Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Chirurgische perfusie en isolatie van de alvleesklier van varkens voor isolatie van eilandjes

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66350

⸱

7 juni 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Section of Vascular Surgery, Washington University School of Medicine, 2CardioVascular Research Innovation in Surgery and Engineering Center, Washington University School of Medicine, 3Department of Medicine, Division of Nephrology, Washington University School of Medicine, 4Department of Medicine, Division of Endocrinology, Washington University School of Medicine, 5Department of Surgery, Section of Transplant Surgery, Washington University School of Medicine, 6Division of Molecular Cell Biology, Washington University School of Medicine, 7Department of Biomedical Engineering, Washington University McKelvey School of Engineering

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor de aanschaf van een alvleesklier van varkens voor isolatie en zuivering van eilandjes.

Samenvatting

Transplantatie van pancreaseilandjes is een opkomende behandeling voor diabetes type I; Het wordt echter beperkt door het matchen en de beschikbaarheid van donateurs. Xenotransplantatie van eilandjes bij varkens biedt een veelbelovend alternatief voor allotransplantatie, met het potentieel voor grootschalige productie van on-demand, functionele eilandjes. De opbrengst en levensvatbaarheid van geïsoleerde eilandjes is zeer afhankelijk van de kwaliteit van de donoralvleesklier en de verkrijgingsmethode, met name de duur van de warme-ischemie. Om het behoud van organen en de daaropvolgende opbrengst en levensvatbaarheid van eilandjes te verbeteren, hebben we een protocol ontwikkeld voor chirurgische perfusie en resectie van de alvleesklier van varkens. Dit protocol maakt gebruik van directe infrarenale aortacanulatie en orgaanperfusie om zowel de tijd van warme ischemie te minimaliseren als de procedure te vereenvoudigen voor operators die geen uitgebreide chirurgische expertise hebben. Daaropvolgende arteriële perfusie van de alvleesklier via de aorta spoelt stilstaand bloed uit de microvasculatuur, waardoor trombose en oxidatieve schade aan het weefsel worden verminderd. Dit manuscript biedt een gedetailleerd protocol voor chirurgische perfusie en resectie van de alvleesklier van varkens, gevolgd door isolatie en zuivering van eilandjes.

Inleiding

Diabetes type 1 wordt veroorzaakt door de auto-immuunvernietiging van bètacellen van de alvleesklier1. Bijgevolg zijn patiënten afhankelijk van exogene insuline, waardoor ze risicovolle glykemische fluctuaties krijgen met episodes van hyper- en hypoglykemie2. Allotransplantatie van eilandjes is een mogelijke remedie voor diabetes type I; De beperkte beschikbaarheid van pancreasorgaandonoren blijft echter een grote barrière voor een wijdverbreide toepassing van de procedure 2,3. Xenotransplantatie van eilandjes van varkensdonoren is een veelbelovend alternatief, aangezien deze dieren gemakkelijk beschikbaar zijn. Optimalisatie en schaalvergroting van de isolatie van eilandjes van varkenspancreas zal van cruciaal belang zijn voor het voortschrijden van xenotransplantatie van eilandjes.

Hoewel er eerder verschillende technieken voor het verkrijgen van varkensalvleesklier zijn gepubliceerd, beschrijven veel van deze procedures pancreatectomie na inductie van hartdood of bloedverbloeding 4,5,6,7,8,9,10. Een groot nadeel van deze technieken is de variabele warme ischemische tijd (WIT) die optreedt tussen het moment van hartdood en de start van intra-arteriële en/of intraductale infusie van conserveringsoplossing. Zelfs 10 minuten WIT heeft een negatieve invloed op de opbrengst en levensvatbaarheid van eilandjes5. Het minimaliseren van WIT vereist een snelle perfusie van de alvleesklier met een conserveringsoplossing. Tijdens de verkrijging van abdominale organen is aortacanulatie gevolgd door intracorporale perfusie met een oplossing van de Universiteit van Wisconsin (UW) cruciaal voor het verwijderen van bloed, het voorkomen van intravasculaire trombose, het beschermen tegen ischemische schade en het minimaliseren van cellulair letsel11,12.

