Method Article

Generatie en stroomafwaartse analyse van single-cell en single-nuclei transcriptomen in hersenorganoïden

DOI:

10.3791/66225

⸱

March 29th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC), 2Institut für Biologie, Humboldt-Universität zu Berlin, 3Organoid platform, Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier introduceren we een uitgebreid protocol voor het genereren en stroomafwaarts analyseren van menselijke hersenorganoïden met behulp van single-cell en single-nucleus RNA-sequencing.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het afgelopen decennium is single-cell transcriptomics aanzienlijk geëvolueerd en een standaard laboratoriummethode geworden voor gelijktijdige analyse van genexpressieprofielen van individuele cellen, waardoor cellulaire diversiteit kan worden vastgelegd. Om de beperkingen van moeilijk te isoleren celtypen te overwinnen, kan een alternatieve benadering gericht op het herstellen van enkele kernen in plaats van intacte cellen worden gebruikt voor sequencing, waardoor transcriptoomprofilering van individuele cellen universeel toepasbaar wordt. Deze technieken zijn een hoeksteen geworden in de studie van hersenorganoïden, waardoor ze modellen zijn geworden van het zich ontwikkelende menselijke brein. Door gebruik te maken van het potentieel van single-cell en single-nucleus transcriptomics in hersenorganoïdenonderzoek, presenteert dit protocol een stap-voor-stap handleiding met belangrijke procedures zoals organoïde dissociatie, isolatie van single-cells of kernen, bibliotheekvoorbereiding en sequencing. Door deze alternatieve benaderingen te implementeren, kunnen onderzoekers datasets van hoge kwaliteit verkrijgen, waardoor de identificatie van neuronale en niet-neuronale celtypen, genexpressieprofielen en celafstammingstrajecten mogelijk wordt. Dit vergemakkelijkt uitgebreid onderzoek naar cellulaire processen en moleculaire mechanismen die de ontwikkeling van de hersenen vormgeven.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren zijn organoïdetechnologieën naar voren gekomen als een veelbelovend hulpmiddel om orgaanachtige weefsels te kweken 1,2,3. Vooral voor organen die niet goed toegankelijk zijn, zoals het menselijk brein, bieden organoïden de mogelijkheid om inzicht te krijgen in de ontwikkeling en manifestatie van ziekten4. Als zodanig zijn hersenorganoïden op grote schaal gebruikt als een experimenteel model om verschillende menselijke hersenaandoeningen te onderzoeken, waaronder ontwikkelings-, psychiatrische of zelfs neurodegeneratieve ziekten 4,5,6.

Met de komst van single-cell transcriptoomprofileringstechnologieën kunnen primaire menselijke weefsels en complexe in vitro-modellen worden bestudeerd met een ongekend niveau van granulariteit, wat mechanistische inzichten biedt in veranderingen in genexpressie op het niveau van celsubpopulaties in gezondheid en ziekte en informatie geeft over nieuwe vermeende therapeutische doelen 7,8,9. Het organoïdeveld heeft vooruitgang geboekt door gebruik te maken van single-cell transcriptoomprofilering om de cellulaire samenstelling, reproduceerbaarheid en de getrouwheid van hersenorganoïdetechnologieën te beoordelen 10,11,12. Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) maakte celclassificatie en de identificatie van genetische ontregeling in zieke organoïden mogelijk13,14. Belangrijk is dat het de complexiteit van organoïde weefsels is die de implementatie van technieken noodzakelijk maakt die de profilering van individuele cellen mogelijk maken. Karakterisering van organoïden met behulp van methoden zoals bulktranscriptoomprofilering (bulk-RNA-sequencing) leidt tot gemaskeerde cellulaire heterogeniteit en genexpressieprofielen die gemiddeld worden over alle soorten cellen in het complexe weefsel, waardoor uiteindelijk ons begrip van lopende processen tijdens de ontwikkeling van organoïden in gezondheid en ziekte wordt beperkt 15,16,17. Naarmate scRNA-seq-methoden zich verder ontwikkelen, worden er steeds meer atlassen gemaakt, geïllustreerd door bronnen zoals de Allen Brain Atlas of de Single cell atlas of human brain organoids van Uzquiano et al.18.

