AQRNA-seq voor het kwantificeren van kleine RNA's

Samenvatting

Absolute kwantificering RNA-sequencing (AQRNA-seq) is een technologie die is ontwikkeld om het landschap van alle kleine RNA's in biologische mengsels te kwantificeren. Hier worden zowel de bibliotheekvoorbereidings- als de gegevensverwerkingsstappen van AQRNA-seq gedemonstreerd, waarbij veranderingen in de transfer-RNA (tRNA)-pool in Mycobacterium bovis BCG worden gekwantificeerd tijdens door uithongering veroorzaakte rustperiode.

Samenvatting

AQRNA-seq biedt een directe lineaire relatie tussen sequencing-leestellingen en het aantal kleine RNA-kopieën in een biologisch monster, waardoor een nauwkeurige kwantificering van de pool van kleine RNA's mogelijk is. De hier beschreven voorbereidingsprocedure voor de AQRNA-seq-bibliotheek omvat het gebruik van op maat ontworpen sequencing-linkers en een stap voor het verminderen van methylatie-RNA-modificaties die de omgekeerde transcriptieprocesiviteit blokkeren, wat resulteert in een verhoogde opbrengst van cDNA's van volledige lengte. Daarnaast wordt een gedetailleerde implementatie van de bijbehorende bioinformatica-pijplijn gepresenteerd. Deze demonstratie van AQRNA-seq werd uitgevoerd door middel van een kwantitatieve analyse van de 45 tRNA's in Mycobacterium bovis BCG, geoogst op 5 geselecteerde dagen gedurende een tijdsverloop van 20 dagen van voedingsdeprivatie en 6 dagen van reanimatie. Lopende inspanningen om de efficiëntie en nauwkeurigheid van AQRNA-seq te verbeteren, zullen hier ook worden besproken. Dit omvat het onderzoeken van methoden om gelzuivering te voorkomen voor het verminderen van problemen met primerdimeer na PCR-amplificatie en om het aandeel van volledige aflezingen te vergroten om een nauwkeurigere leesmapping mogelijk te maken. Toekomstige verbeteringen aan AQRNA-seq zullen gericht zijn op het vergemakkelijken van automatisering en high-throughput implementatie van deze technologie voor het kwantificeren van alle kleine RNA-soorten in cel- en weefselmonsters van diverse organismen.

Inleiding

Next-generation sequencing (NGS), ook bekend als massively parallel sequencing, is een DNA-sequencingtechnologie die DNA-fragmentatie, ligatie van adaptor-oligonucleotiden, op polymerasekettingreactie (PCR) gebaseerde amplificatie, sequentiebepaling van het DNA en herassemblage van de fragmentsequenties tot een genoom omvat. De aanpassing van NGS aan sequentie-RNA (RNA-seq) is een krachtige benadering om RNA-transcripten en hun varianten te identificeren en te kwantificeren¹. Innovatieve ontwikkelingen in workflows voor de voorbereiding van RNA-bibliotheken en pijplijnen voor bio-informaticaanalyse, in combinatie met vooruitgang in laboratoriuminstrumentatie, hebben het repertoire van RNA-seq-toepassingen uitgebreid, en zijn verder gegaan dan exoomsequencing naar geavanceerde functionele omics zoals niet-coderende RNA-profilering², analyse van één cel³, ruimtelijke transcriptomics ^4,5, alternatieve splicinganalyse⁶onder andere. Deze geavanceerde RNA-seq-methoden onthullen complexe RNA-functies door middel van kwantitatieve analyse van het transcriptoom in normale en zieke cellen en weefsels.

Ondanks deze vooruitgang in RNA-seq, beperken verschillende belangrijke technische kenmerken de kwantitatieve kracht van de methode. Hoewel de meeste RNA-seq-methoden nauwkeurige en nauwkeurige kwantificering van veranderingen in de niveaus van RNA's tussen experimentele variabelen (d.w.z. biologische monsters en/of fysiologische toestanden) mogelijk maken, kunnen ze geen kwantitatieve vergelijkingen maken van de niveaus van RNA-moleculen in een monster. De meeste RNA-seq-methoden kunnen bijvoorbeeld het relatieve aantal kopieën van individuele tRNA-isoacceptormoleculen in een cellulaire pool van tot expressie gebrachte tRNA's niet nauwkeurig kwantificeren. Zoals benadrukt in de begeleidende publicatie⁷, komt deze beperking tot RNA-seq voort uit verschillende kenmerken van de RNA-structuur en de biochemie van bibliotheekvoorbereiding. De activiteit van de ligatie-enzymen die worden gebruikt om de 3'- en 5'-end sequencing linkers aan RNA-moleculen te hechten, wordt bijvoorbeeld sterk beïnvloed door de identiteit van de terminale nucleotiden van het RNA en de sequencing linkers. Dit leidt tot grote variaties in de efficiëntie van linkerligaties en diepgaande artefactische verhogingen in sequencing reads ^8,9,10.

Een tweede reeks beperkingen vloeit voort uit de inherente structurele eigenschappen van RNA-moleculen. In het bijzonder kunnen de vorming van secundaire RNA-structuren en dynamische veranderingen in de tientallen post-transcriptionele RNA-modificaties van het epitranscriptoom polymerase-uitval of mutatie veroorzaken tijdens omgekeerde transcriptie. Deze fouten resulteren in onvolledige of afgekapte cDNA-synthese of veranderde RNA-sequentie. Hoewel beide fenomenen kunnen worden uitgebuit om secundaire structuren of sommige wijzigingen in kaart te brengen, verslechteren ze de kwantitatieve nauwkeurigheid van RNA-seq als de volgende stappen voor de voorbereiding van de bibliotheek er niet in slagen afgekapte cDNA's vast te leggen of als gegevensverwerking gemuteerde sequenties weggooit die niet overeenkomen met een referentiedataset^11,12. Bovendien vermindert de immense chemische, lengte- en structurele diversiteit van RNA-transcripten, evenals het gebrek aan hulpmiddelen om lange RNA's uniform te fragmenteren, de toepasbaarheid van de meeste RNA-seq-methoden op alle RNA-soorten¹³.

De AQRNA-seq-methode (absolute kwantificering RNA-sequencing) is ontwikkeld om een aantal van deze technische en biologische beperkingen weg te nemen die de kwantitatieve nauwkeurigheid beperken⁷. Door sequentieafhankelijke vooroordelen bij het vastleggen, ligeren en amplificeren tijdens de voorbereiding van de RNA-sequencingbibliotheek te minimaliseren, bereikt AQRNA-seq superieure lineariteit in vergelijking met andere methoden, waarbij 75% van een referentiebibliotheek van 963 miRNA's nauwkeurig wordt gekwantificeerd met een 2-voudige nauwkeurigheid. Deze lineaire correlatie van sequencing, leestelling en RNA-overvloed wordt ook waargenomen in een analyse van een pool van RNA-oligonucleotidestandaarden met variabele lengte en in verwijzing naar orthogonale methoden zoals northern blotting. Door lineariteit vast te stellen tussen sequencing, het aantal leessnelheden en de overvloed aan RNA kan AQRNA-seq een nauwkeurige, absolute kwantificering van alle RNA-soorten in een monster bereiken.

