Methodenartikel

Een eenvoudige, snelle en effectieve methode voor tumor xenotransplantatie analyse in transparante zebravis embryo's

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66164

⸱

12 juli 2024

 ,  ,  , 
1Nuclear Dynamics and Cancer Program, Fox Chase Cancer Center

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol voor xenotransplantatie in de dooier van transparante zebravisembryo's dat wordt geoptimaliseerd door een eenvoudige, snelle stadiëringsmethode. Analyses na injectie omvatten overleving en het beoordelen van de ziektelast van xenogetransplanteerde cellen door middel van flowcytometrie.

Samenvatting

In vivo studies naar tumorgedrag zijn een hoofdbestanddeel van kankeronderzoek; Het gebruik van muizen brengt echter aanzienlijke uitdagingen met zich mee op het gebied van kosten en tijd. Hier presenteren we larvale zebravissen als een transplantatiemodel dat tal van voordelen heeft ten opzichte van muizenmodellen, waaronder gebruiksgemak, lage kosten en korte experimentele duur. Bovendien maakt de afwezigheid van een adaptief immuunsysteem tijdens de larvale stadia de noodzaak overbodig om immunodeficiënte stammen te genereren en te gebruiken. Hoewel er gevestigde protocollen voor xenotransplantatie in zebravisembryo's bestaan, presenteren we hier een verbeterde methode met embryostadiëring voor snellere overdracht, overlevingsanalyse en het gebruik van flowcytometrie om de ziektelast te beoordelen. Embryo's worden in scène gezet om snelle celinjectie in de dooier van de larven te vergemakkelijken en celmarkering om de consistentie van de geïnjecteerde celbolus te controleren. Na injectie wordt de analyse van de embryooverleving tot 7 dagen na injectie (dpi) beoordeeld. Ten slotte wordt ook de ziektelast beoordeeld door overgedragen cellen te markeren met een fluorescerend eiwit en analyse door middel van flowcytometrie. Flowcytometrie wordt mogelijk gemaakt door een gestandaardiseerde methode voor het bereiden van celsuspensies uit zebravisembryo's, die ook kan worden gebruikt bij het vaststellen van de primaire cultuur van zebraviscellen. Samenvattend maakt de hier beschreven procedure een snellere beoordeling van het gedrag van tumorcellen in vivo mogelijk met grotere aantallen dieren per onderzoeksarm en op een meer kosteneffectieve manier.

Inleiding

Analyse van het gedrag van tumoren als reactie op genetische verandering of medicamenteuze behandeling in vivo is een essentieel onderdeel van kankeronderzoek 1,2,3,4. Dergelijke studies omvatten meestal het gebruik van immuungecompromitteerde muismodellen (Mus musculus)5; Xenotransplantatiestudies bij muizen zijn echter in veel opzichten beperkt, waaronder beperkte capaciteit, langere duur, aanzienlijke kosten en de vereiste van geavanceerde beeldvormingsapparatuur om de progressie van inwendige tumoren te volgen 6,7. Het zebravismodel (Danio rerio) daarentegen maakt een grotere capaciteit, een kortere duur, lagere kosten en, dankzij hun transparantie, eenvoudige monitoring van de ziekteprogressie mogelijk 8,9.

Zebravis is een goed ontwikkeld modelsysteem van gewervelde dieren met ex-utero ontwikkeling en hoge vruchtbaarheid, waarbij individuele vrouwtjes meer dan 100 embryo's produceren10. Bovendien zijn zebravisembryo's transparant, waardoor ontwikkelingsprocessen gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiegerelateerde technieken zoals reporters. Ten slotte maakt het behoud van kritieke ontwikkelingsprocessen ze tot een ideaal model voor vele soorten studies, waaronder het gedrag van getransplanteerde kwaadaardige cellen11,12. Wildtype zebravisembryo's ontwikkelen melanocyten, waardoor ze optisch ondoorzichtig zijn als ze 2 weken oud zijn, maar dit is overwonnen door de generatie van casper-embryo's (roya9; MitfaW2), die gedurende het hele leven transparant blijven13. Vanwege hun optische eigenschappen zijn casper zebravissen ideale ontvangers van getransplanteerde tumorcellen 14,15,16. Xenotransplantatie van tumorcellen in zebravissen heeft in de afgelopen 2 decennia aan belang gewonnen 17,18,19,20,21. Zebravisembryo's hebben een aangeboren immuniteit; Ze missen echter adaptieve immuniteit tijdens hun larvale stadium, waardoor ze functioneel immuungecompromitteerd zijn, waardoor ze kunnen dienen als effectieve gastheren voor getransplanteerde tumorxenotransplantaten22.

Er zijn protocollen ontwikkeld voor tumorimplantatie in zebravisembryo's en volwassenen die rekening hebben gehouden met een aantal verschillende variabelen 23,24,25,26,27. Deze hebben talloze plaatsen van tumorafzetting in zebravissen onderzocht, waaronder injecties in dooier, peri-vitelline-ruimte en hart en in verschillende ontwikkelingsstadia16,28. De omgevingstemperatuur van de aquacultuur voor xenotransplantaten van zebravissen is ook belangrijk, aangezien de kweek van zebravissen doorgaans plaatsvindt bij 28 °C, terwijl zoogdiercellen groeien bij 37 °C. Daarom moet een compromistemperatuur worden gehanteerd die door de vissen wordt verdragen en toch de tumorgroei ondersteunt, en 34 °C lijkt beide doelen te bereiken29. Analyse van het gedrag en de progressie van tumoren na xenotransplantatie is een ander belangrijk aandachtsgebied, en dit omvat het gebruik van een verscheidenheid aan beeldvormingsmodaliteiten en overlevingsanalyse30. Een van de grote voordelen van het zebravismodel is de beschikbaarheid van grote aantallen studiedieren om een enorme statistische kracht te bieden aan in vivo studies van tumorgedrag; Eerdere benaderingen hebben dit potentieel echter ernstig beperkt vanwege de vereiste van vervelende montageprocedures voor injecties.