Eerdere studies hebben aangetoond dat tijdens de aanschaf van de alvleesklier van varkens, het spoelen onder lage druk van de coeliakiestam en de superieure mesenteriale slagader met UW-oplossing de opbrengst en zuiverheid van eilandjes verbetert4. Eerder gepubliceerde methoden voor de aanschaf van varkenspancreas omvatten echter open aortacanuleatie, wat technisch uitdagend kan zijn, vooral voor kleinere varkens 13,14,15. In dit manuscript presenteren we een gedetailleerd, stapsgewijs protocol met bijbehorende visuele hulpmiddelen voor de chirurgische perfusie en verkrijging van de varkenspancreas, gevolgd door isolatie en zuivering van eilandjes. Deze nieuwe techniek van aortacanulatie tijdens pancreasisolatie is speciaal ontwikkeld om WIT te minimaliseren en de pancreasverkrijging in een bloedloos veld mogelijk te maken als een middel om de opbrengst en levensvatbaarheid van eilandjesisolatie te maximaliseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren betrokken zijn, zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Washington University School of Medicine Division of Comparative Medicine. Volwassen Yorkshire-varkens van 35 tot 35 kg zijn ideaal voor deze procedure; Het protocol kan echter worden aangepast voor varkens van verschillende grootte, afhankelijk van de experimentele context. De hele procedure moet op een steriele manier worden uitgevoerd in een operatiekameropstelling.

1. Preoperatieve voorbereiding en anesthesie

  1. Verdedig het varken met een cocktail van 4 mg/kg tiletamine en zolazepam, 20 mg/kg ketamine en 2 mg/kg xylazine intramusculair geïnjecteerd.
  2. Breng perifere veneuze toegang tot stand via de auriculaire ader.
  3. Induceer algemene anesthesie met geïnhaleerd 1%-3% isofluraan in 100% zuurstof en intubeer het varken endotracheaal.
    OPMERKING: Het kan de voorkeur hebben om propofol of een ander intraveneus inductiemiddel te gebruiken in plaats van inhalatiemiddel voor inductie voor een soepelere inductie- en intubatieprocedure. De vitale functies, end-tidal CO2, zuurstofverzadiging en cardiale golfvorm worden continu gecontroleerd om de diepte van de anesthesie te beoordelen en te behouden. Het abdominale chirurgische vliegtuig wordt bevestigd met behulp van echografie aan het bed.
  4. Scheer en bereid het varken voor met chloorhexidinegluconaat van de sternale inkeping tot de bilaterale lies.
  5. Drapeer het operatieveld met een duidelijk zicht op de hele buik (Figuur 1A).

2. Operatieve opstelling en belichting van het retroperitoneum

  1. Voer een incisie in de middellijn laparotomie uit (Figuur 1B).
    1. Gebruik een scalpel met 10 mesjes en elektrocauterisatie om een laparotomie op de middellijn te maken van het xiphoid-proces tot het schaambeen. Zorg ervoor dat de incisie rond de inferieure urogenitale opening van de buik wordt gebogen.
  2. Voer een rechtse viscerale rotatie uit.
    1. Externaliseer de rechter dikke darm en dunne darm en wikkel ze in een steriele handdoek.
    2. Trek de dikke darm en darm voorzichtig naar links terug om het rechter retroperitoneum bloot te leggen en vermijd darmtorsie of malrotatie.
  3. Laat de blaas leeglopen (optioneel).
    1. Als de blaas vol is en de blootstelling beïnvloedt, pak dan de blaas vast tussen twee DeBakey-tangen en gebruik een scalpel met 11 mesjes om de ventrale blaaswand in te snijden.
    2. Plaats een Yankauer-zuigtip in de blaas om de urine af te voeren en de blaas te decomprimeren.
  4. Plaats een abdominale retractorset om een optimale belichting van het rechter retroperitoneum mogelijk te maken (Figuur 1C).

