Kolonisatie van plantengroeibevorderende rhizobacteriën (PGPR) in de rhizosfeer is essentieel voor de groeibevorderende werking. Het is noodzakelijk om de detectiemethode van bacteriële rhizosfeerkolonisatie te standaardiseren. Hier beschrijven we een reproduceerbare methode voor het kwantificeren van bacteriële kolonisatie op het worteloppervlak.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bacteriële kolonisatie meten op wortels van Arabidopsis thaliana in hydrocultuur
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het meten van bacteriële kolonisatie op de wortel van Arabidopsis thaliana is een van de meest voorkomende experimenten in onderzoeken naar plant-microbe-interacties. Een gestandaardiseerde methode voor het meten van bacteriële kolonisatie in de rhizosfeer is nodig om de reproduceerbaarheid te verbeteren. We kweekten eerst steriele A. thaliana in hydrocultuuromstandigheden en inoculeerden vervolgens de bacteriële cellen in de rhizosfeer met een eindconcentratie van OD600 van 0,01. 2 dagen na inoculatie werd het wortelweefsel geoogst en drie keer gewassen in steriel water om de niet-gekoloniseerde bacteriecellen te verwijderen. De wortels werden vervolgens gewogen en de bacteriële cellen die op de wortel waren gekoloniseerd, werden verzameld door een draaikolk. De celsuspensie werd verdund in een gradiënt met een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), gevolgd door plating op een Luria-Bertani (LB) agarmedium. De platen werden gedurende 10 uur bij 37 °C geïncubeerd, en vervolgens werden de enkele kolonies op LB-platen geteld en genormaliseerd om de bacteriële cellen aan te geven die op de wortels waren gekoloniseerd. Deze methode wordt gebruikt om bacteriële kolonisatie in de rhizosfeer te detecteren in mono-interactieomstandigheden, met een goede reproduceerbaarheid.
Inleiding
Er zijn kwantitatieve en kwalitatieve methoden voor het detecteren van kolonisatie van de rhizosfeer door een enkele bacteriestam. Voor de kwalitatieve methode moet een rek worden gebruikt die constitutief fluorescentie tot expressie brengt, en de fluorescentieverdeling en -intensiteit moeten worden onderzocht met behulp van fluorescentiemicroscopie of confocale laserinstrumenten 1,2. Die strategieën kunnen bacteriële kolonisatie in situ3 heel goed weerspiegelen, maar ze zijn niet zo nauwkeurig als traditionele methoden voor het tellen van platen in kwantificering. Bovendien kan het, vanwege de beperking van het weergeven van slechts gedeeltelijke wortelzones onder de microscoop, soms worden beïnvloed door subjectieve vooringenomenheid.
Hier beschrijven we een kwantitatieve methode, waaronder het verzamelen van de gekoloniseerde bacteriecellen en het tellen van de bacteriële CFU's op een plaat. Deze methode is gebaseerd op verdunning en plating waarbij de gekoloniseerde stammen die van plantenwortels zijn gestript, kunnen worden geteld en het totale aantal gekoloniseerde bacteriën op de wortel kan worden berekend op 4,5.
Eerst werd A. thaliana gekweekt in hydrocultuuromstandigheden en vervolgens werden bacteriële cellen geïnoculeerd in de rhizosfeer met een eindconcentratie van 0,01 OD600. De geïnfecteerde wortelweefsels werden 2 dagen na inoculatie geoogst en in steriel water gewassen om de niet-gekoloniseerde bacteriële cellen te verwijderen. Verder werden bacteriële cellen die op de wortel waren gekoloniseerd, verzameld, verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en geplateerd op een Luria-Bertani (LB) agar-medium. Na incubatie bij 37 °C gedurende 10 uur werden enkele kolonies op LB-platen geteld en genormaliseerd om de bacteriecellen te bepalen die op de wortels waren gekoloniseerd.
Deze methode is zeer toepasbaar, heeft een goede herhaalbaarheid en is meer geschikt voor nauwkeurige bepaling van bacteriële kolonisatie in de rhizosfeer.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Steriele hydrocultuur van A. thaliana
- Bereid A. thaliana zaailingen voor.
- Bereid cultuur A. thaliana zaailingen medium voor, dat bestaat uit 1/2 MS medium (Murashige en Skoog) met 2% (wt/vol) sucrose en 0,9% (wt/vol) agar.
- Giet het bereide sterilisatiemedium in steriele vierkante petrischaaltjes (13 cm x 13 cm) voordat u stolt. Vermijd drogen aan de lucht om de luchtvochtigheid op peil te houden.
- Dompel A. thaliana zaden onder in een microcentrifugebuis van 2 ml gevuld met 1 ml steriel water bij 4 °C gedurende 12 uur, en steriliseer de zaden vervolgens gedurende 2 minuten met 1 ml 2% (vol/vol) NaClO.
- Was de zaden zes keer grondig met steriel water om de NaClO-oplossing te verwijderen. Zaai de zaden op petrischaaltjes met MS agar medium met een steriel tipje van 1 ml.