Hier pakken we deze beperking aan door de ontwikkeling van een eenvoudige, snelle methode om embryo's in scène te zetten die een hoge doorvoer en monitoring van de injectiekwaliteit mogelijk maakt met behulp van de transparante casper zebravislijn. Dit houdt in dat xenotransplantaten 2 dagen na de bevruchting (dpf) in de dooierzak van de casper-zebravisembryo's worden geïnjecteerd. We observeren de overleving van embryo's na xenotransplantatie als onderdeel van de analyse van tumorgedrag. We tonen verder de beoordeling van de ziektelast na xenotransplantatie door het maken van eencellige suspensies en analyse door middel van flowcytometrie (Figuur 1).

Protocol

Het onderhoud, de voeding en de veehouderij van zebravissen vonden plaats onder standaard aquacultuuromstandigheden bij 28,5 °C, zoals beschreven31. Alle experimenten met zebravissen werden bij deze temperatuur uitgevoerd; na xenotransplantatie werden de dieren echter gedurende de duur van het experiment bij 34 °C gekweekt, in overeenstemming met de procedures die waren goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Fokken (3 dagen voor injectie)

  1. Geef een week voor het fokken droogvoer (extra voer; 5-6 korrels per vis) aan visparen om de diergezondheid te maximaliseren en het aantal embryo's dat door fokparen wordt geproduceerd te verhogen.
  2. Zet op de avond voorafgaand aan de embryooogst fokdieren op in kweekbakken met een scheidingswand die mannelijke en vrouwelijke vissen scheidt, met behulp van haremparingen van 2 vrouwtjes voor elk mannetje.
    OPMERKING: Voor experimenten met 4 armen van 100 dieren per arm, gebruik 20 fokparen per experiment. Om het aantal benodigde broedparen te bepalen is een goede schatting 50 embryo's per casper fokpaar. Een andere optie is om een robuustere, gepigmenteerde zebravisstam te gebruiken en te behandelen met 1-fenyl 2-thiourea (PTU) om pigmentatie te voorkomen. In de praktijk moet het experiment zo worden opgeschaald dat men genoeg embryo's heeft om 1 dag na injectie (dpi) twee keer het gewenste aantal te injecteren.

2. Embryoverzameling (2 dagen voor injectie)

  1. Verwijder de volgende ochtend de verdelers, zodat de vissen zich kunnen voortplanten.
  2. Visualiseer de embryo's in de tanks 20 minuten (min) na het verwijderen van de verdelers.
  3. Verzamel de embryo's met behulp van een zeef in een petrischaal van 90 mm met embryowater gemaakt zoals beschreven in The Zebrafish Book31.
    1. Om embryowater te maken, voegt u 1,5 ml bouillonzouten toe aan 1 l gedestilleerd water en methyleenblauw tot 0,1% definitief. Maak de bouillonzoutoplossing door 40 g zeezout (materiaaltabel) op te lossen in 1 l gedestilleerd water. De ionische samenstelling van embryowater is K+ (0,68 mg/L), Cl− (31,86 mg/L), Na+ (17,77 mg/L), SO4− (4,47 mg/L), Mg2+ (2,14 mg/L) en Ca2+ (0,68 mg/L).
  4. Laat de zebravis een uur langer broeden en verzamel de resulterende embryo's.
  5. Bundel de embryo's voor het experiment.
  6. Verwijder 's avonds alle onbevruchte of dode embryo's, die herkenbaar zijn aan hun abnormale morfologie, en zorg voor vers embryowater.

3. Onderhoud van het embryo en voorbereiding van het gereedschap voor injecties (1 dag voor de injectie)

  1. Verwijder de volgende ochtend eventuele extra dode embryo's en geef vers embryowater.
  2. Bereid een agaroseplaat voor door 1,5% agarose te verwarmen in embryowater en giet het verwarmde mengsel in een petriplaat van 90 mm. Een schaal van 90 mm heeft 30-35 ml van het mengsel nodig.
  3. Trek niet-filamentnaalden uit glazen capillairen (borosilicaat) met behulp van de naaldtrekker. Naalden worden getrokken (onder hittedruk) waardoor een gesloten uiteinde ontstaat; Klem ze vast met een tang om een optimale opening te genereren. Beoordeel de geschiktheid van de naaldopening door het volume verplaatste vloeistof per tijdseenheid te bepalen (zie hieronder, punt 6.3).
    OPMERKING: Glazen capillairen kunnen worden gekocht met of zonder centrale filamenten. Haarvaten zonder centrale filamenten hebben de voorkeur voor celinjecties.
  4. Plaats de naalden in een afgedekte petriplaat van 90 mm in de groeven die zijn gemaakt met klei (boetseerklei voor kinderen) tot gebruik (Figuur 2A).

