Beeldvorming van levende cellen gebruiken om de effecten van pathologische eiwitten op axonaal transport in primaire hippocampusneuronen te meten

Samenvatting

Hier laten we zien hoe transfectie van primaire hippocampale knaagdierneuronen kan worden gecombineerd met confocale beeldvorming met levende cellen om pathologische eiwitgeïnduceerde effecten op axonaal transport te analyseren en mechanistische routes te identificeren die deze effecten mediëren.

Samenvatting

Bidirectioneel transport van ladingen langs het axon is van cruciaal belang voor het behoud van functionele synapsen, neurale connectiviteit en gezonde neuronen. Axonaal transport wordt verstoord bij meerdere neurodegeneratieve ziekten, en projectieneuronen zijn bijzonder kwetsbaar vanwege de noodzaak om cellulair materiaal over lange afstanden te transporteren en een aanzienlijke axonale massa te behouden. Pathologische modificaties van verschillende ziektegerelateerde eiwitten hebben een negatieve invloed op het transport, waaronder tau, amyloïde-β, α-synucleïne, superoxide dismutase en huntingtine, en bieden een potentieel gemeenschappelijk mechanisme waardoor pathologische eiwitten toxiciteit uitoefenen bij ziekte. Methoden om deze toxische mechanismen te bestuderen zijn nodig om neurodegeneratieve aandoeningen te begrijpen en mogelijke therapeutische interventies te identificeren.

Hier worden gekweekte primaire hippocampusneuronen van knaagdieren samen met meerdere plasmiden om de effecten van pathologische eiwitten op snel axonaal transport te bestuderen met behulp van confocale beeldvorming van fluorescerend gelabelde vrachteiwitten. We beginnen met het oogsten, dissociëren en kweken van primaire hippocampusneuronen van knaagdieren. Vervolgens co-transfecteren we de neuronen met plasmide-DNA-constructen om fluorescerend gelabeld vrachteiwit en wildtype of mutant tau (gebruikt als voorbeeld van pathologische eiwitten) tot expressie te brengen. Axonen worden geïdentificeerd in levende cellen met behulp van een antilichaam dat een extracellulair domein van neurofascine, een eiwit uit het eerste segment van axonen, bindt, en een axonaal interessegebied wordt afgebeeld om fluorescerend vrachtvervoer te meten.

Met behulp van KymoAnalyzer, een vrij verkrijgbare ImageJ-macro, karakteriseren we uitgebreid de snelheid, pauzefrequentie en directionele vrachtdichtheid van axonaal transport, die allemaal kunnen worden beïnvloed door de aanwezigheid van pathologische eiwitten. Via deze methode identificeren we een fenotype van verhoogde ladingspauzefrequentie geassocieerd met de expressie van pathologisch tau-eiwit. Daarnaast kunnen gen-uitschakeling shRNA constructen aan de transfectiemix worden toegevoegd om de rol van andere eiwitten te testen bij het mediëren van transportverstoring. Dit protocol is gemakkelijk aan te passen voor gebruik met andere neurodegeneratieve ziektegerelateerde eiwitten en is een reproduceerbare methode om de mechanismen te bestuderen van hoe die eiwitten axonaal transport verstoren.

Inleiding

Neuronen zijn afhankelijk van het bidirectionele transport van vracht langs het axon om functionele synapsen en neurale connectiviteit te behouden. Axonale transporttekorten worden verondersteld een cruciale bijdrage te leveren aan de pathogenese van verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD) en andere tauopathieën, de ziekte van Parkinson, amyotrofische laterale sclerose en de ziekte van Huntington ^1,2,3. Pathologische modificaties van verschillende ziektegerelateerde eiwitten hebben inderdaad een negatieve invloed op het transport (besproken in ⁴). Het ontwikkelen van methoden om de mechanismen te onderzoeken waarmee pathologische eiwitten toxiciteit uitoefenen bij ziekte is noodzakelijk om neurodegeneratieve aandoeningen te begrijpen en potentiële doelen voor therapeutische interventie te identificeren.