- Sluit de petrischaaltjes af met ademende medische tape en plaats ze verticaal in een lichte incubator om 1 week te groeien. Stel de dag/nachtverhouding van de lichtincubator in op 16 uur/8 uur, houd de temperatuur op 23 °C en de luchtvochtigheid op 40%-60%.
- Transplantatie A. thaliana.
- Snijd gaten van 5 mm op de 40 μm poriëngrootte celkleurer en steriliel ze.
- Transplanteer drie 7 dagen oude A. thaliana planten door de gaten van een celzeef en doe ze in een plaat met 6 putjes met 3 ml steriele vloeibare 1/2 MS medium met 0,5% sucrose.
- Plaats de 6-wells platen in een lichte incubator (Figuur 1A) en incubeer gedurende 10 dagen.
2. Bacterieteelt en inoculatie
- Bereid bacteriële suspensie voor op inoculatie.
- Voor Bacillus velezensis inoculeert u de bacteriecellen in een steriel LB-medium en incubeert u bij 37 °C met schudden bij 170 tpm totdat de OD600 van 0,8-1,2 is bereikt.
- Verzamel de bacteriecellen door centrifugatie bij 6000 x g gedurende 2 minuten en resuspendeer de cellen in PBS-buffer (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Herhaal de stappen voor centrifugeren en resuspenderen 3 keer om het LB-medium en de bacteriële metabolieten te verwijderen.
- Suspendeer de bacteriecellen in een vers 1/2 MS-medium bij een eindconcentratie van OD600 0,01. Inoculeer de bacteriesuspensies op de 6-putjes platen waarop A. thaliana zaailingen groeien, plaats de 6-putjes platen in de lichte incubator en kweek ze gedurende 2 dagen.
3. Het meten van bacteriën die op wortels zijn gekoloniseerd
- Oogst het wortelweefsel en leg de gekoloniseerde cellen op een plaat.
OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder gnotobiotische omstandigheden- Weeg de buisjes van 2 ml en noteer het gewicht als W0.
- Oogst de co-gekweekte A. thaliana wortelweefsels en was ze 3 keer in steriel water. Leg de wortel op filtreerpapier om het overtollige water te verwijderen.
- Plaats de wortel in de gewogen microcentrifugebuis, weeg de wortels samen met de buis en noteer deze als W1.
- Voeg 1 ml PBS toe aan elke buis en draai de buizen gedurende 8 minuten op de maximale snelheid.
- Verdun de suspensies met de verzamelde wortelgekoloniseerde bacteriecellen tot 1 x 10-1-1 x 10-4 (afhankelijk van het vermogen van de bacteriekolonisatie). Verdeel de verdunde bacteriële suspensies over platen met LB-agarmedium en incubeer gedurende 10 uur bij 37 °C.
- Tel de kolonies en normaliseer de gegevens.
- Tel de bacteriekolonies op LB-platen.
- Bereken de kve's op basis van de overeenkomstige verdunning en normaliseer de gegevens met het verse gewicht van de wortel (W1-W 0). De definitieve resultaten geven het aantal gekoloniseerde bacteriële cellen per gram wortel aan 2 dagen na inoculatie (Figuur 1B).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de nauwkeurigheid van het kolonisatievermogen van bacteriën te testen dat met deze methode in de A. thaliana rhizosfeer wordt gedetecteerd, hebben we Bacillus velezensis SQR9 WT en een afgeleide mutant Δ8mcp afzonderlijk in de rhizosfeer van A. thaliana geïnoculeerd. De Δ8mcp is een mutant die alle chemoreceptorcoderende genen mist en heeft een aanzienlijk verminderde kolonisatie6. We hebben hun kolonisatie 2 dagen na inoculatie gemeten met behulp va...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Om een goede reproduceerbaarheid te bereiken, zijn er vier cruciale stappen voor het kolonisatiedetectieproces van dit protocol. Ten eerste is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het aantal geïnoculeerde bacteriecellen in elk experiment precies hetzelfde is. Ten tweede is het ook noodzakelijk om de reinigingsintensiteit van de niet-gekoloniseerde bacteriën met steriel water te beheersen. Ten derde moet elk monsterverdunningsproces worden gewerveld voordat het wordt uitgevoerd om het monster in een volledige mengtoes...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben met de inhoud van dit artikel.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (32370135), het innovatieprogramma van de Chinese Academie voor Landbouwwetenschappen (CAAS-CSAL-202302), het Science and Technology Project van het Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
Referenties
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization. AMB Express. 9 (1), 141(2019).
- Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187. Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).
- Zhang, H., et al. Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE. Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).
- Liu, Y., et al. Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization. Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).
- Feng, H., et al. Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9. Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).
- Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).
- Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya. J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).
- Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth. Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).
- Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles. ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).
- Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. Microbe-induced plant volatiles. New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).
- Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana. Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).
- Yahya, M., et al. Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria. Front Microbiol. 12, 744094(2021).
- Husna, K. B. -E., Won, M. -H., Jeong, M. -I., Oh, K. -K., Park, D. S. Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics. Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