4. Bereiding en etikettering van leukemiecellen met CM-Dil (dag van injectie)

  1. Onderhoud de te transplanteren cellen onder omstandigheden die optimaal zijn voor hun groei. De hier gebruikte muizenleukemiecellen waren ofwel voldoende (M82; Rpl22+/+) of gebrekkig (M109; Rpl22-/-) voor het ribosomale eiwit Rpl22, dat functioneert als een tumorsuppressor32.
  2. Pelletcellen in een conische buis van 50 ml. Tellen en vervolgens centrifugeren bij 300 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg.
    OPMERKING: Het aantal benodigde cellen wordt bepaald door de experimentele reikwijdte en omstandigheden, maar 1 x 106 cellen is een goed uitgangspunt.
  3. Voer CM-Dil-kleuring uit
    OPMERKING: CM-Dil-kleuring maakt monitoring van de injectiebolus mogelijk.
    1. Maak een stockoplossing van CM-Dil door een injectieflacon van 50 μg CM-Dil te resuspenderen in 50 μl dimethylsulfoxide (DMSO; 1 mg/ml of ~1 mM definitief).
    2. Produceer een werkende oplossing door de voorraad (4,8 μL kleurstof/ml) te verdunnen in 1% foetaal runderserum (FBS)/Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met eventuele ondersteunende supplementen die de te gebruiken cellen nodig hebben.
  4. Resuspendeer de cellen bij 1 x 106/100 μl in de werkoplossing van de vlek.
  5. Incubeer bij 37 °C gedurende 10 min.
    OPMERKING: De kleuringsomstandigheden moeten worden geoptimaliseerd voor de gebruikte cellen (tijd, enz.). De cellen die hier werden gebruikt, hadden twee verschillende incubaties van 10 minuten bij verschillende temperaturen nodig om een optimale kleuring te bereiken.
  6. Wassen met 10 ml 1x HBSS op kamertemperatuur (RT).
  7. Pelletcellen (centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT), decanteer de supernatant, resuspendeer vervolgens met 10 ml HBSS en herhaal hetzelfde voor een tweede wasbeurt.
  8. Resuspendeer de gekleurde tumorcellen bij 40.000 cellen/μL in 1% FBS/PBS en eventuele ondersteunende supplementen die nodig zijn en houd de celsuspensie op 34 °C tot injectie.
    OPMERKING: Ondersteunende supplementen waren nodig voor het onderhoud van de cellijnen die in deze studie werden gebruikt (bijv. 1% FBS en cytokines). De supplementen en xenotransplantatie moeten mogelijk worden aangepast aan de specifieke cellijnen die worden bestudeerd. PBS werd hier geselecteerd in plaats van media om mogelijke toxiciteit in de dooier te voorkomen.

5. Dechorionatie

  1. Dechorioneer de casper zebravisembryo's handmatig op 2 dpf met behulp van insulinespuiten onder een vergroting van 2x in een lichtmicroscoop. Prik met één naald in het chorion terwijl u de andere naald gebruikt om het chorion te immobiliseren.
    OPMERKING: Het gebruik van pronase voor dechorionatie wordt niet aanbevolen omdat dit soms leidt tot een verminderde gezondheid van het embryo. Het dechorioneren van de embryo's bij 2 dpf heeft de voorkeur omdat dit gemakkelijker is en de embryo's minder kwetsbaar zijn dan op eerdere tijdstippen (1 dpf).
  2. Zorg er tijdens het dechorioneren voor dat u de embryo's niet met de naalden aanraakt. Het aanraken of beschadigen van de dooier van embryo's door onbedoeld contact met de naalden kan de dood tot gevolg hebben.
  3. Verwijder de gestripte chorionen door het embryowater te verversen.

6. De microinjector en naald instellen

  1. Zet de microinjector en de pomp aan en stel de omstandigheden in die geschikt zijn voor micro-injecties van cellen. Een injectiedruk van 9-11 psi en een injectietijd van 0,5 seconde (s) zijn een goed uitgangspunt voor het knippen van de naald en het instellen van de opening.
  2. Laad de suspensie van de tumorcellijn (~5 μL) voorzichtig in één keer in de micronaald, vermijd de vorming van luchtbellen, die de celstroom in de naald verstoren.
  3. Snijd het uiteinde van de naald af met een pincet (Dumont nummer 5) om een opening te produceren die de uitwerping van 10-15 nanoliter (nL) celsuspensie per 0,2-0,3 s ondersteunt.
    OPMERKING: De bovenstaande berekening van het nL-volume wordt gedaan met behulp van kalibratiecapillairen, waarbij 1 mm = 30 nL. Kortom, stel de tijd in op 0,5 s en druk na elke clip van de naald op injecteren en verzamel het volume in het kalibratiecapillair. Vervolgens wordt de lengte van het verzamelde volume gemeten met behulp van de schaal onder een microscoop en wordt het knippen van de naald gestopt wanneer 30 nL wordt geïnjecteerd in 0,5 s. Stel vervolgens de tijd van injecties in op 0,2-0,3 s. (injectie van ~10-15 nL cellen)

7. Voorbereiding van het embryo voor injectie

  1. Selecteer gezonde embryo's onder de microscoop en verwijder embryo's met ontwikkelingsafwijkingen zoals hartoedeem of een korte of gebogen stam.
  2. Verdoof de embryo's met behulp van tricaïnemethaansulfonaat (MS-222; 0,16 g/l embryowater) gedurende 1 minuut in een petriplaat van 90 mm.
  3. Gebruik een glazen pasteurpipet om de embryo's op te pakken. Leg 10-15 embryo's in een zijligging op de 1,5% agaroseplaat (Figuur 2B-D).
  4. Verwijder overtollig water met behulp van de Pasteurpipet en laat de minimale hoeveelheid embryowater over die nodig is om de embryo's in leven te houden.

