Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een naadloze kloneringsbenadering voor de vectorconstructie van de reproductieve en respiratoire syndroomexpressie van het varkensvirus

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66320

⸱

17 mei 2024

 ,  , 
1College of Life Sciences, China West Normal University, 2Sichuan Sports College, 3Pathology Department, Suining Central Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om de pVAX1-PRRSV-expressievector te verkrijgen door geschikte beperkingsplaatsen te introduceren aan het 3'-uiteinde van de inserts. We kunnen de vector lineariseren en DNA-fragmenten één voor één aan de vector verbinden door middel van homologe recombinatietechnologie.

Samenvatting

De constructie van genexpressievectoren is een belangrijk onderdeel van laboratoriumwerk in de experimentele biologie. Met technische ontwikkelingen zoals Gibson Assembly wordt vectorconstructie relatief eenvoudig en efficiënt. Wanneer het volledige genoom van het Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) echter niet gemakkelijk kan worden geamplificeerd door een enkele polymerasekettingreactie (PCR) van cDNA, of het moeilijk is om een genexpressievector van volledige lengte te verkrijgen door homologe recombinatie van meerdere inserts in vitro, slaagt de huidige Gibson Assembly-techniek er niet in dit doel te bereiken.

Daarom wilden we het PRRSV-genoom in verschillende fragmenten verdelen en geschikte restrictieplaatsen introduceren in de omgekeerde primer voor het verkrijgen van PCR-geamplificeerde fragmenten. Na het samenvoegen van het vorige DNA-fragment in de vector door middel van homologe recombinatietechnologie, verwierf de nieuwe vector de splitsingsplaats van het restrictie-enzym. We kunnen de vector dus lineariseren door gebruik te maken van de nieuw toegevoegde enzymsplitsingsplaats en het volgende DNA-fragment stroomafwaarts van het stroomopwaartse DNA-fragment te introduceren.

De geïntroduceerde splitsingsplaats van het restrictie-enzym aan het 3'-uiteinde van het stroomopwaartse DNA-fragment zal worden geëlimineerd en een nieuwe splitsingsplaats zal worden geïntroduceerd in het 3'-uiteinde van het stroomafwaartse DNA-fragment. Op deze manier kunnen we DNA-fragmenten één voor één aan de vector koppelen. Deze methode is van toepassing om de PRRSV-expressievector met succes te construeren en is een effectieve methode voor het samenvoegen van een groot aantal fragmenten tot de expressievector.

Inleiding

Als een essentiële techniek om op DNA gebaseerde experimentele instrumenten te construeren voor expressie in prokaryote en eukaryote cellen, is moleculair klonen een zeer belangrijk onderdeel van de experimentele biologie. Moleculair klonen omvat vier processen: het verkrijgen van insert-DNA, ligatie van de insert in de juiste vector, transformatie van de recombinante vector in Escherichia coli (E. coli) en identificatie van de positieve klonen1. Tot nu toe zijn er meerdere methoden toegepast om DNA-moleculen samen te voegen met behulp van restrictie-enzymen 2,3 en PCR-gemedieerde recombinatie 4,5,6. Homologe recombinatie, bekend als naadloze kloontechnologie, is de groep kloonmethoden die sequentie-onafhankelijke en littekenloze invoeging van een of meer DNA-fragmenten in een vector mogelijk maakt. Deze technologie omvat sequentie- en ligatie-onafhankelijk klonen (SLIC), Seamless Ligation Cloning Extract (SLiCE), In-Fusion en Gibson Assembly. Het maakt gebruik van een exonuclease om een streng van het inzetstuk af te breken en een vector om samenhangende uiteinden te genereren, en ofwel in vivo reparatie of in vitro recombinatie om het inzetstuk covalent aan de vector te verbinden door fosfodiësterbindingen te vormen. De mogelijkheid om een enkele wisselplaat in elke volgorde aan een vector te koppelen zonder littekens is zeer aantrekkelijk. Bovendien heeft de technologie de mogelijkheid om 5-10 fragmenten in een vooraf bepaalde volgorde samen te voegen zonder sequentiebeperkingen.

