Fenotypering op basis van afbeeldingen met hoge doorvoer voor het bepalen van morfologische en fysiologische reacties op enkelvoudige en gecombineerde spanningen in aardappel

Summary

We ontwierpen een op afbeeldingen gebaseerd fenotyperingsprotocol om de morfologische en fysiologische reacties op enkelvoudige en gecombineerde hitte-, droogte- en wateroverlastbehandelingen te bepalen. Deze aanpak maakte het mogelijk om vroege, late en herstelreacties te identificeren op het niveau van de hele fabriek, met name bovengrondse delen, en benadrukte de noodzaak van het gebruik van meerdere beeldsensoren.

Abstract

High-throughput beeldgebaseerde fenotypering is een krachtig hulpmiddel om op niet-invasieve wijze de ontwikkeling en prestaties van planten onder specifieke omstandigheden in de loop van de tijd te bepalen. Door gebruik te maken van meerdere beeldsensoren kunnen veel interessante eigenschappen worden beoordeeld, waaronder de biomassa van planten, fotosynthese-efficiëntie, de temperatuur van het bladerdak en bladreflectie-indices. Planten worden vaak blootgesteld aan meerdere spanningen onder veldomstandigheden waar ernstige hittegolven, overstromingen en droogte de productiviteit van gewassen ernstig bedreigen. Wanneer spanningen samenvallen, kunnen de resulterende effecten op planten verschillend zijn als gevolg van synergetische of antagonistische interacties. Om op te helderen hoe aardappelplanten reageren op enkelvoudige en gecombineerde spanningen die lijken op natuurlijk voorkomende stressscenario's, werden vijf verschillende behandelingen opgelegd aan een geselecteerde aardappelcultivar (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) bij het begin van tuberisatie, d.w.z. controle, droogte, hitte, wateroverlast en combinaties van hitte, droogte en wateroverlast. Onze analyse toont aan dat wateroverlaststress het meest nadelige effect had op de prestaties van de plant, wat leidde tot snelle en drastische fysiologische reacties die verband hielden met stomatale sluiting, waaronder een vermindering van de kwantumopbrengst en efficiëntie van fotosysteem II en een toename van de temperatuur van het bladerdak en de waterindex. Onder hitte en gecombineerde stressbehandelingen werd de relatieve groeisnelheid in de vroege fase van stress verminderd. Onder droogte en gecombineerde stress daalden het plantvolume en de fotosynthetische prestaties met een verhoogde temperatuur en huidmondjessluiting in de late fase van stress. De combinatie van geoptimaliseerde stressbehandeling onder gedefinieerde omgevingsomstandigheden samen met geselecteerde fenotyperingsprotocollen maakte het mogelijk om de dynamiek van morfologische en fysiologische reacties op enkelvoudige en gecombineerde spanningen te onthullen. Hier wordt een nuttig hulpmiddel gepresenteerd voor plantenonderzoekers die op zoek zijn naar planteigenschappen die wijzen op veerkracht tegen verschillende aan klimaatverandering gerelateerde stress.

Introduction

De mogelijke effecten van klimaatverandering, waaronder de toename van de intensiteit en frequentie van hittegolven, overstromingen en droogte, hebben negatieve gevolgen voor de teelt van gewassen¹. Het is belangrijk om de invloed van klimaatverandering op de gewasvariabiliteit en de daaruit voortvloeiende fluctuaties in de jaarlijkse gewasproductie te begrijpen². Met de toenemende bevolking en vraag naar voedsel is het handhaven van de opbrengst van gewassen een uitdaging, waardoor het vinden van klimaatbestendige gewassen voor veredeling dringend nodig is ^3,4. Aardappel (Solanum tuberosum L.) is een van de essentiële voedselgewassen die bijdraagt aan de wereldwijde voedselzekerheid vanwege zijn hoge voedingswaarde en verhoogde efficiëntie van het watergebruik. Vermindering van groei en opbrengst onder ongunstige omstandigheden is echter een groot probleem, vooral bij de vatbare rassen ^5,6. Veel studies benadrukten het belang van het onderzoeken van alternatieve benaderingen om de productiviteit van aardappelgewassen op peil te houden, waaronder landbouwpraktijken, het vinden van tolerante genotypen en het begrijpen van de impact van stress op de ontwikkeling en opbrengst ^7,8,9, waar ook veel vraag naar is bij Europese aardappeltelers (of boeren)¹⁰.

Geautomatiseerde fenotyperingsplatforms, waaronder op afbeeldingen gebaseerde fenotypering, maken de kwantitatieve analyses van de structuur en functie van planten mogelijk die essentieel zijn voor het selecteren van relevante interessante eigenschappen^11,12. High-throughput fenotypering is een geavanceerde, niet-invasieve techniek om verschillende morfologische en fysiologische kenmerken die van belang zijn op een reproduceerbare en snelle manier te ^bepalen13. Hoewel het fenotype genotypische verschillen weerspiegelt in verband met milieueffecten, maakt het vergelijken van planten onder gecontroleerde omstandigheden met stress het mogelijk om de uitgebreide fenotyperingsinformatie te koppelen aan een specifieke (stress)conditie¹⁴. Fenotypering op basis van afbeeldingen is essentieel bij het beschrijven van fenotypische variabiliteit, en het is ook in staat om een reeks eigenschappen in de ontwikkeling van planten te screenen, ongeacht de populatiegrootte¹⁵. Het meten van morfologische kenmerken, waaronder de vorm, grootte en kleurindex van bladeren met behulp van rood-groen-blauw (RGB) beeldsensoren, wordt bijvoorbeeld gebruikt om de groei en ontwikkeling van planten te bepalen. Bovendien worden metingen van fysiologische kenmerken, waaronder fotosynthetische prestaties, bladerdaktemperatuur en bladreflectie, gekwantificeerd met behulp van meerdere soorten sensoren, zoals chlorofylfluorescentie, thermisch infrarood (IR) en hyperspectrale beeldvorming¹⁶. Recente studies in gecontroleerde omgevingen toonden het potentieel aan van het gebruik van op afbeeldingen gebaseerde fenotypering bij het beoordelen van verschillende mechanismen en fysiologische reacties van planten onder abiotische stress, zoals hitte in aardappel¹⁷, droogte in gerst¹⁸, rijst¹⁹ en gecombineerde droogte- en warmtebehandelingen in tarwe²⁰. Hoewel het bestuderen van de reacties van planten op meerdere stressinteracties complex is, onthullen de bevindingen nieuwe inzichten in het begrijpen van plantmechanismen bij het omgaan met snelle veranderingen in klimaatomstandigheden^.