Hier volgt een beschrijving van het protocol voor de workflow voor de voorbereiding van de AQRNA-seq-bibliotheek en de bijbehorende downstream data-analysepijplijn. De methode werd toegepast om de dynamiek van de tRNA-overvloed tijdens door uithongering veroorzaakte rustperiode en daaropvolgende reanimatie op te helderen in het Mycobacterium bovis bacillen de Calmette et Guérin (BCG) model van tuberculose. De resultaten werden gepresenteerd voor de verkennende visualisatie van de sequentiegegevens, samen met daaropvolgende clustering- en differentiële expressieanalyses die waarneembare patronen in de overvloed aan tRNA onthulden die verband houden met verschillende fenotypes.

Protocol

OPMERKING: Figuur 1 geeft een grafische illustratie van de procedures die betrokken zijn bij de voorbereiding van de AQRNA-seq-bibliotheek. Gedetailleerde informatie over de reagentia, chemicaliën en kolommen/kits die in de procedure worden gebruikt, is te vinden in de Materiaaltabel. Het wordt aanbevolen om een uitgebreide evaluatie uit te voeren van de zuiverheid, integriteit en kwantiteit van de input-RNA-monsters met behulp van (i) 3% agarosegelelektroforese, (ii) geautomatiseerde elektroforese-instrumenten voor monsterkwaliteitscontrole van biomoleculen (zie Materiaaltabel), en (iii) UV-zichtbare spectrofotometrie en/of fluorometrische kwantificering. Het is verplicht om alle reacties en mastermixen op ijs te bewaren, tenzij anders aangegeven. Transporteer reagentia (bijv. enzymen) in koelboxen van en naar -20 °C opslag om hun houdbaarheid te behouden en meerdere vries-dooicycli van bibliotheektussenproducten te voorkomen.

1. Defosforylering van RNA's

OPMERKING: Verwijdering van het 5'-fosfaat (P; donor) voorkomt zelfligatie aan het 3'-hydroxyl (OH; acceptor) van RNA's. Linkers zullen zichzelf niet ligeren omdat hun 3'-uiteinde is gemodificeerd om een dideoxycytidine (Linker 1) of een afstandhouder (Linker 2) te bevatten. Linkers kunnen alleen worden geligeerd door hun 5'-P te verbinden met de 3'-OH van de RNA's of cDNA's.

1. Bereid de defosforyleringsreactie voor in een steriele PCR-buis (bijv. buis van 200 μl of 500 μl) door maximaal 2 μl van het RNA-monster, 0,5 μl 40 E/μL RNaseremmer, 1 μL van 0,5 μM interne standaard (tabel 1), 0,5 μL 10x T4-RNA-ligasereactiebuffer, 1 μL van 1 E/μL garnalen alkalische fosfatase, en voldoende RNasevrij water om het totale volume op 5 μL te brengen.
   OPMERKING: Voor typische monsters wordt 75 ng RNA's (of ongeveer 2 pmol voor een 80 nt RNA) als voldoende beschouwd voor kwantificering van kleine RNA's met behulp van dit protocol.
2. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten om RNA's te defosforyleren en vervolgens 5 minuten bij 65 °C om het enzym te inactiveren en de RNA's te denatureren. Bewaar de monsters gedurende ten minste 10 minuten bij 4 °C om renaturatie te voorkomen.

2. Ligatie van linker 1 aan het 3'-uiteinde van RNA's

1. Bereid de Linker 1-ligatiereactie voor in een steriele PCR-buis door 5 μl van de gedefosforyleerde RNA's (producten uit stap 1), 0,5 μl 40 E/μL RNaseremmer, 1 μl 100 μM Linker 1 (tabel 1), 3 μL 10 mM ATP, 2,5 μL 10x T4-RNA-ligasereactiebuffer, 15 μL PEG8000 (50%-oplossing) toe te voegen, 2 μL 30 E/μL T4 RNA-ligase 1 en 1 μL RNasevrij water.
   OPMERKING: Reagentia kunnen tot mastermix worden verwerkt om de verwerking van de monsters te vergemakkelijken. Neem geen PEG8000 en T4 RNA-ligase 1 op in de mastermix.
2. Incubeer bij 25 °C gedurende 2 uur en vervolgens bij 16 °C gedurende 16 uur om Linker 1 aan de RNA's te ligateren.
3. Kolom-zuiveren van de Linker-1-ligated RNA's. Gebruik een kit voor het herstellen en opschonen van DNA/RNA (zie Materiaaltabel).
   OPMERKING: Dit kolomreinigingsprotocol is van toepassing op alle volgende kolomzuiveringen met dezelfde kit. Kits die gelfiltratietechnologie gebruiken om kleurstofterminators uit sequentiereacties te verwijderen (zie Materiaaltabel) kunnen hier niet worden gebruikt, omdat PEG8000 niet compatibel is met de gelfilters van dergelijke kits. Het wordt aanbevolen om na zuivering een aliquot (1,2 μl) van elk monster te bewaren. Indien nodig kunnen deze aliquots worden gebruikt voor het controleren van de ligatie-efficiëntie door een in de handel verkrijgbare nucleïnezuuranalysator uit te voeren. Bewaar de resterende gezuiverde monsters op ijs of bij -20 °C tot verdere stappen.
   1. Voeg voor een monstervolume < 50 μl RNasevrij water toe om het op 50 μl te brengen. Voeg 2 volumes van de oligobindingsbuffer (meegeleverd in de kit) toe aan 1 volume van het monster. Voeg 8 delen 100% ethanol toe aan 1 volume van het monster.
   2. Laad het monster (tot 750 μl per keer) in een kolom die in een verzamelbuisje van 2 ml is geplaatst (meegeleverd in de set). Om RNA's aan de kolom te binden, centrifugeert u gedurende 30 s bij 10.000 x g en gooit u de doorstroom (d.w.z. de vloeistof in de verzamelbuis) weg. Plaats de kolom terug in de opvangbuis.
   3. Om de onzuiverheden van de kolom te wassen, voegt u 750 μL van de DNA-wasbuffer (meegeleverd in de kit) toe aan de kolom. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 s en gooi de doorstroom weg. Plaats de kolom terug in de opvangbuis.
   4. Centrifugeer op maximale snelheid (bijv. 16.000 x g voor een tafelmodel microcentrifuge) gedurende nog eens 1 minuut om de resterende DNA-wasbuffer te verwijderen.
   5. Om de RNA's te elueren, verplaatst u de kolom voorzichtig naar een steriele buis van 1,5 ml en voegt u RNasevrij water toe aan de kolom. Gebruik een groter volume dan nodig is bij het elueren van de RNA's om rekening te houden met mogelijk volumeverlies tijdens het elutieproces. Als er bijvoorbeeld 15 μl nodig is voor de volgende stap, voeg dan 17 μl RNasevrij water toe voor elution. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 s.

3. Verwijdering van posttranscriptionele methylaties door AlkB-demethylase

OPMERKING: AlkB is een bacterieel enzym dat methylgroepen verwijdert uit sommige, maar niet alle, gemethyleerde nucleotiden in DNA en RNA. Verwijdering van verschillende soorten gemethyleerde ribonucleotiden in RNA voorkomt het afvallen van de reverse transcriptase om meer volledige metingen en identificatie van modificatieplaatsen mogelijk te maken. Deze stap moet worden gecontroleerd bij een lage pH om onverwachte afbraak van RNA's te voorkomen.