Verschillende belangrijke inzichten in axontransport, waaronder de ontdekking van conventioneel kinesine, de kinase- en fosfatase-afhankelijke routes die motoreiwitten reguleren, en mechanismen waarmee pathologische eiwitten de regulatie van axontransport verstoren, werden gedaan met behulp van het geïsoleerde inktvisaxofasmemodel ^4,5. Perfusie van inktvisaxofosma met pathologische vormen van tau-eiwit remt anterograde snel axonaal transport (FAT), een effect dat afhankelijk is van de blootstelling van het fosfatase-activerende domein van tau, dat eiwitfosfatase 1 (PP1) activeert6,7,8. PP1 activeert glycogeensynthasekinase 3 (GSK3), dat op zijn beurt kinesine lichte ketens fosforyleert, waardoor lading vrijkomt. Een ander pathologisch eiwit bij AD is amyloïde-β. Oligomere vormen van amyloïde-β remmen bidirectioneel FAT door caseïnekinase 2, dat kinesine lichte ketens fosforyleert⁹. Bovendien verstoort pathologisch huntingtine-eiwit met een polyglutamine-expansie en een familiale ALS-gekoppelde SOD1-mutant elk het axonale transport in het inktvisaxofosma via c-Jun N-terminaal kinase en p38 mitogeen-geactiveerde proteïnekinase-activiteit, respectievelijk^10,11.

Hoewel het inktvisaxofasma-model een waardevol hulpmiddel blijft bij het begrijpen van de effecten van pathologische eiwitten op axonaal transport, voorkomt beperkte toegang tot de apparatuur en monsters dat het op grotere schaal wordt gebruikt. We ontwikkelden een transporttest met behulp van confocale microscopiebeeldvorming met levende cellen van primaire neuronen van knaagdieren (muizen en ratten). Dit model vertegenwoordigt een gemakkelijk aanpasbare en manipuleerbare op zoogdierneuronen gebaseerde benadering met behulp van algemeen beschikbare celbronnen en microscopiesystemen. Bijvoorbeeld, een verscheidenheid aan pathologische eiwitten (bijv. die ziektegerelateerde modificaties herbergen) worden tot expressie gebracht om te identificeren hoe specifieke modificaties van deze eiwitten het transport in axonen beïnvloeden. Op dezelfde manier kan een verscheidenheid aan fluorescerend gelabelde ladingeiwitten worden gebruikt om ladingspecifieke veranderingen te onderzoeken. Bovendien kunnen de onderliggende moleculaire mechanismen relatief eenvoudig worden bestudeerd door zich te richten op expressie (d.w.z. knockdown of overexpressie) van geselecteerde eiwitten die deze effecten kunnen mediëren. Deze methode is ook gemakkelijk aan te passen voor primaire neuronen die zijn afgeleid van een grote verscheidenheid aan diermodellen.

We presenteren een gedetailleerd protocol dat de live-cell axontransporttest beschrijft die eerder werd gebruikt in primaire hippocampale neuronen om aan te tonen dat mutante tau-eiwitten geassocieerd met frontotemporale kwabdementie (FTLD; P301L of R5L tau) verhogen de pauzefrequentie van fluorescerend gelabelde ladingeiwitten bidirectioneel¹². Bovendien heeft de knockdown van de PP1γ-isovorm de pauze-effecten gered¹². Dit biedt ondersteuning voor het model van pathologische tau-geïnduceerde verstoring dat wordt gemedieerd door afwijkende activering van een signaalroute geïnitieerd door PP1 zoals hierboven beschreven ^6,7,12. In een afzonderlijke studie toonden we aan dat pseudofosforylering van tau bij S199/S202/T205 (het pathogene AT8-fosfoepitoop dat relevant is voor tauopathieën) de frequentie van de ladingpauze en de snelheid van het anterograde segment verhoogde. Deze effecten waren afhankelijk van het N-terminale fosfatase-activerende domein van tau¹³. Deze voorbeelden benadrukken het nut van dit model voor het identificeren van de mechanismen van hoe pathologische eiwitten het axontransport in zoogdierneuronen verstoren.

Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van de methode die begint met het oogsten, dissociëren en kweken van primaire hippocampusneuronen van muizen, gevolgd door de transfectie van de neuronen met vrachteiwitten gefuseerd met een fluorescerend eiwit, en ten slotte de benadering van live-cell beeldvorming en beeldanalyse. We laten zien hoe deze methode wordt gebruikt om de effecten van gemodificeerd tau op het bidirectionele transport van het blaasjes-geassocieerde eiwit, synaptofysine, te bestuderen. Er is echter flexibiliteit in het pathogene eiwit en het transportladingseiwit van belang, waardoor dit een veelzijdige benadering is om axonaal transport te bestuderen.

Protocol

Deze protocollen zijn goedgekeurd door de Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee. Dit protocol is met succes toegepast op Tau Knockout-muizen met een C57BL/6J-achtergrond en wildtype Sprague Dawley-ratten. Andere soorten zouden ook acceptabel moeten zijn.

1. Oogst van primaire hippocampusneuronen

1. Smeer een glaasje met 4 putjes in met gefilterd 0,5 mg/ml poly-d-lysine (PDL) in boraatbuffer (12,5 mM natriumboraatdecahydraat en 50 mM boorzuur). Voeg 750 μL/putje toe en incubeer een nacht bij kamertemperatuur.
2. Was het kamerglaasje 4x met steriel gedeïoniseerd water. Laat na de laatste wasbeurt aan de lucht drogen en bewaar op 4 °C voor kortstondige opslag (<1 week).
   NOTITIE: Laat de PDL niet drogen op het objectglaasje voor en tussen de wasbeurten, aangezien dit giftig is voor de culturen. We vinden dat langdurige opslag van PDL-gecoate objectglaasjes de neuronale gezondheid kan beïnvloeden en dat het handhaven van consistente intervallen tussen coating en plating de variabiliteit tussen de runs in de levensvatbaarheid van de cultuur vermindert.
3. Zorg voor een getimede zwangere muis of rat.
   OPMERKING: Getimede drachtige dieren kunnen bij verschillende bedrijven worden besteld of in eigen beheer worden gefokt. Embryonale dag nul verwijst naar de dag dat de vaginale plug wordt gevonden, en we hebben succes gehad met het kweken van E16-18 primaire hippocampus- en corticale neuronen van muizen met deze benadering. Rattenneuronen worden ook geoogst op embryonale dag 18.
4. Op E18 euthanaseer het zwangere vrouwtje volgens een goedgekeurde methode. Snijd de buikwand door en verwijder de twee baarmoederhoorns. Leg ze in een petrischaaltje met ijskoude 0,9% zoutoplossing. Spoel af tot de zoutoplossing schoon is.
   OPMERKING: We dienen een overdosis natriumpentobarbital (minimaal 100 mg/kg) toe via intraperitoneale injectie.
5. Onthoofd de pups. Beginnend bij het foramen magnum (de opening aan de achterkant van de schedel), gebruikt u een microdissectieschaar om de huid en schedel langs de middellijn te knippen, waarbij u de onderste punt van de schaar tegen het interne deel van de schedel kantelt om schade aan het hersenweefsel te voorkomen.
6. Verwijder de bovenliggende huid en verwijder voorzichtig de schedel om de hersenen bloot te leggen.
7. Gebruik een tang om het mond-/neusgebied vast te houden en draai de schedel zodat de hersenen naar beneden wijzen boven een petrischaal gevuld met 0,9% zoutoplossing. Draai de hersenen uit de schedel en snijd de zenuwen en hersenstam door om de hersenen in de zoutoplossing vrij te laten.
8. Plaats de petrischaal onder een ontleedmicroscoop voor dissectie van de hippocampus. Steek een schaar in de middellijn van de hersenen, kantel de schaar zodat het bovenste mes een van de hersenhelften naar buiten duwt en knip om de hemisfeer te scheiden van de subcorticale gebieden.
9. Maak een verticale snede door de cortex zodat de frontale cortex zich anterieur bevindt en de hippocampus posterieur van de snijplaats. Steek de onderste punt van de schaar in het resulterende gat en knip voorzichtig langs de top van de cortex, stoppend aan het achterste uiteinde.
10. Zwaai met de tang de cortex voorzichtig naar buiten en maak de achterste snede af. De hippocampus moet lijken op de vorm van een halve maan. Snijd de resterende cortex voorzichtig bij zodat de hippocampus zijn afgeronde, halvemaanvormige vorm behoudt.
11. Verwijder met een tang en een schaar voorzichtig de hersenvliezen uit de hippocampus.
    OPMERKING: Het is belangrijk om alle hersenvliezen uit de hersenen te verwijderen om het aantal niet-neuronale cellen dat wordt verzameld te verminderen, terwijl het hippocampusweefsel niet wordt beschadigd of gescheurd.
12. Snijd de hippocampus in vier gelijke stukken en plaats het weefsel in een kegelvormige buis van 15 ml gevuld met ijskoude calcium- en magnesiumvrije buffer (CMF; Dulbecco's PBS met 0,1% glucose, 2,5 μg/ml amfotericine B en 50 μg/ml gentamicine).
    OPMERKING: Voor het beste resultaat verzamelt u de hippocampi van 5-10 pups per dissociatie. Elke hippocampus zou ongeveer 300.000 cellen moeten leveren voor muizen en 500.000 cellen voor ratten.

