Methodenartikel

Snelle kwantificering van geoxideerde en gereduceerde vormen van glutathion met behulp van orthoftalaldehyde in gekweekte zoogdiercellen in vitro

DOI:

10.3791/66267

⸱

28 juni 2024

 ,  ,  ,  , 
1School of Health and Life Sciences, Teesside University, 2Institute of Biochemical Chemistry, Biophysics, and Bioengineering, Heriot-Watt University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantificering van zowel geoxideerde als gereduceerde vormen van glutathion (respectievelijk GSSG en GSH) is bereikt door het gebruik van orthoftalaldehyde (OPA). OPA wordt sterk fluorescerend zodra het is geconjugeerd met GSH, maar kan GSSG niet conjugeren totdat het is verminderd. Hier beschrijven we een multiparametrische test om beide te kwantificeren met behulp van eiwitkwantificering voor normalisatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glutathion wordt al lang beschouwd als een belangrijke biomarker voor het bepalen van de antioxidantrespons van de cel. Daarom is het een primaire marker voor studies naar reactieve zuurstofsoorten. De methode maakt gebruik van orthoftalaldehyde (OPA) om de cellulaire concentratie van glutathion(en) te kwantificeren. OPA conjugeert met gereduceerd glutathion (GSH) via sulfhydrylbinding om vervolgens een isoindool te vormen, wat resulteert in een sterk fluorescerend conjugaat. Om een nauwkeurig resultaat van zowel geoxideerd glutathion (GSSG) als GSH te bereiken, is een combinatie van maskeermiddelen en reductiemiddelen, die in dit protocol zijn geïmplementeerd, vereist. Behandelingen kunnen ook de cellulaire levensvatbaarheid beïnvloeden. Daarom wordt normalisatie via eiwittest gepresenteerd in deze multiparametrische test. De test toont een pseudo-lineair detectiebereik van 0,234 - 30 μM (R2=0,9932±0,007 (N=12)) specifiek voor GSH. De voorgestelde test maakt ook de bepaling van geoxideerd glutathion mogelijk met de toevoeging van het maskeringsmiddel N-ethylmaleimide om gereduceerd glutathion te binden, en het reductiemiddel tris(2-carboxyethyl) fosfine wordt geïntroduceerd om de disulfidebinding in GSSG te splitsen om twee moleculen GSH te produceren. De test wordt gebruikt in combinatie met een gevalideerde bicinchoninezuurtest voor eiwitkwantificering en een adenylaatkinasetest voor de beoordeling van cytotoxiciteit.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) zijn een primaire inductor van oxidatieve stress; oxidatieve stress is goed ingeburgerd bij het genereren van DNA-mutaties, cellulaire veroudering/dood, verschillende vormen van kanker, diabetes, neurologische aandoeningen (zoals Parkinson en Alzheimer) en verschillende andere levensslopende aandoeningen 1,2,3,4,5. Een belangrijke verdediging tegen ROS zijn thiolische, niet-enzymatische antioxidanten, die in staat zijn oxidatiemiddelen of radicalen te verminderen door als protondonoren te fungeren 6,7. Glutathion (GSH) en cysteïne zijn de twee meest voorkomende thiolen die bij zoogdieren worden aangetroffen8, terwijl er verschillende andere thiolen met een laag molecuulgewicht bestaan (zoals ergothioneïne), GSH en cysteïne zijn de meest gemeten niet-enzymatische antioxidanten die in de literatuurworden aangetroffen 9,10,11 en zijn het meest relevant voor de bestrijding van ROS 8,12,13,14.

Wanneer GSH wordt gebruikt als antioxidant, worden twee moleculen GSH covalent aan elkaar gekoppeld via een disulfidebinding om glutathiondisulfide (GSSG) te maken. Uitputting van GSH wordt vaak gebruikt als indicator van oxidatieve stress15,16. Deze beoordeling kan ook worden gecombineerd met de detectie van GSSG, hoewel de toename van GSSG in cellen vaak wordt beperkt door actieve exportprocessen, aangezien GSSG relatief reactief kan zijn in cellen, wat leidt tot de vorming van disulfidebindingen met andere eiwitthiolen16.

Traditionele methoden voor het meten van GSH en GSSG zijn geen eenvoudige processen en vereisen tal van stappen, waaronder cellulaire extractie met behulp van lytische reagentia17,18. Het hier beschreven protocol vereenvoudigt deze methoden en maakt de nauwkeurige meting van niet-enzymatische thiolen en normalisatie mogelijk met behulp van het cellulaire eiwitgehalte of de afgifte van adenylaatkinase. Bovendien is het mogelijk om de cellulaire levensvatbaarheid te meten voorafgaand aan GSH/GSSG-extractie. Verschillende methoden hebben eerder geprobeerd om gereduceerde en geoxideerde niet-enzymatische thiolen efficiënt te richten en te kwantificeren; methoden, waaronder het gebruik van HPLC 19,20,21, plaattest (biochemisch)22,23,24,25, en waarbij gebruik wordt gemaakt van gangbare reagentia voor thiolconjugatie, zoals 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoëzuur) (DTNB/Ellman's reagens)19, monochloorbimane (mBCI)26,27,28. Verschillende bedrijven hebben ook eigen kits gemaakt voor de detectie van glutathion; Ze publiceren echter geen onverenigbaarheden van reagens, wat problemen oplevert die afhankelijk zijn van de gebruikte behandelingen29.