1. Bereid een stockoplossing van 1 M 2-ketoglutaraat door 1,4611 g 2-ketoglutaraat (146,11 g per M) op te lossen in 10 ml RNasevrij water. Filter steriliseer de oplossing door een spuitfilter van 0,2 μm. Doe de bouillonoplossing in steriele buisjes van 2 ml en bewaar bij -20 °C.
2. Bereid een stockoplossing van 0,5 M L-ascorbinezuur door 0,88 g L-ascorbinezuur (176,12 g per M) op te lossen in 10 ml RNasevrij water. Filter steriliseer de oplossing door een spuitfilter van 0,2 μm. Doe de bouillonoplossing in steriele buisjes van 2 ml en bewaar bij -20 °C.
3. Bereid een stockoplossing van 0,25 M ammoniumijzersulfaathexahydraat door 0,9835 g ammoniumijzersulfaathexahydraat (392,14 g per M) op te lossen in 10 ml RNasevrij water. Filter steriliseer de oplossing door een spuitfilter van 0,2 μm. Doe de bouillonoplossing in steriele buisjes van 2 ml en bewaar bij -20 °C.
4. Bereid een stockoplossing van 1 M HEPES door 2,383 g HEPES (238,30 g per M) op te lossen in 10 ml RNasevrij water. Stel de pH van de oplossing in op 8 met behulp van NaOH en filtreer de oplossing met een spuitfilter van 0,2 μm. Doe de bouillonoplossing in steriele buisjes van 2 ml en bewaar bij -20 °C.
5. Bereid een 2x AlkB-reactiebuffer voor. Om 10 ml van de buffer te maken, combineert u 1,5 μl 1 M 2-ketoglutaraat (gemaakt in stap 3.1), 80 μl 0,5 M L-ascorbinezuur (gemaakt in stap 3.2), 6 μl 0,25 M ammoniumijzersulfaathexahydraat (gemaakt in stap 3.3), 100 μl 10 mg/ml BSA, 1000 μl 1 M HEPES (gemaakt in stap 3.4; als laatste toevoegen), en 8812,5 μL RNasevrij water. Filter steriliseer de buffer door een spuitfilter van 0,2 μm.
   OPMERKING: De 2x AlkB-reactiebuffer moet onmiddellijk voor elk experiment vers worden bereid vanwege de chemische labiliteit van de componenten.
6. Bereid de AlkB-digestiereactie voor in een steriele PCR-buis door 20 μL van de Linker-1-ligated RNA's (producten uit stap 2), 50 μL van de 2x AlkB-reactiebuffer (gemaakt in stap 3.5), 2 μL AlkB-demethylase, 1 μL RNaseremmer en 27 μL RNasevrij water toe te voegen.
7. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur om posttranscriptionele methylaties van de RNA's te verwijderen.
8. Om AlkB uit de reactie te verwijderen, volgt u de onderstaande stappen.
   1. Voeg voor een scheiding in de schone fase 50 μL RNasevrij water toe aan de AlkB-reactie en voeg vervolgens 100 μL fenol toe: chloroform: isoamylalcohol 25:24:1 (pH = 5,2).
   2. Schud met de hand gedurende 10 s en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten op 16.000 x g . Zorg ervoor dat de rotor van de tafelcentrifuge compatibel is met de PCR-buisjes. Gebruik indien nodig adapters.
   3. Breng de RNA's (d.w.z. de waterige laag bovenop; ongeveer 140 μL) over in een steriele buis van 1,5 ml. Als chloroform (d.w.z. de onderste laag) in de waterige laag wordt gemengd, centrifugeer dan opnieuw met dezelfde instellingen.
   4. Voeg 100 μL chloroform toe aan de geëxtraheerde RNA's om het resterende fenol te verwijderen. Schud met de hand gedurende 10 s en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten op 16.000 x g .
   5. Breng de RNA's (d.w.z. de waterige laag bovenop; ongeveer 120 μL) over in een steriele buis van 1,5 ml.
9. Kolom-zuiveren van de geëxtraheerde RNA's. Gebruik een kit voor het herstellen en opschonen van DNA/RNA (zie Materiaaltabel). Volg het protocol dat in stap 2.3 wordt beschreven om de kolomzuivering uit te voeren.

4. Verwijdering van overtollig Linker 1

OPMERKING: Het wordt aanbevolen om na zuivering een aliquot (1,2 μL) van elk monster te bewaren. Indien nodig kunnen deze aliquots worden gebruikt voor het controleren van de efficiëntie van RecJf-vergisting door een commerciële nucleïnezuuranalysator uit te voeren. Ga onmiddellijk verder met de gezuiverde monsters om de transcriptie om te keren.

1. Bereid de deadenylatiereactie voor in een steriele PCR-buis door 15 μL linker-1-ligated RNA's (producten uit stap 3), 1 μL 40 E/μL RNaseremmer, 2 μL 10x kitbuffer 2 (zie Materiaaltabel) en 2 μL 50 E/μL 5'-deadenylase toe te voegen.
2. Incubeer bij 30 °C gedurende 1 uur om de adenine aan het 5'-uiteinde van Linker 1 te verwijderen. Voeg 2 μL 30 E/μL RecJf toe aan de deadenylatiereactie.
3. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten om overtollig Linker 1 te verteren. Voeg nog eens 2 μL 30 E/μL RecJf toe aan de reactie.
4. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten om de vertering van overtollig Linker 1 voort te zetten en vervolgens bij 65 °C gedurende 20 minuten om het enzym te denatureren.
5. Kolom-zuiveren van de Linker-1-ligated RNA's. Gebruik een kit die gebruikmaakt van gelfiltratietechnologie om kleurstofterminators uit sequentiereacties te verwijderen (zie Materiaaltabel), omdat deze effectief is in het verwijderen van korte restanten (bijv. oligonucleotiden met een lengte van 2 tot 10 bp). Volg de hieronder beschreven stappen voor zuivering.
   1. Bereid gelfilterkolommen voor volgens het protocol van de fabrikant. Plaats een kolom in een steriel buisje van 1,5 ml en laad de kolom met 24 μl van het monster.
   2. Om de RNA's te zuiveren, centrifugeert u gedurende 3 minuten bij 800 x g en gooit u de kolom weg. De gezuiverde RNA's bevinden zich in het eluentie.

5. Omgekeerde transcriptie (RT) reactie

OPMERKING: De volgende RT-reactieopstelling (zie Materiaaltabel) volgt het protocol van de fabrikant, met kleine wijzigingen om AQRNA-seq-compatibiliteit mogelijk te maken.

1. Bereid de RT-primergloeireactie voor in een steriele PCR-buis door 24 μL sjabloon-RNA's (producten uit stap 4), 1 μL 2 μM RT-primer (tabel 1) en 1 μL dNTP (10 mM van elk type nucleotiden) toe te voegen.
2. Incubeer bij 80 °C gedurende 2 minuten om RT-primers tot de sjabloon-RNA's te gloeien en koel vervolgens onmiddellijk 2 minuten af op ijs.
3. Bereid de RT-reactie voor door 6 μL 5x RT-reactiebuffer, 1 μL 40 E/μL RNaseremmer en 1 μL reverse transcriptase toe te voegen aan de gloeireactiebuis.
4. Incubeer bij 50 °C gedurende 2 uur om de RNA-sjablonen omgekeerd te transcriberen, en vervolgens bij 70 °C gedurende 15 minuten om het enzym te inactiveren. De RT-producten (d.w.z. RNA-cDNA-hybriden) kunnen 's nachts bij 4 °C of -20 °C worden bewaard.