2. Dissociatie en plating van primaire hippocampusneuronen

1. Verwijder de CMF met een pasteurpipet en spoel de tissue 4x af met verse, koude CMF, terwijl u tussen de spoelingen door voorzichtig ronddraait.
2. Verwijder de CMF en voeg 3 ml gefilterde 0,125% trypsineoplossing toe (verdun 2,5% trypsine in voorverwarmde [37 °C] CMF). Incubeer het weefsel gedurende precies 15 minuten bij 37 °C; Draai elke 5 minuten zachtjes rond.
   OPMERKING: Maak de trypsine-oplossing direct voor gebruik.
3. Bereid 5 ml trypsine-inactivatieoplossing (TIS; Hanks' Balanced Salt Solution, 20% serum van pasgeboren kalveren en 1x DNase I-oplossing [10x voorraad: 5 mM natriumacetaat, 1 μM calciumchloride, 0,5 mg/ml DNase I]).
4. Verwijder de trypsine-oplossing en was 2x met koud CMF. Voeg 3 ml koude TIS toe.
5. Dissocieer cellen door trituratie met behulp van een spuit van 3 ml met naalden met een steeds kleinere diameter: tritureer 30x met een naald van 14 G, 30x met een naald van 15 G, 20x met een naald van 16 G, 20x met een naald van 18 G en 15x met een naald van 21 G. Gebruik 2 s trekjes met de eerste vier naalden en 3 s trekjes met de 21 G naald.
   OPMERKING: Andere trituratiemethoden (bijv. vuurgepolijste glazen^{pipetten 14,15}) kunnen ook worden gebruikt. We vinden dat het gebruik van de gestandaardiseerde metalen spuitnaalden de variabiliteit in celklontering en levensvatbaarheid aanzienlijk vermindert.
6. Plaats met de naald van 21 G een druppel van de celsuspensie op een microscoopglaasje en controleer op celklonten. Als er meerdere klonten worden waargenomen, trituer dan nog drie keer door een naald van 22 G en controleer opnieuw. Herhaal dit proces totdat een homogene eencellige suspensie is verkregen, waarbij u ervoor zorgt dat u tijdens het proces voorzichtig tritureert.
7. Filter 5 ml foetaal runderserum (FBS) met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm. Breng de celsuspensie voorzichtig aan op de FBS in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de cellen (200 × g bij 4 °C) gedurende 5 minuten.
8. Verwijder zoveel mogelijk FBS zonder de pellet te verstoren. Resuspenderen in 1 ml warme (37 °C) antibioticavrije neurobasale media (NBM; aangevuld met 1x glutaminevervanger en 1x B-27).
9. Verdun de celsuspensie in trypanblauw (0,4%) en verkrijg een celgetal.
   OPMERKING: Een verdunning van 1:1 werkt goed voor een automatische cellenteller en gebruik een verdunning van 1:60 voor handmatig tellen met een hemacytometer. Om door te gaan met celplating, moet de levensvatbaarheid van het neuron op dit moment hoger zijn dan 90%. Dit vergroot de kans op een gezonde neuroncultuur na dissociatie aanzienlijk.
10. Plaat de cellen met een dichtheid van 175.000 cellen/putje (70.000 cellen/mm²) in een voorverwarmd PDL-gecoat vierwells-kamerglaasje in 750 μL antibioticavrij NBM. Plaat bovendien 200.000 cellen/putje in vier putjes van een PDL-gecoate plaat met 24 putjes in 1,5 ml antibioticavrij NBM voor gebruik als geconditioneerd medium in de transfectie beschreven in sectie 3. Incubeer de cellen in een vochtgecontroleerde kamer van 37 °C en 5% CO₂ -kamer.
    OPMERKING: De dichtheid van cellen kan worden aangepast op basis van de resultaten. Hoge dichtheden kunnen het moeilijker maken om de neuronen in beeld te brengen, terwijl lage dichtheden een negatieve invloed kunnen hebben op de gezondheid van de cultuur en de overleving van neuronen. Onze ervaring is dat rattenneuronen met een lagere dichtheid kunnen worden geplateerd in vergelijking met muizenneuronen.