Het bereiken van succesvolle scRNA-seq uit hersenorganoïden is afhankelijk van effectieve isolatie en het vastleggen van intacte cellen. Aangezien de dissociatie van hersenorganoïden om individuele cellen te verkrijgen gebaseerd is op enzymatische spijsvertering, kan het genexpressiepatronen beïnvloeden door stress en celbeschadiging te induceren19,20. Daarom is de dissociatie van het weefsel in individuele cellen de meest cruciale stap. Een alternatieve benadering is single-nucleus RNA-sequencing (snRNA-seq), die de enzymvrije extractie van kernen uit zowel vers als bevroren weefsel vergemakkelijkt21,22. De isolatie van kernen uit een weefsel brengt echter andere uitdagingen met zich mee, zoals de verrijking van interessante celtypen en het lage RNA-gehalte van kernen in vergelijking met cellen.

Transcriptoomstudies van hersenorganoïden worden vaak uitgevoerd met behulp van scRNA-seq 10,18,23. De isolatie van afzonderlijke kernen zou echter een orthogonale en aanvullende methode kunnen bieden om het transcriptomische profiel van organoïden te onderzoeken. Hier introduceren we een toolbox voor scRNA- en snRNA-seq voor hersenorganoïden en bespreken we de kritieke punten voor het verkrijgen van sequentiegegevens van de beste kwaliteit.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het beschreven protocol wordt uitgevoerd in een laboratorium van bioveiligheidsniveau 1 van het Max Delbrück Center for Molecular Medicine (goedkeuringsnummer: 138/08), in overeenstemming met de vereisten en in overeenstemming met de EU- en nationale regels inzake ethiek in onderzoek.

1. Afleiding van organoïden van de voorhersenen uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's)

OPMERKING: Dit protocol is getest voor verschillende iPSC-lijnen die zijn gekweekt in verschillende stamcelmedia van verschillende bedrijven (tabel 1). Het genereren van organoïden van de voorhersenen is sterk afhankelijk van iPSC's van hoge kwaliteit en een samenvloeiing van 60%-70% voordat het protocol wordt gestart. Hier hebben we gebruik gemaakt van een in de handel verkrijgbare cellijn (zie Materiaaltabel).