6. RNA-hydrolyse

1. Voeg 1 μL 5 M NaOH toe aan de RNA-cDNA-hybride (producten uit stap 5). Incubeer bij 93 °C gedurende 3 minuten om de RNA-streng van de RNA-cDNA-hybride te hydrolyseren.
2. Voeg 0,77 μL 5 M HCl toe om de reactie te neutraliseren. Nadat je HCl hebt toegevoegd, veeg je om te mixen en draai je de buis naar beneden. Neutralisatie is onmiddellijk.
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de precieze hoeveelheid van 5 M HCl te testen die nodig is voor het neutraliseren van 1 μL NaOH (bijv. met behulp van pH-strips) in gebufferde omstandigheden.
3. Kolom-zuiveren van de enkelstrengs cDNA's. Gebruik een kit voor het herstellen en opschonen van DNA/RNA (zie Materiaaltabel). Volg het protocol dat in stap 2.3 wordt beschreven om de kolomzuivering uit te voeren.
   OPMERKING: Kits die gelfiltratietechnologie gebruiken om kleurstofterminators uit sequentiereacties te verwijderen (zie Materiaaltabel) kunnen hier niet worden gebruikt vanwege de pH-variatie in eerdere stappen.
4. Versnel de gezuiverde cDNA's tot < 5 μL en voeg vervolgens RNasevrij water toe om het volume terug te brengen naar 5 μL. Zorg ervoor dat u de cDNA's niet snel vacuüm zuigt tot ze volledig droog zijn.
5. Breng de gezuiverde cDNA's over in een steriele PCR-buis. De gezuiverde cDNA's kunnen tot 1 week worden bewaard bij -20 °C.

7. Ligatie van linker 2 aan het 3'-uiteinde van cDNA's

1. Bereid de Linker 2-ligatiereactie voor in een steriele PCR-buis door 5 μL cDNA's (producten uit stap 6), 1 μL 50 μM Linker 2 (tabel 1), 2 μL 10x T4-DNA-ligasereactiebuffer, 1 μL 10 mM ATP, 9 μL PEG8000 (50%-oplossing) en 2 μL 400 E/μL T4-DNA-ligase toe te voegen.
   OPMERKING: Reagentia kunnen tot mastermix worden verwerkt om de verwerking van de monsters te vergemakkelijken. Neem geen PEG8000 en T4-DNA-ligase op in de mastermix.
2. Incubeer bij 16 °C gedurende 16 uur om Linker 2 aan de cDNA's te binden.
3. Kolom-zuiveren van de Linker-2-ligated cDNA's. Gebruik een kit voor het herstellen en opschonen van DNA/RNA (zie Materiaaltabel). Volg het protocol dat in stap 2.3 wordt beschreven om de kolomzuivering uit te voeren.

8. Verwijdering van overtollig Linker 2

1. Bereid de deadenylatiereactie voor in een steriele PCR-buis door 16 μL linker-2-ligated cDNA's, 2 μL 10x kitbuffer 2 en 2 μL 50 E/μL 5'-deadenylase toe te voegen. Incubeer bij 30 °C gedurende 1 uur om de adenine aan het 5'-uiteinde van Linker 2 te verwijderen.
2. Voeg 2 μL 30 E/μL RecJf toe aan de deadenylatiereactie. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten om overtollig Linker 2 te verteren. Voeg nog eens 2 μL 30 E/μL RecJf toe aan de reactie.
3. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten om de vertering van overtollig Linker 2 voort te zetten en vervolgens bij 65 °C gedurende 20 minuten om het enzym te denatureren.

9. PCR-amplificatie van de cDNA's met sequencing primers

1. Wijs PCR-primers toe aan de monsters. Elk monster heeft een unieke combinatie van voorwaartse en achterwaartse primers nodig (tabel 1) voor effectief multiplexen.
2. Voeg RNasevrij water toe om het monstervolume op 25 μl te brengen. Bewaar 5 μl van elk monster in een steriele PCR-buis als back-up voor het geval PCR moet worden herhaald.
3. Bereid de PCR-reactie voor (zie Materiaaltabel voor PCR-kit) door 20 μL cDNA's (producten uit stap 8), 1 μL 2,5 μM voorwaartse primer, 1 μL 2,5 μM omgekeerde primer, 25 μL 2x DNA-polymerasebuffer, 2 μL RNasevrij water en 1 μL DNA-polymerase toe te voegen.
   OPMERKING: Reagentia kunnen tot mastermix worden verwerkt om de verwerking van de monsters te vergemakkelijken. Voeg geen DNA-polymerase toe aan de mastermix.
4. Voer PCR uit met een initiële denaturatie bij 94 °C gedurende 1 minuut, gevolgd door 18 cycli van denaturatie bij 98 °C gedurende 20 s - gloeien bij 58 °C gedurende 20 s - verlenging bij 68 °C gedurende 1 min.
   OPMERKING: PCR amplificeert niet buiten het lineaire bereik. Een totaal van 18 cycli is optimaal voor de meeste experimenten, maar dit kan contextafhankelijk zijn.
5. Versnel de PCR-producten tot minder dan 25 μl en voeg vervolgens RNasevrij water toe om het volume terug te brengen naar 25 μl. Breng 5 μl van de PCR-producten over naar een steriel buisje van 0,5 ml om de grootteverdeling te controleren (zie stap 9.6). Bewaar de resterende 20 μL van de PCR-producten bij -20 °C tot verdere stappen.
6. Controleer de maatverdeling van de PCR-producten zoals hieronder beschreven.
   1. Bereid 3% agarosegel in TAE-buffer.
      OPMERKING: In dit protocol wordt ethidiumbromide (EtBr) gebruikt voor gelkleuring na elektroforese (zie stap 9.6.5). Geschikte DNA-kleuringen kunnen bij deze stap aan de geloplossing worden toegevoegd of later voor gelkleuring worden gebruikt.
   2. Meng 1 μL 6x ladende kleurstof in 5 μL PCR-producten (uit stap 9.5) en laad de gel met het mengsel.
   3. Laad 5 μL DNA-ladders in het putje vóór het eerste monster en het putje na het laatste monster. Gebruik DNA-ladders van 50 bp of 100 bp om een betere groottediscriminatie van PCR-producten tussen 150 bp en 300 bp mogelijk te maken.
   4. Voer gelelektroforese uit om de PCR-producten te lokaliseren. De juiste actieve voorwaarde kan contextafhankelijk zijn. Draai hier op 120 V, 400 mA gedurende 75 minuten voor een gelplaat van 17,78 cm (breedte) x 10,16 cm (hoogte) x 1 cm (dikte).
   5. Plaats de gel in een doos en vul de doos met gedeïoniseerd (DI) water totdat de gel volledig is ondergedompeld. Voeg 10 μL EtBr toe aan het DI-water en doordrenk de gel. Wikkel de doos in folie en plaats deze op een shaker. Kleur de gel gedurende 30 minuten tijdens het schudden.
   6. Gooi het EtBr-bevattende afval weg in een afvalfles die in een zuurkast is geplaatst. Spoel de gel één keer af met DI-water en gooi het EtBr-houdende water weg in de afvalfles.
   7. Vul de doos met DI-water totdat de gel volledig is ondergedompeld. Wikkel de doos in folie en plaats deze op een shaker. Was de gel gedurende 10 minuten tijdens het schudden.
   8. Gooi het EtBr-houdende water weg in de afvalfles in de zuurkast. Gebruik een gelimager om de banden te visualiseren. Verkrijg een afbeelding met hoge resolutie van de gel.