Dit protocol schetst een multiparametrische test die verminderde thiolen (zoals GSH) detecteert via orthoftalaldehyde (OPA) conjugatie om een fluorescerend signaal te produceren dat detecteerbaar is bij respectievelijk 340/450 Ex/Em. Deze test vergemakkelijkt de detectie van zowel GSH als GSSG tegelijkertijd (in plaat), door het gebruik van maskeringsmiddelen (N-ethylmaleimide) en GSSG-reductiemiddelen (tris(2-carboxyethyl) fosfine). Dit multi-biomarkerprotocol biedt ook de mogelijkheid om tijdens de cellulaire lyseringsfase eiwitten te kwantificeren via een bicinchoninezuurtest voor de normalisatie van monsters na voltooiing van de eindmeting of via een adenylaatkinase-test van de celmedia. Deze test kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende reagentia die in de meeste laboratoria beschikbaar zijn en vereist slechts een paar extra ongebruikelijke chemicaliën om uit te voeren. Het proces is eenvoudig, toegankelijk en kan zonder moeizame fasen in minder dan 2 uur worden uitgevoerd.

In dit protocol werden verschillende nanomaterialen gekozen waarvan eerder was aangetoond dat ze ROS induceerden of waarvan werd vermoed dat ze oxidatieve stress induceerden30,31. Een concentratiebereik werd onderzocht om de effecten van blootstelling van deze nanomaterialen op verschillende cellijnen en de effectiviteit van de test bij het kwantificeren van antioxidantthiolen te zien.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Het volgende protocol is ontworpen met de capaciteit om te worden gebruikt in combinatie met een bicinchoninezuur (BCA) eiwittest en een adenylaatkinase (AK) test om monsters te normaliseren naar behandelingen. Zorg ervoor dat de bediener de juiste kleding en de nodige veiligheidsuitrusting draagt, zoals een Howie-laboratoriumjas, nitrilhandschoenen en een veiligheidsbril van klasse I, tijdens de voorbereiding en het gebruik van materialen. Het protocol is opgedeeld in verschillende fasen.

1. Voorbereidingen voor voorraad en werkoplossingen

  1. Bereid voorraadoplossingen van 100 mM GSH standaard in 1 mM HCl (bereid uit 37% HCl in dubbel gedestilleerd water (ddH2O)).
    OPMERKING: Als u verdunt met een sterk geconcentreerd zuur, zoals 37% HCl, zorg dan voor het juiste proces van het toevoegen van zuur aan water in een zuurkast van klasse I.
  2. Bereid een voorraad van 22,35 mM OPA in absolute ethanol voor. Voer deze stap uit in een zuurkast van klasse I. Bereid 25 mM N-ethylmaleimide (NEM) voor in ddH2O. Voer deze stap uit in een zuurkast van klasse I.
    OPMERKING: Deze drie oplossingen kunnen maximaal 3 maanden bij -20 °C worden bewaard.
  3. Bereid 0,01 M Tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP) voor tot een totaal volume van 500 μl, nodig voor 100 putjes. Bereid 100 μL 1 mM GSH-standaard, verdund uit 100 mM voorraad met ddH2O.
  4. Gebruik immunoprecipitatie (IP) lysisbuffer of de volgende formulering: 394 mg Tris-HCl (eindconcentratie 25 mM), 877 mg NaCl (eindconcentratie 150 mM), 29 mg EDTA (eindconcentratie 1 mM), ofwel 1 ml 100% NP-40 of IGEPAL CA-630 (eindconcentratie van 1% V/V), 5 ml glycerol (eindconcentratie 5% V/V), 84 ml ddH2O. Meng de componenten door voorzichtig te roeren en stel de pH in op 7,4. Decanteren in een maatkolf van 100 ml en voeg het resterende volume ddH2O toe om een eindvolume van 100 ml te bereiken. Steriel filtreren door een filter van 0,22 μm en maximaal 6 maanden bewaren bij 2-8 °C.
    OPMERKING: Lyseeroplossingen werken als een contaminant/interferent in deze test; Daarom zijn de bovenstaande formuleringen gespecificeerd.
  5. Bereid 1 L 0,1 M fosfaatgebufferde zoutoplossing aangevuld met ethyleendiaminetetraazijnzuur (PBS-EDTA) bij 3 verschillende pH-waarden, namelijk 7,2, 8,5 en 9,0. Gebruik een in de handel verkrijgbare 0,1 M PBS-buffer aangevuld met 1 mM EDTA (292,24 mg/L) of de volgende 10x (1 L) formulering: 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, 800 ml ddH2O. Voeg toe en meng; Vul bij tot 1 L. Autoclaaf de oplossing voor steriliteit en bewaar deze 12 maanden bij kamertemperatuur. Maak van de 10x voorraadoplossing een werkende oplossing van PBS en vul deze aan met EDTA (concentratie zoals eerder vermeld).
    OPMERKING: pH is van cruciaal belang; zorg ervoor dat de pH nauwkeurig is voordat u met het protocol begint.
  6. Voer een 1:2 seriële verdunning uit van 1 mM GSH met behulp van ddH2O (1 mM, 500 μM, 250 μM, 125 μM, 62,5 μM, 31,25 μM, 15,625 μM en 7,8125 μM). Voeg 10 μL van elke concentratie toe aan standaardputjes (uitgevoerd in tweevoud). Monsters worden verder verdund in lysisbuffer; daarom zullen de concentraties daarna 1/5e van hun oorspronkelijke concentratie zijn (200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625 μM).
    OPMERKING: De uiteindelijke concentraties voor kalibratie zijn 30 μm, 15 μm, 7,5 μm, 3,75 μm, 1,875 μm, 937,5 nm, 468,8 nm en 234,4 nm.

2. Voorbereiding van de test

OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van menselijke cellijnen HepG2, A549 en J774, die commercieel zijn gekocht bij ATCC. Deze cellijnen werden gebruikt volgens de goedgekeurde richtlijnen die zijn uiteengezet in de dier- en weefselkweekwetten en -voorschriften van de universiteit.

