Een in-vitroweefselperfusiesysteem gebruiken om de functionele activiteiten van geïsoleerde darmbuizen in realtime te detecteren

Summary

We presenteren een methode voor het isoleren van darmbuizen van ratten en het beoordelen van de impact van geneesmiddelen op hun spanning, frequentie en amplitude in vitro. Deze methode biedt een waardevolle aanpak voor onderzoekers die onderzoek doen naar darmbuisjes.

Abstract

Gastro-intestinale aandoeningen, die veel voorkomen, vormen een aanzienlijke uitdaging voor de mens. De dunne darm is een integraal onderdeel van de vertering en opname van voedsel en medicijnen en speelt een cruciale rol bij de behandeling van deze ziekten. Het experiment met de verplaatsing van de darmbuis, een veel voorkomende en essentiële in-vitromethode , wordt gebruikt om de gastro-intestinale dynamiek te bestuderen. Dit omvat de voorbereiding van de geïsoleerde darmbuis, evenals de suspensie van de voorbereide darmbuis in het bad en de aansluiting ervan op een signaaldetector. Dit wordt gevolgd door de registratie en analyse van een reeks parameters, zoals spanning, die kunnen worden gebruikt om de darmmotoriek te beoordelen, evenals overwegingen om de darmbuis in vitro actief te houden. Het gestandaardiseerde programma van bemonstering tot gegevensverzameling verbetert de herhaalbaarheid van de experimentele gegevens aanzienlijk en garandeert de authenticiteit van de registratie van darmspanning na fysiologische, pathologische en medicamenteuze interventie. Hier presenteren we de belangrijkste problemen bij experimentele werking en een waardevol experimenteel referentieprotocol voor het bestuderen van geneesmiddelen die de gastro-intestinale motiliteit reguleren.

Introduction

Gastro-intestinale aandoeningen, een veel voorkomende aandoening, hebben ernstige gevolgen voor het leven en de gezondheid van de mens¹. Gastro-intestinale motiliteitsstoornis is een belangrijk onderdeel van functionele gastro-intestinale aandoeningen en manifesteert zich voornamelijk in slopende symptomen, vertraagde maaglediging en ernstige maagproblemen^. Het kan de gastro-intestinale coördinatie verstoren, de maaglediging belemmeren, darmvoedselintolerantie beïnvloeden en zelfs functionele obstructie in de dunne of dikke darm veroorzaken^. Voor patiënten die een gastro-intestinale operatie ondergaan, kan deze aandoening direct leiden tot darmfalen. Bovendien is darmaandoening niet alleen gerelateerd aan gastro-intestinale aandoeningen, maar ook aan de pathogene factoren van verschillende andere ziekten, zoals hepatitis en ziekten van het centrale zenuwstelsel. Intestinale microbiële gemeenschappen spelen een cruciale regulerende rol in de darmfysiologie, inclusief motiliteit, die vervolgens de kolonisatie binnen het microbiële ecosysteem beïnvloedt⁴. Naarmate de hepatitis B-virusinfectie evolueert naar chronische hepatitis B, zijn er verschillende gradaties van veranderingen in de darmflora. Het moduleren van de darmflora heeft voordelen aangetoond bij de behandeling van het hepatitis B-virus⁵. Bovendien kan het centrale zenuwstelsel de darm beïnvloeden en de microbiële samenstelling ervan veranderen. Recente ontwikkelingen in de sequencingtechnologie van microflora hebben bidirectionele interacties tussen darmmicroflora en de functie van het centrale zenuwstelsel aan het licht gebracht, die nauw verband houden met het optreden en de progressie van ziekten van het centrale zenuwstelsel ^6,7.