8. Procedure voor injectie

  1. Controleer onder de lichtmicroscoop of de cellen zich hebben opgehoopt in de punt van de naald.
  2. Injecteer de embryo's met behulp van de gekalibreerde naald gedurende 0,2-0,3 s (met 10-15 nL overeenkomend met 400-600 cellen) in de dooier van de embryo's.
  3. Herhaal de injectie voor alle embryo's en verzamel ze vervolgens in vers embryowater.
    OPMERKING: Omdat cellen de neiging hebben zich op te hopen op de naaldpunt, moet de punt elke 15-20 injecties iets opnieuw worden geknipt. Dit vereist ook dat de druk en tijd bij elke reclipping opnieuw worden ingesteld om ervoor te zorgen dat een vergelijkbaar volume wordt geïnjecteerd.
  4. Om er zeker van te zijn dat de vergelijking van het gedrag van twee verschillende sets overgedragen cellen geldig is, controleert u de bolus van de overgedragen cellen. Doe dit door de embryo's te sorteren op basis van CM-Dil-kleuring (in het RFP-kanaal) 1 uur na injectie (hpi), waarbij u degenen met optimale kleuring ("goede bolus") scheidt van degenen met inferieure kleuring ("inferieure bolus"; Figuur 3, gele pijl).
  5. Gooi de embryo's met een inferieure bolus weg of gebruik ze om de impact van een andere celdosis op de ziekteprogressie te beoordelen.
  6. Verwijder alle dode embryo's aan het einde van de dag, omdat hun dood verband houdt met injectietrauma in plaats van tumorgroei. Verwijder embryo's die geen cellen bevatten uit de analyse, aangezien de cellen waarschijnlijk uit de injectieplaats zijn gelekt.
  7. Houd de geïnjecteerde embryo's gedurende het experiment op 34 °C in een schaal van 90 mm met ~60 embryo's per plaat.
    OPMERKING: Na 5 dpf is de dooier geconsumeerd door de groeiende embryo's, dus embryo's moeten voor de duur van het experiment worden voorzien van parameciumvoedsel. Om een goede voeding te garanderen, moet paramecia dagelijks aan de embryo's worden gegeven van 6 dpf (4 dpi) tot 9 dpf (7 dpi). Paramecia worden vermeerderd door kweek in kolven onder optimale voedings- en temperatuuromstandigheden, zoals beschreven31.

9. Analyse van de overleving

  1. Houd de embryo's de volgende 7 dpi in de gaten en ververs het embryowater dagelijks. Waterverversingen kunnen voor het gemak worden teruggebracht tot afwisselende dagen als het onderzoek medicamenteuze behandeling omvat.
  2. Controleer de gezondheid van het embryo en scoor de dood voor de duur van de analyse.
    OPMERKING: De experimentele duur was 7 dagen voor dit experiment, maar kan korter of langer zijn, afhankelijk van de agressiviteit van de xenogetransplanteerde tumor.
  3. Gebruik CM-Dil-fluorescentie om de ziektelast te beoordelen (Figuur 4A) en bepaal de impact van genetische veranderingen of medicamenteuze behandelingen op overleving met behulp van Kaplan Meier-analyse en geef grafisch weer (bijv. met GraphPad Prism; Figuur 4B) 33. okt.

10. Eencellige suspensie van embryo's voor flowcytometrie-analyse

OPMERKING: De ziektelast kan worden beoordeeld door middel van flowcytometrieanalyse na xenotransplantatie; Dit vereist echter een onuitwisbare markering van de tumorcellen. Retroviraal of lentiviraal toegediend rood fluorescerend eiwit (RFP) of mCherry is effectief omdat het een goed signaal geeft over de autofluorescentie van zebraviscellen, die het signaal van groen fluorescerend eiwit verdoezelt.

  1. Isoleer embryo's in het dpi-stadium van uw keuze. Hier wordt 5 dpi weergegeven (Figuur 5).
  2. Verzamel 30-40 embryo's per aandoening als uitgangspunt, maar het aantal embryo's kan verschillen afhankelijk van het stadium en de agressiviteit van de getransplanteerde cellen. Verdoof de embryo's zoals hierboven beschreven.
    OPMERKING: Embryo's kunnen worden onderverdeeld in replicaten om statistische significantie te verkrijgen, zoals hier weergegeven (Figuur 5B).
  3. Breng de embryo's over in centrifugebuisjes van 1,5 ml.
  4. Gebruik 100 μL calciumvrije Ringer's oplossing (recept31) per monster om de dooier op te lossen, aangezien een laag calciumgehalte de embryonale weefsels verzacht, waardoor een effectievere weefseldissociatie mogelijk is.
  5. Pipeteer met tussenpozen 5 minuten op en neer om de dooier te verwijderen met behulp van een pipetpunt van 200 μl.
  6. Verwarm 0,05% trypsine/PBS (zonder fenolrode indicator) voor op 29 °C en vul dit aan met 27 μL collagenase IV (100 mg/ml) per ml trypsineoplossing. Voor elk monster van embryo's is een volume van 1 ml oplossing nodig.
  7. Voeg 1 ml trypsine/collagenase-oplossing toe aan elk monster van gededooierde embryo's en incubeer bij 29 °C gedurende 30-35 minuten.
  8. Pipeteer de embryo's in deze oplossing met behulp van een pipetpunt van 1 ml elke 5 minuten op en neer totdat de structuur van de embryo's (ruggengraat) niet meer zichtbaar is.
  9. Stop de reactie met 200 μL FBS.
  10. Meng goed en incubeer bij 29 °C gedurende nog eens 5 minuten om volledige inactivatie van de trypsine te garanderen.
    OPMERKING: Een temperatuur van 29 °C wordt gebruikt voor het weefseldissociatieprotocol om door hitteschok veroorzaakte dood van zebraviscellen te voorkomen, die optreedt bij 37 °C; Als het behoud van zebraviscellen echter niet nodig is, kan de spijsvertering worden uitgevoerd bij 37 °C.
  11. Pellet de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
  12. Resuspendeer de celpellet in 4 °C PBS en pellet zoals hierboven.
  13. Herhaal de wasbeurt en zeef de cellen vervolgens door een celzeef van 70 μm.
  14. Pellet en ga verder met kleuring voor flowcytometrieanalyse.
    OPMERKING: Als kweek van primaire zebraviscellen nodig is, was dan nog twee keer met 4 °C PBS en resuspendeer in L15-media (met antibiotica en 10% FBS).

11. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS): Kleuring en sortering van xenogetransplanteerde cellen

  1. Resuspendeer de celsuspensie in een kleurstof (HBSS met 1% FBS) en pellet bij 300 x g gedurende 5 min.
  2. Resuspendeer de celpellet in het kleuringsmedium met een antilichaam dat reactief is met de getransplanteerde cellen om een tweede marker te bieden (naast RFP of mCherry) waarmee getransplanteerde cellen kunnen worden onderscheiden van zebraviscellen. Hier werd 50 μL anti-muis CD45 (APC-CD45) per monster gebruikt in een verdunning van 1:50 (Figuur 5).
  3. Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C alvorens te wassen zoals hierboven met 1 ml van het kleurmedium om het ongebonden antilichaam te verwijderen.
  4. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspendeert u de celpellet in 200 μl kleurstof die de vitale kleurstof Helix NP Blue (1 μM) bevat, waardoor onderscheid tussen levend en dood mogelijk is.
  5. Breng het celmengsel over in polycarbonaatbuisjes van 5 ml met ronde bodem voor flowcytometrieanalyse.
    OPMERKING: Het parallel kleuren van een tumorcelcontrole biedt duidelijkheid voor het trekken van poorten tijdens flowcytometrieanalyse.

12. Flowcytometrie

  1. Schakel de flowcytometer in die beschikbaar is met een laag debiet (500 gebeurtenissen per seconde of minder) om de parameters in te stellen.
  2. Gebruik de tumorcelcontrole (dezelfde cellen die worden gebruikt voor xenotransplantatie) om de spanning in te stellen voor FSC (voorwaartse verstrooiing), SSC (zijverstrooiing), BV421/CasB (levensvatbaarheid), CE-594 (mCherry) en APC (CD45.2) kanalen.
    OPMERKING: Enkelvoudig gekleurde monsters zijn nodig om de compensatie-instellingen vast te stellen die fluorochroomoverlapping tussen verschillende vlekken elimineren.
  3. Gebruik het niet-geïnjecteerde embryomonster om instellingen tot stand te brengen die geschikt zijn voor zowel getransplanteerde als zebraviscellen.
  4. Verhoog de stroomsnelheid tot 8000 gebeurtenissen per seconde en registreer 1 miljoen gebeurtenissen voor elk monster.
  5. Analyseer de resulterende gegevens met behulp van geschikte analysesoftware, waarbij eerst singlets worden geselecteerd door FSC-H versus FSC-A (hoogte versus s-gebied) uit te zetten, gevolgd door een plot voor het selecteren van levensvatbare cellen. FlowJo software wordt veel gebruikt voor dergelijke analyses.
  6. Teken met behulp van de tumorcelcontrole een poort rond de getransplanteerde cellen door FSC-A versus SSC-A en gebruik vervolgens de indicatorkleuringen, in dit geval CD45 en mCherry (Figuur 5B).
    OPMERKING: De groottepoort die voor de tumor is geselecteerd, zal ook zebraviscellen bevatten, wat de basis vormt voor normalisatie en bepaling van de ziektelast.
  7. Analyseer de embryomonsters met dezelfde poortinstellingen als hierboven. De uiteindelijke grafiek van de tumorkleuring en de fluorescerende eiwitindicator zal een maat zijn voor de ziektelast (Figuur 5C).
    OPMERKING: Hier werd het verschil in ziektelast uitgezet voor embryo's die een goede bolus van geïnjecteerde cellen kregen versus degenen die een inferieure bolus kregen.
  8. Sorteer indien nodig de tumorcellen in de embryo's door middel van flowcytometrie voor stroomafwaartse moleculaire analyse.