  1. 24 uur vóór het begin van de analyse, zaadcellen in concentraties vermeld in tabel 1; Afhankelijk van de cellijn/het type en de gebruikte behandeling, past u echter de dichtheid indien nodig aan. Kweekcellen in volledig groeimedium (Eagles modified essentials medium (EMEM) met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum (HIFS), 1% Penstrep (10.000 E/ml penicilline/ 10 mg/ml streptomycine) en 1% niet-essentiële aminozuren.
  2. Zaadcellen met behulp van conventionele celzaaimethoden32. Zaadcellen in volledig zwarte platen als ze niet met behulp van post-assay microscopie gebruiken. Beoordeel de cellen in de T75-kolf vóór gebruik op samenvloeiing en algemene gezondheid via microscopie.
  3. In een schone, steriele, biologische veiligheidskast van klasse II en volgens een strikte aseptische techniek, gooit u de celmedia weg, wast u de cellen voorzichtig met ~15 ml steriele PBS op kamertemperatuur (RT) en gooit u ze weg.
  4. Voeg 5 ml steriel 1x trypsine toe aan de celkolf, schud voorzichtig om ervoor te zorgen dat de celmonolaag bedekt is en plaats deze gedurende 5 minuten in een incubator bij 37 °C om de celloslating te vergemakkelijken.
  5. Stop de trypsinisatie door toevoeging van groeimedium met door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum (10%), ongeveer 10 ml.
  6. Breng de cellen over in een centrifugebuis van 50 ml en pellet op 200 x g gedurende 5 minuten. Gooi het medium weg en vervang het door 5 ml van hetzelfde medium. Resuspendeer de cellen in de buis totdat ze homogeen zijn en er geen klontering meer kan worden waargenomen.
  7. Verwijder 20 μL celsuspensie en plaats deze in een hemocytometer om te tellen. Zodra het aantal benodigde cellen is berekend, voert u een verdunning uit om een oplossing met de juiste celdichtheid te maken.
  8. Pipetmedia met cellen in platen met 96 putjes (capaciteit van 350 μl), met een maximaal volume van 200 μl per putje. Plaats de cellen in een incubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur om zich aan het plaatoppervlak te hechten.
  9. Om zowel het totale glutathion als het GSSG te beoordelen, behandelt u monsters voor beide aandoeningen. Zaai en behandel 6 putjes om 2 sets GSH en GSSG te leveren met 3 technische herhalingen (figuur 1 toont de lay-out).
  10. Zorg ervoor dat alle reagentia op de juiste manier zijn bereid voordat met de test wordt begonnen; zorg ervoor dat alle buffercomponenten en reagentia op RT zijn voordat u begint met de bouw van buffers of het gebruik in de test, met uitzondering van pH 7.4 PBS (zonder EDTA), die tot gebruik op ijs/gekoeld moet worden bewaard.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de vorming van luchtbellen tot een minimum wordt beperkt om de gewenste reacties binnen de test mogelijk te maken en nauwkeurige kwantificering via de plaatlezer mogelijk te maken.

De lijn van de celZaaidichtheid (plaat met 96 putjes)
HepG210.000 cellen / put
A5495.000 cellen / put
J77410.000 cellen / put

Tabel 1: Voorgestelde zaaidichtheden voor gekozen cellijnen. Aangetoond zijn verschillende zaaidichtheden voor drie verschillende cellijnen die in de weergegeven gegevens worden gebruikt, met name A549, J774 en HepG2.

figure-protocol-1
Figuur 1: Voorgestelde lay-out voor het zaaien van platen met 96 putjes voor de gelijktijdige bepaling van totaal glutathion en glutathiondisulfide. Wells voor kalibratie en controles worden ook gedemonstreerd. Putten die niet worden gebruikt, worden weergegeven met een kruis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Behandeling van nanomaterialen

  1. Weeg nanomaterialen (met name ZnO, TiO2, CuO en Ag) in een μg-compatibele weegschaal. Voer een berekening uit om een beginconcentratie van 1 mg/ml per nanomateriaal te bereiken.
  2. Breng nanomateriaaloplossingen over naar een sonicator en sonicaat gedurende 16 minuten met behulp van een sonicatiebad (38 W) om een homogene oplossing te produceren. Maak een reeks verdunningen voor elk nanomateriaal bij 125, 62,5, 31,25, 15,625 μg/ml.
  3. Verwijder de cellen uit de couveuse en was ze lichtjes met RT PBS. Nadat u zich ervan hebt vergewist dat alle PBS is verwijderd, voegt u 100 μl behandelingen toe aan de plaat, met controles (kweekmedia zonder HIFS). Na het toepassen van de behandeling op de cellen, incuberen met de nanomaterialen in een incubator van 37°C (5% CO2) gedurende 4 uur; gebruik daarna het onderstaande protocol om GSH te kwantificeren: GSSG, eiwitconcentratie en AK-afgifte.