De fysiologische en morfologische reacties van planten worden direct beïnvloed door abiotische stressomstandigheden (hoge temperatuur, watertekort en overstromingen), wat resulteert in opbrengstvermindering²². Hoewel aardappelen een hoge efficiëntie van watergebruik hebben in vergelijking met andere gewassen, heeft een watertekort een negatieve invloed op de kwantiteit en kwaliteit van de opbrengst vanwege de ondiepe wortelarchitectuur⁵. Afhankelijk van de intensiteit en de duur van het droogteniveau wordt de bladoppervlakte-index verlaagd en wordt de vertraging van de groei van het bladerdak met remming van nieuwe bladvorming uitgesproken tijdens latere stadia van stress, wat leidt tot een vermindering van de fotosynthesesnelheid²³. Het drempelniveau van water is van cruciaal belang bij overtollig water of langdurige droogteperiodes, wat resulteert in een negatief effect op de plantengroei en knolontwikkeling als gevolg van zuurstofbeperking, verminderde hydraulische geleidbaarheid van de wortels en beperking van de gasuitwisseling^24,25. Bovendien zijn aardappelen gevoelig voor hoge temperaturen, waarbij temperaturen boven de optimale niveaus resulteren in een vertraagde start, groei en assimilatiesnelheid van de knol²⁶. Wanneer stress in combinatie optreedt, verschillen de biochemische regulaties en fysiologische reacties van individuele stressreacties, wat de noodzaak benadrukt om de reacties van planten op stresscombinaties te onderzoeken²⁷. Gecombineerde stress kan leiden tot (nog meer) ernstige verminderingen van de plantengroei en bepalende effecten op reproductiegerelateerde eigenschappen²⁸. De impact van de stresscombinatie hangt af van de dominantie van elke stress ten opzichte van de andere, wat leidt tot een verbeterde of onderdrukte plantrespons (bijv. droogte leidt meestal tot sluiting van huidmondjes terwijl huidmondjes open zijn om afkoeling van het bladoppervlak onder hittestress mogelijk te maken). Gecombineerd stressonderzoek is echter nog in opkomst en verder onderzoek is nodig om een beter begrip te krijgen van de complexe regulatie die plantreacties onder deze omstandigheden bemiddelt²⁹. Deze studie heeft dus tot doel een fenotyperingsprotocol met behulp van meerdere beeldvormingssensoren te benadrukken en aan te bevelen dat geschikt kan zijn om morfofysiologische reacties te beoordelen en de onderliggende mechanismen van de algehele prestaties van aardappelen onder enkelvoudige en gecombineerde stressbehandelingen te begrijpen. Zoals verondersteld, bleek het combineren van meerdere beeldvormingssensoren een waardevol hulpmiddel te zijn om de vroege en latere strategieën tijdens de stressrespons van planten te karakteriseren. Het optimaliseren van het op afbeeldingen gebaseerde fenotyperingsprotocol zal een interactief hulpmiddel zijn voor plantenonderzoekers en veredelaars om eigenschappen te vinden die van belang zijn voor abiotische stresstolerantie.

Protocol

1. Voorbereiding van plantmateriaal en groeiomstandigheden

1. Verplant in vitro aardappel (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) stekken van weefselkweek in potten van 250 ml.
2. Vul de potten met volledig verzadigd Klasmman Substraat 2 en houd ze 1 week in de groeikamer bij weinig licht.
3. Stel de lichtomstandigheden op het niveau van de luifel in op 160 μmol·^m-2·^s-1 met een combinatie van 25% wit licht en 35% infrarood met behulp van een lichtmeter.
4. Verplant de planten na 10 dagen kweken van de in-vitrostekken in de grond in potten van 3 L (15,5 cm diameter, 20,5 cm hoogte).
5. Vul de pot van 3 L met 1850 g 3:1 Klasmann Substraat 2: Zand.
6. Plaats de planten in de groeikamer onder lichtcondities van 320 μmol·^m-2·^s-1 met een combinatie van 55% wit licht en 81% infrarood en stel deze in op een lang dagregime (16 uur fotoperiode).
7. Stel de temperatuur in de groeikamer in op 22 °C/19 °C voor dag/nacht en de relatieve vochtigheid (RV) op 55% voor het hele experiment.
8. Houd het potgewicht op 60% grond relatief watergehalte (SRWC) als het geschikte controleniveau om de groei en opbrengst te behouden ^30,31.
   OPMERKING: Op basis van eerdere onderzoeken bevorderde het handhaven van het volumetrische watergehalte van meer dan 60% de mosgroei op het bodemoppervlak en verhoogde het het risico op plantenziekten. Bovendien kan de aanwezigheid van mos misleidende positieve signalen genereren van chlorofylfluorescentiebeeldvorming, wat een uitdaging is om eruit te filteren. Gebruik de volgende vergelijking: SRWC% = (FW-DW)/(TW-DW) × 100, waarbij FW het verse gewicht van de grond is, TW het turgorgewicht en DW het droge gewicht³².
   1. Selecteer de grondmonsters (100 g) uit drie verschillende Klasmman Substrate 2 mengselzakken als replicaten en weeg het verse gewicht van de grond.
   2. Verzadig de grond met water totdat de potten water vasthouden zonder te druppelen en weeg het gewicht van de grondturgor.
   3. Plaats het monster 3 dagen in de oven bij 80 °C tot de grondmonsters volledig droog zijn en weeg het drooggewicht van de grond³³.
9. Leg de blauwe matten op het potoppervlak om verdamping te verminderen.
   OPMERKING: Blauwe kleur is nodig om de grondachtergrond af te trekken van plantpixels in de afbeeldingssegmentatie.
10. Selecteer tien biologische replicaten per behandeling.
11. Randomiseer de potten tijdens de irrigatie (in totaal 50 potten).
12. Voeg de blauwe houders toe om de planten te ondersteunen en mechanische schade te voorkomen wanneer u ze in het fenotyperingssysteem plaatst.

2. Stress toepassing

1. In het vroege tuberisatiestadium (28 dagen na het verplanten van de in-vitrostekken ), verdeel de planten in vijf behandelingsgroepen en fenotype tien planten per behandeling (Figuur 1).
2. Induceer de enkelvoudige en gecombineerde stress tot een niveau dat niet schadelijk is als volgt:
   1. Houd de planten in de groeikamer onder controle, droogte- en wateroverlastbehandelingen bij 22 °C/19 °C dag/nacht (stap 1.7), met verschillende percentages SRWC:
      Controle (C) met 60% SRWC gedurende het gehele experiment.
      Droogte (D) met 20% SRWC geleidelijk gedurende 7 dagen, gevolgd door 1 dag herstel.
      Wateroverlast (W) met 160% SRWC gedurende 5 dagen, gevolgd door 10 dagen herstel.
   2. Om het waterpeil boven het grondoppervlak te houden in de wateroverlastbehandeling, steekt u een plastic zak in de lege pot en plaatst u vervolgens de hoofdpot met aarde in de voorbereide tweede pot.
   3. Plaats de planten in een groeicapsule bij 30/28 °C dag/nacht en 55% RV voor warmtebehandelingen. Enkelvoudige en gecombineerde hittespanningen als volgt opleggen:
      1. Voor warmte (H) houdt u de temperatuur gedurende 15 dagen op 30-28 °C met 60% SRWC.
      2. Voor Hitte + Droogte + Wateroverlast (HDW) drievoudige stress, stel de planten de eerste 7 dagen bloot aan een warmtebehandeling bij 30 °C/28 °C dag/nachttemperatuur (met behoud van 60% SRWC), gevolgd door droogte + hitte gecombineerde behandeling gedurende de andere 7 dagen (20% SRWC en 30 °C/28 °C) en stel de planten ten slotte gedurende 1 dag bloot aan wateroverlaststress. Voor dit laatste plaats je de planten terug in de groeikamer (zie stap 1.7 voor de omstandigheden) en induceer je wateroverlast tot 160% SRWC gedurende 1 dag.
         OPMERKING: De geselecteerde duur van de geïnduceerde spanningen was gebaseerd op een proefexperiment dat stresseffecten aantoonde zonder nadelige effecten met 100% overleving van de behandelde planten. In de omgeving van de groeikamer lag de variatie van de omgevingsomstandigheden in het bereik ± 0,2 °C voor temperatuur en ± 3% voor vochtigheid.