Resultaten

Xenotransplantatie
Een uitgebreid overzicht van het gehele experiment en de analyse wordt weergegeven in figuur 1, variërend van embryoproductie tot de beoordeling van ziekteprogressie door zowel overleving als ziektelastanalyse door flowcytometrie. Deze aanpak brengt verschillende verbeteringen met zich mee die de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van xenotransplantatie verbeteren, en voegt ook een nieuwe manier toe om de ziektelast te beoordelen. Het succes van deze experimenten is sterk afhankelijk van de gezondheid van de getransplanteerde cellen, aangezien cellen die niet gezond zijn en zich in de logfase bevinden, zich bij transplantatie niet kunnen voortplanten. De duur van de injectiesessie is ook een kritische parameter. Nadat de tumorcellen zijn voorbereid, is het van cruciaal belang om de injectie in zebravissen binnen 3-4 uur te voltooien. De aanpak die in deze studie is gebruikt, maakt het mogelijk om in dit tijdsbestek grotere aantallen embryo's te injecteren door ze eenvoudig op hun zij op een agaroseplaat te plaatsen en ze in de dooier te injecteren (Figuur 2C,D). Bovendien is het absoluut noodzakelijk dat de optimale naaldopening zo wordt gekozen dat er voldoende cellen worden geïnjecteerd (400-600 cellen), maar dat de opening niet zo groot is dat de embryo's gewond raken. Een andere overweging is de injectiedruk. We vinden dat drukken van meer dan 12-13 psi de dooier van embryo's verstoren, waardoor de dood ontstaat. Ten slotte is een andere variabiliteit die inherent is aan deze procedure de consistentie van de injectie. De te injecteren cellen nestelen zich in het uiteinde van de injectienaald, waardoor een nauwkeurige regeling in de injectiebolus een uitdaging is. Wanneer de cellen worden geëxxenotransplanteerd, hebben alle embryo's het potentieel om dezelfde injectiebolus te krijgen, maar in de praktijk is dat niet het geval (figuur 3). Het aantal overgedragen cellen kan sterk variëren, afhankelijk van het gedrag van de tumorcellen (bijv. samenklonteren) en het vaardigheidsniveau van de operator. We hebben deze onzekerheid aangepakt door middel van CM-Dil-kleuring/mCherry-labeling, die het mogelijk maakt om na injectie te categoriseren van dieren die een geschikte en consistente celbolus hebben gekregen, evenals van dieren die een inferieure bolus hebben gekregen. De CM-Dil-kleuring, maar effectiever gemarkeerd met een fluorescerend eiwit, heeft als bijkomend voordeel dat het de monitoring van de ziekteprogressie vergemakkelijkt, hetzij door microscopie of door flowcytometrie (Figuur 4 en Figuur 5).

Analyse van tumorgedrag
Tumorprogressie kan eenvoudig worden gevolgd met behulp van eenvoudige fluorescentiemicroscopie gericht op RFP (Figuur 4A). Evenzo kan traditionele overlevingsmonitoring worden uitgevoerd door middel van Kaplan-Meier-analyse (Log-rank en Wilcoxon-test) (Figuur 4B). In tegenstelling tot xenotransplantatiestudies op basis van muizen, waarbij er doorgaans 8-10 dieren per onderzoeksarm zijn, is het met behulp van de hier beschreven zebravismethode niet moeilijk om onderzoeksarmen te bereiken met elk meer dan 60 dieren (Figuur 4B). Dit verhoogt het oplossend vermogen van in vivo studies aanzienlijk. Ten slotte hebben we een andere benadering geïmplementeerd voor de analyse van de ziektelast met behulp van flowcytometrie. Dit omvat de verstoring van een equivalent aantal embryo's en het analyseren van de tumorcelinhoud van de resulterende eencellige suspensie door middel van flowcytometrie. Door een tumorspecifieke celoppervlaktemarker te combineren met de fluorescerende eiwitindicator, kunnen de xenogetransplanteerde muizen/menselijke cellen met vertrouwen worden geïdentificeerd door middel van flowcytometrie als een benadering om de ziektelast te beoordelen (Figuur 5). Voor dit doel zijn rode fluorescerende eiwitten superieur, omdat de groene fluorescerende eiwitten geen signaal afgaven over de autofluorescentie van gastheerzebraviscellen. Hier werd mCherry gebruikt voor cellabeling en monitoring tijdens xenotransplantatie voor FACS-analyse samen met CD45. De dubbele labeling stelde ons in staat om verschillen in de tumorlast tussen goede versus inferieure bolusinoculatie te meten (Figuur 5B,C).