3. Retroperitoneale dissectie

  1. Begin met retroperitoneale dissectie (Figuur 2A).
    1. Gebruik elektrocauterisatie om het buikvlies rechts van de middellijn in te snijden, vanaf het niveau van de rechternier tot de aortabifurcatie.
    2. Leg de infrarenale aorta, de inferieure vena cava (IVC) en de rechter nierslagader en ader scherp bloot
  2. Verkrijg omtrekcontrole van de distale infrarenale aorta met een grote vaatlus.
  3. Ligate de IVC (Figuur 2B).
    1. Verkrijg omtrekcontrole van de mid-infrarenale IVC.
    2. Bind de IVC vast met een 2-0 zijden stropdas.
  4. Maak de niervaten los (Figuur 2C).
    1. Verkrijg omtrekcontrole van de rechter en linker nierslagaders en aders.
    2. Maak deze structuren vast met behulp van 2-0 zijden banden.
    3. Als er meerdere nierslagaders zijn, isoleer en ligate dan op dezelfde manier elk van deze bloedvaten.

4. Intrathoracale dissectie

  1. Snijd het rechter hemiafijnrif in (Figuur 3A).
    1. Trek de lever voorzichtig inferieur terug om het rechter hemiaphragm bloot te leggen. Breng twee Allis-klemmen aan op het vliezige deel van het rechter hemidiaphragm en snijd het diafragma tussen de twee clamps in met behulp van elektrocauterisatie.
    2. Verleng de myotomie van het diafragma tot ongeveer 7 cm horizontaal.
  2. Verkrijg omtrekcontrole van de intrathoracale IVC (Figuur 3B).
    1. Plaats een 2-0 zijden stropdas rond de intrathoracale IVC. Breek de uiteinden van de hechting af met een kleine hemostaat zonder de IVC af te sluiten.
  3. Verleng de middenriftomie naar het linker hemidiafragma (Figuur 3C).
    1. Gebruik twee Allis-klemmen om de rand van het diafragma inferieur in te trekken en uit te strekken naar het linker hemiafdiafragma.
      OPMERKING: Vermijd het betreden van het hartzakje tijdens het middenrif.
  4. Leg de dalende thoracale aorta bloot in het linker posteromediale borstgebied.

5. Infrarenale aortacanulatie, viscerale isolatie en perfusie

  1. Systemisch anticoaguleren van het varken.
    1. Systemische heparine (100 E/kg) toedienen via perifere veneuze toegang. Wacht 3 minuten voordat u doorgaat met aortacanuleatie.
  2. Krijg toegang tot de infrarenale aorta met behulp van een micropunctienaald van 18 G (Figuur 4A).
  3. Steek een j-draad door de naald in de aorta en verwijder de naald over de draad.
  4. Plaats een 10Fr-huls over de draad in de aorta en verwijder de draad (Figuur 4B).
  5. Sluit de IV-slang aan op de 10Fr-huls en laat op steriele wijze UW-oplossing door de huls trekken. Infuseren met UW-oplossing met een snelheid van 40-60 druppels/min.
    OPMERKING: De stroom begint pas als de thoracale aorta kruislings is vastgeklemd. Zorg ervoor dat de intraveneuze slang niet op spanning staat om verplaatsing van de intra-aortahuls te voorkomen.
  6. Voer viscerale isolatie en perfusie snel achter elkaar uit.
    1. Klem de infrarenale aorta af met een aortaklem.
    2. Klem de dalende thoracale aorta af met behulp van een aortaklem.
    3. Sluit de intrathoracale IVC af met de eerder geplaatste 2-0 gelijkspel.
    4. Toedienen 100 mg/kg KCl voor euthanasie via perifere veneuze toegang.
      OPMERKING: Hartdood begint met de toediening van KCl.
    5. Maak een venotomie in de infrarenale IVC, superieur aan de 2-0 gelijkspel, en plaats zwembadgetipte afzuiging door de venotomie (Figuur 4C).
    6. Doordrenk de ingewanden met 2-3 L koude UW-oplossing.
    7. Ga verder met dissectie voor totale pancreatectomie tijdens de perfusie.
      OPMERKING: De ingewanden, en met name de alvleesklier, moeten bleek worden als de UW-oplossing in het vaste orgaangebied wordt geperfundeerd (Figuur 5A).