10. Gel zuivering

1. Bereid 3% agarosegel in TAE-buffer. Maak met brede kammen een gel van 1 cm dikte (1 mm dikte; 5 mm breedte; 15 mm diepte), zodat elk putje ten minste 25 μl monsterladend verfmengsel kan bevatten.
2. Meng 4 μL 6x laadkleurstof met 20 μL PCR-producten (uit stap 9.5) en laad de gel met het mengsel. Laat lege rijstroken tussen de monsters om kruisbesmetting tijdens gelexcisie tot een minimum te beperken.
3. Laad DNA-ladders, voer gelelektroforese uit, beits en was de gel en maak gelfoto's zoals beschreven in stap 9.6.
4. Accijns de gelblokken die PCR-producten bevatten binnen het doelgroottebereik. Om contaminatie met primerdimeren (175 bp linkers zonder inserts) te minimaliseren, extraheert u PCR-producten met een grootte van meer dan 195 bp (175 bp linkers + 20 bp miRNA's).
5. Zuiver de PCR-producten met behulp van gelextractie. Gebruik een gelextractieset (zie Materiaaltabel). Het zuiveringsprotocol is gebaseerd op het protocol van de fabrikant, met kleine aanpassingen voor AQRNA-seq-compatibiliteit. Alle centrifugatiestappen moeten worden uitgevoerd bij 17.900 x g gedurende 1 minuut met behulp van een tafelcentrifuge bij kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven. Volg de onderstaande stappen.
   1. Meet het gewicht van de gelblokken in de tubes. Voeg 6 volumes Buffer QG (meegeleverd in de kit) toe aan 1 volume gelblok (1 mg gel is ongeveer 1 μL).
   2. Incubeer bij 50 °C gedurende 10 minuten of tot de gelblokken volledig zijn opgelost. Vortexbuizen om de 2 minuten om het oplossen van gel te vergemakkelijken. Na het oplossen van de gel moet het mengsel lijken op de kleur van de Buffer QG zonder de opgeloste gel. Als de kleur oranje of violet is, voeg dan 10 μL 3 M natriumacetaat (pH = 5,0) toe en meng goed.
   3. Voeg 1 gelvolume isopropanol toe aan het mengsel en meng goed. Plaats een spinkolom in een opvangbuisje van 2 ml (meegeleverd in de set).
   4. Om DNA te binden, brengt u het monster (tot 750 μl per keer) aan op de kolom en centrifugeert. Gooi de doorstroom weg en plaats de kolom terug in dezelfde opvangbuis. De maximale hoeveelheid gel per centrifugekolom is 400 mg.
   5. Voeg 500 μL Buffer QG toe aan de kolom en centrifugeer. Gooi de doorstroom weg en plaats de kolom terug in dezelfde opvangbuis.
   6. Om de onzuiverheden te wassen, voegt u 750 μL Buffer PE (meegeleverd in de kit) toe aan de kolom, laat de kolom 5 minuten staan en centrifugeer. Gooi de doorstroom weg en plaats de kolom terug in dezelfde opvangbuis. Centrifugeer nogmaals om de resterende wasbuffer te verwijderen.
   7. Plaats de kolom in een steriel buisje van 1,5 ml. Om DNA te elueren, voegt u 30 μL Buffer EB (meegeleverd in de kit) toe aan het midden van het kolommembraan, laat u de kolom 4 minuten staan en centrifugeert u.
   8. Speed-vac en resuspendeer de met gel gezuiverde PCR-producten in 12 μL Buffer EB.
6. Meet de concentratie van de geconstrueerde bibliotheken door middel van UV-zichtbare spectrofotometrie en/of fluorometrische kwantificering.

11. Volgorde van de bibliotheek

1. Dien de geconstrueerde bibliotheken in bij een extern sequencingcentrum voor kwaliteitsbeoordeling en Illumina-sequencing. Om voldoende gevoeligheid te garanderen bij het kwantitatief in kaart brengen van kleine RNA-landschappen, kiest u voor sequencing met gepaarde sequencing met 75 bp lezingen vanuit elke richting (d.w.z. PE75), waarbij wordt gestreefd naar ten minste 1,5 M ruwe sequentielezingen in elke richting voor elk monster. Gebruik aangepaste primers (Tabel 1) voor NextSeq-sequencing, maar dit is optioneel voor sequencing op MiSeq.
   OPMERKING: Sequencing kan worden uitgevoerd met behulp van MiSeq- of NextSeq500-platforms. De keuze van het platform kan afhangen van de aard van de monsters en het totale aantal monsters.

12. Pijplijn voor gegevensanalyse

OPMERKING: Figuur 2 geeft een grafische illustratie van vereenvoudigde procedures die betrokken zijn bij de data-analysepijplijn, die onbewerkte sequentielezingen (in FASTQ-formaat) als invoer neemt en een overvloedsmatrix genereert met rijen die leden van kleine RNA-soorten van belang vertegenwoordigen en kolommen die monsters vertegenwoordigen. Voor sequencing aan het gekoppelde uiteinde komt elk monster overeen met twee FASTQ-bestanden, één voor de voorwaartse lezingen en de andere voor de achterwaartse lezingen. De volledige data analytics pipeline, met alle bijbehorende scripts en een handleiding met uitgebreide annotaties voor elke stap, is beschikbaar op GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git).

1. Haal onbewerkte sequentielezingen op uit het externe sequencingcentrum en beoordeel de sequencingkwaliteit met behulp van open-sourceprogramma's zoals FastQC¹⁴ of fastp¹⁵.
2. Maak een bibliotheek met referentiesequenties in FASTA-formaat.
   OPMERKING: De sleutel tot het aanpassingsvermogen van de pijplijn aan diverse kleine RNA-klassen is een geschikte referentiesequentiebibliotheek. Om nauwkeurige schattingen van de abundantie van leden van specifieke RNA-klassen van belang (bijv. miRNA) te bereiken, wordt van de gebruikers verwacht dat ze nauwgezet een referentiesequentiebibliotheek samenstellen voor gebruik met de pijplijn. Alle andere instructies voor de uitvoering van de pijplijn blijven consistent in verschillende kleine RNA-klassen.
3. Maak een map met de naam AQRNA-seq voor het implementeren van de data-analysepijplijn en plaats alle scripts, op kwaliteit gefilterde sequentielezingen en de referentiesequentiebibliotheek in deze map. Volg de gedetailleerde instructies op GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) om submappen voor te bereiden en essentiële wijzigingen aan te brengen in de bestanden voor het targeten van verschillende organismen en/of kleine RNA-soorten, evenals de compatibiliteit van het besturingssysteem en/of de taakplanner.
4. Implementeer de pijplijn voor gegevensanalyse volgens de stappen die worden beschreven in de handleiding op GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git), die beschrijvingen, invoer- en uitvoerbestanden bevat, evenals opdrachtregels voor elke stap. Samenvattend omvat de pijplijn (i) het bijsnijden van linkersequenties en willekeurige nucleotiden uit de lezingen, (ii) het filteren van lezingen op basis van hun lengte, (iii) het in kaart brengen van de lezingen aan de referentiesequenties, (iv) het oplossen van dubbelzinnige toewijzingen en (v) het genereren van de abundantiematrix.