Als een van de vele recombinant-DNA-technieken is de Gibson Assembly-techniek, momenteel de meest effectieve kloonmethode 7,8, een robuuste en elegante op exonuclease gebaseerde methode om een of meerdere gelineariseerde DNA-fragmenten naadloos samen te stellen. De Gibson Assembly-reactie wordt uitgevoerd onder isotherme omstandigheden met behulp van een mengsel van drie enzymen, namelijk 5'-exonuclease, high-fidelity polymerase en een thermostabiel DNA-ligase. Enkelstrengs 3'-uitsteeksels gecreëerd door het 5'-3'-exonuclease dragen bij aan het gloeien van fragmenten die aan één uiteinde complementariteit delen. Het high-fidelity polymerase vult effectief de hiaten in de gegloeide enkelstrengs gebieden door dNTP's toe te voegen, en het thermostabiele DNA-ligase sluit de inkepingen af om gezamenlijke DNA-moleculen te vormen8. Daarom is deze technische methode veel gebruikt voor de constructie van genexpressievectoren.

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is een virale ziekte die leidt tot reproductieve stoornissen en respiratoire insufficiëntie bij varkens veroorzaakt door PRRSV op elke leeftijdvan 9 jaar. Het syndroom manifesteert zich als koorts, anorexia, longontsteking, lethargie, depressie en ademnood. Bovendien zijn bij sommige epidemieën klinische verschijnselen waargenomen, waaronder rood/blauwe verkleuring van de oren. Als lid van het arterivirus van de familie wordt PRRSV op grote schaal overgedragen naar varkensvleesproducerende landen door direct contact en uitwisseling van vloeistoffen, waaronder urine, colostrum en speeksel. Als gevolg van de verspreiding van PRRSV in de Verenigde Staten worden de totale economische verliezen van de varkensvleesindustrie geschat op ongeveer $ 664 miljoen per jaar, op basis van de fokschaal van 5.8 miljoen zeugen en 110 miljoen varkens10,11. Uit het rapport van de Inspectiedienst voor de Dier- en Plantgezondheid blijkt dat 49,8% van de niet-gevaccineerde varkens de aanwezigheid van PRRSV in serum12 vertoont en dat lage niveaus van PRRSV bij geïnfecteerde varkens worden uitgescheiden via speeksel, neusafscheidingen, urine en ontlasting13. Er zijn meerdere strategieën geïmplementeerd om de voortplanting van PRRSV te beheersen 14,15,16. Naast eliminatieprocedures om volledig virusnegatieve populaties te creëren of het verbeteren van de bioveiligheid en het beheer, is het toedienen van vaccins een effectief middel om PRRS te beheersen.

PRRSV is een omhuld, enkelstrengs, positief-sense RNA-virus met een lengte van ongeveer 15 kilobasen (kb). Het PRRSV-genoom bestaat uit ten minste 10 open leesframes (ORF's), een kort 5' niet-vertaald gebied (5' UTR) en een poly(A)-staart aan het eindpunt van 3' (Figuur 1A)17. Het genoom van een negatiefstrengs RNA-virus is niet-infectieus, terwijl het genoom van positiefstrengs RNA-virussen besmettelijk is. Er zijn twee hoofdstrategieën voor RNA- en DNA-transfectie voor het genereren van virusnageslacht18. Het klonen van het volledige fragment dat overeenkomt met het RNA-genoom is echter cruciaal voor de constructie van infectieuze klonen. Vanwege de lange en complexe aard van het PRRSV-genoom kan het volledige genoom niet gemakkelijk in één keer via PCR worden verkregen. Bovendien, hoewel de kunstmatige synthese van PRRSV-genen een effectieve oplossing is, is de synthese van lange fragmenten vaak duur. Om de PRRSV-expressievector van volledige lengte te verkrijgen, hebben we daarom geprobeerd deze te creëren met behulp van de homologe recombinatiemethode met meerdere inserts19,20. Helaas waren we niet in staat om de volledige genexpressievector te verkrijgen. Daarom hebben we in deze studie de juiste restrictieplaatsen toegevoegd aan de omgekeerde primer en met succes de pVAX1-PRRSV-expressievector verkregen door verschillende rondes van homologe recombinatiereacties. Bovendien kan deze methode ook deletie of mutatie van doelgenen bereiken en een groot aantal DNA-fragmenten efficiënt aan de expressievector koppelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van de sjabloon van het PRRSV-gen