6. Totale pancreatectomie

  1. Laat de dunne darm los van retractie terwijl de UW-oplossing aan het parfumeren is.
  2. Begin met dissectie van de twaalfvingerige, verbindende en miltkwabben van de alvleesklier tijdens de viscerale perfusie. Trek de maag superieur terug om de alvleesklier bloot te leggen. Met een combinatie van stompe dissectie en elektrocauterisatie, ontleedt u de alvleesklier van zijn omentale aanhechtingen.
    OPMERKING: Het lichaam van de alvleesklier wikkelt zich effectief om de poortader. Zorg ervoor dat de poortader niet naar achteren naar de twaalfvingerige darmkwab loopt en vervolgens naar voren naar de brug en de verbindingslobben.
  3. Isoleer de ductus pancreaticus (Figuur 5B). Zoek het pancreaskanaal waar het de twaalfvingerige darm binnenkomt. Maak het kanaal vast met behulp van twee 3-0 zijden banden en snijd het kanaal tussen de banden door.
  4. Volledige pancreatectomie (Figuur 5C).
    1. Ontleed de rest van de twaalfvingerige darmkwab van de C-lus van de twaalfvingerige darm totdat deze vrij beweegbaar is.
    2. Scheid de alvleesklier van de resterende aanhechtingen. Bind en verdeel voorzichtig de kleine bloedvaten van de superieure mesenteriale slagader naar de alvleesklier.
    3. Scheid de alvleesklier van de poortader. Ontleed het lichaam van de alvleesklier en de verbindingskwab van de poortader. Ligate eventuele veneuze takken van de poortader naar de alvleesklier, inclusief de miltine.
      1. Transsnijd de brug van de alvleesklier tussen de verbindingskwab en de miltkwab om vrije mobilisatie vanuit de poortader mogelijk te maken.
        OPMERKING: Zorg ervoor dat u de kwab van de twaalfvingerige darm van de pancreas niet verstoort van de miltkwab.
  5. Dompel de hele alvleesklier onder in een koude, steriele UW-oplossing en plaats de container onmiddellijk op ijs. Transporteer de alvleesklier naar een steriele kap voor isolatie van eilandjes. Ga verder met de isolatie van het eilandje van de alvleesklier (Figuur 6).

7. Canultie van de ductus pancreaticus

  1. Plaats de alvleesklier op een steriele bak op ijs in de bioveiligheidskast.
  2. Ontleed overtollig vezelig weefsel en bloed uit de buurt van de alvleesklier.
  3. Snijd indien nodig het kanaal dwars door om het lumen beter te visualiseren. Lokaliseer de canule en schuif deze in het kanaal met een katheter van de juiste maat (16 G).
  4. Zet de katheter op zijn plaats vast met een 2.0 zijden band, maar vermijd het afsluiten van het lumen.
  5. Bereid drie ontsmettingsoplossingen voor en dompel de gecanuleerde alvleesklier 60 s onder in elke ontsmettingsoplossing.