3. Transfectie van neuronen

OPMERKING: Neuronen kunnen worden getransfecteerd op DIV 7 of DIV 8 zonder noemenswaardige veranderingen in transfectie-efficiëntie of transportresultaten. Deze volumes zijn voor vier putjes van een glaasje met vier putjes en een glazen bodemplaat in 750 μL volume/put. Dit protocol beschrijft transfectie met behulp van lipidetransfectiereagentia. Laat media en transfectiereagentia voor gebruik opwarmen tot kamertemperatuur.

1. Bereid transfectiebouillonreagens voor door 4,4 μl transfectiereagens toe te voegen aan 127,6 μl gereduceerd serummedium. Schud voorzichtig met de hand om te mengen en 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.
2. Bereid DNA-voorraden voor tijdens de incubatie van de lipidentransfectie. Voeg 200 ng fluorescerend lading-DNA (pFIN mApple-synaptofysine; 12.112 basenparen) en 200 ng DNA toe om het eiwit van belang (gebruikte tau-plasmiden waren pCMV tau-Flag-constructen; 5.036 basenparen) tot expressie te brengen in gereduceerd serum of serumvrij medium tot een eindvolume van 32 μL¹². Voeg 0,8 μl transfectieversterkend reagens toe (2 μl per μg DNA). Meng goed met de hand.
   OPMERKING: We vinden dat een afgeleide van RFP het beste werkt (mApple of mCherry), maar GFP kan ook worden gebruikt. Daarnaast kan een DNA-construct om een gen-uitschakeling klein haarspeld-RNA (shRNA) tot expressie te brengen, worden opgenomen om mechanismen van fenotypes te testen die worden waargenomen met de expressie van het eiwit van interesse. Om dit te doen, neemt u 150 ng van elk van de drie DNA-constructen op in de DNA-mix en past u de hoeveelheid transfectieversterkend reagens dienovereenkomstig aan. Het wijzigen van de parameters van DNA of lipofectiereagens kan de transfectie-efficiëntie beïnvloeden en kan worden aangepast op basis van de behoefte aan meer of minder efficiënte transfecties.
3. Voeg 32 μL lipidetransfectiemix toe aan elke buis DNA. Schud voorzichtig met de hand om te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
4. Voeg langzaam 64 μl DNA/transfectie-reagensmengsel toe aan de cellen door de punt van de pipet net onder het oppervlak van het medium te plaatsen en in een kronkelige beweging door het putje te bewegen. Schud het kamerglaasje na toevoeging voorzichtig met de hand aan alle kuiltjes om verder te mengen en plaats het kamerglaasje in de couveuse. Incubeer bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende 2 uur.
   OPMERKING: Minimaliseer de hoeveelheid tijd dat neuronen zich buiten de couveuse bevinden, omdat ze erg gevoelig zijn voor veranderingen in temperatuur en pH, die snel kunnen optreden.
5. Voer 2 uur na transfectie een halve mediumverandering uit met geconditioneerde media + Neurofascine-antilichaam. Onmiddellijk voorafgaand aan de mediumwissel verzamelt u 1,5 ml geconditioneerde antibioticavrije NBM uit de cellen die op de plaat met 24 putjes zijn gekweekt. Voeg 0,75 μL Neurofascin 186 (NF-186) antilichaam (500 ng/ml) toe aan het geconditioneerde medium.
   OPMERKING: Het NF-186-antilichaam detecteert een extracellulair domein van neurofascine dat is verrijkt in het initiële axonsegment (AIS) om het axon definitief te identificeren voor beeldvorming.
6. Voer 18 uur na transfectie een volledige mediumverandering uit met geconditioneerd medium dat het secundaire antilichaam bevat. Voeg 1 μL secundair antilichaam tegen geiten-konijn geconjugeerd aan AlexaFluor 647 toe aan 3 ml geconditioneerd NBM (antibioticavrij) gepoold uit de plaat met 24 putjes. Goed mengen.