  1. Ontdooi de virusvoorraad in 1 ml RNA-extractiereagens (zie materiaaltabel).
  2. Voeg 0,2 ml chloroform toe en meng goed. Incubeer gedurende 3 min.
  3. Centrifugeer het mengsel gedurende 15 minuten bij 12.000 × g bij 4 °C.
    OPMERKING: Het mengsel is verdeeld in drie fasen, namelijk een kleurloze waterige fase, een interfase en een rode fenol-chloroformfase.
  4. Pipetteer de kleurloze waterige uitfasering en breng deze over naar een nieuwe buis.
  5. Meng de waterige fase grondig met 0,5 ml isopropanol en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  6. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 × g bij 4 °C.
    OPMERKING: De bodem van de buis heeft een wit RNA-precipitaat.
  7. Gebruik een micropipet om het supernatans van de buis weg te gooien.
  8. Voeg 1 ml 75% ethanol toe om de pellet en de vortex kort te resuspenderen.
  9. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 7.500 × g bij 4 °C. Gebruik een micropipet om het supernatans van de buis weg te gooien.
  10. Droog het RNA gedurende 5 minuten, voeg 20-50 μL RNasevrij water toe om het RNA te resuspenderen en meng grondig.
  11. Ga verder met het uitvoeren van omgekeerde transcriptie; Stel de reacties in om reverse transcriptie uit te voeren, zoals weergegeven in Tabel 1.
    OPMERKING: Gebruik RNA-sjablonen van hoge kwaliteit om een succesvolle omgekeerde transcriptie te garanderen.
  12. Gebruik het resulterende cDNA voor PCR of bewaar het bij -20 °C.

2. PCR-primer ontwerp

  1. Ontwerpen van de voorwaartse primer
    1. Open de software en kies Nieuw DNA-bestand.
    2. Plak de PRRSV-gensequentie (GenBank: FJ548852.1) van NCBI in de software. Klik op OK om de sequentiebestanden te genereren.
    3. Analyseer de sequentie en markeer de fragmentjuncties. Ontwerp de voorwaartse specifieke sequentieprimer van de fragmenten. In de meeste gevallen ligt de voorkeurssmelttemperatuur (Tm) tussen 55 °C en 62 °C en is het GC-gehalte 40-60%.
    4. Klik op Primers en kies Primer toevoegen.
    5. Plak de specifieke sequentie en voeg overlappende sequenties van de vector toe aan de eerste 5' nucleotide van de specifieke sequentieprimer. Kies in de buurt van elke kruising 20-40 bp om te dienen als overlappingsgebied tussen de twee aangrenzende fragmenten.
    6. Noem de voorwaartse primer met de uitsteeksels en de specifieke volgorde (zie aanvullende afbeelding S1).
    7. Klik op Primer toevoegen aan sjabloon.
  2. Ontwerpen van de omgekeerde primer
    1. Analyseer de sequentie en markeer de fragmentjuncties in de software. Ontwerp de omgekeerde specifieke sequentieprimer van de fragmenten.
    2. Klik op Primers en kies Primer toevoegen.
    3. Plak de specifieke sequentie en voeg de restrictieplaats toe aan de eerste 5' nucleotide van de specifieke sequentieprimer.
      OPMERKING: De toegevoegde beperkingssites moeten afwezig zijn in het invoegfragment en de vector, met uitzondering van de meerdere kloonsites.
    4. Voeg 20-40 bp overhangsequenties van vectoren toe aan de eerste 5' nucleotide van de restrictieplaats.
    5. Noem de omgekeerde primer met de uitsteeksels en de specifieke volgorde (zie aanvullende afbeelding S1).
    6. Klik op Primer toevoegen aan sjabloon.