Met de vergrijzing van de samenleving escaleert de incidentie van gastro-intestinale motiliteitsstoornis, gekoppeld aan de achteruitgang of het verlies van de neuronale functie in het enterische zenuwstelsel en de intrinsieke innervatie van de darm⁸. Naarmate ons begrip van gastro-intestinale aandoeningen zich verbreedt, ontstaan er tal van nieuwe ideeën en benaderingen, die mogelijk kunnen leiden tot nieuwe geneesmiddelenontwikkelingen. Veel van deze ideeën zijn echter nog steeds hypothetisch of wachten op positieve resultaten van klinische proeven om zich te materialiseren ^9,10. Effectieve onderzoeksmethoden zijn cruciaal bij het overwinnen van gastro-intestinale aandoeningen. In de afgelopen jaren is er uitgebreid onderzoek gedaan naar gastro-intestinale geneesmiddelen en motiliteitsregulatie. Gastro-intestinale geneesmiddelen en gastro-intestinale dynamiek zijn onlosmakelijk met elkaar verbonden, en veel andere systemische geneesmiddelen hebben verschillende effecten op de gastro-intestinale dynamiek. Niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID's) worden bijvoorbeeld gebruikt voor pijn en ontsteking en langzame gastro-intestinale beweging, waardoor het risico op maagzweren toeneemt¹¹. Aan de andere kant kunnen sommige antidepressiva de gastro-intestinale motiliteit beïnvloeden¹². Momenteel is het belangrijkste in vitro farmacologische experiment dat de effecten van gastro-intestinale geneesmiddelen en andere systemische geneesmiddelen op de gastro-intestinale motiliteit bestudeert, de in vitro darmbewegingstest¹³. Door fysiologische omstandigheden te simuleren, observeren ze de directe impact van medicijnen op de samentrekking en ontspanning van de intestinale gladde spieren, en evalueren ze hun gastro-intestinale effecten. De precieze oorzaak van gastro-intestinale motiliteitsstoornissen blijft echter onduidelijk, waarschijnlijk een complex samenspel van genetische, omgevings-, voedings- en neuro-endocriene factoren. Bijgevolg blijft de behandeling van gastro-intestinale motiliteitsstoornissen aanzienlijke uitdagingen met zich meebrengen.

De dunne darm, een cruciale plaats voor de spijsvertering, opname en het metabolisme van geneesmiddelen, is van belang voor de gastro-intestinale functie. Als gevolg hiervan is de geïsoleerde darmbuisbewegingstest een essentieel hulpmiddel voor het bestuderen van gastro-intestinale aandoeningen. Dit omvat het voorbereiden en plaatsen van de geïsoleerde darmbuis van het dier in een bad, het aansluiten op een energiewisselaar, het gebruik van een transducer om mechanische bewegingen om te zetten in elektrische signalen voor versterking, en het opnemen door een fysiologische recorder. Verschillende parameters zoals frequentie, gemiddelde amplitude van trillingen, spanning en oppervlakte onder de curve kunnen worden gemeten om de motorische functie van de darmbuis te evalueren. Deze methode biedt voordelen zoals eenvoud, economische haalbaarheid, eenvoudige controle van experimentele omstandigheden, minimale beïnvloedende factoren, hoge reproduceerbaarheid en nauwkeurige en betrouwbare resultaten. Bovendien is het bijzonder nuttig voor het onderzoeken van het werkingsmechanisme van geneesmiddelen. Er zijn echter opmerkelijke uitdagingen bij de werking van het geïsoleerde darmbuisexperiment, bijvoorbeeld de darmactiviteit is moeilijk lang vol te houden. Om deze problemen aan te pakken en te putten uit ervaringen in in vitro experimenten, zal dit artikel een gedetailleerde inleiding geven tot de belangrijkste problemen bij experimentele werking en een waardevol experimenteel referentieprotocol presenteren voor het bestuderen van geneesmiddelen die de gastro-intestinale motiliteit reguleren.