4. Protocol bij de bepaling

  1. Beoordeel na blootstelling aan de behandeling (Figuur 2A) de levensvatbaarheid via adenylaatkinase (AK)-activiteit (optioneel). Gebruik voor deze test een in de handel verkrijgbare kit volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Draai de platen in een centrifuge bij 200 x g gedurende 5 minuten om de pelletbehandeling en het celafval licht te verwijderen (Figuur 2B).
  3. Verwijder voorzichtig 20 μl media-supernatant uit elk monster en controleputje (zoals hierboven aangegeven) en pipet in een aangrenzende witte plaat met 96 putjes in hetzelfde lay-outformaat (Figuur 2C).
  4. Voeg 100 μL werkoplossing uit de AK-kit toe aan elk putje, bescherm de plaat tegen licht en laat 10 minuten bij kamertemperatuur ontwikkelen. Registreer luminescentie met behulp van een plaatlezer met 1000 telling/s.
  5. Voeg voor GSH-normen 40 μl totale glutathionbuffer toe aan elk putje (figuur 2D; optioneel, vereist voor kwantificering).
  6. Zuig de resterende media van de plaat op en was 3x met ijskoud 0,1 M PBS, pH 7,2, waarbij u elke wasbeurt weggooit (Figuur 2E), met uitzondering van de normen. Laat de laatste was op de plaat zitten totdat de GSH-kalibratie in de plaat is geladen.
  7. Voeg 10 μL van elke glutathionconcentratie en blanco (ddH2O) toe aan putjes in drievoud.
  8. Verwijder de laatste PBS-wasbeurt en voeg de mengsels toe aan elk putje zoals beschreven in tabel 2 voor de gewenste doelkwantificering (Figuur 2E). Bereken de vereiste volumes voordat u met deze stap begint als gevolg van tijdgevoelig verlies van activiteit met volledige buffers. Zorg ervoor dat deze reagensmengsels worden gemaakt voordat het analyseproces wordt gestart, maar laat ze niet langer dan 30 minuten staan voor gebruik.
  9. Plaats op een orbitale plaatschudder en laat de plaat gedurende 2 minuten 2 minuten op 300 RPM schudden (Figuur 2F).
  10. Haal uit de shaker en voeg 5 μL 0,01M TCEP-oplossing toe aan elk putje, met uitzondering van het NEM-controleputje. Plaats de plaat terug in de shaker en incubeer gedurende 10 minuten (Figuur 2F).
  11. Breng de plaat over naar de centrifuge en draai gedurende 5 minuten op 200 x g . Breng 25 μl over van elk monsterputje naar een andere plaat met 96 putjes (helder); Dit wordt gebruikt voor de eiwitconcentratie (zie stap 4.15 ; Figuur 2G). Draag geen normen of analysecontroles over.
  12. Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume voor elk putje 30 μL is; verwijder het volume uit de bedieningselementen en normen om aan deze vereiste te voldoen (Figuur 2H).
  13. Voeg 170 μL werkende OPA-oplossing toe aan elk putje, bescherm de plaat tegen licht en plaats deze gedurende 15 minuten op de shaker (Figuur 2I).
  14. Lees de fluorescentie af met behulp van een plaatlezer op Ex340/Em450 (Figuur 2J). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn tijdens de meetfase; Ze zullen een nadelige invloed hebben op zowel de reactie als de kwantificering via de plaatlezer.
  15. Om het eiwitgehalte van gelyseerde cellen te kwantificeren, gebruikt u een in de handel verkrijgbare BCA-testkit. Breng de monsters uit stap 4.12 over naar een nieuwe plaat met 96 putjes (helder) met een snelheid van 25 μl per putje.
  16. Gebruik een runderserumalbumine (BSA) standaard verdund in IP-lysisbuffer en voeg toe aan de plaat in drievoud van 25 μl per putje. De exacte concentraties zijn vastgelegd in het BCA-kitprotocol.
  17. Bereid een werkoplossing voor die bestaat uit een verhouding van 50:1 van de reagentia A en B uit de BCA-kit en voeg 200 μl toe aan elk putje met monster, standaard en controle. Bescherm de platen tegen licht en incubeer bij 37°C gedurende 30 minuten (Figuur 2K).
  18. Haal de monsters uit de incubator, laat ze 5 minuten bij kamertemperatuur in evenwicht komen en lees vervolgens de absorptie af via een plaatlezer bij 562 nm (figuur 2L).
Lysis-reagensmix met totale glutathionconcentratie
BestanddeelVolume
Lysis buffer50μL
Totaal volume / put50μL
Geoxideerde glutathionconcentratie lysis reagensmix
BestanddeelVolume
Lysis buffer49,5 μl
NEM (25mM)0,5 μl
Totaal volume / put50μL
GEBRUIK BEIDE OPLOSSINGEN BINNEN 30 MINUTEN NA SAMENSTELLING VAN HET MENGSEL
Onderdeel van de OPA-detectieoplossingVolume
OPA 3mg/ml5μL
PBS (pH 9,0)165μL
Totaal volume / put170μL

Tabel 2: Noodzakelijke hoeveelheden reagentia voor de uitvoering van het protocol. Benodigde volumes per putje voor de bepaling van het totale glutathion, glutathiondisulfide en het benodigde werkreagens. Zorg ervoor dat de vereiste volumes worden berekend en dat er een overschot wordt opgenomen om rekening te houden met volumeverlies door overdracht.

figure-protocol-2
Figuur 2: Schematische weergave van het protocol. (A) Eerste zaaiing, incubatie en behandeling van cellen. (B) Centrifugeren om media te scheiden van gesuspendeerde vaste stoffen. (C) Mediaoverdracht voor Adenylaatkinase-bepaling. (D) Toevoeging van glutathionconcentraties voor het kalibratiebereik. (E) Wasfasen en toevoeging van lyseerreagens. (F) Bufferadditie en tris(2-carboxyethyl)-fosfineadditie met schudstap. (G) Centrifugatie van gelyseerde cellen voor verwijdering van media voor eiwitanalyse. (H) Mediaverwijdering om het volume over de plaat gelijk te maken. (I) Toevoeging van orthoftalaldehyde werkoplossing met schudincubatie. (J) Meting van orthoftalaldehydefluorescentie via plaatlezer. (K) Incubatiestadia voor de bepaling van bicinchoninezuur voor de bepaling van eiwitten. (L) Meting van de eiwitconcentratie, waardoor normalisatie van glutathion: glutathiondisulfidewaarden mogelijk is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens dit protocol werden A549- en J774-cellijnen gezaaid met een dichtheid van respectievelijk 5.000 cellen/put en 10.000 cellen/put en gekweekt bij 37 °C in 5% CO2 gedurende 48 uur. De AK-analyse na behandeling met nanomaterialen is weergegeven in aanvullende tabel 1 en de eiwitconcentratie is weergegeven in aanvullende tabel 2.