  1. Dag 0: Vorming van het embryoïde lichaam
    1. Voor de behandeling van een plaat met 96 putjes met pluronische oplossing voegt u 80 μl steriel gefilterde 2% pluronische oplossing toe per putje van een U-bodemplaat met 96 putjes. Incubeer gedurende ten minste 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) of 37 °C.
      OPMERKING: Met pluronic behandelde platen kunnen maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard en kunnen direct worden gebruikt zonder wasstappen voor de vorming van embryoïde lichamen.
    2. Verwijder de pluronische oplossing uit elk putje met behulp van een aspirator of een meerkanaalspipet voordat u de cellen zaait.
    3. Bereid voordat u begint de volgende reagentia voor op een plaat met 96 putjes: 15 ml centrifugebuis met 5 ml voorverwarmde DMEM: F12 medium; 11 ml stamcelmedium aangevuld met 50 μM Y-27632, met pluronium behandelde plaat (zoals hierboven beschreven).
    4. Aspireer media uit één putje van een 6-wells plaat van 60-70% confluente iPSC's. Was de cellen één keer met PBS. Voeg 500 μl reagens op basis van trypsine toe en incubeer gedurende 2-6 minuten bij 37 °C.
      OPMERKING: De incubatietijd voor een goede loslating van cellen met een reagens op basis van trypsine is afhankelijk van de celdichtheid en de celmatrix-adhesieve eigenschappen van elke iPSC-lijn. Om oververtering te voorkomen, wordt geadviseerd om de celmorfologie na 2 minuten incubatie met een reagens op basis van trypsine te onderzoeken met behulp van een helderveldmicroscoop.
    5. Maak de cellen los met behulp van een pipet van 1000 μl en breng ze over in de eerder bereide centrifugebuis van 15 ml met DMEM:F12-medium om de dissociatie te stoppen.
    6. Centrifugecelsuspensie gedurende 3 minuten bij 300 x g. Aspireer supernatans en bewaar de celkorrel. Resuspendeer de cellen in 1 ml stamcelmedium aangevuld met 50 μM Y-27632.
    7. Tel de cellen met behulp van een cellenteller en voeg het gewenste aantal cellen toe aan de stamcelmedia aangevuld met 50 μM Y-27632. Voor het genereren van een enkel embryoïde lichaam zijn 3.000-12.000 cellen nodig, afhankelijk van de cellijn.
    8. Breng de celsuspensie over naar een meerkanaals reagensreservoir met behulp van een pipet van 10 ml. Plaats met behulp van een meerkanaalspipet 100 μl/putje van de celsuspensie in de eerder met pluronisch behandelde plaat met 96 putjes.
    9. Plaats de plaat met 96 putjes in een incubator bij 37 °C, 5% O2 en 5% CO2 . Om verstoring tijdens de vorming van het embryoïde lichaam te voorkomen, dient u de plaat niet te verplaatsen.
  2. Dag 2: Onderzoek naar de vorming van het embryoïde lichaam
    1. Onderzoek de vorming van het embryoïde lichaam met behulp van een 10x objectief van een helderveldmicroscoop. Embryoïde lichamen moeten duidelijke randen en minimale celdood vertonen.
    2. Zuig zoveel mogelijk medium op en vervang het door 100 μL/putje stamcelmedium. (Kritiek) Embryoïde lichamen kunnen gemakkelijk uit de put worden verwijderd tijdens middelwisseling. Let erop dat u ze niet verwijdert, controleer daarom het medium na aspiratie.
  3. Dag 3: Neuroectoderm inductie
    1. Zuig zoveel mogelijk medium op en vervang het door 120 μL/putje inductiemedium en plaats de plaat op 37 °C, 20% O2 en 5% CO2.
  4. Dag 6: Inbedding
    1. Afhankelijk van de iPSC-lijn zijn 3 of 4 dagen nodig om het ontstaan van neuro-ectoderm te induceren. Controleer embryoïde lichamen regelmatig. Zodra de randen helder worden, zijn embryoïde lichamen klaar om in te bedden. Gebruik een van de twee verschillende methoden die kunnen worden gebruikt voor de inbedding van het embryoïde lichaam, zoals hieronder beschreven24.
    2. Embedding methode 1: Cookie embedden
      1. Ontdooi een aliquot onverdunde extracellulaire matrixgel op ijs gedurende 1-2 uur. (Kritiek) Bewaar extracellulaire matrixgel altijd op ijs om te voorkomen dat deze stolt. Bereid van tevoren aliquots voor om de ontdooitijd en herhaalde ontdooicycli tot een minimum te beperken.
      2. Snijd de punt van een pipet van 200 μl af met een klauwtang en verzamel 16-32 embryoïde lichaampjes in één microcentrifugebuisje van 1,5 ml.
      3. Breng de embryoïde lichamen in 67 μl van het medium over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 100 μL extracellulaire matrixgel toe met behulp van een gesneden pipetpunt van 200 μL en meng voorzichtig.
      4. Verdeel de embryoïde lichamen gelijkmatig in een schaal van 6 cm en plaats de plaat 5-10 minuten om de extracellulaire matrixgel te laten stollen.
      5. Voeg ongeveer 4 ml differentiatiemedia toe en incubeer bij 37 °C, 20% O2 en 5% CO2 . Plaats de schaal de volgende dag op een orbitale shaker (84 rpm). Zorg ervoor dat alle embryoïde lichamen loskomen van de bodem. Als dit niet het geval is, gebruikt u een doorgesneden pipetpunt en media om ze voorzichtig los te maken.
    3. Inbeddingsmethode 2: Vloeibare inbedding
      1. Ontdooi een hoeveelheid onverdunde extracellulaire matrixgel op ijs gedurende 1-2 uur en plaats differentiatiemedia op ijs. (Kritiek) Media moeten ijskoud zijn bij het toevoegen van extracellulaire matrixgel.
      2. Zodra het medium koud is, voegt u extracellulaire matrixgel toe tot de uiteindelijke concentratie van 2%. Snijd de punt van een pipet van 200 μl af met een klauwtang en breng maximaal 24 embryoïde lichaampjes over in één putje van een plaat met 6 putjes.
      3. Verwijder alle overtollige media en voeg ongeveer 4 ml 2% extracellulaire matrixgel/differentiatiemedia toe aan een putje van een plaat met 6 putjes. Plaats de plaat onmiddellijk op de orbitale schudder (84 rpm).
  5. Dag 9-20: Voer elke 3-4 dagen een volledige media-uitwisseling uit met behulp van differentiatiemedia.
  6. Dag 21-30: Breng organoïden over in rijpingsmedia en voer elke 3-4 dagen volledige media-uitwisselingen uit.
  7. Dissociatie van organoïden: Gebruik voor enkelvoudige kernen en celdissociatie organoïden van hoge kwaliteit. Om overmatige hoeveelheden celdood te voorkomen, snijdt u de organoïden regelmatig om de opbouw van een necrotische kern te voorkomen en laat u ze 2 weken herstellen voordat u ze dissocieert voor verdere analyse.