3. Plantvoorbereiding voor fenotypering

1. Nadat de lichten om 6.00 uur 's ochtends in de groeikamers zijn ingeschakeld, laat u de planten ten minste 2-3 uur acclimatiseren onder de constante groeilichtomstandigheden (320 ^μmol-m-2·^s-1) voordat het fenotyperingsprotocol wordt gestart. Dit zorgt ervoor dat de fotosynthese en stomatale regulatie in een stabiele toestand zijn³⁴.
2. Breng de planten vóór de meting over van hun teeltlocatie naar het groeibuffergebied van het fenotyperingssysteem dat wordt gebruikt voor het handmatig laden van planten in het systeem, terwijl het geautomatiseerde scoren in de stand-bymodus staat en in de kas is geplaatst (aanvullende figuur 1, aanvullende figuur 2 en aanvullende figuur 3).
   OPMERKING: De planten werden tijdens de fenotyperingsperiode van 3,5 uur in het groeibuffergebied gehouden. In de kas lag de variatie in de omgevingsomstandigheden in het bereik van ± 2 °C voor temperatuur, ± 5% voor vochtigheid en 20% fluctuatie in de lichtintensiteit. Houd er dus rekening mee dat de metingen onmiddellijk moeten beginnen en kort moeten zijn, waarbij de invloed van kasomstandigheden op planten wordt vermeden.
3. Plaats in het fenotyperingsplatform de potten in de schijven die automatisch op een transportband bewegen met bepaalde tussenpozen naar de beeldsensor volgens de meetprotocollen gespecificeerd in sectie 4.
4. Label elke plant/tray met een unieke ID om ervoor te zorgen dat de gemeten gegevens tijdens het experiment aan de juiste plant worden toegewezen.

4. Protocol voor fenotypering

1. Optimaliseer het fenotyperingsprotocol met behulp van meerdere beeldvormingssensoren (chlorofylfluorescentie, thermische IR, RGB en hyperspectrale beeldvorming), waardoor gelijktijdige meting van zowel de fysiologische als de morfologische parameters van planten mogelijk is (Figuur 2).
   OPMERKING: Aangezien de reacties van de plant de omgevingsomstandigheden en de dagelijkse effecten weerspiegelen, is het belangrijk om randomisatie van de potten en het uitvoeren van fenotypering binnen dezelfde periode van de dag te overwegen.
2. Zorg er in het fenotyperingsplatform voor dat de planten het systeem binnenkomen via een aanpassingstunnel (Figuur 2A) waar eerst de hoogte van de plant wordt vastgelegd en vervolgens de hoogte van elke sensor wordt aangepast op basis van een vaste werkafstand.
3. Voer de metingen uit in twee rondes zoals gerechtvaardigd in het meetprotocol met behulp van de software.
   1. In de eerste ronde omvatten de metingen van fysiologische reacties gekwantificeerd als "snelle reacties" met behulp van chlorofylfluorescentie en thermische beeldvorming.
   2. Begin met het meten van de fysiologische parameters bij hittestressbehandelingen en daarna de rest van de behandelingen.
   3. Ga in de tweede ronde verder met andere metingen voor het beoordelen van langzamere reacties, waaronder structurele RGB en hyperspectrale beeldvorming, gevolgd door gewichtsbeoordeling en water geven.
4. Definieer tijdens de weeg- en watergift het referentiegewicht voor elke plant om geautomatiseerde bewatering en weging voor de gegeven behandeling mogelijk te maken.
   1. Zorg ervoor dat het totale referentiegewicht het gewicht omvat van de schijf, het inzetstuk op de transportband, de ondersteunende blauwe houder, de blauwe mat, de pot, de grond en de plantaardige biomassa in het gedefinieerde protocol.
   2. Voor een nauwkeurige meting van de evapotranspiratie tijdens het wegen en water geven, bereidt u lege potten voor als referentie. Maak daarnaast extra potten klaar om te corrigeren voor het gewicht van de plantaardige biomassa.
5. Om 50 planten te meten, duurt het hele fenotyperingsprotocol 215 minuten (85 minuten in de 1e^{ronde en} 130 minuten in de 2e^ronde).
6. Fenotypeer dagelijks alle planten onder controleomstandigheden (1 dag voor de behandeling) en induceer vervolgens de stressbehandelingen om de dynamische reacties te monitoren en de vroege en late fasen van de geïnduceerde stress te beoordelen.

5. Instellingen voor elke beeldsensor aanpassen

1. Kinetische chlorofylfluorescentiebeeldvorming
   OPMERKING: Kinetische chlorofylfluorescentie wordt gebruikt om de fotosynthetische capaciteit van planten te onderzoeken als reactie op verschillende omgevingsomstandigheden, waaronder abiotische stress, en om waardevolle informatie te verstrekken over de kwantumefficiëntie van fotochemie en warmteafvoer (niet-fotochemisch proces).
   1. Voer chlorofylfluorescentiemetingen uit op aan licht aangepaste planten met behulp van een kort lichtprotocol om de reacties van planten onder verschillende behandelingen te onderscheiden.
   2. Acclimatiseer³⁵ de planten gedurende 5 minuten onder het licht in de adaptatietunnel uitgerust met koelwitte LED's (6500 K) bij 500 μmol·^m-2·^s-1.
      OPMERKING: Chlorofylfluorescentiebeeldvorming is de eerste meting na de lichtaanpassing die wordt gebruikt om veranderingen in de fotosynthesecapaciteiten van planten te volgen.
   3. Selecteer en optimaliseer het vooraf gedefinieerde protocol op basis van de grootte van de installatie en de vereiste lichtintensiteiten.
   4. Optimaliseer de meetinstellingen, inclusief camera- en lichtintensiteitsinstellingen om ervoor te zorgen dat een sterk signaal wordt verkregen met een optimale signaal-ruisverhouding.
      1. Pas camera-instellingen aan, zoals sluitertijd (belichtingstijd, duur van het meten van flitsen) en gevoeligheid (elektrische versterking van de camera). Gebruik de sluiter op 2 ms en de gevoeligheid op 12%.
         OPMERKING: Deze waarden worden aangepast op basis van de grootte en vorm van de vleugel en de gedefinieerde afstand tussen de bovenkant van de luifel en de beeldsensor.
      2. Stel de actinische lichtintensiteit in op 500 μmol·^m-2·^s-1 en stel de verzadigingspuls in op 3200 μmol·^m-2·^s-1, wat minstens 6-7 keer hoger is dan het actinische licht.
   5. Om parameters in lichtstationaire toestand (Lss) (hieronder beschreven) te meten, passen de planten zich aan het licht aan gedurende 5 minuten vóór de metingen in de lichtaanpassingstunnel.
   6. Om de kwantumopbrengst van steady-state fotosysteem II (PSII) van aan licht aangepaste planten te schatten, selecteert u het korte lichtprotocol (Figuur 3) en stelt u het protocol als volgt in.
      OPMERKING: De duur van het protocol was 10 s per plant.
      1. Begin de meting door het koelwitte actinische licht op 500 μmol·^m-2·^s-1 gedurende 3 s aan te zetten om de steady-state fluorescentie in licht (F_t_Lss aka. F_t')
      2. Pas een verzadigingspuls toe op 3200 μmol·^m-2·^s-1 gedurende 800 ms om de steady-state maximale fluorescentie in licht (F_m_Lss aka. F_m')
      3. Schakel het actinische licht uit en vervolgens het verrode licht (735 nm) om PSII in staat te stellen 800 ms in het donker te ontspannen en de steady-state minimale fluorescentie in licht (F_o_Lss aka. F_o').
   7. Om de relatieve parameters te berekenen, gebruikt u data-analysesoftware die de achtergrond aftrekt en de relevante parameters extraheert.
      OPMERKING: Parameters geëxtraheerd uit het gebruikte protocol zijn: maximale efficiëntie van PSII-fotochemie van aan licht aangepast monster in lichtsteady-state bepaald als F_v/F_m_Lss oftewel . F_v'/F_m', fotosysteem II kwantumopbrengst of operationele efficiëntie van fotosysteem II in lichte stationaire toestand gedefinieerd als QY_Lss aka. φ_PSII = F_q'/F_m', en de fractie van open reactiecentra in PSII (geoxideerde QA) wordt bepaald als qL_Lss = (F_q'/F_v') x (F₀'/F_t').
2. Thermische infrarood (IR) beeldvorming
   OPMERKING: Thermische IR-beeldvorming wordt gebruikt voor niet-invasieve meting van de werkelijke temperatuur van het bladerdak, waardoor de verschillende huidmondjesregulaties worden bepaald. In de thermische IR-beeldvormingseenheid is een thermische camera zijdelings op de robotarm gemonteerd om de temperatuur van de luifel vanaf het zijaanzicht te meten.
   1. Om het contrast van de achtergrondtemperatuur tijdens de beeldverwerking te verhogen ten opzichte van de temperatuur van het afgebeelde object, gebruikt u een automatisch geregelde verwarmde wand aan de andere kant van de thermische camera om het contrast te verhogen. Regel de wandtemperatuur op 8 °C boven de luchttemperatuur in de beeldvormingseenheid.
      OPMERKING: De warmtebeelden zijn in het donker gemaakt met behulp van lijnscanmodus³⁵.
   2. Genereer na beeldacquisitie een plantenmasker op basis van RGB-zijaanzichtgegevens en gebruik dit om samen met thermische gegevens te registreren in de beeldanalyse. Dit zorgt voor een nauwkeurige identificatie van het gescande object en elimineert achtergrondinterferentie zoals de planthouder.
   3. Om de invloed van fluctuerende omgevingsomstandigheden gedurende het hele experiment te voorkomen, berekent u het parametertemperatuurverschil (delta T of ΔT).
      OPMERKING: Delta T (ΔT) wordt gedefinieerd als het verschil tussen de gemeten temperatuur van het bladoppervlak (het gemiddelde van alle pixels van het gehele gedetecteerde oppervlak van de plant) en de omgevingsluchttemperatuur in de beeldvormingsdoos.
3. RGB-beeldvorming
   OPMERKING: RGB-beeldvorming is gebaseerd op VIS-camera's (Visual Inertial System) die licht detecteren in het zichtbare bereik van 400-700 nm, waar het wordt gebruikt voor diepgaande analyse van plantmorfologie, architectuur en extractie van kleurindexkenmerken.
   1. De beeldvormingseenheid bevat een draaitafel voor nauwkeurige positionering van de lade en maakt tegelijkertijd beeldvorming vanuit meerdere hoeken mogelijk voor zijaanzichten.
   2. Stel RGB-beeldvorming in op basis van zijaanzichtbeelden om de plant vanuit drie hoeken (0°, 120° en 240°) vast te leggen, die wordt gemaakt in lijnscanmodus (RGB1) en bovenaanzichtbeeldvorming in snapshotmodus (RGB2).
   3. Beide camera's hebben een op LED gebaseerde lichtbron, die zorgt voor een homogene verlichting van de afgebeelde plant en zo de morfologische en kleurkenmerken nauwkeurig bepaalt.
   4. Extraheer berekende parameters met behulp van data-analysesoftware.
   5. Bereken voor aanvullende parameters op basis van zij- en bovenaanzichten het plantvolume (digitale biomassa)³⁶:
      