8. Perfusie en uitzetting van de alvleesklier

  1. Bereid de enzymverteringsoplossing voor (Figuur 6).
    1. Meng 100 mg in de handel verkrijgbare collagenase 1 en 2 oplossingen (zie Materiaaltabel voor meer details) met de gewenste hoeveelheid 1x HBSS en 10.000 U Heparine-oplossing. Als het geïsoleerde pancreasweefsel tussen 100 g en 200 g is, meng dan het enzym met 200 ml in totaal 1x HBSS en heparine-oplossing.
  2. Doordrenk de alvleesklier met de enzymoplossing.
    1. Breng met gecontroleerde matige kracht enzymoplossing in bolussen van 60 ml in het pancreaskanaal. Ga door met dit proces totdat het geheel van de enzymoplossing in de alvleesklier is toegediend.
      OPMERKING: Effectieve infusie moet ervoor zorgen dat het weefsel van de alvleesklier opzwelt.
    2. Als er een enzymoplossing uit het weefsel van de alvleesklier in de steriele bak lekt, injecteer deze resterende oplossing dan opnieuw in de alvleesklier in stap 8.3 of plaats deze in stap 9.2 in de Ricordi-kamer.
  3. Injecteer de resterende enzymoplossing rechtstreeks in slecht opgezwollen pancreasparenchymsegmenten met behulp van een naald van 22 G.

9. Vertering van de alvleesklier

  1. Plaats het circuitreservoir met 500 ml 1x HBSS in een waterbad dat is ingesteld op 47 °C om de reservoiroplossing voor te verwarmen.
    OPMERKING: De enzymoplossing functioneert optimaal bij 36-38 °C en deze temperatuur moet binnen 5 minuten na het starten van de peristaltische pomp worden bereikt. De temperatuur van de inhoud van de Ricordi, inclusief de met enzymen doordrenkte alvleesklier, is aanvankelijk 4 °C. Door het circuitreservoir voor te verwarmen tot 47 °C, zullen de inhoud van het reservoir en de Ricordi-kamer zich vermengen, waardoor de temperatuur van het gehele circuit binnen 5 minuten na het starten van de peristaltische pomp op 36-38 °C komt.
  2. Verwijder de katheter uit de ductus pancreaticus en gooi deze weg en snijd de alvleesklier in stukken van ~1-3 cm.
  3. Bereid het spijsverteringscircuit voor. De peristaltische pomp zal de oplossing uit het reservoir van het spijsverteringscircuit door de verwarmingsspiraal en in de Ricordi-kamer laten circuleren (Figuur 6).
  4. Plaats de stukjes alvleesklier met negen siliciumnitride-knikkers van 1,5 cm in de Ricordi-kamer en vul tot het filterniveau met de resterende enzymoplossing.
  5. Om de Ricordi-kamer af te dichten, plaatst u het gaasfilter en de rubberen pakking, gevolgd door het deksel op de Ricordi-kamer. Zet het deksel van de Ricordi-kamer vast door de schroeven vast te draaien en zorg ervoor dat de kamer goed is afgesloten voordat u verder gaat.
  6. Plaats de verwarmingsspiraal in een warmwaterbad van 47 °C.
  7. Plaats de instroom- en uitstroomcanules in het reservoir van het vergistingscircuit met 500 ml 1x HBSS.
  8. Start de pomp met een debiet van 450 ml/min totdat de hele kamer is gevuld met de digestieoplossing. Verlaag het debiet tot 100 ml/min terwijl de vloeistof in het circuit circuleert.
  9. Schud de spijsverteringskamer handmatig om het weefsel te roeren met de siliciumnitride-knikkers.
  10. Neem vanaf 8 minuten spijsvertering een monster van 1 ml uit het circuitreservoir voor dithizone (DTZ)-kleuring om de voortgang van de spijsvertering te volgen.
    1. Om DTZ-kleuring voor te bereiden, lost u 10 mg DTZ op in 2 ml dimethylsulfoxide (DMSO).
    2. Voeg 10 μL van de bereide DTZ-kleuring toe aan 1 ml van het digestiemonster. Inspecteer het monster onder een vergroting van 4x. Eilandjes zien er donkerrood tot zwart uit met DTZ-kleuring.
      OPMERKING: De spijsvertering is voltooid wanneer de meeste of alle waargenomen eilandjes 'vrij' en intact zijn, waarbij het acinaire weefsel in kleinere clusters is verspreid.
  11. Wanneer de spijsvertering is voltooid, brengt u de spoel over naar het ijsbad, verwijdert u de instroomcanule uit het reservoir en verhoogt u de pompsnelheid tot 210-250 ml/min. Laat het verteerde weefsel uit de Ricordi-kamer weglopen in het circuitreservoir.
    OPMERKING: Het is typisch om te zien dat er na de spijsvertering heel weinig weefsel in de Ricordi-kamer achterblijft. Doorgaans blijft er <10% onverteerd pancreasweefsel over, hoewel dit kan variëren als gevolg van monsterspecifieke factoren.
  12. Weeg het resterende weefsel om de efficiëntie van de vertering te bepalen. Breng het verteerde weefsel over van het circuitreservoir in conische buizen van 250 ml die koel worden gehouden op ijs.