3. PCR om fragmenten te amplificeren

  1. Stel zes individuele PCR-reacties in (tabel 2): gebruik voor fragment 1 primers P1 en P2 (zie aanvullende figuur S2); gebruik voor fragment 2 de primers P3 en P4 (zie aanvullende figuur S2); gebruik voor fragment 3 de primers P5 en P6 (zie aanvullende figuur S2); gebruik voor fragment 4 de primers P7 en P8 (zie aanvullende figuur S2); voor fragment 5 gebruik je de primers P9 en P10; en gebruik primers P11 en P12 om fragment 6 te versterken (zie aanvullende figuur S2).
    NOTITIE: Ontdooi, meng en centrifugeer elk onderdeel kort voor gebruik.
  2. Voer de PCR uit met behulp van het driestappenprotocol in tabel 2.
  3. Voeg 1 μL 6x DNA-laadbuffer toe aan 5 μL PCR-product, meng en centrifugeer de inhoud kort.
  4. Analyseer de monsters met behulp van 1% agarosegelelektroforese.

4. Zuivering van de PCR-fragmenten

OPMERKING: Het zuiveren van de PCR-producten uit een gel met behulp van een gelextractiekit (zie Materiaaltabel) is belangrijk voor vectorconstructie.

  1. Voeg 9 μL 6x DNA-laadbuffer toe aan 45 μL PCR-producten, meng en centrifugeer de inhoud kort.
  2. Voer 1% agarosegel/goldview-elektroforese uit om de DNA-fragmenten te scheiden.
    OPMERKING: Gebruik de TAE-loopbuffer niet opnieuw, aangezien de pH-waarde het herstel van DNA-fragmenten beïnvloedt.
  3. Gebruik na voldoende scheiding van de banden een scherp scalpel om de DNA-banden voorzichtig weg te snijden.
    OPMERKING: Minimaliseer de grootte van het plakje gel door overtollige agarose af te snijden.
  4. Weeg de gelplak af in een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml, voeg een gelijk volume bindingsbuffer toe aan de gelplak (bijv. 0,3 ml op een plakje van 0,3 g) en incubeer bij 60 °C gedurende 7 minuten.
  5. Plaats een minikolom in een opvangbuisje van 2 ml. Voeg 700 μL DNA/agarose-oplossing uit stap 4.4 toe aan de minikolom.
  6. Centrifugeer bij 10.000 × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Gooi het filtraat weg en hergebruik de opvangbuis.
  7. Voeg 300 μL bindingsbuffer toe en centrifugeer bij 13.000 × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Gooi het filtraat weg en hergebruik de opvangbuis.
  8. Voeg 700 μL wasbuffer toe en centrifugeer op 13.000 × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Gooi het filtraat weg en hergebruik de opvangbuis.
  9. Draai de lege minikolom 2 minuten op maximale snelheid om de kolommatrix te drogen. Plaats de minikolom in een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  10. Voeg 20 μL gedeïoniseerd water rechtstreeks toe aan het midden van het kolommembraan en laat 2 minuten op kamertemperatuur staan. Centrifugeer op een snelheid van 13.000 × g gedurende 1 minuut.
  11. Bewaar het DNA bij -20 °C.