2. Afleiding van eencellige cellen uit organoïden

OPMERKING: Dissociatie van één cel wordt uitgevoerd met behulp van de Neural Tissue Dissociation Kit (Tabel 2), die gebruikmaakt van mechanische en enzymatische dissociatie. Hier beschrijven we een handmatige mechanische dissociatie. Als alternatief kan een dissociatiemachine worden gebruikt.

  1. Bereid de STOP-oplossing en 0,04% BSA op ijs. Bereid enzymmix 1 en 2 en 0,04% BSA in PBS en leg op ijs.
  2. Verzamel maximaal 5 organoïden in één putje van een plaat met 6 putjes en zuig overtollige media op en was eenmaal met PBS om kweekmedia te verwijderen. Leg de organoïden in het midden van het kuiltje en hak de organoïden met een scalpel goed fijn.
  3. Voeg enzymmix 1 toe en plaats bij 37 °C, 20% O2 en 5% CO2, schud op 90 tpm gedurende 10-15 min.
  4. Gebruik een pipetpunt van 1000 μl om organoïden te resuspenderen door tot 10x te pipetteren. Voeg enzymmix 2 toe en meng het goed door te pipetteren met behulp van een pipetpunt van 1000 μL. Plaats bij 37 °C, 20% O2 en 5% CO2, schudden op 90 tpm gedurende 10-15 min.
  5. Stop het dissociatieproces door de celoplossing te resuspenderen in 10 ml koude STOP-oplossing. Filtreer de celoplossing met behulp van een celzeef van 70 μM. Centrifugeer de gefilterde celoplossing gedurende 10 minuten bij 300 x g bij 4 °C om een pellet te vormen.
  6. Zuig media op, laat een celpellet achter en resuspendeer de cellen in 4 ml koud 0,04% BSA. Filtreer de celoplossing met behulp van een celzeef van 40 μM en tel de cellen met behulp van een cellenteller.
  7. Centrifugeer de celoplossing gedurende 10 minuten bij 300 x g bij 4 °C. Zuig de BSA-oplossing op en laat een celkorrel over. Resuspendeer cellen volgens een op microfluïdica gebaseerde-snRNA-seq kit-handleiding in NSB+ medium.

3. Isolatie van afzonderlijke kernen uit organoïden

  1. Breng de organoïden over in gekoelde PBS en snijd elke organoïde in 4 stukken. Was organoïden 2x met gekoelde PBS.
  2. Knip met een schaar de pipetpunt van een pipet van 1000 μl af en doe de stukjes organoïde in een douncer van 2 ml. Zuig PBS volledig op en voeg 1 ml NP40 lysisbuffer toe.
  3. Stamp 3x met dounce stamper A en 3x met dounce stamper B. Breng de suspensie over in een centrifugebuisje van 15 ml. Was de douncer met een extra 1 ml NP40 lysisbuffer en breng over in een centrifugebuis van 15 ml. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT en centrifugeer vervolgens de suspensie gedurende 5 minuten bij 500 x g.
  4. Aspireer supernatans en laat 50 μL supernatans achter. Voeg 1 ml NSB+ toe zonder de pellet te verstoren. Resuspenderen na 5 minuten incubatie.
  5. Laagsuspensie bovenop een Percoll-gradiënt (onderste laag: 1 ml NSB+ en 250 μL Percoll, middelste laag: 1 ml NSB+ en 188 μL Percoll, toplaag: 1 ml NSB+ en 125 μL Percoll). (Kritiek) Voer laagjes heel voorzichtig uit om vermenging van lagen te voorkomen.
  6. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C, zuig supernatans op en resuspendeer in NSB+. Filtreer de kernoplossing met behulp van een celzeef van 40 μM.
  7. Kleuring en tel kernen met behulp van DAPI en een Neubauer-kamer. Resuspendeer kernen volgens een op microfluïdica gebaseerde scRNA-seq-kithandleiding.