10. Verzameling van pancreasweefsel

  1. Centrifugeer het verteerde alvleesklierweefsel in conische buisjes van 250 ml bij 250 × g gedurende 1 minuut bij 4 °C zonder rem.
  2. Verwijder de buisjes voorzichtig uit de centrifuge en zuig het supernatans op met een serologische pipet zonder verstoring van de pellet.
  3. Resuspendeer de pellets in elke conische buis voorzichtig en combineer ze tot een conische buis van 250 ml. Als er ≤50 ml weefsel is, resuspendeer de pellet dan tot een totaal volume van 100 ml in Islet Collection Solution. Als er >50 ml weefsel is, resuspendeer de pellet dan tot een totaal volume van 200 ml in Islet Collection Solution. In het geval dat meer dan 100 ml weefsel wordt verzameld, voert u twee zuiveringscycli van de celprocessor uit.
  4. Resuspendeer het weefsel in RPMI-medium om een totaal volume van 100 ml te maken (ervan uitgaande dat 50 ml weefsel is verzameld) en laad het in de celprocessor.

11. Zuivering van eilandjes met behulp van de continue gradiëntmethode

  1. Bereid de celprocessor voor volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Laad 125 ml High Density-gradiëntoplossing in de continue gradiëntvormer en laad vervolgens de High Density-gradiëntoplossing in de celprocessor met behulp van een pomp die is ingesteld op 200 ml/min.
  3. Start de centrifugefunctie van de Cell Processor bij 1.000 tpm.
  4. Laat de lucht uit het systeem ontsnappen en vul opnieuw met High-density Gradient Solution.
  5. Voeg 125 ml gradiëntoplossing met hoge dichtheid en 130 ml oplossing met lage dichtheid toe aan de gradiëntvormer.
  6. Laad de 100 ml verteerde weefselsuspensie.
  7. Verhoog de snelheid van de celprocessor tot 2.000 RPM gedurende 3 minuten.
  8. Bereid 16 conische buizen van 50 ml voor voor het verzamelen van gezuiverde eilandjesfracties. Voeg 25 ml RPMI-medium toe aan elke buis en rangschik alle buizen in oplopende volgorde.
  9. Verzamel de gezuiverde eilandjesfracties in de voorbereide conische verzamelbuizen.

12. Beoordeling en kleuring van eilandjes

  1. Verzamel aliquots van 100-200 μL van elk van de gezuiverde eilandjesfracties en plaats ze in een weefselkweekplaat met 24 putjes voor DTZ-kleuring om de eilandjesinhoud te beoordelen en van elke zuiveringsfractie. Inspecteer elke fractie met behulp van lichtmicroscopie met 4x vergroting. De eilandjes zien er donkerrood tot zwart uit met DTZ-kleuring.
  2. Zodra de eilandjes zijn geïdentificeerd, selecteert u de fracties met het hoogste gehalte aan eilandjes. Centrifugeer de gezuiverde fractie bij 250 × g gedurende 1 minuut bij 4 °C zonder rem.
  3. Zuig het supernatans voorzichtig op en resuspendeer de eilandjespellet in groeimedia van eilandjes. Breng de gezuiverde eilandjes over in 1-4 T-125 kweekkolven.
  4. Evalueer de eilandjes na zuivering op kwantiteit, levensvatbaarheid en functie.
    1. Gebruik een eilandjesteller om het aantal eilandjes en de grootteverdeling te evalueren (Figuur 7A). Een hele alvleesklier levert doorgaans 1-2 miljoen eilandjesequivalenten op.
    2. Meng voor levensvatbaarheidskleuring 2 μL calceïne AM en 2 μL ethidiumhomodimeer-1 (CaAM/EthD-1) met 1.000 μL PBS (Figuur 7B). Laat de eilandjes 30 minuten beitsen en evalueer ze vervolgens met een vergroting van minder dan 4x of 10x. Levensvatbare eilandjes zullen groen kleuren, terwijl niet-levensvatbare eilandjes rood zullen kleuren.