Kalibratie grafiek
In figuur 3 worden drie kalibraties weergegeven met behulp van het vermelde concentratiebereik (0,234 - 30 μM eindconcentratie) van drie afzonderlijke platen van drie verschillende celtypen (hoewel dit geen invloed zou moeten hebben op de kalibratie) op drie verschillende, niet-opeenvolgende dagen. Hoewel er 3 monsters worden getoond, werd een N van 12 waargenomen en vertoonde vergelijkbare lineaire regressies met een gemiddelde R2-waarde van 0,9932 ± 0,007.

figure-results-1
Figuur 3: Glutathion kalibratie grafieken voor assay. Drie kalibratiegrafieken van afzonderlijke glutathionkalibratiebereiken in de plaat, elk uitgevoerd met een tussenpoos van een week; foutbalken ± SD (n=3, N=12) n=technische replicaten, N=Biologische replicaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voorbeeld resultaten
HepG2-, A549- en J774-cellen werden gebruikt bij de beoordeling van verschillende nanomaterialen waarvan wordt vermoed dat ze via oxidatieve stress veranderingen in cellulaire mechanismen veroorzaken. Er werd gebruik gemaakt van het beschreven detectie- en kwantificeringsprotocol.

De gegevens die werden ontvangen van de 3 metingen (AK, BCA en GSH/GSSG) werden als volgt behandeld. De AK- en BCA-test werd geïmplementeerd voor normalisatie; de AK-test, met behulp van de aanbevolen kit, geeft de snelste en eenvoudigste gegevens voor de hoeveelheid AK die in de celmedia vrijkomt. Een toename van AK-waarden wordt verwacht voor het verhogen van de celdood. Daarom is een -ve (Levend) en +ve (Dood) controle vereist. Dit maakt normalisatie op basis van percentage mogelijk.

De BCA-test is een langer proces, maar maakt het mogelijk om kwantificeerbare resultaten te verkrijgen via eiwitkwantificering (mg/ml). Dit vereist geen -ve- of +ve-controle zoals bij de AK, maar vereist nog steeds een algemene -ve-controle (onbehandelde cellen) om de normalisatie van waarden te kunnen bereiken.

In deze sectie met representatieve resultaten werd vastgesteld dat de behandeling (nanomaterialen) het potentieel had om interferentie met de AK-test te veroorzaken. Daarom werd alle normalisatie uitgevoerd met behulp van de BCA-gegevens. Daarom wordt informatie gepresenteerd als de concentratie van gedetecteerde soorten (GSH of GSH+GSSG (er wordt echter een aftrekking van de GSH-concentratie van de totale GSH+GSSG-concentratie uitgevoerd om de GSSG-concentratie te krijgen) per mg/ml eiwit (via BCA-test). Indien gewenst kan dit vervolgens worden omgezet in een verhouding om de verandering in GSH: GSSG van de gewenste behandeling te beoordelen.

Weergegeven in figuur 4 zijn de GSH: GSSG-ratiogegevens van drie verschillende cellijnen (A549, J774 en HepG2) verkregen met behulp van het OPA-protocol en genormaliseerd naar eiwitexpressie via BCA (μg/ml), verdere gegevens die aanvullende GSH- en GSSG-waarden specificeren, zijn te vinden in aanvullende figuur 1.

figure-results-2
Figuur 4: Glutathion: Glutathiondisulfideverhouding van het uitvoeren van de test. Getoond zijn de glutathion: glutathiondisulfideverhoudingen van 3 cellijnen, namelijk (A) A549, (B) J774 en (C) HepG2. Cellen werden gedurende 4 uur geïncubeerd met behandelingen (verschillende nanomaterialen in serumvrije media). Cellen werden verwerkt met behulp van dit protocol om veranderingen in glutathion en glutathiondisulfide te kwantificeren en genormaliseerd via eiwitkwantificering, foutbalken ± SE (n=3, N=3) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De plaat bevat ook een reeks bedieningselementen om ervoor te zorgen dat de test correct is uitgevoerd. NEM wordt als een afzonderlijk onderdeel toegevoegd om een gebrek aan interactie met OPA-detectiemedia aan te tonen. De kalibratiestandaard toont een lineaire toename van de GSH-concentratie, wat het effectieve vermogen van het OPA-detectiereagens aantoont om effectief te binden aan toenemende GSH-concentraties.

Opgemerkt moet worden dat deze test specifiek gericht is op vrije sulfhydrylgroepen die vaak worden aangetroffen in thiolen (zoals GSH, die gewoonlijk als antioxidanten worden beschouwd). Een mogelijke interactie is de binding van OPA aan eiwitthiolen, wat zou resulteren in onnauwkeurige gegevensverzameling. Daarom is de BCA-test een cruciale fase om gegevens te normaliseren naar eiwit en een nauwkeurige weerspiegeling van vrij GSH mogelijk te maken.

Aanvullende figuur 1: Cijfers die de verhouding glutathion, glutathiondisulfide en glutathion: glutathiondisulfide aantonen van 3 cellijnen, namelijk (A) A549, (B) J774 en (C) HepG2. Cellen werden gedurende 4 uur geïncubeerd met behandelingen (verschillende nanomaterialen in serumvrije media). Cellen werden verwerkt met behulp van dit protocol om veranderingen in glutathion en glutathiondisulfide te kwantificeren en genormaliseerd via eiwitkwantificering, foutbalken ± SE (n=3, N=3) Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Metadata van adenylaatkinasewaarden voor A549- en J774-cellen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Metadata van bicinchoninezuurwaarden met kalibratie voor A549-, J774- en HepG2-cellen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals gezegd, is de noodzaak om cellulaire redox te begrijpen, toestanden van oxidatieve stress te monitoren en de antioxidantrespons altijd cruciaal geweest bij het begrijpen en voorkomen van een groot aantal ziekten, zoals kanker en neurodegeneratie. Hier wordt een middel gedemonstreerd om het translationele landschap te verbeteren door de toegankelijkheid van nauwkeurige GSH te vergroten: GSSG-detectie met snelle, minimale voorbereiding.