Resultaten

Mycobacterium bovis BCG (bacillen de Calmette et Guérin) stam 1173P2 die een exponentiële groei doormaakten, werden onderworpen aan een tijdreeks (0, 4, 10 en 20 dagen) van uithongering van voedingsstoffen, gevolgd door een 6-daagse reanimatie in een voedingsrijk medium zoals eerder gepresenteerd in Hu et ^al.7. Kleine RNA's werden geïsoleerd uit een bacteriecultuur, met drie biologische replicaten, op elk van de vijf aangewezen tijdstippen. Illumina-bibliotheken werden gebouwd met behulp van de hierboven beschreven AQRNA-seq-bibliotheekvoorbereidingsworkflow (Figuur 1), gevolgd door sequencing op een sequencer in het BioMicro Center van het Massachusetts Institute of Technology. De sequentiegegevens werden vervolgens verwerkt met behulp van de AQRNA-seq-data-analysepijplijn (figuur 2) die is aangepast voor kwantificering van de tRNA-overvloed.

Na de PCR-amplificatie van de cDNA-bibliotheek met de sequencing-primers, werd de aanwezigheid van PCR-producten met een grootte van 175 basenparen (bp) waargenomen in alle monsters (Figuur 3A), wat wijst op de vorming van primerdimeren. Om de carry-over van primerdimeren te verminderen, werden PCR-producten met een grootte van meer dan 195 bp uit de gel weggesneden en gezuiverd (figuur 3B).

Op kwaliteit gefilterde en bijgesneden sequentielezingen werden toegewezen aan een aangepaste referentiesequentiebibliotheek, waaronder de 45 tRNA-isoacceptoren, de interne standaard en controlesequenties (d.w.z. 23S rRNA, 16S rRNA, 5S rRNA, rnpB en ssr). tRNA-isoacceptoren waren goed voor 10,5% tot 40,2% van de totale in kaart gebrachte lezingen van een bepaald monster en vertoonden een veel hogere abundantie dan de controlesequenties (figuur 4). Belangrijk is dat de relatief lage leesverhoudingen van tRNA-isoacceptoren kunnen worden toegeschreven aan de hogere relatieve overvloed van de interne standaarden. Daarom kunnen de leesverhoudingen van tRNA-isoacceptoren ten opzichte van interne standaarden (Figuur 4, roze versus groene kleurblokken) worden gecontroleerd door de operator door de hoeveelheid interne standaard die in de reactie wordt gespiket, te verfijnen.

De ruwe gegevens over de tRNA-overvloed werden genormaliseerd met behulp van de mediaan van ratio's-methode die werd geïmplementeerd met de DESeq2-pakketversie (hierna v) 1.36.0¹⁶ in R Statistical Programming Environment (hierna R genoemd) v 4.2.1¹⁷. Na normalisatie wordt een kwantitatief landschap van tRNA-isoacceptoren in Mycobacterium bovis BCG gedurende een tijdsverloop van uithongering en reanimatie van voedingsstoffen bereikt (Figuur 5).

Om verschillende clusters van monsters met verschillende fenotypes te onthullen op basis van patronen in de overvloed aan tRNA-isoacceptoren, werd Principal Component Analysis (PCA) uitgevoerd op de genormaliseerde tRNA-abundantiegegevens met behulp van het statistiekenpakket v 4.2.1¹⁷ in R (Figuur 6). De analyse onderscheidde monsters van uithongeringsdag 0 en reanimatiedag 6 van monsters van uithongeringsdagen 4, 10 en 20, wat wijst op een aanzienlijk verschil in het tRNA-landschap van Mycobacterium bovis BCG gekweekt in een voedingsarm medium en een voedingsrijk medium.

Om de dynamiek van de abundantie van elke tRNA-isoacceptor over de vijf aangewezen tijdstippen te profileren, werd differentiële expressieanalyse uitgevoerd op de genormaliseerde tRNA-abundantiegegevens met behulp van het DESeq2-pakket v 1.36.0 in R (Figuur 7). Uit de analyse bleek dat 17 van de 20 isoacceptorfamilies isoacceptoren bevatten die differentieel tot expressie werden gebracht (d.w.z. significant op- of neerwaarts gereguleerd) op ten minste één van de tijdstippen, wat wijst op een mogelijke rol van de regulatie van de tRNA-pool in de aanhoudende toestand van Mycobacterium bovis BCG tijdens tuberculose.

Figuur 1: Schema van de workflow voor de voorbereiding van de AQRNA-seq-bibliotheek. De belangrijkste stappen die in de workflow worden beschreven, worden in het midden van het schema vermeld en zijn door stippellijnen verbonden met hun respectieve grafische illustraties. De gedetailleerde beschrijving van elke stap is te vinden in de sectie Protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Schema van de AQRNA-seq data analytics pipeline. De belangrijkste stappen die in de pijplijn worden beschreven, worden in het midden van het schema vermeld en zijn door stippellijnen verbonden met hun respectieve grafische illustraties. De gedetailleerde beschrijving van elke stap is beschikbaar op GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Agarosegelelektroforese van de cDNA-fragmenten na PCR-amplificatie met sequencingprimers. (A) Afbeelding van de gel voorafgaand aan gelextractie en -zuivering. Banen 7 en 14 vanaf de linkerkant bevatten 5 μL van de 50 bp DNA-ladder, terwijl de andere banen 20 μL van elk van de 15 monsters bevatten. Groottelokalisatie van de PCR-producten geeft hun hoogste concentratie aan binnen het bereik van 175 bp (primerdimeren) tot 300 bp (twee primers + 120 bp 5S rRNA). (B) Afbeelding van de gel na gelextractie en -zuivering. Voor elk monster werd het gelblok tussen 200 bp en 400 bp weggesneden om de vervuiling van primerdimeren in de sequencingbibliotheek te minimaliseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 4: Aantal sequentielezingen dat met succes is toegewezen aan de bibliotheek met referentiesequenties. De x-as toont de namen van de monsters (bijv. D18-69XX) gegroepeerd op tijdstip (bijv. Hongerdag 0). Voor elke steekproef wordt het aantal leesbewerkingen dat is gekoppeld aan verschillende doelonderwerpcategorieën weergegeven met behulp van kleurblokken die op elkaar zijn gestapeld. Getallen in het midden van de kleurblokken vertegenwoordigen de verhoudingen van lezingen die overeenkomen met de respectieve doelonderwerpen binnen een bepaald monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Kwantitatief landschap van tRNA-isoacceptoren van Mycobacterium bovis BCG op verschillende tijdstippen langs het verloop van de uithongering en reanimatie. Ruwe tRNA-overvloedsgegevens werden genormaliseerd met behulp van de mediaan van ratio's-methode. Hier geeft elke rij genormaliseerde tRNA-abundanties (y-as) weer als gemiddelde ± standaardfout voor 3 biologische replicaten op elk tijdstip. Op de x-as werden isoacceptoren uit dezelfde familie gegroepeerd en gelabeld met het bijbehorende aminozuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Vierkante-cosinusgrafiek van monsters afgeleid van hoofdcomponentenanalyse (PCA). PCA werd uitgevoerd op basis van de genormaliseerde tRNA-overvloed. De gekwadrateerde cosinus geeft het belang van de hoofdcomponenten voor de monsters aan, en de monsters werden uitgezet ten opzichte van de kwadratische cosinus van de eerste twee hoofdcomponenten. Monsters werden gelabeld met behulp van monster-ID's en kleurgecodeerd op tijdstip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Differentiële expressie van tRNA-isoacceptoren over verschillende tijdstippen. Genormaliseerde tRNA-abundanties werden samengevat als gemiddelden (lijnknopen) ± standaardfout (foutbalken) over 3 biologische replicaten. Wegens ruimtegebrek werden de voorwaarden als volgt ingekort: S0-S20 = hongerdagen 0-20; R6 = reanimatie dag 6. Differentiële expressieanalyse werd uitgevoerd voor elke tRNA-isoacceptor, waarbij verschillende tijdstippen op een paarsgewijze manier werden vergeleken met behulp van de likelihood ratio-test en de Wald-test. Compacte letters werden gebruikt om statistische significantie weer te geven, waarbij de abundanties van een bepaalde tRNA-isoacceptor op tijdstippen die ten minste één gemeenschappelijke letter deelden, niet significant van elkaar verschilden. Bijvoorbeeld, de overvloed aan tRNA-Lys-CTT-1-1 (in het lysinepanel) werd significant neerwaarts gereguleerd van S0 naar S4 en van S4 naar S10, maar niet van S10 naar S20. Het werd toen aanzienlijk omhoog gereguleerd van S20 naar R6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Oligonucleotiden die betrokken zijn bij de workflow voor de voorbereiding van de AQRNA-seq-bibliotheek. De interne standaard is RNA, terwijl alle andere oligonucleotiden DNA zijn. De vermelde PCR-primers en aangepaste sequencing-primers zijn specifiek voor de sequencingplatforms. Extra PCR-primers kunnen worden ontworpen met nieuwe indexsequenties. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