Protocol

Dit protocol is afgeleid van eerder gepubliceerde literatuur 14,15,16,17. Mannelijke Sprague Dawley (SD) ratten (260-300 g, 8-10 weken oud) werden gebruikt voor de huidige studie. Het dierprotocol werd beoordeeld en goedgekeurd door het managementcomité van de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (recordnummer 2023017). Voorafgaand aan het experiment kregen de ratten de opdracht om 24 uur te vasten. Tijdens het experiment werden de ratten in een dierenkamer gehouden en hadden ze vrije toegang tot voedsel en water.

1. Voorbereiding van de oplossing

1. Bereid fysiologische zoutoplossing (PSS) met 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl₂, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM MgCl₂∙6H₂O, 25 mM NaHCO₃, 11 mM D-glucose en 5 mM HEPES (zie de materiaaltabel).
2. Verzadig de oplossingen en bel met een gemengd gas van 95% O₂ en 5% CO_{2 .} Houd ondertussen de pH-waarden van de oplossing tussen 7,38 en 7,42 met 2 mM NaOH.
3. Koel 1/3 van de PSS voor tot 4 °C en verwarm de rest voor op 37 °C voor latere experimenten.
   OPMERKING: de PSS is oorspronkelijk bereid bij kamertemperatuur in de stappen 1.1-1.2

2. Dissectie van het darmkanaal van ratten

1. Verzamel petrischaaltjes gevuld met 4°C PSS, een chirurgisch pincet en een schaar. Dien 2% isofluraan toe om de rat te verdoven door inademing gedurende ongeveer 5 minuten. Controleer of de rat diep verdoofd is door een teenknijptest uit te voeren. Dien indien nodig aanvullende verdoving toe. Leg vervolgens het darmkanaal bloot door de buikholte op een operatietafel te openen.
2. Plaats de maag- en darmbuisjes snel in een petrischaaltje gevuld met 4 °C PSS (pH 7,40) met 95% O₂ en 5% CO₂ verzadigd. Lokaliseer de twaalfvingerige darm, het begin van de dunne darm, in de pylorus van de maag. Til met een pincet het aangrenzende weefsel voorzichtig op en knip het voorzichtig met een schaar weg van de rand van de darm. Verdeel vervolgens de darm in segmenten van 1-2 cm; dit hele proces wordt geïllustreerd in figuur 1.

3. Suspensie en fixatie van het darmkanaal (figuur 2)

1. Schakel het in-vitroweefselperfusiesysteem in en stel de badtemperatuur in het instrument in op 37 °C. Plaats de PSS (37 °C) in het bad.
2. Maak een chirurgische hechtdraad van 15 cm (zie de materiaaltabel) en week deze in 4 °C PSS die verzadigd is met 95% O₂ + 5% CO₂. Zet met de hechtdraad het ene uiteinde van het darmkanaal vast en gebruik een stalen naaldhaak om het andere uiteinde vast te zetten.
3. Installeer de darmbuis. Monteer het segment met de stalen naaldhaak aan de onderkant van het bad en bevestig het andere uiteinde van de chirurgische lijn aan de transducer. Zet de gasschakelaar aan om bubbels in het bad te laten komen.
4. Open de data-acquisitiesoftware (zie de Tabel met materialen) en klik op Start om er zeker van te zijn dat het bijbehorende padsignaal wordt geregistreerd.

4. Normalisatie

1. Draai de spiraalas van het bad tegen de klok in om de darmbuisjes in hun natuurlijke staat te ontspannen. Klik op Setup-Zero All Inputs om ervoor te zorgen dat de initiële spanning van de darmbuis in de software op 0 g is ingesteld.
2. Draai de spiraalas van het bad tegen de klok in om de spanningswaarde naar 1 g te trekken en stabiliseer deze in de pH = 7,40, 95% O₂ + 5% CO₂ verzadigd 37 °C PSS gedurende 30 min.
   OPMERKING: De normalisatie van de darmbuis is om de voorbelasting aan te passen aan een optimale toestand. Voor holtemonsters was een optimale voorbelasting nodig om een uitzonderlijke activiteit in vitro te behouden. De optimale voorbelasting van de darmbuis van de rat was 1 g¹⁸.