   6. Bereken de relatieve groeisnelheid (RGR)³⁷:
      
      Waarbij T_n en T_n+1 het tijdsinterval (dagen) aangeven.
4. Hyperspectrale beeldvorming
   OPMERKING: Hyperspectrale beeldvorming wordt gebruikt voor de visualisatie van de spectrale reflectie van de planten. De veranderingen in bladreflectie zijn indicatoren van de verschillende fysiologische status van de gegeven plant.
   1. Gebruik de hyperspectrale beeldvormingssensor om de reflectie van het bladerdak in het zichtbare deel van de lichtspectra te kwantificeren, met een zichtbaar-nabij-infrarood (VNIR) hyperspectrale camera in het bereik van 380-900 nm en een infraroodcamera met korte golflengte (SWIR) in het bereik van 900-1700 nm.
   2. De camera's zijn gemonteerd op een robotarm met een geïmplementeerde halogeenbuislichtbron (600 W) voor een homogene en spectraal passende monsterverlichting tijdens beeldacquisitie die over het XZ-gebied beweegt.
   3. Beide camera's werken in line scan-modus en worden in een lichtgeïsoleerde beelddoos geplaatst.
   4. Voer voor elke meetronde (automatisch) twee kalibratiemetingen uit: donkerstroomkalibratie en radiometrische kalibratie met behulp van de spectrale reflectie Teflon-standaard.
   5. Het donkere kalibratiebeeld wordt afgetrokken van het onbewerkte en witte kalibratiebeeld om de donkere stroomruis te verwijderen. Genereer vervolgens het uiteindelijke hyperspectrale beeld door het onbewerkte beeld na aftrek te delen door het witte kalibratiebeeld.

