Methodenartikel

RNA-interferentie in de ei-sluipwesp, Trichogramma dendrolimi Matsumura

DOI:

10.3791/66250

⸱

21 november 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, 2State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De manipulatie van RNA-interferentie (RNAi) vormt een formidabele uitdaging bij veel sluipwespen met een kleine grootte, zoals Trichogramma-wespen . Deze studie schetste een efficiënte RNAi-methode in Trichogramma denrolimi. De huidige methodologie biedt een robuust model voor het onderzoeken van genregulatie in Trichogramma-wespen .

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De eiparasitoïden, Trichogramma spp., worden erkend als efficiënte biologische bestrijders tegen verschillende lepidoptera-plagen in de landbouw en bossen. De onvolgroeide stadia van Trichogramma-nakomelingen ontwikkelen zich in het gastheerei en vertonen een opmerkelijke verkleining (ongeveer 0,5 mm in volwassen lengte). RNA-interferentie (RNAi)-methodologie is naar voren gekomen als een cruciaal hulpmiddel voor het ophelderen van genfuncties in tal van organismen. Het manipuleren van RNAi in bepaalde kleine sluipwespsoorten, zoals Trichogramma, heeft echter over het algemeen aanzienlijke uitdagingen met zich meegebracht. In deze studie presenteren we een efficiënte RNAi-methode in Trichogramma denrolimi. De geschetste procedure omvat de verwerving en isolatie van individuele T. dendrolimi-monsters uit gastheereieren, het ontwerp en de synthese van dubbelstrengs RNA (dsRNA), de in vitro transplantatie en kweek van T. dendrolimi-poppen , de micro-injectie van dsRNA en de daaropvolgende beoordeling van het uitschakelen van doelgenen door middel van RT-qPCR-analyse. Deze studie biedt een uitgebreide, visueel gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van RNAi-experimenten in T. dendrolimi, waardoor onderzoekers de genregulatie in deze soort kunnen onderzoeken. Bovendien is deze methodologie aanpasbaar voor RNAi-studies of micro-injecties in andere Trichogramma-soorten met kleine aanpassingen, waardoor het een waardevolle referentie is voor het uitvoeren van RNAi-experimenten in andere endoparasitaire soorten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trichogramma spp. zijn een groep eiparasitoïden die op grote schaal zijn gebruikt als zeer efficiënte biologische bestrijders tegen een breed spectrum van lepidoptera-plagen in landbouw- en bosecosystemen over de hele wereld 1,2,3,4. De toepassing van in massa gekweekte Trichogramma biedt een milieuvriendelijke aanpak voor de duurzame bestrijding van ongedierte 5,6,7. Inzicht in de moleculaire biologie van Trichogramma-wespen biedt waardevolle inzichten in het verbeteren van de efficiëntie van de massakweek en veldprestaties van deze biologische bestrijders 8,9 door de methodologie van genregulatie en genoombewerking te onderzoeken10.

Sinds de ontdekking van dubbelstrengs RNA (dsRNA)-gemedieerde specifieke genetische interferentie in Caenorhabditis elegans in 1998, is de RNA-interferentie (RNAi)-methode geëvolueerd tot een essentiële genetische toolkit voor het onderzoeken van de regulerende mechanismen van organismen door de expressie van doelgenen te onderdrukken11. RNAi-experimenten zijn een standaardmethodologie geworden die op grote schaal wordt toegepast om de genfunctie in tal van insectensoorten te bestuderen12,13. Niettemin vormt de manipulatie van RNAi een formidabele uitdaging bij veel parasitoïde soorten, met name bij die welke behoren tot de endoparasitaire Chalcidoidea-familie 14,15,16. De RNAi-methode is gedocumenteerd in ten minste 13 parasitoïde soorten 14,15,16,17,18,19. Hiervan is de RNAi-benadering uitgebreid uitgevoerd bij Nasonia-wespen en is deze toepasbaar in alle ontwikkelingsstadia, inclusief embryo's, larven, poppen en volwassenen 14,15,16. Het is opmerkelijk dat Nasonia-wespen ectoparasitoïden zijn, waarbij hun nakomelingen zich ontwikkelen in de interstitiële ruimte tussen de gastheerpop en het puparium, waardoor ze in vitro kunnen worden gekweekt en bepaalde behandelingen, zoals micro-injectie, kunnen verdragen. In tegenstelling tot Nasonia-wespen ondergaan Trichogramma-individuen hun volledige embryonale, larvale en popontwikkeling in het gastheerei. De laag in embryo- en larvestadia (die de doorlaatbaarheid van dsRNA kunnen belemmeren), kwetsbaarheid voor schade en de moeilijkheid om in vitro te overleven, vormen formidabele obstakels 20,21,22. Bovendien maakt de kleine grootte van Trichogramma-individuen, ongeveer ~ 0.5 mm in volwassen of poplengte, ze buitengewoon ingewikkeld om 20,21,22 te manipuleren.