figure-results-1
Figuur 1: Schema van de gehele procedures voor xenotransplantatie en analyse na injectie. (A) De kweekopstelling, de embryoverzameling en de morfologie van de 2 dagen na de bevruchting (dpf) is geschematiseerd. (B) Bereiding, kleuring en injectie van leukemiecellen voor xenotransplantatie in de dooier van zebravisembryo's. (C) Analyses na xenotransplantatie, met inbegrip van overleving en flowcytometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatieve beelden van de instrumenten die voor de injecties zijn gebruikt. (A) Getrokken naalden in een petriplaat. (B) De agaroseplaat voor de stadiëring van het embryo. (C,D) Een plaat met embryo's die in scène zijn gezet (representatief diagram in paneel C en echte embryo's (omcirkeld in rood) in paneel D) voor injecties op de embryolaadplaat. De inzet in de rechterbenedenhoek van paneel D toont een weergave met een hogere vergroting van de geënsceneerde embryo's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Representatieve beelden van xenogetransplanteerde embryo's. Er worden helderveld- en immunofluorescerende beelden getoond van CM-Dil-kleuring (rood)-positieve cellen in de dooier van de casper-embryo's bij 1 dpi (koppelingsbeeld). Embryo's met een inferieure bolus worden aangeduid met een gele pijl, terwijl embryo's met een verstoorde morfologie worden aangegeven met een sterretje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Beoordeling van ziekteprogressie door middel van fluorescentiebeeldvorming en overlevingsanalyse. (A) Representatief beeld van xenogetransplanteerde embryo's bij 4 dpi en 7 dpi. (B) De Kaplan Meier-plot met de overlevingsanalyse van embryo's met twee genetisch verschillende leukemielijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Flowcytometrische analyse van de ziektelast bij xenogetransplanteerde zebravissen. (A) Schematische weergave van de bereiding van celsuspensie en flowcytometrieanalyse. In het kort worden embryo's bij 4 dpi uitgesplitst in eencellige suspensies met behulp van trypsine en collagenase, gevolgd door flowcytometrie. (B) Representatieve grafieken voor de flowcytometrieanalyse, waarbij het linkerbeeld in elk paneel FSC-A versus SSC-A-plot is en het rechterbeeld CD45 versus mCherry-signalen. (C) Staafdiagram met de celstatistieken voor xenogetransplanteerde cellen zoals verkregen uit CD45 vs/s mCherry-plot voor niet-geïnjecteerde, goede en inferieure embryo's (n = 45, 40 en 40 voor elke replicaat (n = 3); p-waarde * ≤ 0,05, berekend met behulp van ongepaarde t-test met Welch's correctie in GraphPad Prism 9). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Xenotransplantatie van zebravissen is naar voren gekomen als een snel, robuust en kosteneffectief alternatief voor muizenstudies12. Hoewel er verschillende benaderingen van xenotransplantatie van zebravissen zijn gemeld, heeft onze aanpassing geleid tot aanzienlijke verbeteringen. Naast het standaardiseren van parameters rond de procedure, richten deze verbeteringen zich specifiek op het versnellen van de snelheid waarmee tumorinjecties kunnen worden uitgevoerd, waardoor een toename van het aantal dieren per onderzoeksarm mogelijk wordt en tumoretikettering wordt gebruikt om de kwaliteit van injectie en gedrag na injectie te controleren.

Hoewel de hier beschreven verbeteringen van deze methode een groot potentieel hebben, vereist de succesvolle uitvoering van deze strategie een bekwame beoefenaar en optimalisatie voor de specifieke toepassing. We gebruikten leukemiecellen. Bijgevolg kan het gebruik van solide kankers extra uitdagingen met zich meebrengen. Dergelijke tumoren kunnen vatbaar zijn voor aggregatie, wat variabiliteit zou veroorzaken in de afgifte van de celbolus; maar zelfs in dergelijke omstandigheden moet RFP-etikettering een adequate kwaliteitscontrole van de bolus na injectie mogelijk maken. Dit is superieur aan GFP-etikettering of groene kleurstoffen, die worden verdoezeld door autofluorescentie. Ten slotte minimaliseert de hier beschreven standaardisatie van de meeste parameters die van invloed zijn op het succes (gezondheid van het embryo, aquacultuurtemperatuur, naaldopening, injectiedruk, enz.) de variabiliteit van dit proces.

Een belangrijke overweging voor xenotransplantatie-experimenten bij zebravissen is de injectieplaats. Hier hebben we aangetoond dat de injecties in de dooier vrij eenvoudig zijn in vergelijking met andere, meer technisch uitdagende plaatsen, zoals perivitelineruimte34, Duct of Cuvier35 en intracardiale injectie (hartventrikel)36. Het nadeel van dooierinjectie is dat het een vitaal orgaan is voor de groeiende embryo's, dus er moet voor worden gezorgd dat de naalddiameter en druk zorgvuldig worden gecontroleerd, zodat het embryo niet sterft als gevolg van injectietrauma. De hier beschreven aanpak vermindert deze bezorgdheid door letsel te minimaliseren en duidelijke verwondingen of overlijden met 1 dpi weg te gooien, aangezien die problemen geen verband houden met tumorgroei. De laatste overweging met betrekking tot de injectieplaats is dat verschillende micro-omgevingen in meer of mindere mate in staat kunnen zijn om de voortplanting van xenogetransplanteerde tumoren te ondersteunen. Daarom kunnen misschien eerst dooierinjecties worden uitgevoerd voordat wordt overgegaan tot meer uitdagende orthotope injecties. Het grote voordeel van dooierinjectie is dat het geen nauwkeurige embryostadiëring vereist en dus een snellere injectie van een groter aantal embryo's mogelijk maakt, waardoor hun gezondheid beter behouden blijft en de statistische kracht om verschillen in het gedrag van getransplanteerde tumorcellen op te lossen, wordt vergroot.

Monitoring van de ziekteprogressie na injectie wordt doorgaans beoordeeld aan de hand van effecten op overleving met behulp van Kaplan-Meier-analyse37; Het testen van de ziektelast kan echter ook behoorlijk informatief zijn. Voor getransplanteerde cellen die op de injectieplaats achterblijven, kan de tumorbelasting worden gekwantificeerd met behulp van verschillende microscopiemethoden, op voorwaarde dat de etiketteringsmethode voor de tumorcellen niet wordt verdoezeld door autofluorescentie29. De CM-Dil-kleuring is gemakkelijk op te lossen en wordt niet beïnvloed door autofluorescentie, dus het werkt goed om de tumorlast van gelokaliseerde cellen te kwantificeren. De uitdaging doet zich voor wanneer tumorcellen niet op de injectieplaats blijven en zich verspreiden. In dergelijke gevallen is flowcytometrie, in combinatie met onuitwisbare genetische markering met behulp van rode fluorescerende eiwitten, een zeer effectieve manier om de ziektelast in gestandaardiseerde klauwen van embryo's te controleren, aangezien de gelabelde tumor kan worden geanalyseerd met behulp van soortspecifieke kleuringen die verschillen van de zebraviscellen. Een tekortkoming van CM-Dil is dat het wordt verdund door celdeling38. Dienovereenkomstig heeft aanpassing met behulp van genetische markering van de tumoren met behulp van RFP of mCherry aanzienlijke voordelen. mCherry-expressie, gekoppeld aan een tumorspecifiek antilichaam, maakt de zelfverzekerde identificatie van getransplanteerde cellen mogelijk tussen wat een complex patroon van achtergrondsignalen kan zijn die door de gastheerzebraviscellen worden geleverd.