4. Voorbereiding en volgorde van de bibliotheek

  1. Laad 10.000 cellen en kernen in een microfluïdica-systeem en genereer de bibliotheek volgens de handleiding van de op microfluïdica gebaseerde scRNA-seq-kit (Tabel met materialen).
  2. Sequentie van de bibliotheken met naar schatting 6 x 108 lezingen per snRNA-seq-bibliotheek en 1,6 x 108 lezingen per scRNA-seq-bibliotheek, wat resulteert in een sequentieverzadiging van 87% voor de snRNA-seq-dataset en 36% sequentieverzadiging voor de scRNA-seq-dataset.

5. Beoordeling

  1. Voer een analyse van sequencing uit met behulp van een data-analysepijplijn voor scRNA-seq en snRNA-seq en stem af op het menselijke GRCh38-genoom. Onderwerp de door deze pijplijn gegenereerde telmatrix aan verdere analyse met behulp van het R-pakket Seurat (versie 4.1.1)25.
  2. Creëer het Seurat-object door genen te beschouwen die in ten minste 5 cellen vertegenwoordigd waren en cellen op te nemen die ten minste 300 genen bevatten. Voer aanvullende kwaliteitscontrolefiltering uit door cellen te behouden die meer dan 1000 genen maar minder dan 4000 genen bevatten voor de scRNA-seq-dataset en meer dan 800, maar minder dan 4000 genen per kern voor de snRNA-seq-dataset. Sluit datasets, cellen en kernen uit die meer dan 5% mitochondriale lezingen overschrijden.
  3. Om batcheffecten tussen beide methoden te beperken, integreert u beide gefilterde gegevenssets, normaliseert en visualiseert u via Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP). Laat cluster 1 weg, dat een lage unieke moleculaire identificatie (UMI) en gentelling vertoont. Ken vervolgens voor de clusters celidentiteiten toe op basis van bekende markergenen en de 30 dagen oude organoïde dataset van Ana Uzquiano et. al. (Aanvullend coderingsbestand 1)18.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de celtypesamenstelling van hersenorganoïden te onderzoeken met behulp van scRNA-seq en snRNA-seq, werden hersenorganoïden geoogst na 30 dagen cultuur, aangezien organoïden in dit stadium al neuro-epitheliale lussen vertonen die bestaan uit voorlopercellen omgeven door tussenliggende voorlopercellen en neuronen in een vroeg stadium 4,18. Het monitoren van de kwaliteit van de organoïden tijdens de groei en kweek is essentieel voor het verkrijgen van betrouwbare single-cell en single-nucleus gegevens.

Organoïden worden gevormd door de aggregatie van iPSC's in embryoïde lichamen (Figuur 1B,C). Bij assemblage wordt verwacht dat deze embryoïde lichamen duidelijke randen vertonen met minimaal cellulair puin (Figuur 1C). Na de inductie van het neuro-ectoderm vertonen de embryoïde lichamen een waarneembare verheldering rond het oppervlak met een relatief donkerder binnengebied, wat wijst op succesvolle neurale inductie (Figuur 1D). In de daaropvolgende weken ontwikkelen de organoïden zogenaamde lussen, neuronale rozetachtige structuren, voornamelijk samengesteld uit neuro-epitheelcellen (Figuur 1E,F). Hoewel deze organoïden gedurende enkele maanden in cultuur kunnen worden gehouden, moet worden opgemerkt dat met hun toenemende omvang er een overeenkomstige toename van celdood is in het binnenste deel van de organoïden als gevolg van het gebrek aan voedingsstoffen en beschikbaarheid van zuurstof, wat uiteindelijk resulteert in de ontwikkeling van een necrotische kern.

Om de cellulaire diversiteit binnen corticale organoïden te onderzoeken door middel van sequencing-analyse, hebben we zowel individuele cellen als kernen uit organoïden geïsoleerd. Om de inherente heterogeniteit binnen een enkele batch hersenorganoïden in evenwicht te brengen, hebben we sequencing uitgevoerd van vier gepoolde organoïden uit één batch. Bovendien werden deze organoïden voor vergelijkingsdoeleinden tussen de isolatieprocessen en om batcheffecten tussen de snRNA-seq- en de scRNA-seq-bibliotheek te verwijderen, in helften verdeeld (acht helften in totaal; Figuur 2). Na de enzymatische isolatie van individuele cellen is het van cruciaal belang ervoor te zorgen dat de levensvatbaarheid van de cellen boven de 80% blijft, waarbij wordt waargenomen dat de cellen een ronde morfologie behouden (figuur 3A,B). Evenzo zou de mechanische isolatie van individuele kernen intacte kernen van verschillende grootte moeten opleveren met minimale tot geen detecteerbare puin (Figuur 3C,D).