In de huidige studie schetsen we een uitgebreide procedure voor het uitvoeren van RNA-interferentie (RNAi) experimenten in Trichogramma denrolimi Matsumura. Deze procedure omvat de volgende procedures: (1) het ontwerp en de synthese van dubbelstrengs RNA (dsRNA), (2) micro-injectie van T. denrolimi-poppen, (3) de transplantatie en in-vitro-incubatie van deze poppen, en (4) de detectie van doelgen-knockdown door middel van RT-qPCR-analyse. Het doelgen dat voor het RNAi-experiment is geselecteerd, is de ferritine-homologie met zware ketens (Ferhch). FerHCH, een ijzerbindend eiwit, bevat een ferroxidasecentrum met antioxiderende eigenschappen, waardoor de oxidatie van Fe2+ tot Fe3+ wordt vergemakkelijkt. Het speelt een onmisbare rol bij de groei en ontwikkeling van verschillende organismen door het redoxevenwicht en de ijzerhomeostase in stand te houden. Uitputting van FerHCH kan leiden tot overaccumulatie van ijzer, wat leidt tot onomkeerbare weefselbeschadiging en vaak culmineert in significante fenotypische veranderingen, waaronder groeiafwijkingen, misvormingen en mortaliteit23,24. Deze studie biedt een stap-voor-stap handleiding voor het uitvoeren van RNAi in T. denrolimi, die van onschatbare waarde zal zijn voor het onderzoeken van de genfuncties binnen de bredere context van Trichogramma-wespen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, instrumenten, software en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.

1. Verzamelen en onderhouden van insectenkweek

  1. Plak een groep van ~5.000 eieren van Corcyra cephalonica (Stainton) op een kaart van 9 cm bij 16 cm met een 1:5 (v/v) oplossing van Arabische gompoeder en water25,26.
    NOTITIE: Vermijd het bevestigen van te veel gastheereieren aan de kaart, aangezien overbevolking het onpraktisch maakt voor latere overdrachts- en dissectieprocedures.
  2. Om het uitkomen van gastheereieren te voorkomen, stelt u de gastheereikaarten bloot aan 30 minuten ultraviolette (UV) straling (Figuur 1-i). Snijd vervolgens het papier met geïnactiveerde eieren in eierkaarten van 1 cm dik en 8 cm in diameter, elk met ongeveer 300-500 eieren (Figuur 1-ii)25,26,27.
  3. Introduceer een cohort van 80-120 T. denrolimi-wespen in een glazen buis met een diameter van 2 cm en een lengte van 8 cm. Sluit de buis af met katoen.
    LET OP: Houd de wespen op een temperatuur van 25 ± 1 °C, met een licht/donkercyclus van 16 uur licht en 8 uur duisternis en houd een relatieve luchtvochtigheid van ongeveer 75% aan.
  4. Presenteer een gastheereikaart aan de wespen voor parasitisatie (Figuur 1-ii). Laat de wespen hun eieren gedurende 6 uur in de eieren van de gastheer deponeren, waarna de wespen onmiddellijk worden verwijderd.
    OPMERKING: Vermijd het overmatig verlengen van de parasiteringsperiode, omdat dit kan leiden tot overbevolking van T. denrolimi-nakomelingen in een gastheerei, wat resulteert in een verhoogde sterfte van wespennakomelingen28,29.