4. Beeldvorming van neuronen

1. Bereid u 2 dagen na transfectie voor op beeldvorming. Verwarm het opzetstuk voor de actieve celkamer voor de confocale microscoop tot 37 °C (inclusief het 60x objectief en de lensolie) en breng de kamer in evenwicht tot 5% CO₂ .
2. Gebruik een objectief met een hoge vergroting en een live-celkamer om de cellen in beeld te brengen.
   OPMERKING: We gebruiken een 60x 1.40 NA-objectief op een confocale laserscanmicroscoop, maar andere confocale (bijv. draaiende schijf) of breedveldfluorescentiemicroscopiesystemen kunnen ook worden gebruikt als ze in staat zijn om hoge beeldvormingsframesnelheden te bereiken.
3. Identificeer visueel getransfecteerde neuronen in het kanaal dat het vrachteiwit bevat met behulp van de oculairs. Breng vervolgens de neuronen in beeld om de AIS in het Cy5-kanaal te identificeren (Figuur 1).
4. Stel het gezichtsveld in op een rechthoekig vak van 32 pixels bij 128 pixels en verplaats het om een gebied van het axon ~50-150 μm distaal van de AIS af te beelden. Noteer en noteer de directionaliteit van het vrachtvervoer en de oriëntatie van de ROI. De stippen op het vak verschijnen respectievelijk als de boven- en rechterkant van eventuele volgende afbeeldingen en films. Noteer welke kant van het beeld zich het dichtst bij het cellichaam bevindt en welke het dichtst bij het axoneindpunt, zodat de kymograafpolylijn in stap 5.1 in de juiste richting kan worden getekend.
   OPMERKING: Bij het selecteren van het interessegebied moet het afgebeelde gebied van een geïsoleerd axon relatief recht zijn en het gezichtsveld aan elk uiteinde snijden. Het hele segment moet zich binnen hetzelfde brandpuntsvlak bevinden. In het gebied moet duidelijk actief vrachtvervoer worden weergegeven. Overmatig heldere neuronen brengen doorgaans het ladingseiwit en de eiwitten van belang tot expressie op niveaus die waarschijnlijk giftig zijn voor het neuron en die moeten worden vermeden.
5. Stel het laservermogen van de 561 in op 1.40, het gaatje op 7.8, de grootte op 128 px² en de snelheid op 32 frames/s. Pas de versterking aan om het transport van individuele vrachtblaasjes te visualiseren zonder dat het wordt verduisterd door een achtergrondsignaal (meestal tussen 10 en 50 resulteert in hoogwaardige kymografen).
   OPMERKING: Het extreem lage laservermogen is haalbaar dankzij zeer gevoelige GaAsP-detectoren en voorkomt mogelijke fototoxische effecten en fotobleken van bewegende lading. De grootte van de gaatjes is zo breed mogelijk ingesteld om de scherptediepte te vergroten om ervoor te zorgen dat de volledige ROI wordt afgebeeld, aangezien het axon mogelijk niet perfect plat op het oppervlak van de dia ligt.
6. Stel de ROI in door Rechthoekige ROI tekenen te selecteren... in het vervolgkeuzemenu ROI . Teken de ROI zo dat deze het hele gezichtsveld beslaat. Klik met de rechtermuisknop op de ROI en selecteer Gebruiken als stimulatie-ROI: S1.
7. Bereid de ND-installatie voor door de volgende stappen op te nemen in het tabblad ND-instellingen.