13. Celcultuur van pancreaseilandjes

  1. Kweek de eilandjes gedurende de eerste 48 uur in herstelmedium bij 37 °C om voldoende voedingsstoffen te leveren (~1.000 eilandjes/ml herstelmedium).
  2. Kweek de eilandjes van dag 2-21 in een standaard groeimedium bij 37 °C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De operatieve opstelling en laparotomie op de middellijn worden weergegeven in figuur 1. De incisie in de laparotomie moet gebogen zijn om de urogenitale opening te voorkomen (Figuur 1B). Bevestig bij het opzetten van het oprolmechanisme de paal voor het Omni- of Bookwalter-oprolmechanisme aan de linker, onderste hoek van de tafel. Ideale retractie omvat twee oprolbladen voor de rechter buikwand, twee voor de linker buikwand en ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Xenotransplantatie van pancreaseilandjes met behulp van varkensdonoren is een veelbelovende strategie voor de behandeling van diabetes type I. De isolatie van eilandjes is een uitdaging en de uiteindelijke levensvatbaarheid en opbrengst van eilandjes zijn zeer gevoelig voor hypotensie en weefselischemie die worden aangetroffen tijdens de verkrijging van organen16,17. Om de verkrijging en bewaring van de alvleesklier te optimalise...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs melden geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit manuscript werd ondersteund door een klinische innovatiesubsidie van de Mid-America Transplant Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 M NaOH, 100 mLMillipore Sigma1310-73-2
10x HBSS, 500 mL (15 to 30 °C)Thermo Fisher14065056
1x D-PBS, 500 mLThermo Fisher14200075
1x HBSS, 1 LThermo Fisher14025076
250 mL Conical TubesMillipore SigmaCLS430236-6EA
Amphotericin B [50 mg]Millipore SigmaPHR1662
Antiseptic Povidone Iodine 10%Millipore Sigma25655-41-8
BioRad Gradient FormerBioRad395
Calcium Chloride dihydrateThermo Fisher10035-04-8
COBE Cell ProcessorEbay317690 
Digestion circuit reservoir, Gibco bottle, 1 LThermo Fisher10341001
Dimethylsulfoxide (DMSO)Thermo Fisher85190
DithizoneThermo Fisher60-10-6
Gradient Former Connection KitBioRad1652008
Heparin [1000 U/mL]Emergency Medical Products0409-2720-01
HEPES Buffer (1 M), 100 mLThermo Fisher15630080
Human Serum Albumin 25%, 100 mLCelprogenHSA2001-25-1
IsofluraneCovetrusItem#:11695067772
KetaminePattersonItem #:07-894-8462
Liberase (100 mg)Millipore Sigma5401020001
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity KitThermo FisherL3224
Lympholyte 1.1 Media 500 mLCedarlane LabsCL5020
Masterflex LS 16 TubingMasterfle96419-16
Masterflex Peristaltic PumpMasterflex07522-30
PenStrep (2 mg/mL)CelprogenPS-30-002
Pulmozyme (1 mg/mL, 2.5 mL/vial)Dornase Alfa8931278
Recovery Medium, PIM(R)Prodo Laboratories, Inc.PIM-R001GMP
RPMI 1640Millipore SigmaR8758-1L
Standard Culture Medium, PIM(S)Prodo Laboratories, Inc.PIM-S001GMP
Tzed™ (tiletamine and zolazepam) Injection CPattersonItem #:07-894-6240
University of Wisconsin (UW) Solution, 3 LGlobal Transplant Solutions1000-0046-06
WaterbathSigma AlderichCLS6783-1EA
XylazinePattersonItem #:07-891-6165