2. Synthese van dsRNA

  1. Ontwerp primersets met een T7-promotor voor de synthese van dubbelstrengs RNA (dsRNA). Kies een segment van 300-400 bp van het beoogde gen (Ferhch) voor dsRNA-synthese.
  2. Verwerf commercieel gesynthetiseerde primersets voor de productie van dsRNA voor het beoogde gen en dsGFP voor gebruik als negatieve controle.
  3. Extraheer RNA-inhoud van 100 T. denrolimi-wespen met behulp van de kit waarnaar wordt verwezen volgens het protocol van de fabrikant9. Controleer de kwaliteit van het RNA-gehalte; Ga verder als de waarde van OD260/OD280 varieert van 1,8 tot 2,09.
  4. Zuiver het RNA-gehalte met 2 μL 5x buffer (1 U/50 μL), 1 μL DNAse (1 U/50 μL) en 6,5 μL RNA (~100 ng/μL), 0,5 μL H2O bij 42 °C gedurende 2 minuten.
  5. Voer een reverse transcriptase-polymerasekettingreactie (RT-PCR) uit om een cDNA-sjabloon te genereren met 10 μL gezuiverd RNA (~100 ng/μL), 4 μL 5x buffer (1 U/50 μL), 1 μL enzymmix I (1 U/50 μL) en 4 μL H2O. Voer RT-PCR uit met behulp van de volgende instellingen: 37 °C gedurende 15 min, 85 °C gedurende 5 s. Bewaar het cDNA-product bij -4 °C tot gebruik.
  6. Voer polymerasekettingreactie (PCR) uit om de dsRNA-sequenties te amplificeren in overeenstemming met de gerefereerde mastermix (10 μL Taq II [1 U/50 μL], 0,8 μL voorwaartse primer [0,4 μM], 0,8 μL omgekeerde primer [0,4 μM], 0,8 μL DNA-sjabloon [40 ng/μL] en 7,6 μL H2O). Voer PCR uit met behulp van de volgende instellingen: 94 °C gedurende 2 min; 35 cycli met 94 °C gedurende 30 s, 60 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 30 s; 72 °C gedurende 2 min.
  7. Beoordeel de kwaliteit van PCR-producten door elektroforese op een 2,0% agarosegel 5,9 en bevestig de doelsequentie door middel van Sanger-sequencing.
  8. Zuiver het PCR-product met behulp van de Gel Extraction Kit volgens de richtlijnen van de fabrikant 9,23.
  9. Gebruik een RNAi-systeem om dsRNA voor het doelgen te synthetiseren met 10 μL 2x buffer (0,02 U/μL), 8 μL DNA-sjabloon (75 ng/μL) en 2 μL enzymmix (1 U/50 μL) met de volgende instellingen: 37 °C gedurende 30 min, 70 °C gedurende 10 min en 25 °C gedurende 20 min. Elute het gesynthetiseerde dsRNA met 30 μL nucleasevrij water.
  10. Beoordeel de kwaliteit van het dsRNA-product door het te visualiseren op een 1,0% agarosegel 5,9. Verdun het dsRNA tot 7.000 ng/μL. Controleer de kwaliteit van het dsRNA-product; Ga verder als de waarde van OD260/OD280 varieert van 1,8 tot 2,09. Bewaar het dsRNA-product bij -20 °C tot gebruik.