   OPMERKING: Dit is het acquisitieprotocol in vijf stappen dat één keer wordt ingesteld en vervolgens door de software wordt uitgevoerd telkens wanneer de films worden verzameld.
   1. Verkrijg afbeelding om het referentiebeeld voor prestimulatie te verzamelen.
   2. Stimulatie; ROI: S1; Interval: Geen vertraging; Duur 1,64 s, lussen: 7. Deze stap bleekt de achtergrondfluorescentie met verschillende pulsen van de laser.
   3. Imago verwerven. Deze stap verzamelt een poststimulatie referentiebeeld.
   4. Wachten; Geen actie; 2 min. Deze stap biedt een herstelperiode voor fluorescerende lading om de gebleekte ROI opnieuw te bevolken.
   5. Aanwinst; Interval: Geen vertraging; Duur 5 min, Loops: 8.615. Met deze stap worden beelden verzameld met de maximale snelheid voor de beeldvormingsperiode van 5 minuten.
8. Nadat het ND Setup-protocol is ingesteld, klikt u op de knop Stimulatie-instellingen toepassen op het tabblad ND Setup . Klik op Nu uitvoeren wanneer u klaar bent om vrachtvervoer te bekijken. Hiermee wordt vanaf stap 4.7 het ND Acquisitieprotocol gestart.
   OPMERKING: Hoewel de framesnelheid is ingesteld op 32 frames/s, kan de praktische framesnelheid langzamer zijn (~28,7 frames/s). Deze waarde moet voor een nauwkeurige kymograafanalyse worden vermeld in rubriek 5. Idealiter wordt beeldvorming van het transport van levende cellen gedaan met de hoogst mogelijke framesnelheid (bijv. >25 frames/s) om vrachtbewegingen beter te ontcijferen.
9. Reset het gezichtsveld naar de hele afbeelding; verzamel en bewaar vervolgens een afbeelding van het volledige neuron in de 561 - en 647-kanalen met de ROI-box inbegrepen. Noteer de XY-coördinaten waar de foto is genomen voor bevestiging na fixatie van de expressie van het betreffende eiwit.
10. Verzamel transportvideo's van ten minste twee neuronen voor analyse. Zorg ervoor dat elke onafhankelijke replicatie afkomstig is van het middel van variabelen die zijn gemeten van een individuele primaire neuronoogst (d.w.z. geen individuele neuronen).
    OPMERKING: Voor een bepaalde oogst van primaire neuronen verzamelen we video's van 2-4 neuronen per aandoening.
11. Fixeer de cellen door het medium te verwijderen en te incuberen met voorverwarmd 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de buffer en was de cellen elk 3 x 5 minuten in TBS.
    OPMERKING: Voor paraformaldehydefixatie gebruiken we cytoskeletbuffer, een gemeenschappelijke buffer die de cytoskeletstructuur in stand houdt (10 mM 2-(N-morfolino)ethaansulfonzuur [MES], 138 mM KCl, 3 mM MgCl₂ en 4 mM EGTA, pH 6.1). Andere buffers (bijv. TBS, PBS) kunnen ook worden gebruikt voor fixatie.
12. Bevestig dat de geanalyseerde neuronen zowel het betreffende eiwit als het fluorescerend gelabelde ladingseiwit tot expressie brengen door middel van immunocytofluorescentiekleuring. Kleuring voor humaan tau (Tau12) om exogene tau-expressie te bevestigen en β-III tubuline (Tuj1) om te verifiëren dat de neuronen gezond bleven tijdens het beeldvormingsproces.
    OPMERKING: We observeren co-expressie van beide DNA-constructen in bijna alle getransfecteerde cellen met behulp van deze methoden.