5. Voorbereiding van een gelineariseerde vector

OPMERKING: Na het bereiden van het plasmide kunnen de geselecteerde enzymen worden gebruikt om het te knippen. Lange spijsvertering of dubbele enzymvertering is cruciaal voor het waarborgen van de vertering van al het DNA. Dit zal het aantal vals-positieve klonen in volgende experimenten verminderen.

  1. pVAX1 linearisatie
    1. Bereid het reactiemengsel bij kamertemperatuur in de aangegeven volgorde (tabel 3).
      OPMERKING: Het volume water moet worden toegevoegd om het aangegeven totale reactievolume te behouden. Hier werd 1 μg van het plasmide verteerd met enzymen in het reactiemengsel. Afhankelijk van de plasmideconcentratie kan het volume van het plasmide in het reactiemengsel worden aangepast.
    2. Meng voorzichtig; Draai dan naar beneden. Incubeer bij 37 °C in een warmteblok of waterthermostaat gedurende 60 min.
    3. Voer een gelzuivering uit die vergelijkbaar is met de zuivering van de PCR-fragmenten in sectie 4 met behulp van de gelextractiekit (zie Materiaaltabel).
  2. pVAX1-F1 linearisatie
    OPMERKING: pVAX1-F1 is de vector verkregen uit de eerste ronde van pVAX1 (NdeI en HindIII) en fragment 1 recombinatie. pVAX1-F2 is de vector die wordt verkregen uit de ronde van pVAX1-F1 (NdeI) en fragment 2 recombinatie. pVAX1-F3 is de vector die wordt verkregen uit de ronde van pVAX1-F2 (NdeI) en fragment 3 recombinatie. pVAX1-F4 is de vector die wordt verkregen uit de ronde van pVAX1-F3 (NdeI) en fragment 4 recombinatie. pVAX1-F5 is de vector die wordt verkregen uit de ronde van pVAX1-F4 (EcoRV en NtoI) en fragment 5 recombinatie.
    1. Bereid voor elke vector het reactiemengsel afzonderlijk bij kamertemperatuur in de aangegeven volgorde (tabel 3).
    2. Meng voorzichtig; Draai dan naar beneden. Incubeer bij 37 °C in een warmteblok of waterthermostaat gedurende 60 min.
    3. Voer een gelzuivering uit die vergelijkbaar is met de zuivering van de PCR-fragmenten in sectie 4 met behulp van de gelextractiekit (zie Materiaaltabel).

6. Subklonen naar een nieuwe vector

OPMERKING: Een goede kloonefficiëntie kan worden bereikt bij gebruik van 50-200 ng vector en inzetstukken.

  1. Stel de naadloze kloon- en montagereactie van ExonArt in (tabel 4). Stel het totale reactievolume in op 10 μL met behulp van gesteriliseerde gedeïoniseerde H2O en meng.
  2. Incubeer de reactie in een thermocycler gedurende 15-60 minuten bij 50 °C. Bewaar de monsters op ijs.
    NOTITIE: Het verlengen van de incubatie tot 60 minuten kan de montage-efficiëntie verbeteren.
  3. Ontdooi DH5α chemisch competente cellen op ijs.
  4. Voeg 10 μL van het assemblageproduct toe aan de bevoegde cellen; Meng vervolgens voorzichtig door op en neer te pipetteren.
  5. Leg het mengsel 30 minuten op ijs.
  6. Hitteschok bij 45 °C gedurende 45 s en breng de buizen gedurende 3 minuten over op het ijs.
  7. Voeg 900 μL SOC-medium toe aan de buis.
  8. Schud de buis gedurende 1 uur op 225 rpm in een schudincubator van 37 °C.
  9. Centrifugeer de transformatiereactie bij 6.000 × g gedurende 2 minuten. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in 100 μl vers SOC-medium.
  10. Verdeel de getransformeerde celsuspensie op een aparte LB-plaat met 50 μg/ml kanamycine.
  11. Incubeer alle platen een nacht bij 37 °C. Kies individuele geïsoleerde kolonies van elke experimentele plaat.