3. Transplantatie van T. denrolimi poppen

  1. Kweek de geparasiteerde gastheereieren gedurende ongeveer 8 dagen bij 25 ± 1°C, met behoud van een 16 uur licht/8 uur donkercyclus en een relatieve vochtigheid van ~75%. De geparasiteerde gastheereieren zullen na 5 dagen30 zwart worden (Figuur 1-iv,v).
  2. Breng de host-eikaart over naar een ontleedmicroscoop. Gebruik een paar wolfraamnaalden (Figuur 1-vi) om het chorion zorgvuldig uit de gastheereieren te verwijderen (Figuur 1-vii) en haal de pop van binnenuit (Figuur 1-viii)5,17,18.
    NOTITIE: De punt van de snijnaald moet kleiner zijn dan 0.05 mm.
  3. Maak een schone plaat voor het substraat. Giet 10-15 ml van een agar-oplossing van 15 g/l uit en laat deze op natuurlijke wijze afkoelen (Figuur 2-i).
    OPMERKING: Meng de agar-oplossing met 0,5 g streptomycine om de groei van verontreinigingen in vitro te remmen.
  4. Gebruik een gedesinfecteerde graveermachine om verschillende groeven van 0,2-0,3 mm diep en 0,4-0,8 mm breed te etsen (Figuur 2-ii).
  5. Gebruik een kleine borstel (Figuur 2-iii) om een pop van het ontlede gastheerei in een van de groeven op het agarsubstraat te transplanteren (Figuur 2-iv).
  6. Herhaal stap 3.4 en 3.5 en transplanteer 100-300 poppen afzonderlijk één voor één in de groeven (Figuur 2-v).

4. Micro-injectie van dsRNA in T. denrolimi pupa

  1. Gebruik een glazen naaldtrekker om een glazen capillair te trekken (Figuur 3-i,ii). Stel het vuur in op 280, de snelheid op 170, de vertraging op 250 en de trekkracht op 30 op een naaldtrekker (Figuur 3-iii). Bereid meerdere capillaire glazen naalden voor op micro-injectie (Figuur 3-iv,v).
  2. Schuin de punt van de glazen naald af met behulp van een schuurplaat (Figuur 3-vi).
    NOTITIE: Zorg ervoor dat de punt van de injectienaald scherp blijft; anders kan dit leiden tot sterfte onder de pop of de doorstroming van reagens door de naald belemmeren (Figuur 3-vii).
  3. Laad ongeveer 2 μL van de dsRNA-injectieoplossing met 7.000 ng/μL in de voorbereide injectienaald met behulp van een micro-injectiepomp (Figuur 3-vii).
  4. Breng het agarsubstraat met honderden poppen over op het platform van een samengestelde microscoop (Figuur 3-viii).
  5. Steek de injectienaald voorzichtig in de buik van een T. denrolimi-pop in een hoek van ~30° ten opzichte van de buik onder de lens (Figuur 3-ix).
  6. Injecteer geleidelijk ~5 nL van de injectieoplossing (stap 4.3) in de T. denrolimi pop, zo voorzichtig mogelijk.
    OPMERKING: De pop T. denrolimi kan licht opzwellen als de dsRNA-oplossing wordt geïnjecteerd. Het injecteren van een overmatige hoeveelheid oplossing in de pop of het gebruik van naalden met te grote openingen kan leiden tot vroegtijdige dood van de pop. Vervang de naalden wanneer ze verstopt raken na het injecteren van enkele tot tientallen poppen.
  7. Herhaal stap 4.5 en 4.6 en injecteer dsRNA één voor één in 600 poppen.
    OPMERKING: Voor een betrouwbare RT-qPCR-analyse moet het RNA-gehalte worden geïsoleerd uit ten minste 100 poppen. Injecteer ten minste 600 poppen voor drie replicaten in de dsRNA-behandeling en drie replicaten in de dsGFP-negatieve controle9.

5. Incubatie van T. denrolimi poppen

  1. Breng het substraat met geïnjecteerde poppen over naar een incubator bij 25 ± 1 °C met een licht/donkercyclus van 16 uur/8 uur en een relatieve luchtvochtigheid van ~75%.
  2. Incubeer ongeveer 700 T. denrolimi poppen per behandeling gedurende 24 uur of 48 uur. Extraheer RNA-inhoud uit een groep van 100 poppen per replicaat9.
    OPMERKING: Verwijder de gekrompen poppen (dode poppen) uit de monsters; anders kan het leiden tot fouten in de detectie van genexpressie.
  3. Incubeer ~50 T. denrolimi poppen per behandeling totdat de wespen tevoorschijn komen (Figuur 3-x). Noteer de opkomstsnelheid en het misvormingspercentage.