Uit sequentieanalyse bleek dat er meer cellen dan kernen werden gevangen en gesequenced. Beide datasets toonden een goede kwaliteit, beoordeeld door het hoge aantal genen en UMI per cel en kern, en het lage percentage mitochondriale metingen (Figuur 4A-C). Zoals verwacht vormen zowel mitochondriale als ribosomale lezingen een groter deel van het totale aantal lezingen dat in de scRNA-seq-dataset is teruggevonden in vergelijking met de snRNA-seq-dataset. In de scRNA-seq-dataset bevatten de meeste cellen minder dan 30% ribosomale lezingen, terwijl in de snRNA-seq-dataset de meerderheid van de kernen minder dan 5% ribosomale lezingen bevatte. Bovendien bevat de meerderheid van de cellen die in de scRNA-seq-dataset zijn vastgelegd minder dan 5% mitochondriale metingen. Na het uitfilteren van mitochondriale metingen passeerden ongeveer 10.000 cellen en 3.000 kernen de kwaliteitsdrempel.

Integratieve analyse van beide datasets toonde aan dat alle clusters in beide datasets vertegenwoordigd zijn, wat aangeeft dat beide methoden dezelfde celtypen herstellen (Figuur 5A,C). De annotatie van de dataset laat zien dat de belangrijkste celpopulaties bestaan uit radiale glia, intermediaire voorlopercellen, subcorticale voorlopercellen en neuronen, evenals pasgeboren diepe laagprojectieneuronen en minder vertegenwoordigde celtypen zoals Cajal-Retzius, de corticale zoom en choroïde plexuscellen (Figuur 5B). Over het algemeen zouden scRNA-seq en snRNA-seq alle celtypen kunnen herstellen die naar verwachting aanwezig zijn in een 30 dagen oude hersenorganoïde20.

figure-results-1
Figuur 1: Generatie van hersenorganoïden uit iPSC's. Tijdsverloop van de generatie van hersenorganoïden (A). Voorbeeldbeelden van een succesvolle corticale differentiatie van iPSC's (B), die embryoïde lichamen vormen (72 uur na het zaaien) (C) en een succesvolle neurale inductie laten zien na 7 dagen kweek (D). Organoïde toont duidelijke lussen op dag 15 (E) en dag 30 (F). Schaalverdeling: B-D 200 μm, E 400 μm, F 800 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Workflow voor het verkrijgen van enkelvoudige cellen en enkelvoudige kernen uit hersenorganoïden. Dissociatie van organoïden in afzonderlijke cellen wordt uitgevoerd door organoïden te verkleinen met een scalpel, gevolgd door een enzymatische vertering (boven). Isolatie van kernen wordt uitgevoerd door mechanische dissociatie, gevolgd door zuivering via een Percoll-gradiënt (bodem). De suspensie van een enkele cel en kernen worden gefilterd en in een microfluïdisch systeem geladen voor het genereren en sequencen van bibliotheken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Representatieve resultaten van geïsoleerde cellen en kernen van 30 dagen oude organoïden. (A) Voorbeeldfoto van trypanblauw gekleurde cellen gemaakt met behulp van een cellenteller en (B) overeenkomstige close-up. (C) Overlay van helderveld- en fluorescerend beeld van DAPI-gekleurde kernen en (D) overeenkomstige close-up. Schaalbalk: 100 μM Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Kwaliteitscontrole van scRNA- en snRNA-seq. Viooldiagrammen illustreren het absolute UMI-getal (A), het aantal genen (B), mitochondriaal (C) en ribosomale lezingen (D) van cellen (blauw) en kernen (roze-paars). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: scRNA-seq en snRNA-seq halen vergelijkbare celpopulaties op in organoïden van 30 dagen oud. Geïntegreerde ingebedde UMAP van 30 dagen oude organoïden, met scRNA-seq (blauw) en snRNA-seq resultaten (roze-paars) (A), geïntegreerd en geannoteerd en individuele profielen van scRNA-seq en snRNA-seq (B,C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Celkweekmedia en coatingcomponenten Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Dissociatiebuffers voor scRNA en snRNA-seq. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 1: Coderingsbestand dat wordt gebruikt om de scRNA-seq- en snRNA-seq-gegevens te analyseren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transcriptomische analyse van afzonderlijke cellen en afzonderlijke kernen is naar voren gekomen als een cruciaal hulpmiddel voor het begrijpen van genregulerende mechanismen in complexe weefsels. Beide methoden maken transcriptoomstudies van hersenorganoïden mogelijk. Om een algeheel succesvol experiment te garanderen, is de kwaliteit van het uitgangsmateriaal van groot belang. Daarom is het noodzakelijk om de organoïden regelmatig te knippen om de vorming van een necrotische kern te voorkomen26. Het is ook mogelijk om dit probleem op te lossen met een Air-Liquid Interface-cultuur27. Om batcheffecten als gevolg van heterogeniteit van organoïden te verminderen, raden we aan om ten minste vier organoïden per extractie te gebruiken. Als alternatief is het mogelijk om meerdere sequencing-runs van individuele organoïden uit te voeren, waardoor bovendien de variabiliteit binnen dezelfde batch17 kan worden onderzocht. Bij het parallel gebruiken van beide methoden, scRNA-seq en snRNA-seq, kan het in tweeën knippen van organoïden en het verdelen ervan voor elke methode de verschillen veroorzaakt door heterogeniteit van organoïden verder verminderen.