7. Analyse van de transformaties

  1. Pluk acht kolonies in 20 μL LB-medium met 50 μg/ml kanamycine.
  2. Stel de kolonie-PCR-reactie in en voer de PCR uit (Tabel 5).
    OPMERKING: Gebruik voor de kolonie-PCR-reactie voor fragment 1 primers P1 en P2 (zie aanvullend dossier 1); voor fragment 2 gebruik de primers P3 en P4 (zie aanvullend dossier 1); voor fragment 3 gebruik de primers P5 en P6 (zie aanvullend dossier 1); gebruik voor fragment 4 de primers P7 en P8 (zie aanvullende figuur S2); voor fragment 5 gebruik je de primers P9 en P10; en gebruik primers P11 en P12 om fragment 6 te detecteren (zie aanvullende figuur S2).
  3. Voeg 1 μL 6x DNA-laadbuffer toe aan 5 μL van het PCR-product, meng en centrifugeer de inhoud kort.
  4. Analyseer de resultaten met behulp van 1% agarosegelelektroforese.
  5. Selecteer een positieve kolonie in 5 ml LB-medium met 50 μg/ml kanamycine en kweek 's nachts bij 37 °C.
  6. Verkrijg het plasmide met behulp van een plasmide-DNA-minikit (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.
  7. Visualiseer de resultaten met behulp van 1% agarosegelelektroforese.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit artikel presenteren we een in vitro recombinatiesysteem om overlappende DNA-moleculen te assembleren en te repareren met behulp van de omgekeerde primer via continu geïntroduceerde restrictieplaatsen (Figuur 1B). Dit systeem is een eenvoudige en efficiënte procedure die bestaat uit de voorbereiding van de lineaire vector en de insert-fragmenten met overhangen die door PCR zijn geïntroduceerd met primers met de juiste 5'-extensiesequenties en restrictieplaatsen; een enkelv...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De Gibson-assemblagetechniek is een in vitro op recombinatie gebaseerde moleculaire kloonmethode voor de assemblage van DNA-fragmenten8. Deze methode maakt de assemblage van meerdere DNA-fragmenten tot een cirkelvormig plasmide mogelijk in een isothermische reactie met één buis. Een van de obstakels voor de Gibson Assembly-techniek is echter het verkrijgen van lange fragmenten uit cDNA. De lange fragmenten zijn om vele redenen moeilijk nauwkeurig te versterken. Primers zijn bijvoorbeeld g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de financiële steun van de fondsen voor het initiëren van doctoraatsonderzoek, verstrekt door de China West Normal University (nr. 20E059).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 kb plus DNA LadderTiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., LtdMD113-02
2x Universal Green PCR Master MixRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA303-1
AgaroseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.9012-36-6
Benchtop MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific  Co., LtdFRESCO17
Clean BenchSujing Antai Air Technology  Co., LtdVD-650-U
DNA Electrophoresis EquipmentCleaver Scientific  Co., Ltd170905117
DNA Loading Buffer (6x)Biosharp Biotechnology Co., LtdBL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kitOmega Bio-Tek Co., LtdD2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-Tek Co., LtdD6943-01
Electro-heating Standing-temperature CultivatorShanghai Hengyi Scientific Instrument Co., LtdDHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kitRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNaseRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)Thermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0303
FastDigest HindIIIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0504
FastDigest NheIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0974
FastDigest NotIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0596
Gel Doc XRBio-Rad Laboratories Co., Ltd721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel StainShanghai Yubo Biotechnology Co., LtdYB10201ES03
Ice Maker MachineShanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., LtdFMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific  Co., Ltd12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113-0001
MicropipettorsThermo Fisher Scientific  Co., Ltd—
Microwave OvenPanasonic Electric (China) Co., LtdNN-GM333W
Orbital ShakersShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LtdZHWY-2102C
PRRSV virusSichuan Agricultural University—
SnapGeneGSL Biotech, LLCv5.1Om primers te ontwerpen
T100 PCR Gradient Thermal CyclerBio-Rad Laboratories  Co., LtdT100 Thermal Cycler
TAE bufferSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B040123-0010
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific  Co., Ltd15596026RNA-extractiereagens