6. Detectie van gerichte genexpressie

  1. Ontwerp de primerset voor het doelgen en de referentiegenen voor RT-qPCR met behulp van een ontwerptool.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de sequenties van de RT-qPCR-primers niet overlappen met het beoogde gebied van dsRNA.
  2. Gebruik het gen forkhead box O (FoxO) als referentiegen in de RT-qPCR-analyse; de primers van FoxO zijn eerder gemeld9.
  3. Verkrijg commercieel gesynthetiseerde primersets. Voer RT-qPCR uit met 10 μL Taq II (1 E/50 μL), 0,8 μL voorwaartse primer (0,4 μM), 0,8 μL omgekeerde primer (0,4 μM), 0,8 μL sjabloon (10 ng/μL) en 7,6 μL H2O. Voer RT-qPCR uit met behulp van de volgende instellingen: 95 °C gedurende 30 s; 35 cycli met 95 °C gedurende 5 s, 57 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 30 s; 95 °C gedurende 10 s; 60 °C gedurende 5 s en 95 °C gedurende 5 s.
  4. Bereken de expressiewaarde van het beoogde gen met behulp van de 2-ΔΔCt-methode 9,25.
  5. Gebruik de Kruskal-Wallis-test om de expressie van het doelgen te analyseren onder invloed van verschillende behandelingen (dsFerhch, dsGFP, niet-injectie).
    OPMERKING: Vermijd het gebruik van parametrische tests (bijv. t-toets) voor post-hocvergelijkingen, aangezien de heteroscedasticiteit en niet-normaliteit van de gegevens tot onjuiste conclusies kunnen leiden25.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het opkomstpercentage van T. denrolimi-poppen die met dsFerhch waren geïnjecteerd, was significant lager dan die van degenen die met dsGFP waren geïnjecteerd of die zonder injectie (tabel 1). Van de uitgekomen wespen ontwikkelde 51,85% van de T. denrolimi-wespen die aan dsFerhch werden blootgesteld, misvormde kleine vleugels. De misvormde wespen werden niet waargenomen bij de wespen die met dsGFP waren geïnjecteerd of zonder injectie (tabel 1<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trichogramma-wespen worden erkend als effectieve biologische bestrijdingsmiddelen, met name gericht op een reeks lepidoptera-plagen in de land- en bosbouw1. Deze kleine wespen ondergaan hun onvolgroeide stadia in het ei van de gastheer, een kenmerk dat uitdagingen met zich meebrengt bij het uitvoeren van RNAi-experimenten 5,18. Deze studie biedt een uitgebreide visuele gids voor het uitvoeren van RNAi-experimenten in T. denrol...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gefinancierd door de projecten van de National Natural Science Foundation of China (32172476, 32102275), het Agricultural Science and Technology Innovation Program (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) en Central Funds Guiding the Local Science and Technology Development (XZ202301YD0042C).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2x ES Taq MasterMix (Dye)Cowin Biotech, ChinaCW0690HOm de dsRNA-sequenties te versterken
20x PBS Buffer, DEPC behandeld (7.2-7.6)Sangon Biotech, ChinaB540627-0500Om dsRNA te verdunnen