5. Detectie van reactiviteit

1. Observeer de ritmische spontane contractiegolven in de software en ga verder met het volgende experiment, aangezien dit een voldoende respons aangeeft.

6. Experimentele observatie

1. Voeg het testmedicijn (zoals acetylcholine, enz.) toe aan het bad om het effect van het medicijn op de darmbuisfunctie te bestuderen.
   OPMERKING: Het effect van het geneesmiddel werd beoordeeld door veranderingen voor en na toediening in de darmvernauwingscurve te vergelijken. Wanneer het medicijn wordt toegevoegd, is het gepast om de bubbel te vergroten om het medicijn te mengen en vervolgens de bubbel na het mengen aan te passen aan normaal.

7. Analyse van de gegevens

OPMERKING: Het in vitro weefselperfusiesysteem heeft vier kanalen die tegelijkertijd tests kunnen uitvoeren op de effecten van vier identieke of verschillende geneesmiddelen op vier darmbuizen. Aangezien de experimentele parameters en analysemethoden voor alle kanalen hetzelfde zijn, wordt één kanaal geselecteerd als voorbeeld voor data-analyse.

1. Stop de data-acquisitiesoftware en voer data-analyse uit op deze data-acquisitiesoftware. Bewerk het databord en selecteer de analyseparameters als volgt: Klik op Window-Data Pad en kies de gemiddelde spanning voor het kanaal.
2. Selecteer de contractiecurve vóór toediening en klik op Toevoegen aan gegevensblok; selecteer de contractiecurve na toediening en klik op Toevoegen aan gegevensblok. De gemiddelde spanningswaarde voor en na toediening verschijnt achtereenvolgens op het gegevensblok.
3. Klik op Window-Data Pad om gegevens te kopiëren naar andere statistische analysesoftware (zie de Materiaaltabel) voor statistische analyse.
4. Analyseer andere parameters, zoals gemiddelde amplitude, gemiddelde frequentie en integraal (gebied onder de curve), vervang eenvoudig de gemiddelde spanning door de respectieve parameter en de bewerking is hetzelfde als de stappen 6.1-6.3.
5. Contractiecurve opslaan: Selecteer de contractiecurve, klik op Bewerken-Kopiëren Labchart-gegevens om gegevens naar tekensoftware te kopiëren (zie de Materiaaltabel) om de contractiecurve te tekenen.

8. Postoperatieve behandeling

1. Na de operatie euthanaseert u de dieren volgens institutioneel goedgekeurde protocollen.
   OPMERKING: Voor de huidige studie werden de dieren geëuthanaseerd door overmaat isofluraan in te ademen.

Results

Het eerste deel van de studie richt zich op het proces van het scheiden van geïsoleerde darmbuisjes van het lichaam en het omzetten ervan in vitrobuisjes van 2 cm. Dit proces wordt in detail geïllustreerd in figuur 1. Het tweede deel omvat de suspensie en standaardisatie van de geïsoleerde darmbuisring. Het succes van dit proces wordt aangetoond in figuur 2, die de automatische ritmische samentrekking van een normale buis laat zien. Ten slotte onderzoekt de studie de effecten van representatieve contractiele middelen en relaxantia op de geïsoleerde darmbuisring. Het bleek dat acetylcholine (0,3 μmol/L) en bariumchloride (1,2 mmol/L) de spanning in deze buizen verhoogden, terwijl atropine (300 μmol/L), epinefrine (1 μmol/L) en nifedipine (10 μmol/L) hun spanning remden, zoals geïllustreerd in figuur 3.