Dit protocol demonstreert een multiparametrische sequentie van assays voor de bepaling van intracellulaire glutathion/thiolsoorten (gereduceerd en geoxideerd), met 2 manieren van normalisatie via BCA-eiwittest en/of AK-assay. Deze test kan ook worden aangepast om verschillende andere markers te detecteren via de eerste extractiestap van de mediator en kan worden vereenvoudigd op een manier die eenvoudigweg een geoxideerde/gereduceerde thiolverhouding oplevert met uitsluiting van het kalibratiebereik.

Bij het overwegen van de evaluatie van de analyten werden zowel mBCI als OPA onderzocht en vergeleken voor gebruik. Hoewel mBCl aanvankelijk een goed signaalpotentieel vertoonde, werden aanzienlijke beperkingen in het gebruik ontdekt. In de eerste plaats toont het gebruik van levende cellen het beste gebruik van mBCl aan; na cellyse bleek het signaal echter gedoofd te zijn en is het over het algemeen verminderd in een multiwell-formaat in vergelijking met OPA35. Een ander probleem is de meting van GSSG via mBCl, literatuur hierover is schaars, en door protocoloptimalisatie/exploratie werd nauwkeurige detectie van GSSG via mBCl niet bereikt.

We hebben aangetoond dat de OPA-test aanzienlijk betrouwbare kalibratiebereiken biedt, met een R2-gemiddelde van 0,9932 ± 0,007 (N=12) over een concentratiebereik van 0,234 - 30 μM GSH. Dit bereik is gekozen op basis van eerdere referentiebereiken die in de literatuur zijn gevonden35. Het is theoretisch mogelijk om glutathion buiten deze bereiken te detecteren, maar vereist een wijziging van de concentratie van reagentia, de incubatietijd en mogelijk de apparatuur die bij de detectie wordt gebruikt. Opgemerkt moet worden dat elke plaat zijn eigen standaardbereik vereist voor kwantificering; Het kleinste verschil in tijd tussen platen die op verschillende dagen worden uitgevoerd, kan een aanzienlijk effect hebben op de waarden die tijdens de meting worden verkregen.

Het verkrijgen van nauwkeurige en betrouwbare gegevens uit dit protocol is afhankelijk van een aantal cruciale stappen die strikt worden nageleefd. Bij het samenstellen van de verschillende buffers die in het protocol nodig zijn, is het van cruciaal belang dat de pH nauwkeurig is. Daarom mogen buffers die een pH van 9 vereisen, geen afwijking hebben van meer dan ± 0,1 van deze waarde. Dit komt door de mogelijkheid dat buffercomponenten in de verkeerde pH uit de oplossing neerslaan; Door dit protocol precies te volgen, wordt dit probleem voorkomen.

Volledige verwijdering van de behandeling en nauwkeurig wassen vóór het lyseren zijn ook van cruciaal belang om artefacten en onnauwkeurige gegevensverzameling tijdens de plaatleesfase te voorkomen. Als de cellen eenmaal zijn gelyseerd (stap 4.8), is verwijdering van de behandeling niet mogelijk en kan de plaat niet meer worden gered. Omdat de volumes buffers/reagentia die in het hele protocol worden toegevoegd, variëren tussen monsters en standaarden, is het van cruciaal belang dat de gebruiker op de hoogte is van de verschillende volumes, in stap 4.12 en 4.13. De analyse-operator wordt ook op de hoogte gebracht van deze gevarieerde volumes en geïnstrueerd om ervoor te zorgen dat alle volumes hetzelfde zijn, zodat een nauwkeurige meting kan worden bereikt. Aangezien de volumes tussen de monsters en de standaarden niet zichtbaar significant zijn, kan het een gemakkelijke fout zijn om te maken met betrekking tot het hebben van een teveel aan oplossing in de monsterput.

Er zijn beperkingen aan dit protocol die afhankelijk zijn van cruciale stappen, die van cruciaal belang zijn voor het verkrijgen van nauwkeurige en betrouwbare gegevens. De gebruikers die deze test uitvoeren, moeten over een redelijk niveau van laboratoriumvaardigheden beschikken om ongewenste problemen, zoals luchtbelvorming, te voorkomen. Bellenvorming heeft een drastische impact op zowel het vermogen om reacties binnen de microplaat te laten plaatsvinden als de meting van fluorescentie. Het lyseermiddel dat in dit protocol wordt gebruikt, bevat een wasmiddel, wat een probleem is voor een beginnende onderzoeker die moeite heeft om bellenvorming te voorkomen. Onmiddellijk centrifugeren kan deze fout verhelpen. Het protocol is mogelijk ook beperkt met betrekking tot het celtype; cellijnen A549, J774 en HepG2 werden gebruikt om zowel gegevens voor dit protocol te optimaliseren als te produceren. Andere cellijnen kunnen verschillende seeding-dichtheden en optimalisatie van het protocol vereisen om nauwkeurige gegevens te krijgen.

Dit protocol biedt tal van voordelen ten opzichte van verschillende bestaande testen. Hoewel de detectie van thiolen met behulp van ftalaldehyde geen nieuw concept is, biedt gebruik in een gecombineerd testformaat zoals dit, in een microplaat, met beperkte benodigde materialen en apparatuur, een groot potentieel voor alle laboratoria om toegang te krijgen tot dit protocol. De meeste Thiol/GSH-kits van commerciële leveranciers maken de samenstelling van hun reagentia niet bekend. Daarom kan het moeilijk zijn om de kans op onverenigbaarheden/interferentie te voorzien. Hier presenteren we elk onderdeel van alle gebruikte reagentia om dat potentieel te beperken.