6. Exporteren van gegevens en beeldanalyse

1. Gebruik de data-analysesoftware voor automatische extractie, achtergrondaftrekking en plantmaskersegmentatie van de beeldverwerkingspijplijn (Afbeelding 2B).
2. De software voert een volledig geautomatiseerde analyse uit waarbij het aanbrengen van maskers, het aftrekken van de achtergrond waarbij planten van hun achtergrond worden geïsoleerd, en de parameterberekening worden verwerkt zoals beschreven voor RGB-beeldvorming³⁸ en warmtebeeldvorming²⁰.
3. Extraheer de gemeten en berekende parameters uit de plantspecifieke pixels zoals gedefinieerd door het door de RGB-afbeelding gegenereerde plantenmasker en het traymasker.
4. Als de beelden niet volledig zijn geselecteerd, wat kan gebeuren als gevolg van veranderingen in de groenheid van de vegetatie tijdens latere ontwikkelingsstadia of het effect van stressbehandeling, opent u het lokale gegevensanalysegedeelte in de software en past u de instellingen van het plantenmasker opnieuw aan in de software van de gegevensanalysator, afhankelijk van elke sensor.
5. Pas bij de verwerking van chlorofylfluorescentiebeelden de analyseparameters van de instellingen van het chlorofylfluorescentie-plantenmasker aan (aanvullende afbeelding 4).
   1. Stel de drempelwaarde in op True, wat betekent dat plantsegmentatie automatisch wordt uitgevoerd.
   2. Stel de Mask Frame Index in op False, wat betekent dat voor de detectie van plantenmaskers het Time-Visual-frame wordt gebruikt zoals gedefinieerd in het chlorofylfluorescentieprotocol.
6. Stel bij de verwerking van warmtebeelden de parameters in voor de analyse van het plantmasker (aanvullende afbeelding 5).
   1. Stel de automatische drempelwaarde voor het genereren van objectmaskers in op Onwaar.
   2. Stel het masker van de RGB-zijafbeelding in op Waar om te worden gebruikt voor analyse.
7. Pas bij RGB-beeldverwerking de analyseparameters van de instellingen van het plantenmasker aan (aanvullende afbeelding 6 en aanvullende afbeelding 7), afhankelijk van de soort en het ontwikkelingsstadium.
   1. Selecteer de formule 4*G-3*B-R, die de definitie is voor het genereren van objectmaskers en de gebruikte kleurcomponent definieert (Rode, Groene , Blauwe component).
      OPMERKING: Deze standaardformule en andere instellingen kunnen veranderen afhankelijk van het type camera dat wordt gebruikt (boven- of grootteweergave), de toegepaste behandeling en de verschillende cultivars.
   2. Pas de drempel aan die wordt gebruikt voor de conversie van het grijswaardenbeeld met een verbeterd groen kanaal naar een binair beeld dat het oppervlak bepaalt dat door de plant wordt bedekt.
   3. Pas de mediane filtergrootte aan die wordt gebruikt om de ruis en ongeldige pixels te verminderen en ontbrekende pixels op te vullen.
   4. Pas de minimale grootte van het object in pixels aan die in de analyse moet worden opgenomen.
   5. Pas de minimale grootte van gaten in de maskerobjecten aan in pixels, meestal tientallen pixels. De gaten die kleiner zijn dan deze waarde worden gesloten en in de objectpixels opgenomen.
   6. Stel de optie Reflectiereductie gebruiken in op Waar voor het normaliseren van RGB-waarden in elke pixel.
   7. Stel de Skip Bad Exposed Points in als Waar voor het bijsnijden van/onder belichte pixels van het plantenmasker (bijv. het weglaten van de oppervlaktereflecties of de donkere pixels waar de ruis groter is dan het signaal).
8. Kleur de segmentatie-instellingen die vanuit RGB zijn geanalyseerd met behulp van de data-analysatorsoftware om informatie te verstrekken over kleurveranderingen die verband houden met stressreacties en plantenveroudering.
   OPMERKING: De groenheid wordt geschat aan de hand van een vooraf gedefinieerd kleurengamma dat alle stadia van de ontwikkeling van de plant vertegenwoordigt. De intensiteit in kleurkanalen van alle pixels die overeenkomen met het plantoppervlak werd gegroepeerd en geclusterd om te worden gebruikt als een bronkleurenkaart voor kleursegmentatie.
   1. Geef de verwerkte RGB-afbeelding (verwijderde achtergrond), kleurenkaart - lijst met tinten voor specifieke analyse, als invoer in de software.
   2. Om onbevooroordeelde resultaten te krijgen, voert u kleurselectie uit met behulp van een "trainings"-dataset en selecteert u verschillende ontwikkelingsstadia en behandelingen.
      OPMERKING: Analyse slaat R-, G- en B-waarden op van elke pixel van elke afbeelding uit deze trainingsgegevensset.
   3. Definieer het aantal tinten (selecteer 6 tinten) met behulp van de software voor de uitvoer van de kleurdefinitie, variërend van 0-255 voor elk kanaal.
   4. Geef de lijst met tinten op die zijn gegenereerd in de software voor gegevensanalysator (Kleuren).
9. Bij hyperspectrale beeldverwerking verwerk je de verkregen hyperspectrale gegevens met behulp van de pixel-voor-pixel-analyse die is geïmplementeerd in de hyperspectrale analysatorsoftware, met radiometrische en donkere ruiskalibratie, achtergrondaftrekking en segmentatie van plantenmaskers. Gebruik de gemiddelde spectra en vegetatie-indices voor verdere analyse.
10. Maak het masker voor gegevensextractie uit het hyperspectrale beeld van het VNIR-beeld dat is gemaakt door de VNIR Hyperspectral-camera. Genereer voor de SWIR-hyperspectrale scan een plantenmasker op basis van SWIR-analyse.
    1. Gebruik in VNIR Plant Mask de formule 1.2*(2.5*(R740-R672)-1.3*(R740-R556)) voor het visualiseren van de afbeeldingen waarbij R de reflectiewaarde in een specifieke golflengte vertegenwoordigt (aanvullende figuur 8).
    2. Gebruik in SWIR Plant Mask de formule (R960-R1450)-(R960-R1200) in beeldverwerking voor het visualiseren van de afbeeldingen (aanvullende afbeelding 9).

7. Wegen en water geven

1. Bewaar het gewicht (voor) water geven tijdens het wegen en water geven. Breng vervolgens water aan en houd het gewicht ook na het water geven op peil.
2. Geef de trays water in de referentiemodus - elke tray had een referentiewaarde opgeslagen in de database, waarop het altijd werd bewaterd. Bepaal de referentie op basis van de behandeling.

8. Analyse van de gegevens

1. Analyseer de gegevens met behulp van de ANOVA- en Shapiro-test.
2. Voer paarsgewijze vergelijkingen uit tussen verschillende behandelingen door de Pairwise Wilcox-test in R-studio (versie 4.2.3) met behulp van (dplyr), (tidyverse), (rstatix) en (ggpubr) pakketten.
   OPMERKING: De beeldanalyse werd automatisch uitgevoerd met behulp van data-analysesoftware. Gebruik voor verdere analyse van de beeldacquisitie sensorspecifieke data-analysesoftware.

Results

In deze studie werd geautomatiseerde beeldgebaseerde fenotypering gebruikt om de morfologische en fysiologische reacties van aardappel (cv. Lady Rosetta) onder enkelvoudige en gecombineerde stress te onderzoeken. De toegepaste aanpak toonde de dynamische reacties van planten met een hoge spatio-temporele resolutie wanneer stress werd geïnduceerd in de startfase van de knol. Om de vroege en late fasen van stress te beoordelen, werden de resultaten gepresenteerd als 3 tijdsperioden ([0-5 dagen fenotypering (DOP)], [6-10 DOP] en [11-15 DOP]) (Figuur 1). Tot 0 DOP werden alle planten gekweekt onder gecontroleerde omstandigheden (C), daarna van 1-5 DOP, waarbij wateroverlaststress (W) en hittestress (H) werden toegepast. De reacties werden dus als volgt waargenomen: (i) in 0-5 DOP, gaf de aanvankelijke hitte en wateroverlast aan; (ii) in 6-10 DOP, weerspiegelde de vroege droogte (D) en gecombineerde hitte en droogte (HD) werd waargenomen en (iii) in 11-15 DOP, toonde de late hitte, droogte en gecombineerde hitte + droogte + wateroverlast (HDW) stress. Het herstel van wateroverlast werd waargenomen bij 6-10 DOP en 11-15 DOP.

Morfologische kenmerken
RGB-beeldvorming werd toegepast om het effect van verschillende spanningen en combinaties op bovengrondse plantengroei te bepalen. De resultaten in figuur 4 laten zien dat warmtebehandeling en wateroverlaststress (0-5 DOP) al een vermindering van het plantvolume en RGR veroorzaken in vergelijking met controle. Gedurende 6-10 DOP namen het plantvolume en de RGR van controleplanten continu toe, terwijl bij hitte, gecombineerde hitte, droogte en wateroverlast deze toename van het plantvolume duidelijk afnam (figuur 4A). Omdat planten erg gevoelig zijn voor wateroverlaststress, was er een duidelijke afname van RGR (Figuur 4B). Tijdens late droogtestress (11-15 DOP), waarbij SRWC op 20% werd gehouden, werd een duidelijke vermindering van RGR waargenomen in vergelijking met de controlegroep. In de late fase van gecombineerde HDW veroorzaakte de toepassing van wateroverlastbehandeling echter een toename van RGR op de laatste dag van stress.

Fysiologische eigenschappen
De combinatie van structurele en fysiologische fenotypering werd toegepast om verdere reacties op stress aan het licht te brengen. Het gebruik van meerdere beeldsensoren maakt het mogelijk om de fysiologische reacties in de vroege fase van stress te bepalen. Verdere analyse van de chlorofylfluorescentiegegevens toonde aan dat wateroverlast een negatieve invloed had op de fotosynthese-efficiëntie, waarbij F_v'/F_m' (F_v/F_m_Lss) dramatisch afnam bij 0-5 DOP en 6-10 DOP, maar een herstellende respons werd waargenomen bij 11-15 DOP waar F_v'/F_m' licht toenam (Figuur 5A). Tijdens de late stressfase (11-15 DOP) werd een vermindering van F_v'/F_m' waargenomen bij droogte en gecombineerde hitte en droogte. In drassige planten was de operationele efficiëntie van planten (QY_Lss ook bekend als φ_PSII) significant lager in vergelijking met andere behandelingen in 0-5 DOP en 6-10 DOP, maar een lichte toename bij 11-15 DOP, wat wijst op herstel van de plant (Figuur 5B). Bovendien werden de verschillende mechanismen bij het reguleren van de efficiëntie die bijdraagt aan de bescherming van PSII bepaald door de fractie van open reactiecentra in PSII in een lichte steady-state (qL_Lss) te berekenen (Figuur 5C). Alleen onder droogte werd een toename van de qL waargenomen, waarschijnlijk als gevolg van foto-inhibitie.