Deze methode introduceert vooral de bepaling van de motorische functie van de geïsoleerde darmbuis. Darmbewegingen worden beïnvloed door een aantal factoren en de meeste effecten worden uitgeoefend via receptoren in de darm. In het maagdarmkanaal zijn er verschillende receptoren, waaronder cholinerge M-receptoren, adrenerge α- en β-receptoren, 5-HT-receptoren, histaminereceptoren en gastro-intestinale hormoonreceptoren¹⁹. De spasmen in de geïsoleerde darm kunnen worden veroorzaakt door de werking van acetylcholine op M-receptoren. Dit effect kan worden geblokkeerd door atropine, dat werkt als een blokker voor M-receptoren (Figuur 3A). De spasmen in de gladde spier van het darmsegment, die worden veroorzaakt door het binnendringen van bariumionen in bariumchloride en hun binding met calmoduline, kunnen echter niet worden geblokkeerd door atropine (Figuur 3B). Epinefrine functioneert als een agonist voor zowel α- als β receptoren (Figuur 3C). Het prikkelt de α receptor en β_2-receptor van de dunne darm, wat resulteert in de ontspanning van de gladde spier en een verzwakte samentrekking van de dunne darm. Als gevolg hiervan wordt de peristaltiek vertraagd en wordt de absorptiesnelheid verminderd. Nifedipine daarentegen voorkomt de interne doorstroming van Ca²⁺ en bevordert de ontspanning van de darmen (Figuur 3D). Dit helpt bij het verlichten van darmkrampen, het verminderen van de darmdruk en het vergemakkelijken van de opname van water in de darm.

Figuur 1: De isolatie van darmbuisjes. (A) darmbuisjes bij ratten; (B) Darmbuisjes werden uit het lichaam verwijderd en in een petrischaal met 4 °C fysiologische zoutoplossing geplaatst; (C) darmbuisje na verwijdering van omringend weefsel; (D) 2 cm lange darmbuis die in het experiment is gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Het proces van suspensie en standaardisatie van geïsoleerde darmbuisringen. (A) In-vitroweefselperfusiesysteem (zie de materiaaltabel); (B) het bevestigen van beide uiteinden van de darmbuis met een ijzeren haak en een chirurgische lijn in een petrischaal met een fysiologische zoutoplossing van 4 °C; C) het fixeren van de darmbuis in een bad met een fysiologische zoutoplossing van 37 °C; (D) het geven van voorspanning en het opnemen van normale golfvorm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Effecten van geneesmiddelen op geïsoleerde darmbuisjes. Effecten van (A) acetylcholine (0,3 μmol/L) en atropine (300 μmol/L), (B) bariumchloride (1,2 mmol/L), (C) epinefrine (1 μmol/L) en (D) nifedipine (10 μmol/L) op geïsoleerde darmbuizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Gastro-intestinale motiliteit wordt bereikt door een reeks nauwkeurig gecoördineerde samentrekkingen en ontspanningen van gladde spieren. Dit proces omvat ritmische contractie van één groep spiergroepen, gecoördineerde contractie van meerdere groepen en speciale voortstuwende contractie ^20,21. Het optreden van gastro-intestinale motiliteitsstoornissen kan in verband worden gebracht met disfuncties op verschillende niveaus, zoals het centrale zenuwstelsel, het autonome zenuwstelsel, het enterische zenuwstelsel en de gastro-intestinale gladde spieren. Deze weefselstructuren werken samen door de afgifte van verschillende neurotransmitters en humorale factoren, die zich binden aan overeenkomstige receptoren om verschillende fysiologische functies uit te voeren²². Daarom is het bestuderen van het lokale werkingsmechanisme van geneesmiddelen essentieel, en het uitvoeren van in vitro experimenten met dunne darm kan nauwkeurigere inzichten opleveren door interferentie van vreemde stoffen en de regulatie van het centrale zenuwstelsel uit te sluiten.