Dit protocol wordt ook vrij snel uitgevoerd na voltooiing van de eerste behandelingsperiode. Rekening houdend met de gebruikersverwerking tussen de incubatiefasen, kan het thiolkwantificeringsaspect van dit protocol in minder dan 1 uur worden uitgevoerd. Monsters worden tegelijkertijd gelyseerd en gebonden om auto-oxidatie van monsters te voorkomen, wat optimaal is voor deze reactiesoorten. Hoewel niet gespecificeerd in het protocol, kunnen monsters technisch gezien in een plaat worden gelyseerd en verzegeld, waardoor ze kunnen worden ingevroren voor toekomstige analyse. Deze wijziging van het protocol is echter niet onderzocht.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gefinancierd door de Europese projecten GRACIOUS (GA760840) en SUNSHINE (GA952924). De auteurs willen ook hun erkentelijkheid betuigen voor de inspanningen van al diegenen die op de een of andere manier hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van dit protocol.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22µm filter (optioneel-Voor lysisbuffer)Fisher scientific12561259
100mL volumetrische kolfFisher scientific15290866
1L Volumetrische kolf Fisher scientific15230876
250mL beker (optioneel-Voor lysisbuffer)Fisher scientific15409083
8-kanaals micropipet (20-200µL)SLSFA10011D2
8-kanaals micropipet (2-20µL)SLSB2B06492
96 well platen - zwart met heldere bodem, TC behandeldFisher scientific10000631Voorkeursplaat voor zaaien en fluoresceren, gebruik TC behandelde heldere als deze niet beschikbaar zijn
96 well platen - helder (TC behandeld en onbehandeld)Fisher scientific10141161Als zwarte platen met heldere bodem niet beschikbaar/geschikt zijn, gebruik TC behandelde heldere
96 well platen - wit, niet TC behandeldFisher scientific11457009
A549 (longcarcinoom) cellijnATCCCCL-185
Absolute ethanolMerck (Sigma-Aldrich)1.08543
AluminiumfolieFisher scientific11779408Voor het beschermen van platen tegen licht
BCA Assay KitThermo23225
Benchtop Centrifuge (met 96 platen rotor)Eppendorf5804
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Merck (Sigma-Aldrich)E9884
Glutathione (GSH)Merck (Sigma-Aldrich)G6013
Glutathione disulfide (GSSG)Merck (Sigma-Aldrich)G4501
GlycerolMerck (Sigma-Aldrich)G5516
HCl, 37%Merck (Sigma-Aldrich)258148Verdun tot 1mM voor GSH stock, pH aanpassing ook
HepG2 (Hepatocarcinoom) cellijnATCCHB-8065
IGEPAL CA-630 Merck (Sigma-Aldrich)18896Gebruik ofwel IGEPAL CA-630 of NP-40 voor oplossing, niet beide
IP lysisbuffer Fisher scientific11825135
J774 (monocyt, macrofaag) cellijnATCCTIB-67
KClMerck (Sigma-Aldrich)P3911
KH2PO4 Merck (Sigma-Aldrich)P0662
Micropipet (20-200µL)SLSB2B06482
Micropipet (2-20µL)SLSB2B06478
Microplaat shakerVWR444-0041
Na2HPO4Merck (Sigma-Aldrich)S9763
NaClMerck (Sigma-Aldrich)S9888
NaOH, 10MMerck (Sigma-Aldrich)72068Alleen voor pH aanpassing
N-Ethylmaleimide (NEM) Merck (Sigma-Aldrich)E3876
NP-40Merck (Sigma-Aldrich)492016Gebruik ofwel IGEPAL CA-630 of NP-40 voor oplossing, niet beide. NP-40 alternatief gesuggereerd
Ortho -Ftalaldehyde (OPA)Merck (Sigma-Aldrich)P1378
PBS 0.1MMerck (Sigma-Aldrich)P2272PBS kan kant-en-klaar worden verkregen of zelf gemaakt worden, zie notities
Plate reader (met fluorescentiecapaciteit)TecanSPARK
Roerbar (optioneel-Voor lysisbuffer)Fisher scientific16265731
Toxilight bioassay kit (AK assay)LonzaLT17-217
Tris(2-carboxyethyl)fosfine hydrochloride (TCEP) 0.5M  in H2OAlfa AesarH51864Kan ook worden gekocht in gekristalliseerde en geschorte vorm
TRIS-HClMerck (Sigma-Aldrich)93363
X100 fosfatase en protease cocktail Fisher scientific10025743

