemietumoromgevinglymfocytensubsetsantigeenherstelformaline-gefixeerd weefselhersenmetastasetumorinfiltrerende lymfocytenmultispectrale beeldvormingantilichaamincubatie
Multiplex cyclische fluorescerende immunohistochemie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.