Geïsoleerde darmbuismonsters van cavia-ileum, konijnenjejunum en twaalfvingerige darm worden vaak gebruikt bij proefdieren. Daarnaast kunnen het ileum, de twaalfvingerige darm en het jejunum van ratten en katten ook worden gebruikt voor in vitro experimenten. Deze methode is geschikt voor geïsoleerde weefsels. De gladde darmspier heeft de kenmerken van automatische ritmische contractie en wordt aangetast door de zenuwplexus in de darmwand. De geïsoleerde darmbuisjes van veel dieren kunnen hun spontane motorische functie behouden in een geschikte overlevingsomgeving. In vitro darmbuisexperiment heeft de voordelen van eenvoudige bediening, gemakkelijke controle van experimentele omstandigheden, weinig beïnvloedende factoren, goede reproduceerbaarheid, nauwkeurige en betrouwbare resultaten, en het is meer bevorderlijk voor de bespreking van het mechanisme van geneesmiddelwerking. Bovendien wordt deze methode als economisch en haalbaar beschouwd.

Het in-vitro-darmbuisexperiment heeft ook zijn beperkingen, zoals het gebruik van ongezuiverde ruwe Chinese medicijnpreparaten die onzuiverheden, anorganische ionen, saponinen en tannines bevatten, die de betrouwbaarheid van het experiment kunnen beïnvloeden. Daarom is het noodzakelijk om de invloed van onzuiverheden en fysisch-chemische factoren op de experimentele resultaten volledig te evalueren, inclusief de pH van de vloeistof en verschillende elektrolytische en onzuiverheidsdeeltjes. Verder is het verbeteren van de stabiliteit van het in vitro experimenteel instrument en de conserveringstechniek voor de in vitro darmbuis noodzakelijk. Bij het ontwerpen van in-vitro-experimenten is het essentieel om na te gaan of de gebruikte geneesmiddelen of preparaten voldoen aan de eisen van deze experimenten (bijv. niveaus van onzuiverheden).

Bij deze methode zijn er verschillende voorzorgsmaatregelen die in acht moeten worden genomen. Om te beginnen moet de darmbuis uit de buikholte van de rat worden verwijderd en voorafgaand aan het experiment worden gedrenkt in een koude PSS. Verder is het belangrijk om de hele buis in meerdere stukken te snijden en in de koelkast te bewaren, zodat eventuele stimulatie van de darmen tot een minimum wordt beperkt. Tijdens het doseerproces is het cruciaal om ervoor te zorgen dat de doseerbuis niet in contact komt met de lijn waaraan de darmbuis is opgehangen. Bovendien moet de hoeveelheid medicijn die aan het bad wordt toegevoegd nauwkeurig zijn en mag het medicijn niet aan de wand van het bad of rechtstreeks aan de darmbuis worden toegevoegd om te voorkomen dat de resultaten worden beïnvloed. Bij het spoelen van de darmbuis moet een zachte aanpak worden gebruikt en moet spoelen onder hoge druk worden vermeden om weefselcontractuur te voorkomen. Het wordt aanbevolen om de darmbuis met een pincet vast te pakken en deze niet gedurende langere tijd aan lucht bloot te stellen om verlies van activiteit te voorkomen.

Dit artikel presenteert een demonstratie van de experimentele methodologie voor geïsoleerde darmbuisexperimenten, waarbij de effecten van verschillende traditionele geneesmiddelen die op darmreceptoren inwerken worden gebruikt om hun impact op de beweging van de darmbuis te illustreren, wat een effectieve benadering biedt om het werkingsmechanisme van geneesmiddelen die de gastro-intestinale motiliteit op het maagdarmkanaal reguleren, te onderzoeken.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	Sigma, USA	A6625
atropine	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	IA06501
Barium chloride	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	B861682
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
tekensoftware	GraphPad Software, San Diego, California, USA	—
Epinephrine	Sigma, USA	E4642
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
In vitro weefselperfusiesysteem	PowerLab, ADInstruments, Australië	ML0146
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional versie 8.3	ADInstruments, Australië	—
MgCl2·6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
nifedipine	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	N5087
statistisch analysesoftware	GraphPad Software, San Diego, California, USA	—
Chirurgische hechtingen	Johnson, USA	—