Deze bevindingen waren in overeenstemming met IR-gegevens die verschillende onderliggende mechanismen onder spanningen weerspiegelden (Figuur 6). Een toename van deltaT (ΔT) werd waargenomen bij wateroverlast, waardoor de gaswisselkoers daalde. Onder late droogte en gecombineerde hitte- en droogtestress was een toename van ΔT te wijten aan huidmondjessluiting, die werd beschouwd als een van de belangrijkste reacties om overtollig waterverlies te voorkomen. Aan de andere kant werd een vermindering van ΔT onder warmtebehandelingen waargenomen toen huidmondjes opengingen om de transpiratie-efficiëntie te verbeteren en het bladoppervlak af te koelen.

Door de hyperspectrale gegevens te onderzoeken, werden twee parameters geselecteerd uit de hyperspectrale VNIR-gegevens om de bladreflectie-indices te beoordelen, waaronder NDVI als indicator van het chlorofylgehalte en PRI als indicator van de efficiëntie van fotosynthese. De resultaten toonden alleen een afname van NDVI en PRI onder wateroverlast in verband met de waargenomen afname van de morfologische kenmerken (Figuur 7A,B). Bovendien werd uit de SWIR-hyperspectrale gegevens die werden gebruikt voor het beoordelen van het watergehalte in de planten, een toename van de waterindex bij wateroverlast waargenomen tijdens 0-5 DOP (figuur 7C). Onder warmtebehandelingen werd echter een tegenovergestelde respons waargenomen waarbij de waterindex lager was dan de controlegroep. Deze bevindingen waren in overeenstemming met een onderzoek van vegetatie uit de kleursegmentatie van RGB Topview. De veranderingen in de verhouding van tinten geven de stressreacties in de loop van de tijd aan (figuur 8). De vergroeningsindex toonde een vermindering van het pigmentgehalte onder droogte en gecombineerd HDW in de late stressfase en geleidelijk herstel van de wateroverlastbehandeling. Het gebruik van de meerdere beeldvormingssensoren weerspiegelde dus de correlatie van morfofysiologische kenmerken en maakte het mogelijk om de algehele prestaties van de plant onder abiotische stress te beoordelen.

Figuur 1: Tijdlijn van het toepassen van de verschillende behandelingen, inclusief de leeftijd van de planten in dagen na het verplanten van de in-vitrostekken . Dag 0 van fenotypering (DOP) werd gemeten onder controleomstandigheden (C), en vervolgens werden de verschillende spanningen geïnduceerd met verschillende duur. Van 1-5 DOP werd wateroverlast (W) stress toegepast en de eerste reactie van warmtebehandeling (H). De volgende dagen 6-10 DOP, waar de beginfase van droogtestress (D) en gecombineerde hitte- en droogtestress (HD) werden gepresenteerd. Tijdens 11-15 DOP werd de reactie van planten op de late fase van droogte en hittebehandelingen en de toepassing van wateroverlast op HD (HDW) gedurende 1 dag weerspiegeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Schema met een samenvatting van het fenotyperingsprotocol en gegevensanalyse. (A) Overzicht van het fenotyperingsprotocol. Planten worden vanuit de gecontroleerde omstandigheden in de FS-WI groeikamer (PSI) naar het fenotyperingssysteem getransporteerd. Planten werden vóór de metingen gedurende 5 minuten licht geacclimatiseerd in de lichtaanpassingskamer bij 500 μmol.m-2.s-1. Meerdere beeldsensoren werden gebruikt om morfologische en fysiologische kenmerken te bepalen, gevolgd door het weeg- en waterstation. Afhankelijk van de behandeling werden de planten onder gecontroleerde omstandigheden teruggeplaatst, bij 22 °C/19 °C of 30 °C/28 °C. (B) Automatische extractie en segmentatie van de beeldverwerkingspijplijn van elke beeldsensor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Overzicht van het korte lichtprotocol voor chlorofylfluorescentiebeeldvorming. Het meetprotocol begon met het inschakelen van koel wit actinisch licht om de steady-state fluorescentie in licht te meten (F_t_Lss) en vervolgens een verzadigingspuls toe te passen om de steady-state maximale fluorescentie in licht (F_m_Lss te meten). Het actinische licht werd uitgeschakeld en het verrode licht werd ingeschakeld om de steady-state minimale fluorescentie in licht (F_o_Lss) te bepalen. De duur van het protocol was 10 s per plant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: RGB-beeldvorming gebruikt voor morfologische beoordeling. (A) Plantvolume berekend op basis van het RGB-gebied van boven- en zijaanzichten. (B) Relatieve groeisnelheid (RGR) tijdens de aanloopfase van de knol. De gegevens vertegenwoordigen gemiddelde waarden ± standaarddeviatie (n = 10). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Chlorofylfluorescentiebeeldvorming op aan licht aangepaste planten. (A) Maximale efficiëntie van PSII-fotochemie van aan licht aangepast monster in lichtstabiele toestand (F_v/F_m_Lss). (B) Fotosysteem II kwantumopbrengst of operationele efficiëntie van fotosysteem II in lichte steady-state (QY_Lss). (C) Fractie van open reactiecentra in PSII in lichte steady-state (geoxideerde QA) (qL_Lss). De gegevens vertegenwoordigen gemiddelde waarden ± standaarddeviatie (n = 10). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Thermische IR-beeldvorming werd gebruikt om het verschil te berekenen tussen de gemiddelde temperatuur van het bladerdak op basis van thermische IR-beelden en de luchttemperatuur (ΔT). De gegevens vertegenwoordigen gemiddelde waarden ± standaarddeviatie (n = 10). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Hyperspectrale beeldvorming voor het bepalen van vegetatie-indices en watergehalte. (A) Genormaliseerde Verschil Vegetatie-index (NDVI). (B) Fotochemische reflectie-index (PRI) berekend op basis van VNIR-beeldvorming. (C) Waterindex berekend op basis van SWIR-beeldvorming. De gegevens vertegenwoordigen gemiddelde waarden ± standaarddeviatie (n = 10). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Vergroeningsindex voor planten die verschillende behandelingen ondergaan. Beeldverwerking is gebaseerd op de transformatie van het originele RGB-beeld in een kleurenkaart bestaande uit 6 gedefinieerde tinten. De gegevens vertegenwoordigen gemiddelde waarden ± standaarddeviatie (n = 10). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Lichtintensiteit gemeten tijdens de dagen van fenotypering (DOP). De duur van de metingen van 9.00 uur tot 12.35 uur. LI_Buff verwijst naar de mediaangegevens van 5 lichtsensoren die in de kas zijn verspreid. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Relatieve vochtigheid (RV) gemeten tijdens de dagen van fenotypering (DOP). De duur van de metingen van 9.00 uur tot 12.35 uur. RH_Buff verwijst naar de mediane gegevens van 5 vochtigheidssensoren die in de kas zijn verspreid. RH2 verwijst naar de relatieve vochtigheid in de aanpassingskamer. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Temperatuur gemeten tijdens de dagen van fenotypering (DOP). De duur van de metingen van 9.00 uur tot 12.35 uur. T_Buff verwijst naar de mediaangegevens van 5 temperatuursensoren die in de kas zijn verspreid. T2 verwijst naar de temperatuur in de aanpassingskamer. T3 verwijst naar de temperatuur van de verwarmingswand. T4 verwijst naar de temperatuur in de thermische IR-beeldvormingseenheid. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Screenshot van data-analysesoftware met de parameters die zijn aangepast voor plantmaskeranalyse in chlorofylfluorescentiebeeldvormingssensoren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Screenshot van data-analysatorsoftware met de parameters die zijn aangepast voor plantmaskeranalyse in thermische infraroodbeeldsensoren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 6: Schermafbeelding van data-analysesoftware met de parameters die zijn aangepast voor plantmaskeranalyse in RGB 1-side view beeldsensoren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 7: Screenshot van data-analysatorsoftware met de parameters die zijn aangepast voor plantmaskeranalyse in RGB2-beeldsensoren in bovenaanzicht. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 8: Screenshot van data-analysesoftware met de parameters die zijn aangepast voor plantmaskeranalyse in VNIR-beeldvormingssensoren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 9: Screenshot van data-analysesoftware met de parameters die zijn aangepast voor plantmaskeranalyse in SWIR-beeldvormingssensoren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Verbeterde geavanceerde beeldvormingstools met hoge resolutie en computervisietechnieken hebben de snelle ontwikkeling van plantenfenotypering mogelijk gemaakt om kwantitatieve gegevens te verkrijgen uit massieve plantenbeelden op een reproduceerbare manier³⁹. Deze studie was gericht op het aanpassen en optimaliseren van beeldgebaseerde methodologie met hoge doorvoer met behulp van een reeks momenteel beschikbare beeldsensoren om de dynamische reacties van planten onder enkelvoudige en gecombineerde abiotische stress te monitoren. Een paar cruciale stappen van de toegepaste aanpak vereisen aanpassingen, waaronder het toepassen van stress en het selecteren van een geschikt beeldvormingsprotocol voor de metingen. Het gebruik van meerdere sensoren voor beeldacquisitie maakt het mogelijk om belangrijke fenotypische kenmerken te kwantificeren (zoals plantengroei, fotosynthese-efficiëntie, huidmondjesregulatie, bladreflectie, enz.). Bovendien verbetert het begrip van hoe aardappelplanten reageren op verschillende abiotische stressfactoren. Dit is een belangrijke voorwaarde voor het versnellen van plantenveredelingsprojecten om klimaattolerante genotypen^{te ontwikkelen 40}. De morfologische reacties op de geïnduceerde stress zijn afhankelijk van de ontwikkelingsfase. Het induceren van stress in de initiatiefase van de stolon of knol remt bijvoorbeeld de ontwikkeling van bladeren en planten en beperkt het aantal uitlopers, waardoor de uiteindelijke opbrengst afneemt⁴¹. Onder ongunstige omstandigheden gebruiken planten echter stressreacties als een adaptieve reactie om door stress veroorzaakte cellulaire schade te voorkomen en te^herstellen42. Planten hebben aanpassingsmechanismen om stressomstandigheden te vermijden en te tolereren, afhankelijk van het ernstniveau⁴³.