Referenties

  1. Gillespie, K. M. Type 1 diabetes: pathogenesis and prevention. CMAJ. 175 (2), 165-170 (2006).
  2. Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nat Rev Endocrinol. 13 (5), 268-277 (2017).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Anazawa, T., et al. Improved method of porcine pancreas procurement with arterial flush and ductal injection enhances islet isolation outcome. Transplant Proc. 42 (6), 2032-2035 (2010).
  5. Dufrane, D., et al. Parameters favouring successful adult pig islet isolations for xenotransplantation in pig-to-primate models. Xenotransplantation. 13 (3), 204-214 (2006).
  6. Hilling, D. E., Rijkelijkhuizen, J. K., Tons, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Porcine islet isolation outcome is not affected by the amount and distribution of collagen in the pancreas. Xenotransplantation. 17 (3), 250-255 (2010).
  7. Lamb, M., et al. In vitro maturation of viable islets from partially digested young pig pancreas. Cell Transplant. 23 (3), 263-272 (2014).
  8. Otsuka, R., et al. Pancreas preservation with a neutrophil elastase inhibitor, alvelestat, contributes to improvement of porcine islet isolation and transplantation. J Clin Med. 11 (15), 4290(2022).
  9. Vanderschelden, R., Sathialingam, M., Alexander, M., Lakey, J. R. T. Cost and scalability analysis of porcine islet isolation for islet transplantation: comparison of juvenile, neonatal and adult pigs. Cell Transplant. 28 (7), 967-972 (2019).
  10. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. 21 (6), 574-581 (2014).
  11. Hart, N. A., et al. Determination of an adequate perfusion pressure for continuous dual vessel hypothermic machine perfusion of the rat liver. Transpl Int. 20 (4), 343-352 (2007).
  12. Tullius, S. G., et al. Accumulation of crystal deposits in abdominal organs following perfusion with defrosted University of Wisconsin solutions. Am J Transplant. 2 (7), 627-630 (2002).
  13. Ching, C. D., et al. A reliable method for isolation of viable porcine islet cells. Arch Surg. 136 (3), 276-279 (2001).
  14. Lu, Y., et al. Adult pig islet isolation. J Vis Exp. (176), (2021).
  15. Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation. Cell Transplant. 19 (5), 613-628 (2010).
  16. Iwanaga, Y., Sutherland, D. E., Harmon, J. V., Papas, K. K. Pancreas preservation for pancreas and islet transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13 (4), 445-451 (2008).
  17. Pratschke, J., et al. Brain death and its influence on donor organ quality and outcome after transplantation. Transplantation. 67 (3), 343-348 (1999).
  18. vander Windt, D. J., et al. Early islet damage after direct exposure of pig islets to blood: has humoral immunity been underestimated. Cell Transplant. 21 (8), 1791-1802 (2012).
  19. Wright, M. J., Cavanagh, T. J., Fetterhoff, T. J., Wile, K. J. Effect of blood content on porcine pancreatic dissociation and islet yield. Transplant Proc. 26 (6), 3442(1994).
  20. Toso, C., et al. Isolation of adult porcine islets of Langerhans. Cell Transplant. 9 (3), 297-305 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

AlvleeskliereilandjesXenotransplantatieAortacannulatieOrgaanconserveringPancreasdigestieEilandjeszuiveringGradiëntcentrifugatie
Chirurgische perfusie en isolatie van de alvleesklier van varkens voor isolatie van eilandjes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.