De workflow voor de voorbereiding van de AQRNA-seq-bibliotheek is ontworpen om de opname van RNA's in een monster te maximaliseren en het afvallen van polymerase tijdens reverse transcriptie^{te minimaliseren 7}. Door middel van een tweestaps linkerligatie worden nieuwe DNA-oligo's (Linker 1 en Linker 2) in overmaat geligeerd om het RNA in het monster volledig aan te vullen. Overtollige linkers kunnen efficiënt worden verwijderd met RecJf, een exonuclease van 5' tot 3' dat specifiek is voor enkelstrengs DNA's, waarbij de geligeerde producten intact blijven. Bovendien vermindert AlkB-behandeling methylmodificaties op RNA's¹⁸, die polymerase-fall-off kunnen veroorzaken tijdens reverse transcriptie, en verlicht zo het probleem van artefactisch afgekapte cDNA-producten. AQRNA-seq vertegenwoordigt de eerste gerapporteerde methode om de ligatie- en amplificatie-efficiëntie systematisch te optimaliseren. AQRNA-seq is gevalideerd vanwege zijn kwantitatieve nauwkeurigheid en het ontbreken van bias-artefacten, en het is aangetoond dat het de meest nauwkeurige toepassing is voor miRNA-profileringsstudies.

AQRNA-seq is bijzonder uitgebreid en operationele zorg wordt aanbevolen voor temperatuur- en/of tijdgevoelige stappen tijdens de voorbereiding van de bibliotheek. Met name stappen voorafgaand aan cDNA-synthese (Figuur 1; stappen 1-4), waarbij monsters inherent onstabiel enkelstrengs RNA (ssRNA) of DNA-linker-ligated ssRNA bevatten, moeten zonder onnodige onderbrekingen worden uitgevoerd. RNA-hydrolyse (Figuur 1; stap 6) met behulp van een sterke base bij hoge temperatuur is zeer efficiënt in het verteren van RNA-sjablonen na omgekeerde transcriptie¹⁹. Er moet echter voor worden gezorgd dat langdurige blootstelling van het monster aan de sterke base en vertraagde neutralisatie met sterk zuur wordt vermeden, vooral bij een groot aantal monsters. Over het algemeen wordt ten zeerste aanbevolen om alle reacties op ijs voor te bereiden en herhaalde vries-dooicycli voor tussenproducten uit de bibliotheek te vermijden.

Het wordt aanbevolen om op belangrijke punten in de werkstroom een steekproef te nemen van tussenproducten in de bibliotheek voor kwaliteitscontroles en tijdige probleemoplossing van het proces. Het analyseren van monsters op geautomatiseerde elektroforese-instrumenten kan het succes en de efficiëntie van linkerligatie bepalen (Figuur 1; stappen 2 en 7). Het visualiseren van de lokalisatie van geïndexeerde cDNA-producten na PCR-toevoeging van sequencingprimers (Figuur 1; stap 9) via agarosegelelektroforese kan helpen bij het beoordelen van de geschiktheid van PCR-cycli en bij het identificeren van mogelijke degradatie van monsters en/of de aanwezigheid van primerdimeren. De PCR- en sequencingprimers kunnen opnieuw worden ontworpen om compatibel te zijn met het sequencingplatform van de operator in kwestie.

Mede vanwege de verschillende ontwerpen die betrokken waren bij de voorbereiding van de bibliotheek, werd de AQRNA-seq-pijplijn voor gegevensanalyse voornamelijk opgebouwd uit aangepaste scripts, waarin slechts een handvol bestaande bio-informaticaprogramma's waren opgenomen. Voor het uitlijnen van sequentielezingen met de referentiesequentiebibliotheek werd echter de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)²⁰ gebruikt vanwege de verschillende sterke punten die voldoen aan specifieke behoeften van AQRNA-seq-gegevensanalyse. Deze omvatten (i) de mogelijkheid om leessnelheden korter dan 20 bp uit te lijnen en substring-uitlijningen uit te voeren, (ii) een verstandige omgang met dubbelzinnige basen (N's), (iii) de iets hogere uitlijningsnauwkeurigheid, en (iv) de informatieve output die substantiële details biedt, zoals mismatches en hiaten, wat bevorderlijk is voor diverse stroomafwaartse analyses.