Agar stripShishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, Chinan/aOm kweekmedium te maken
Ampicillin sodiumSangon Biotech, ChinaA610028Om kweekmedium te maken
Bioer Constant temperature metal bathBIOER, ChinaMB-102Om dsRNA te synthetiseren
Borosilicate glas capillairWPI, USA1B100-4Om capillaire glasnaald te trekken
Clean benchAirtech, ChinaSW-CJ-1FDOm RNA te extraheren
Dubbel gedestilleerd waterSangon Biotech, ChinaA500197-0500Om cDNA te verdunnen
Environmental Testing chamberPanasonic, JapanMLR-352H-PCOm T. denrolimi te kweken
Eppendorf CentrifugeEppendrof, Germany5418ROm RNA-inhoud op te slaan
Eppendorf FemtoJet 4iEppendrof, GermanyFemtoJet 4iOm T. denrolimi te injecteren
Eppendorf gekoelde centrifugeEppendrof, Germany5810RCentrifuge
Ethanol oplossing (75%, RNase-vrij)Aladdin, ChinaM052131-500mlOm RNA te extraheren
Gel Extractie KitOmega, USAD25000-02Om cDNA te extraheren
GUM ArabicSolarbio, ChinaCG5991-500gOm eikaart te maken
Isopropyl alcoholAladdin, China80109218Om RNA te extraheren
Laser-Based Micropipette PullerSUTTER, USAP-2000Om capillaire glasnaald te trekken
MicroloaderEppendrof, Germany20 µLOm dsRNA te laden
Multi-sample tissue grinderLICHEN, ChinaLC-TG-24Om T. denrolimi te vermalen
Needle GrinderSUTTER, USABV-10-EOm capillaire glasnaald te vermalen
Nuclease-Vrij WaterSangon Biotech, ChinaOm RNA te verdunnen
OLYMPUS MicroscoopOLYMPUS, JapanXZX16Om T. denrolimi te observeren
PCR machineBio-rad, USAS-1000Voor DNA-versterking
PowerPac BasicBio-rad, USAPowerPacTM BasicOm de kwaliteit van dsRNA te detecteren
Primer van dsGFP (Voorwaarts)[TAATACGACTCACTATAGGG]
ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer van dsGFP (Achterwaarts)[TAATACGACTCACTATAGGG]
CAGAGGCATCTTCAACG
Primer van Ferhch voor qPCR (Voorwaarts)TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer van Ferhch voor qPCR (Achterwaarts)CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer van Ferhch voor RNAi (Achterwaarts)[TAATACGACTCACTATAGGG]AG
TAGCCATCATCTTTCC
Primer van Ferhch voor RNAi(Voorwaarts)[TAATACGACTCACTATAGGG]
ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer van FoxO voor qPCR (Voorwaarts)CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer van FoxO voor qPCR (Achterwaarts)TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit met gDNA Eraser (Perfect Real Time)TaKaRa, JapanRR047A
Kwantitatieve Real-time PCRBio-rad, USACFX 96 TouchOm reverse transcriptase polymerase ketenreactie (RT-PCR) uit te voeren
Real-time PCR (TaqMan) Primer en Probes Ontwerp Toolhttps://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi SystemPromega, USAP1700Om dsRNA  in vitro  te synthetiseren
TB Green Premix Ex TaqTM figure-materials-1 (Til RnaseH Plus)TaKaRa, JapanRR820AOm RT-qPCR uit te voeren
TrichloromethaanKESHI, ChinaGB/T682-2002Om RNA te extraheren
TRIzol ReagentAmbion, USA15596018Om de totale RNA-inhoud uit monsters te extraheren
Ultra-lage temperatuur vriezerThermo, USAForma 911