Om de mechanismen van planten te begrijpen, wordt het induceren van de juiste duur en intensiteit van stress en het bepalen van de reacties van planten op stress met behulp van beeldsensoren als een van de kritieke stappen beschouwd. Wanneer verschillende spanningen samenvallen, kan de intensiteit van de ene stress het effect van de andere overrulen, afhankelijk van de combinatie, intensiteit en duur van de spanningen. Zo kunnen de stresseffecten oplopen, of kunnen tegengestelde reacties elkaar (gedeeltelijk) opheffen, wat uiteindelijk resulteert in positieve of negatieve effecten op planten. Het protocol dat in deze studie werd geselecteerd, was gebaseerd op eerdere ervaringen om ervoor te zorgen dat voldoende stressniveaus werden toegepast. Zo werd de toepassing van de droogtestress aangepast tot een gematigd niveau, aangezien in een eerder experiment de respons niet verschilde van controlebehandelingen in een vroeg stadium van stress op basis van chlorofylfluorescentiebeeldvorming. Dit komt door het optreden van fotorespiratie die fungeert als een alternatieve put voor elektronen in het thylakoïde membraan en een beschermend mechanisme voor het fotosysteem II^44,45. Onder de gecombineerde stressrespons kan blootstelling van planten aan een milde primaire stressor de tolerantie voor een volgende stressor vergroten, wat een gunstig of nadelig effect kan hebben⁴⁶. In deze studie werd een sterkere respons waargenomen onder gecombineerde stress in vergelijking met individuele droogtestress. Door andere fysiologische reacties te onderzoeken, toonden de resultaten een toename van ΔT (deltaT) onder droogte als huidmondjes dichtbij om overtollig waterverlies te voorkomen. Daarentegen werd de omgekeerde respons waargenomen onder hittestress, waarbij ΔT lager was in vergelijking met de controlegroep die de opening van huidmondjes weerspiegelde om de bladkoeling te verbeteren in overeenstemming met de bevindingen bij tarwe onder gecombineerde hitte- en droogtestress²⁰. Tijdens wateroverlast was de toename van ΔT als gevolg van stomatale sluiting het gevolg van zuurstoftekort in de bodem en verstoring van de homeostase van het wortelwater, waardoor de transpiratiestroom werd verlaagd met een toename van de ABA, een sleutelhormoon bij waterstressreacties⁴⁷.

In plantstressstudies is de duur van stress en de daaropvolgende herstelbehandelingen recht evenredig met de stressintensiteit. Matige droogtestress, zoals het handhaven van de bodemvochtigheid op 20% veldcapaciteit (FC), veroorzaakt bijvoorbeeld omkeerbare fenotypische veranderingen die zich doorgaans herstellen na een enkele dag herirrigatie. Daarentegen leiden ernstige stressomstandigheden zoals wateroverlast tot uitgebreide fenotypische schade, waardoor een langere herstelperiode nodig is. Hoewel het standaardiseren van de behandelingsduur ideaal is, moet bij het experimentele ontwerp rekening worden gehouden met de inherente variabiliteit in stressintensiteiten.

De tweede cruciale stap is het selecteren van een geschikt protocol en het optimaliseren van de instellingen voor elke sensor. Chlorofylfluorescentie is een krachtig hulpmiddel bij het bepalen van de prestaties van fotosynthetische apparaten onder stress⁴⁸. Afhankelijk van de onderzoeksvraag en de experimentele opzet kunnen verschillende meetprotocollen voor chlorofylfluorescentie worden geselecteerd, met aan licht of donker aangepaste planten⁴⁹. In deze studie maakt het geselecteerde protocol (korte lichtrespons) de bepaling mogelijk van verschillende eigenschappen, waaronder F_v'/F_m', φ_PSII en qL, die de fotosyntheseprestaties onder verschillende omstandigheden aangeven⁵⁰. Eerdere studies toonden aan dat het gebruikte protocol bij high-throughput fenotypering effectief is bij het onderzoeken van de fotosynthese-efficiëntie van planten onder verschillende toepassingen van stressbehandelingen en het onderscheiden van gezonde en gestreste planten^14,20. Op basis van de experimentele opzet is het zeer kritisch om rekening te houden met de duur van het geselecteerde protocol bij het meten in een systeem met een hoge doorvoer en een hoge plantenpopulatie. Daarom werd de chlorofylfluorescentiemeting op aan licht aangepaste planten met behulp van een kortetermijnprotocol geselecteerd om reacties onder verschillende behandelingen te onderscheiden. Interacties tussen genotype en omgeving kunnen veel fenotypische eigenschappen beïnvloeden, wat van cruciaal belang is tijdens de meting¹². Het is essentieel om te bedenken dat de duur van de meting in korte tijd moet worden voltooid om het dagelijkse effect op fotosynthesebeperkingen te minimaliseren⁵¹.