Er zijn met name nog verschillende ontwerpuitdagingen in zowel de workflow voor bibliotheekvoorbereiding als de data-analysepijplijn van AQRNA-seq, die verdere optimalisaties rechtvaardigen en de focus vormen van het huidige werk in uitvoering. Ten eerste werd de superieure kwantitatieve nauwkeurigheid van AQRNA-seq in vergelijking met conventionele RNA-seq-methoden bereikt met 50-75 ng kleine RNA-input, terwijl de workflow momenteel wordt getest met verminderde hoeveelheden input-RNA's om de gevoeligheid te verbeteren en met langere RNA's om de bruikbaarheid ervan te verbreden. Ten tweede, hoewel posttranscriptionele methylering enzymatisch wordt verwijderd met AlkB, zijn er andere RNA-modificaties die polymerase-fall-off kunnen veroorzaken tijdens reverse transcriptie¹⁰. Dit kan leiden tot artefactische afgekapte cDNA-producten die niet effectief kunnen worden onderscheiden van biologisch betekenisvolle 5'-afbraak van tRNA's over de volledige lengte. Daarom worden momenteel verschillende mogelijke manieren geëvalueerd om de processiviteit van reverse transcriptase verder te verbeteren op effectiviteit en compatibiliteit met AQRNA-seq. Ten derde is de verwijdering van primerdimeren door middel van gelextractie en -zuivering inefficiënt en leidt dit steevast tot een verlies van de doelfragmenten en een grotere variabiliteit tussen bibliotheken. Daarom biedt het beperken van de mogelijke overdracht van primerdimeren zonder verlies van doelfragmenten een kans om de gevoeligheid en kwantitatieve nauwkeurigheid van AQRNA-seq verder te verbeteren. Belangrijk is dat zowel de AlkB-behandeling als de gelextractie en -zuivering arbeidsintensief zijn, waardoor ze suboptimaal zijn voor het verwerken van grote aantallen monsters. Met de verbeteringen die op bovengenoemde gebieden zijn bereikt, zal automatisering en high-throughput verwerking van de AQRNA-seq-methode in de toekomst mogelijk worden gemaakt. De voortdurende verfijning van de pijplijn voor gegevensanalyse geeft prioriteit aan verbeteringen in efficiëntie, kwantitatieve nauwkeurigheid en flexibiliteit. Terwijl de huidige pijplijn effectief 3'-adapters afsnijdt van de sequentie-reads, beschikt een subset van reads ook over 5'-adaptersequenties, waarschijnlijk als gevolg van onvoldoende blokkering van het 3'-uiteinde van de linkers tijdens ligatie. De aanwezigheid van 5'-adaptersequenties kan de kwantitatieve nauwkeurigheid in gevaar brengen door de uitlijning van de sequentie te verstoren. Daarom wordt een adequate verwijdering van zowel 3'- als 5'-adaptersequenties gegarandeerd door gebruik te maken van extra adaptertrimgereedschappen zoals Cutadapt²¹. Om de efficiëntie te vergroten, zal de herziene pijplijn rationele strategieën integreren om de rekentijd te verkorten. Dit omvat een gepaarde stap voor het samenstellen van lezen aan het einde om voorwaartse en achterwaartse leesbewerkingen samen te voegen door een aanzienlijke overlap te identificeren en unieke sequenties te extraheren, samen met hun voorkomens in elke bibliotheek. Verwacht wordt dat dergelijke strategieën de downstream rekentijd aanzienlijk zullen verkorten door redundante analyse van (i) leesbewerkingen uit beide richtingen en (ii) dubbele sequenties te vermijden die de sequentieleespool van AQRNA-seq-bibliotheken kunnen domineren. In de toekomst zal de synergetische optimalisatie van zowel de workflow voor bibliotheekvoorbereiding als de data-analysepijplijn van AQRNA-seq waarschijnlijk diverse mogelijkheden bieden voor het rigoureuze kwantitatieve onderzoek van alle vormen van RNA (bijv. transcriptoom, tRNA-fragmenten en zeldzame RNA-soorten zoals circulerende tumor-RNA's), het in kaart brengen van tRNA-modificaties en andere cruciale gebieden van biomarker- en ontdekkingsbiologie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-ketoglutaraat	Sigma-Aldrich	75890	Bereid een werkoplossing (1 M) en bewaar deze bij -20ºC
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2938C
Adenosine 5'-Trifosfaat (ATP)	New England Biolabs	M0437M (component #: N0437AVIAL)	NEB M0437M bevat T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reactiebuffer (10X), PEG 8000 (1X) en ATP (100 mM); bereid een werkoplossing (10 mM) en bewaar deze bij -20ºC
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Bewaar bij kamertemperatuur
Ammonium ijzer(II) sulfaat hexahydraat	Sigma-Aldrich	F2262	Bereid een werkoplossing (0,25 M) en bewaar deze bij -20 °C
Bioanalyzer Small RNA Analysis	Agilent	5067-1548	De Small RNA Analysis wordt gebruikt voor het controleren van de kwaliteit van invoer-RNA's en de efficiëntie van enzymatische reacties (bijv. Linker 1 ligatie)
Rundvlees Serum Albumine (BSA; 10 mg/mL)	New England Biolabs	B9000	Dit product werd op 12/15/2022 stopgezet en is vervangen door Recombinant Albumine, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4441-10
Demethylase	ArrayStar	AS-FS-004	Demethylase wordt geleverd met de rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthese Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Oplossingsmix	New England Biolabs	N0447L (component #: N0447LVIAL)	Deze dNTP Oplossingsmix bevat gelijkwaardige concentraties van dATP, dCTP, dGTP en dTTP (10 mM elk)
Digital Dual Heat Block	VWR Scientific Products	13259-052	Het verwarmingsblok wordt gebruikt met de QIAquick Gel Extractie Kit
DyeEx 2.0 Spin Kit	Qiagen	63204	Effectief voor het verwijderen van korte restanten (bijv. oligo's minder dan 10 bp in lengte)
Elektroforese Voeding	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0,5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0,5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1,5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)	Eppendorf	022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), Puur	Sigma-Aldrich	E7023	Het pure ethanol wordt gebruikt met de Oligo Clean en Concentrator Kit van Zymo Research
Gel Imaging Systeem	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Ladingskleurstof, Paars (6X), geen SDS	New England Biolabs	N0556S (component #: B7025SVIAL)	NEB N0556S bevat Quick-Load Paars 50 bp DNA Ladder en Gel Ladingskleurstof, Paars (6X), geen SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrofotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	De spectrofotometer wordt gebruikt voor het meten van de oligoconcentraties met behulp van de Wet van Beer's
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Bereid een werkoplossing (1 M; pH = 8 met NaOH) en bewaar deze bij -20 °C
Zoutzuur (HCl)	VWR Scientific Products	BDH3028	Bereid een werkoplossing (5 M) en bewaar deze bij kamertemperatuur
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Puur	Macron Fine Chemicals	3032-16	Isopropanol wordt gebruikt met de QIAquick Gel Extractie Kit
L-Ascorbinezuur	Sigma-Aldrich	A5960	Bereid een werkoplossing (0,5 M) en bewaar deze bij -20ºC
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spectrofotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (component #: B7002SVIAL)	NEB M0264L bevat RecJf (30 U/μL) en NEBuffer 2 (10X); bewaar bij -20 °C
Nuclease-Vrij Water (niet DEPC-Behandeld)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Oligo Clean & Concentrator Kit	Zymo Research	D4061	Bewaar bij kamertemperatuur
PEG 8000 (50% oplossing)	New England Biolabs	M0437M (component #: B1004SVIAL)	NEB M0437M bevat T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reactiebuffer (10X), PEG 8000 (1X) en ATP (100 mM); bereid een werkoplossing (10 mM) en bewaar deze bij -20ºC
Peltier Thermische Cycler	MJ Research	PTC-200
Fenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2	Thermo Fisher Scientific	J62336
PrimeScript Buffer (5X)	TaKaRa	2680A
PrimeScript Reverse Transcriptase	TaKaRa	2680A
QIAquick Gel Extractie Kit	Qiagen	28704	Deze kit vereist een verwarmingsblok en isopropanol om mee te werken
Quick-Load Paars 100 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0551S (component #: N0551SVIAL)