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
  2. Zhou, J. C., et al. Optimal clutch size for quality control of bisexual and Wolbachia-infected thelytokous lines of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) mass reared on eggs of a substitutive host, Antheraea pernyi Guérin-Méneville (Lepidoptera: Saturniidae). Pest Manag Sci. 76 (8), 2635-2644 (2020).
  3. Li, T. H., et al. Current status of the biological control of the fall armyworm Spodoptera frugiperda by egg parasitoids. J Pest Sci. 96, 1345-1363 (2023).
  4. Zhou, J. C., et al. Effects of temperature and superparasitism on quality and characteristics of thelytokous Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) during mass rearing. Sci Rep. 9 (1), 18114(2019).
  5. Zhou, J. C., et al. Penetrance during Wolbachia-mediated parthenogenesis of Trichogramma wasps is reduced by continuous oviposition, associated with exhaustion of Wolbachia titers in ovary and offspring eggs. Pest Manag Sci. 78 (7), 3080-3089 (2022).
  6. Huang, N. X., et al. Long-term and large-scale releases of Trichogramma promote pesticide decrease in maize in northeastern China. Entomol Gen. 40 (4), 331-335 (2020).
  7. Wang, P., et al. Performance of Trichogramma japonicum as a vector of Beauveria bassiana for parasitizing eggs of rice striped stem borer, Chilo suppressalis. Entomol Gen. 41 (2), 147-155 (2021).
  8. Ning, S. F., et al. The identification and expression pattern of the sex determination genes and their sex-specific variants in the egg parasitoid Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). Front Physiol. 14, 1243753(2023).
  9. Huo, L. X., et al. Selection and evaluation of RT-qPCR reference genes for expression analysis in the tiny egg parasitoid wasp, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). J Asia Pac Entomol. 25 (2), 101883(2022).
  10. Leung, K., et al. Next-generation biological control: the need for integrating genetics and genomics. Biol Rev Camb Philos Soc. 95 (6), 1838-1854 (2020).
  11. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  12. Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
  13. Sun, Y., et al. Silencing an essential gene involved in infestation and digestion in grain aphid through plant-mediated RNA interference generates aphid-resistant wheat plants. Plant Biotechnol J. 17 (5), 852-854 (2019).
  14. Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. J Vis Exp. 130, e56990(2017).
  15. Dalla Benetta, E., Chaverra-Rodriguez, D., Rasgon, J. L., Akbari, O. S. Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis. J Vis Exp. 166, e61892(2020).
  16. Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
  17. Zhu, K. Y., Palli, S. R. Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference. Annu Rev Entomol. 65, 293-311 (2020).
  18. Colinet, D., et al. Development of RNAi in a Drosophila endoparasitoid wasp and demonstration of its efficiency in impairing venom protein production. J Insect Physiol. 63, 56-61 (2014).
  19. Wang, B., et al. A digestive tract expressing α-amylase influences the adult lifespan of Pteromalus puparum revealed through RNAi and rescue analyses. Pest Manag Sci. 75 (12), 3346-3355 (2019).
  20. Zhou, J. C., et al. Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi is outcompeted by its uninfected counterpart in superparasitism but does not have developmental delay. Pest Manag Sci. 79 (3), 1005-1017 (2023).
  21. Zhou, J. C., et al. Posterior concentration of Wolbachia during the early embryogenesis of the host dynamically shapes the tissue tropism of Wolbachia in host Trichogramma wasps. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1198428(2023).
  22. Lee, T. Y. The development of Trichogramma evanescens Westw. and its influence on the embryonic development of its host, Attacus cynthia ricini Boisd. Acta Entomol Sin Z. 11 (1), 89-119 (1961).
  23. Shen, Y., Chen, Y. Z., Zhang, C. X. RNAi-mediated silencing of genes in the brown planthopper Nilaparvata lugens affects survival, growth and female fecundity. Pest Manag Sci. 77 (1), 365-377 (2021).
  24. Wu, S., Yin, S., Zhou, B. Molecular physiology of iron trafficking in Drosophila melanogaster. Curr Res Insect Sci. 50, 100888(2022).
  25. Zhou, J. C., et al. Wolbachia-Driven Memory Loss in a Parasitic Wasp Increases Superparasitism to Enhance Horizontal Transmission. mBio. 13 (6), e0236222(2022).
  26. Ning, S. F., Zhou, J. C., Liu, Q. Q., Zhao, Q., Dong, H. Gradual, temperature-induced change of secondary sexual characteristics in Trichogramma pretiosum infected with parthenogenesis-inducing Wolbachia. PeerJ. 7, e7567(2019).
  27. Zhang, C., et al. Decreased Wolbachia titers cause gradual change in masculinization of intersex individuals of thelytokous Trichogramma dendrolimi. Entomol Gen. 42 (5), 751-759 (2022).
  28. Zhang, X., et al. Multi-parasitism: A promising approach to simultaneously produce Trichogramma chilonis and T. dendrolimi on eggs of Antheraea pernyi. Entomol Gen. 41 (6), 627-636 (2021).
  29. Zhou, J. C., et al. Effects of Thelytokous parthenogenesis-inducing Wolbachia on the fitness of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) in superparasitised and single-parasitised hosts. Front Ecol Evol. 9, 730664(2021).
  30. Flanders, S. E. Notes on the life history and anatomy of Trichogramma. Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gene KnockdownDouble Stranded RNAMicro InjectionHost Egg ParasitizationRT qPCR AnalysisFerritin Heavy ChainBiological Control

Gerelateerde artikelen