5. Genereer en analyseer kymografen

OPMERKING: Kymografen kunnen worden gegenereerd en geanalyseerd met behulp van verschillende programma's. We beschrijven kort de vrij verkrijgbare KymoAnalyzer (v. 1.01) software met behulp van zes ImageJ (v. 1.51n) plugins¹⁶. Deze plug-ins kunnen worden gedownload van de ontwikkelaars op de Encalada lab-website (https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer). Meer gedetailleerde instructies over het gebruik van deze software zijn te vinden op deze site.

1. Groepeer de films die in stap 4.9 zijn gegenereerd op basis van experimentele omstandigheden en repliceer. Voer de macro BatchKymographGeneration uit en selecteer de juiste map. Teken een kymograaf polylijn om het axon te traceren, beginnend met het proximale uiteinde in die specifieke afbeelding. De resulterende kymografen worden opgeslagen in de geselecteerde map (Figuur 2).
2. Wijs tracks handmatig toe door de macro Tracks uit te voeren, een afzonderlijke filmmap te selecteren, ja te selecteren om een track toe te voegen en vervolgens te klikken om de baan van elk deeltje te volgen. Voer de eerste klik uit aan de bovenkant van de baan en klik opnieuw op elk punt dat het deeltje van snelheid of richting verandert, zodat de polylijn het spoor van het deeltje op de kymograaf bedekt. Nadat de polylijn over de hele baan is gelegd, klikt u op OK. Herhaal dit totdat alle tracks zijn toegewezen.
3. Voer de resterende macro's uit en wijs de framesnelheid en pixelgrootte toe op basis van beeldparameters. Voer eerst CargoPopulation uit, vervolgens NetCargoPopulation en vervolgens Segmenten. Voer de pixelgrootte en framesnelheid van de films in wanneer daarom wordt gevraagd (respectievelijk 0,22 μm en 28,7 frames/s met deze instellingen). Voer ten slotte de macro poolData uit om transportparametergegevens van alle kymografen in de geselecteerde map te berekenen en samen te voegen.
4. Plot de resultaten van de gegevensbestanden en vergelijk de verschillende omstandigheden met de onafhankelijke replicaten die worden weergegeven door de gemiddelde waarden van alle geanalyseerde neuronen binnen een experimentele conditie voor een individuele neuronoogst.

Resultaten

Met behulp van deze methoden hebben we axonaal transport gekarakteriseerd in de aanwezigheid van wildtype of ziektegerelateerde vormen van tau-eiwit om mogelijke mechanismen van pathologische tau-geïnduceerde neurotoxiciteit bij ziekte te onderzoeken^12,13. De KymoAnalyzer-software berekent en bundelt een verscheidenheid aan verschillende parameters van alle kymografen in een bepaalde map. Transporttarieven worden alleen berekend ...

Discussie

Er zijn steeds meer aanwijzingen dat meerdere pathologische eiwitten die geassocieerd zijn met een verscheidenheid aan neurodegeneratieve aandoeningen het snelle axonale transport in neuronen verstoren. Dit vertegenwoordigt een mogelijk gemeenschappelijk mechanisme van neurotoxiciteit bij deze ziekten. Om beter te begrijpen hoe deze eiwitten het transport verstoren, hebben we tools en modellen nodig waarmee we specifieke vragen kunnen beantwoorden. De hier beschreven methode maakt het mo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427