Om een transcriptomisch profiel van goede kwaliteit van een individuele cel of kern te verkrijgen, is het van cruciaal belang dat het cel- of kernmembraan gedurende de hele procedure intact blijft. Daarom is het van cruciaal belang om zowel de enzymconcentratie als de timing van de enzymatische vertering te optimaliseren, die moeten worden aangepast aan de leeftijd en grootte van de organoïde. Daarnaast is het essentieel om de juiste temperaturen en centrifugeersnelheid te gebruiken en om hard pipetteren te vermijden. In geval van lage levensvatbaarheid kan een kit voor het verwijderen van dode cellen worden gebruikt na de dissociatie van de organoïden in afzonderlijke cellen. Complementair, voor de isolatie van kernen is het van vitaal belang om de organoïde zorgvuldig te wassen met PBS en het aantal slagen met de douncer aan te passen aan de grootte van de organoïde. Het is ook belangrijk om de Percoll-gradiënt zorgvuldig in lagen aan te brengen om verstoringen in de gelaagdheid te voorkomen. Als er na isolatie beschadigde kernen overblijven, wordt geadviseerd om een sorteerstap uit te voeren via fluorescentie-geactiveerde celsortering22. Over het algemeen is het gebruik van RNAse-remmers van vitaal belang voor alle stappen, van monsterdissociatie tot het genereren van bibliotheken, om het hoogwaardige RNA van elke cel of kern te behouden.

In deze studie leverde scRNA-seq meer cellen op, waardoor een breder overzicht van celpopulaties mogelijk is. Bovendien bevatten cellen meer RNA en zijn ze gemakkelijker te verrijken voor specifieke celtypen via oppervlaktemarkers in vergelijking met kernen. Dissociatie van enkele cellen is echter afhankelijk van een enzymatisch proces dat de transcriptie van stressgerelateerde RNA's kan induceren19,28. Vooral bij ziekten die geassocieerd zijn met een verhoogde stressrespons, kan dit resulteren in door dissociatie geïnduceerdeartefacten 20. Bovendien werd aangetoond dat isolatie van één cel resulteerde in het verlies van gevoelige celpopulaties 3,29. Hoewel dit in deze studie misschien niet duidelijk is, is het een mogelijke uitkomst bij het gebruik van oudere hersenorganoïden die worden gekenmerkt door een hogere cellulaire diversiteit.

Omdat beide datasets dezelfde celpopulaties ophalen, is de keuze voor de isolatiemethode sterk afhankelijk van onderzoeksvragen, weefselverwerving en timemanagement. Hoewel na dissociatie de fixatie en opslag van afzonderlijke cellen uit hersenorganoïden in methanol goed ingeburgerd is30, vereist de isolatie van afzonderlijke kernen uit bevroren hersenorganoïden nog steeds optimalisatie.