Referenties

  1. Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Jr Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J. Biol. Eng. 2, 5(2008).
  3. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  4. Horton, R. M. PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes. Mol Biotechnol. 3 (2), 93-99 (1995).
  5. Bang, D., Church, G. M. Gene synthesis by circular assembly amplification. Nat. Methods. 5 (1), 37-39 (2008).
  6. Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Res. 35 (7), e55(2007).
  7. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
  8. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  9. Cho, J. G., Dee, S. A. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Theriogenology. 66 (3), 655-662 (2006).
  10. Holtkamp, D. J., et al. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers. J. Swine Health Prod. 21, 72-84 (2013).
  11. Thomann, B., Rushton, J., Schuepbach-Regula, G., Nathues, H. Modeling economic effects of vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome: Impact of vaccination effectiveness, vaccine price, and vaccination coverage. Front Vet Sci. 7, 500(2020).
  12. Dwivedi, V., et al. Evaluation of immune responses to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs during early stage of infection under farm conditions. Virol J. 9, 45(2012).
  13. Mengeling, W. L., Lager, K. M., Vorwald, A. C. Clinical consequences of exposing pregnant gilts to strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of "atypical" PRRS. Am. J. Vet. Res. 59 (12), 1540-1544 (1998).
  14. Dee, S. A., Joo, H. S. Prevention of the spread of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in endemically infected pig herds by nursery depopulation. Vet Rec. 135 (1), 6-9 (1994).
  15. Dee, S. A., Joo, H. Strategies to control PRRS: a summary of field and research experiences. Vet Microbiol. 55 (1-4), 347-343 (1997).
  16. Renukaradhya, G. J., Meng, X. J., Calvert, J. G., Roof, M., Lager, K. M. Live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Current status and future direction. Vaccine. 33 (33), 4069-4080 (2015).
  17. Conzelmann, K. K., Visser, N., Woensel, P. V., Thiel, H. J. Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group. Virology. 193 (1), 329-339 (1993).
  18. Han, M. Y., Yoo, D. W. Engineering the PRRS virus genome: Updates and perspectives. Vet Microbiol. 174 (3), 279-295 (2014).
  19. Bryksin, A. V., Matsumura, I. Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids. Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).
  20. Wang, S., et al. Restriction-based multiple-fragment assembly strategy to avoid random mutation during long cDNA cloning. J Cancer. 6 (7), 632-635 (2015).
  21. Zhang, Z. D., et al. The economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome outbreak in four Chinese farms: Based on cost and revenue analysis. Front Vet Sci. 9, 1024720(2022).
  22. Chen, N. H., et al. High genetic diversity of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses from 2016 to 2019. Res Vet Sci. 131, 38-42 (2020).
  23. Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).
  24. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  25. Zhang, S. R., et al. Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus high copy plasmid. Virol J. 8, 410(2011).
  26. Ni, Y. Y., Huang, Y. W., Cao, D. J., Opriessnig, T., Meng, X. J. Establishment of a DNA-launched infectious clone for a highly pneumovirulent strain of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus: identification and in vitro and in vivo characterization of a large spontaneous deletion in the nsp2 region. Virus Res. 160 (1-2), 264-273 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

PRRSV-expressievectorhomologe recombinatieGibson-assemblagerestrictie-enzymcloneringPCR-fragmentamplificatieagarosegelelektroforesekolonie-PCRvectorlinearisatieDNA-fragmentassemblage
Een naadloze kloneringsbenadering voor de vectorconstructie van de reproductieve en respiratoire syndroomexpressie van het varkensvirus
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.