Thermische IR-beeldvorming werd gebruikt om de temperatuur van het bladerdak te bepalen en de huidmondjesregulatie onder verschillende behandelingen te begrijpen⁵². Het is vermeldenswaard dat technologische optimalisatie werd gebruikt waarbij de verwarmingsmuur zich aan de andere kant van de camera bevond en de temperatuur van de muur dynamisch werd geregeld en programmeerbaar. Het aanpassen van de achtergrondverwarmde wand met geïntegreerde omgevingssensoren is dus noodzakelijk om planten van de achtergrond correct te selecteren door het contrast van de achtergrondtemperatuur te verhogen ten opzichte van de temperatuur van het afgebeelde object.

Hoewel beeldanalyse geautomatiseerd is, is het aanpassen van RGB-drempelindexen nog steeds nodig om een goed binair masker in RGB-beeldvorming te verkrijgen om planten nauwkeurig te selecteren⁵³. Bovendien is het kiezen van meerdere invalshoeken belangrijk voor het correct schatten van kwantitatieve parameters, waaronder digitale biomassa en groeisnelheid. In deze studie werden drie hoeken (0°, 120° en 240°) op het RGB-zijaanzicht geselecteerd en gemiddeld om het plantvolume en de relatieve groeisnelheid nauwkeurig te berekenen.

Afhankelijk van het spectrale bereik kunnen veel fysiologische kenmerken worden onderzocht met behulp van hyperspectrale beeldvorming⁵⁴. Het is noodzakelijk om te bepalen welke van de reflectie-indices de nodige informatie geeft en de reactie van planten onder verschillende omstandigheden laat zien¹⁴. Er is veel vraag naar bij het screenen van tolerante variëteiten en plantfenotypering om de correlatie tussen de hyperspectrale indices en andere fysiologische kenmerken te bepalen⁵⁵. In deze studie vertoonden planten die wateroverlast ondergingen een uitgesproken respons in het chlorofylgehalte en de fotosynthese-efficiëntie van de VNIR-beeldvorming. Bovendien werden verschillende reacties waargenomen in de waterindex berekend op basis van SWIR-beeldvorming onder warmtebehandelingen en wateroverlast als gevolg van verschillende huidmondjesregulatie en watergehalte in de bladeren.

Deze bevindingen benadrukken dus het nut van een dergelijke aanpak na het optimaliseren van de instellingen en het potentieel van het gebruik van meerdere sensoren om stresskenmerken te vinden die relevant zijn voor klimaattolerantie. Het beoordelen van de dynamiek van de reacties met behulp van meerdere beeldsensoren kan worden gebruikt als een van de krachtige hulpmiddelen bij het verbeteren van fokprogramma's.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.1” CMOS Sensor with RGB camera	PSI, Drásov, Czech Republic	https://psi.cz/	De sensor levert een resolutie van 4112 × 4168 pixels voor zijwaartse weergave en 2560 × 1920 pixels voor bovenweergave. De sensor is uiterst gevoelig en is een echte CCD-vervanger van megapixels en produceert scherpe, laag-ruisbeelden
FluorCam	PSI, Drásov, Czech Republic	FC1300/8080-15	Pulse amplitude gemoduleerde (PAM) chlorofylfluoromete
Fluorcam 10 software	PSI, Drásov, Czech Republic	Version 1.0.0.18106	Voor visualisatie en analyse van chlorofylfluorespiegelbeelden
GigE PSI RGB – 12.36 Megapixels Camera	PSI, Drásov, Czech Republic	https://psi.cz/	Voor de projecties van de zijwaartse weergave werd de lijnscanmodus gebruikt met een resolutie van 4112 px/lijn, 200 lijnen per seconde. Het beeldgebied van de zijwaartse weergave was 1205 × 1005 mm (hoogte × breedte), terwijl het beeldgebied van de bovenweergave 800 × 800 mm was.
Hyperspectral Analyzer software	PSI, Drásov, Czech Republic	Version 1.0.0.14	Voor visualisatie en analyse van hyperspectrale beelden
Hyperspectral camera HC-900 Series	PSI, Drásov, Czech Republic	https://hyperspec.org/products/	Zichtbare dicht bij infrarood (VNIR) camera 380-900 nm met een spectrale resolutie van 0,8 nm FWHM
Hyperspectral camera SWIR1700	PSI, Drásov, Czech Republic	https://hyperspec.org/products/	Korte golflengte infraroodcamera (SWIR) camera 900 - 1700 nm met een spectrale resolutie van 2 nm FWHM
InfraTec thermische camera (VarioCam HEAD 820(800))	Flir,  Verenigde Staten	https://www.infratec.eu/thermography/infrared-camera/variocam-hd-head-800/	Resolutie van 1024 × 768 pixels, thermische gevoeligheid van < 20 mK en thermische emissiviteitswaarde standaard ingesteld op 0,95.  met een scansnelheid van 30 Hz en elke lijn bestaande uit 768 pixels. Het beeldgebied was 1205 × 1005 mm (hoogte × breedte).
LED paneel	PSI, Drásov, Czech Republic	https://led-growing-lights.com/products/	Uitgerust met 4 × 240 rood-oranje (618 nm), 120 koelwitte LEDs (6500 K) en 240 verre rood LEDs (735 nm) gelijkmatig verdeeld over een beeldoppervlak van 80 × 80 cm
Licht-, temperatuur- en relatieve luchtvochtigheidssensoren	PSI, Drásov, Czech Republic	https://psi.cz/	Sensoren gebruikt om gecontroleerde omstandigheden in de kas te bewaken
MEGASTOP Blue mats	Friedola	75831	Om de bodemoppervlakte te bedekken
Morphoanalyzer software	PSI, Drásov, Czech Republic	Version 1.0.9.8	Voor visualisatie en analyse van RGB-beelden en kleursegmentatieanalyse
PlantScreen Data Analyzer software (Version 3.3.17.0)	PSI, Drásov, Czech Republic	https://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/	Om de gegevens van alle beeldsensoren te visualiseren en te analyseren,  bewatering-wegweeg-eenheid en omgevingsomstandigheden in de kas
PlantScreen Modulair systeem	PSI, Drásov, Czech Republic	https://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/	Type fenotypering platform
Plantscreen Scheduler software	PSI, Drásov, Czech Republic	Version 2.6.8368.25987	Om het experiment te plannen en het meetprotocol in te stellen
SpectraPen MINI	PSI, Drásov, Czech Republic	https://handheld.psi.cz/products/spectrapen-mini/#details	Lichtmeter om het lichtniveau op luifelniveau aan te passen
TOMI-2 hoge resolutie camera	PSI, Drásov, Czech Republic	https://fluorcams.psi.cz/products/handy-fluorcam/	Resolutie van 1360 × 1024 pixels, framesnelheid 20 fps en 16-bits diepte) met een 7-positiefilterwiel is gemonteerd op een robotarm gepositioneerd in het midden van het multi-kleurig LED-lichtpaneel met afmetingen van 1326 x 1586 mm.
Walk-in FytoScope groeikamerraam	PSI, Drásov, Czech Republic	https://growth-chambers.com/products/walk-in-fytoscope-fs-wi/	Type kamers gebruikt om de plant te laten groeien