Over het algemeen bieden onze protocollen een veelzijdig en aanpasbaar platform om het transcriptomische profiel van individuele cellen en kernen in hersenorganoïden te onderzoeken, wat de weg vrijmaakt voor diepgaand onderzoek naar ontwikkelings- en ziektegerelateerde vragen in de in vitro menselijke hersenmodellen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Valeria Fernandez-Vallone voor de originele instructies voor de Miltenyi Neural Dissociation kit. We danken ook het Genomics Technology Platform van het Max Delbrueck Centrum voor het verstrekken van het recept voor de NP40 lysisbuffer en waardevol advies bij het opzetten van dit protocol. We danken ook Margareta Herzog en Alexandra Tschernycheff voor de organisatorische ondersteuning van het lab.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)Sigma 43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes VWR525-0130microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline analysis pipline
15 ml FalconFalconCentrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)Life Technologies21985023
50 ml FalconFalconCentrifuge tube
A83-01Bio Technologies379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)Life Technologies15240062
B-27 Plus SupplementLife Technologies17504044
B-27 Supplement without vitamin ALife Technologies12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVEDVWRDHC-N01
Cell strainer 40 µmNeolab352340
Cell strainer 70 µm (white) NylonSigmaCLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit10X Genomics1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.110X Genomics1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor CocktaillRoche11873580001
DAPIMERCK Chemicals0000001722
DMEM/F12Life Technologies11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL completeSigma Aldrich10536355
Essential E8 Flex MediumLife TechnologiesA2858501
EVE Cell Counting SlidesVWREVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotecdissociation maschine
GlutaMAX supplementsLife Technologies35050038
Heparin sodium cell culture testedSigmaH3149-10KU
human recombinant BDNFStemCell Technologies78005.3
human recombinant GDNFStemCell Technologies78058.3
Insulin Solution HumanSigma AldrichI2643-25MG
Knockout serum replacementLife Technologies10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%Sigma Aldrich130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse freeThermo ScientificAM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276stem cell medium
mTeSR1StemCell Technologies85850stem cell medium
N2 Supplement StemCell Technologies17502048
Neural Tissue Dissociation KitMiltenyi Biotec B.V. & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
NextSeq500 systemIlluminaSequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent SolutionLife Technologies28324
PBS Dulbecco’sInvitrogen14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife Technologies EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mLInvitrogenAM9760G
StemFlex MediumThermo ScientificA3349401stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottomSarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan BlueT8154-20mlSigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol redLife Technologies12604013Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Life sciencesBML-WN100-0005

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
  2. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nat Commun. 6, 8715(2015).
  3. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
  6. Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nat Commun. 12 (1), 1929(2021).
  7. Karlsson, M., et al. A single-cell type transcriptomics map of human tissues. Sci Adv. 7 (31), eabh2169(2021).
  8. Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
  9. Lim, B., Lin, Y., Navin, N. Advancing cancer research and medicine with single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (4), 456-470 (2020).
  10. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  11. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 13 (1), 3312(2022).
  12. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  13. Notaras, M., et al. Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids. Mol Psychiatry. 27 (3), 1416-1434 (2022).
  14. Rybak-Wolf, A., et al. Modelling viral encephalitis caused by herpes simplex virus 1 infection in cerebral organoids. Nat Microbiol. 8 (7), 1252-1266 (2023).
  15. Bock, C., et al. The organoid cell atlas. Nat Biotechnol. 39 (1), 13-17 (2021).
  16. Brazovskaja, A., Treutlein, B., Camp, J. G. High-throughput single-cell transcriptomics on organoids. Cur Opinion Biotechnol. 55, 167-171 (2019).
  17. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
  18. Uzquiano, A., et al. Proper acquisition of cell class identity in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex. Cell. 185 (20), 3770-3788.e27 (2022).
  19. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), 7944(2020).
  20. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  21. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 26 (5), 792-802 (2020).
  22. Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protoc. 2 (3), 100694(2021).
  23. Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human cerebral organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2021).
  24. Martins-Costa, C., et al. Morphogenesis and development of human telencephalic organoids in the absence and presence of exogenous extracellular matrix. EMBO J. 42 (22), e113213(2023).
  25. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
  26. Choe, M. S., et al. A simple method to improve the quality and yield of human pluripotent stem cell-derived cerebral organoids. Heliyon. 7 (6), e07350(2021).
  27. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  28. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  29. Wen, F., Tang, X., Xu, L., Qu, H. Comparison of single-nucleus and single-cell transcriptomes in hepatocellular carcinoma tissue. Mol Med Rep. 26 (5), 339(2022).
  30. Alles, J., et al. Cell fixation and preservation for droplet-based single-cell transcriptomics. BMC Biol. 15 (1), 44(2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell TranscriptomicsSingle Nuclei TranscriptomicsBrain OrganoidsOrganoid DissociationNuclei IsolationLibrary PreparationRNA SequencingSpatial TranscriptomicsCell Type RecoveryGene Expression Profiles

Related Articles