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barnham, K. J., Masters, C. L., Bush, A. I. Neurodegenerative diseases and oxidative stress. Nat Rev Drug Discov. 3 (3), 205-214 (2004).
  2. Arfin, S., et al. Oxidative stress in cancer cell metabolism. Antioxidants. 10 (5), 642(2021).
  3. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. The FASEB Journal. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  4. Ghezzi, P., Jaquet, V., Marcucci, F., Schmidt, H. H. H. W. The oxidative stress theory of disease: levels of evidence and epistemological aspects. Br J Pharmacol. 174 (12), 1784-1796 (2017).
  5. Bhattacharyya, A., Chattopadhyay, R., Mitra, S., Crowe, S. E. Oxidative stress: An essential factor in the pathogenesis of gastrointestinal mucosal diseases. Physiol Rev. 94 (2), 329-354 (2014).
  6. Yin, F., Sancheti, H., Cadenas, E. Mitochondrial thiols in the regulation of cell death pathways. Antioxi Redox Sig. 17 (12), 1714-1727 (2012).
  7. Balcerczyk, A., Bartosz, G. Thiols are main determinants of total antioxidant capacity of cellular homogenates. Free Rad Res. 37 (5), 537-541 (2003).
  8. McBean, G. J. Cysteine, glutathione, and thiol redox balance in astrocytes. Antioxidants. 6 (3), 62(2017).
  9. Nimse, S. B., Pal, D. Free radicals, natural antioxidants, and their reaction mechanisms. RSC Adv. 5 (35), 27986-28006 (2015).
  10. Nordberg, J., Arnér, E. S. J. Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system1. Free Rad Biol Med. 31 (11), 1287-1312 (2001).
  11. Pham-Huy, L. A., He, H., Pham-Huy, C. Free radicals, antioxidants in disease and health. Int J Biomed Sci. 4 (2), 89(2008).
  12. Harris, I. S., DeNicola, G. M. The complex interplay between antioxidants and ROS in cancer. Trend Cell Biol. 30 (6), 440-451 (2020).
  13. Traverso, N., et al. Role of glutathione in cancer progression and chemoresistance. Oxid Med Cell Longev. 2013, 972913(2013).
  14. Day, R. M., Suzuki, Y. J. Cell proliferation, reactive oxygen and cellular glutathione. Dose-Resp. 3 (3), 425-442 (2005).
  15. Aquilano, K., Baldelli, S., Ciriolo, M. R. Glutathione: new roles in redox signaling for an old antioxidant. Front Pharmacol. 5, 196(2014).
  16. Zitka, O., et al. Redox status expressed as GSH: GSSG ratio as a marker for oxidative stress in paediatric tumour patients. Onco Lett. 4 (6), 1247-1253 (2012).
  17. Childs, S., Haroune, N., Williams, L., Gronow, M. Determination of cellular glutathione: glutathione disulfide ratio in prostate cancer cells by high performance liquid chromatography with electrochemical detection. J Chrom A. 1437, 67-73 (2016).
  18. Giustarini, D., et al. glutathione disulfide, and S-glutathionylated proteins in cell cultures. Free Rad Biol Med. 89, 972-981 (2015).
  19. Özyürek, M., et al. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  20. Zhang, L., Lu, B., Lu, C., Lin, J. Determination of cysteine, homocysteine, cystine, and homocystine in biological fluids by HPLC using fluorosurfactant-capped gold nanoparticles as postcolumn colorimetric reagents. J Sep Sci. 37 (1-2), 30-36 (2014).
  21. Tsiasioti, A., Georgiadou, E., Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Development and validation of a direct HPLC method for the determination of salivary glutathione disulphide using a core shell column and post column derivatization with o-phthalaldehyde. J Chromat B. 1197, 123216(2022).
  22. Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. J Agri Food Chem. 53 (6), 1841-1856 (2005).
  23. Berker, K. I., Güçlü, K., Tor, İ, Demirata, B., Apak, R. Total antioxidant capacity assay using optimized ferricyanide/prussian blue method. Food Anal Meth. 3 (3), 154-168 (2010).
  24. Rahman, I., Kode, A., Biswas, S. K. Assay for quantitative determination of glutathione and glutathione disulfide levels using enzymatic recycling method. Nat Prot. 1 (6), 3159-3165 (2007).
  25. Kampa, M., et al. A new automated method for the determination of the Total Antioxidant Capacity (TAC) of human plasma, based on the crocin bleaching assay. BMC Clin Pathol. 2 (1), 3(2002).
  26. Fernández-Checa, J. C., Kaplowitz, N. The use of monochlorobimane to determine hepatic GSH levels and synthesis. Anal Biochem. 190 (2), 212-219 (1990).
  27. Nauen, R., Stumpf, N. Fluorometric microplate assay to measure glutathione S-transferase activity in insects and mites using monochlorobimane. Anal Biochem. 303 (2), 194-198 (2002).
  28. Stevenson, D., Wokosin, D., Girkin, J., Grant, M. H. Measurement of the intracellular distribution of reduced glutathione in cultured rat hepatocytes using monochlorobimane and confocal laser scanning microscopy. Toxicol in vitro. 16 (5), 609-619 (2002).
  29. McBeth, C., Stott-Marshall, R. J. Interference of reversible redox compounds in enzyme catalysed assays–Electrochemical limitations. Anal Biochem. 662, 114972(2023).
  30. Yu, Z., et al. Reactive oxygen species-related nanoparticle toxicity in the biomedical field. Nanoscale Res Lett. 15 (1), 115(2020).
  31. Boyles, M., et al. Development of a standard operating procedure for the DCFH2-DA acellular assessment of reactive oxygen species produced by nanomaterials. Toxicol Mech Meth. 32 (6), 439-452 (2022).
  32. Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Sci Meth Clin Res. , 151-172 (2017).
  33. Ma, Q. Role of nrf2 in oxidative stress and toxicity. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 53, 401-426 (2013).
  34. Calabrese, V., Cornelius, C., Dinkova-Kostova, A. T., Calabrese, E. J., Mattson, M. P. Cellular stress responses, the hormesis paradigm, and vitagenes: novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative disorders. Antioxid redox Signal. 13 (11), 1763-1811 (2010).
  35. Ishkaeva, R. A., Zoughaib, M., Laikov, A. V., Angelova, P. R., Abdullin, T. I. Probing cell redox state and glutathione-modulating factors using a monochlorobimane-based microplate assay. Antioxidants. 11 (2), 391(2022).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

GlutathionkwantificeringGeoxideerd GlutathionGereduceerd GlutathionOrtho fitaldehyde assayReactieve ZuurstofverbindingenProte nenormalisatieFluorescentiedetectieZoogdiercelkweekBicinchoninezuur assayCytotoxiciteitsbeoordeling

Gerelateerde artikelen