Alles bij elkaar zorgen de geoptimaliseerde zebravis xenotransplantatie aanpak en analysemethode die in deze studie zijn gebruikt, voor een substantiële verbetering van een toch al krachtig experimenteel platform.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R37AI110985 en P30CA006927, een krediet van het Gemenebest van Pennsylvania, de Leukemia and Lymphoma Society en het Bishop Fund. Deze studie werd ook ondersteund door de kernfaciliteiten van Fox Chase, waaronder celcultuur, flowcytometrie en laboratoriumdierfaciliteit. We danken Dr. Jennifer Rhodes voor het onderhouden van de zebravis en micro-injectiefaciliteit bij FCCC.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-fenyl 2-thioureum (PTU)SigmaP7629
70 micron cel zeefCorning CLS431751-50EA
90 mm Petri schotelThermo Fisher ScientificS43565
AgaroseApex bioresearch20-102GP
APC APC anti-muis CD45.2 AntilichaamBiolegend109814
BD FACSymphony A5 Cel AnalyzerBD BiosciencesBD FACSymphony A5
kalibratie capillairenSigma P1424-1PAK
Cel tracker CM-dil kleurstofInvitrogenC7001
Collageen IVGibco17104019
Dumont pincet nummer 55Fine science tools11255-20
FBSCorning 35-015-CV
Fluorescentie microscoopNikonmodel SMZ1500
Glas capillairen (Borosilicaat)World precision instruments1B100-4
HBSSCorning 21-023-CV
Helix NP BlauwBiolegend425305
Instant Ocean ZeezoutInstant oceanSS15-10
Licht microscoopNikonmodel SMZ1000
MethyleenblauwSigmaM9140-100G
Microloader (lange tips voor het laden van cellen)eppendorf930001007
P1000 micropipettrekkerSutter instrumentsmodel P-97
PM 1000 cel micro-injectorMicroData Instruments, Inc. (MDI)PM1000
Tricaine methaansulfaat (Ethyl 3- aminobenzoaat methaansulfaat)SigmaE10521-10G
Trypsine-EDTA (0,5%), geen fenol roodGibco15400054
Bestraalde volwassen zebravis voeding (droogvoer)Zeigler388763

Referenties

  1. Sharma, G., Goyal, Y., Bhatia, S. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. Preclinical Animal Models of Cancer: Applications and Limitations. , Springer. Singapore. (2022).
  2. Singhal, S. S., et al. Recent advancement in breast cancer research: Insights from model organisms-Mouse models to zebrafish. Cancers. 15 (11), 2961(2023).
  3. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 8 (1), 160(2023).
  4. Fuochi, S., Galligioni, V. Disease Animal Models for Cancer Research. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , Springer, Humana. New York, NY. (2023).
  5. Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
  6. Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
  7. Zeng, M., et al. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 23 (1), 120(2023).
  8. Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models. Heliyon. 9 (3), e14557(2023).
  9. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
  10. Choe, S. -K., Kim, C. -H. Zebrafish: A powerful model for genetics and genomics. Int J Mol Sci. 24 (9), 8169(2023).
  11. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  12. Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288(2023).
  13. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  14. Hill, D., Chen, L., Snaar-Jagalska, E., Chaudhry, B. Embryonic zebrafish xenograft assay of human cancer metastasis. F1000Res. 7, 1682(2018).
  15. Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
  16. Lin, J., et al. A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy. Blood. 128 (2), 249-252 (2016).
  17. Grissenberger, S., et al. High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma. Cancer Lett. 554, 216028(2023).
  18. Baxi, D. Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. , Springer. Singapore. (2022).
  19. Li, X., Li, M. The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents. Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).
  20. Yin, J., et al. Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery. Pharmaceuticals. 16 (4), 598(2023).
  21. Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish. Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).
  22. Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
  23. Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
  24. Casey, M. J., et al. Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response. J Vis Exp. (123), e55712(2017).
  25. Soh, G. H., Kögler, A. C., Müller, P. A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos. J Vis Exp. (174), e62767(2021).
  26. Martinez-Lopez, M., Póvoa, V., Fior, R. Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis. J Vis Exp. (172), e62373(2021).
  27. Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish. J Vis Exp. (122), e55459(2017).
  28. Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768(2011).
  29. Cabezas-Sáinz, P., Pensado-López, A., Sáinz Jr, B., Sánchez, L. Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment. Cells. 9 (9), 1978(2020).
  30. Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis. Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).
  31. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Oregon. (2000).
  32. Rao, S., et al. Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B. Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).
  33. Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate. Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).
  34. Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing. J Vis Exp. (195), e63744(2023).
  35. Murali Shankar, N., et al. Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer. Front Immunol. 14, 1254821(2023).
  36. Takahi, M., et al. Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart. Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).
  37. Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
  38. Regan, J. L., et al. RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence. iScience. 24 (6), 102618(2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FlowcytometrieCelinjectieZiektelastEmbryo overlevingsanalyseFluorescente CelmarkeringBereiding van CelsuspensieLeukemieceltransplantatieRas MAP kinase

Gerelateerde artikelen