Methodenartikel

De vaststelling van calvariale hechting-benige composietdefecten bij ratten: een gestandaardiseerd model voor onderzoek naar hechtingsregeneratieve therapie

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66417

⸱

10 mei 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven de gedetailleerde chirurgische ingrepen van calvariale hechting-benige composietdefecten bij ratten, naast het onderzoek naar de korte- en langetermijnprognoses van het model. We streven ernaar een gestandaardiseerd model te construeren voor het ontwikkelen van hechtregeneratieve therapieën.

Samenvatting

Grootschalige calvariale defecten vallen vaak samen met verstoring van de schedelhechting, wat leidt tot stoornissen in het herstel van calvariale defecten en de ontwikkeling van de schedel (dit laatste komt voor in de zich ontwikkelende schedel). Het ontbreken van een gestandaardiseerd model belemmert echter de vooruitgang bij het onderzoeken van hechtregeneratieve therapieën en vormt een uitdaging voor het uitvoeren van vergelijkende analyses in verschillende onderzoeken. Om dit probleem aan te pakken, beschrijft het huidige protocol het gedetailleerde modelleringsproces van calvariale hechtdraad-benige composietdefecten bij ratten.

Het model werd gegenereerd door rechthoekige gaten van 4,5 mm × 2 mm over de coronale hechtingen over de volledige dikte te boren. De ratten werden geëuthanaseerd en de schedelmonsters werden postoperatief verzameld op dag 0, week 2, week 6 en week 12. μCT-resultaten van monsters die onmiddellijk na de operatie werden verzameld, bevestigden de succesvolle vaststelling van het hechting-benige composietdefect, waarbij de coronale hechting en de aangrenzende botweefsels werden verwijderd.

Gegevens uit de 6een 12epostoperatieve week toonden een natuurlijke genezingsneiging aan om het defect te sluiten. Histologische kleuring bevestigde deze trend verder door verhoogde gemineraliseerde vezels en nieuw bot in het defectcentrum te tonen. Deze bevindingen duiden op progressieve hechtingsfusie in de loop van de tijd na calvariale defecten, wat het belang van therapeutische interventies voor hechtingsregeneratie onderstreept. We verwachten dat dit protocol de ontwikkeling van hechtregeneratieve therapieën zal vergemakkelijken, waardoor nieuwe inzichten worden geboden in het functionele herstel van calvariale defecten en het verminderen van nadelige gevolgen die gepaard gaan met hechtingsverlies.

Inleiding

Schedelhechtingen zijn dichte vezelige verbindingen tussen schedelbeenderen, die fungeren als gewrichten om lichte schedelbewegingen te vergemakkelijken en een beschermend kussen te bieden voor de hersenen onder druk1. In de afgelopen jaren heeft meer onderzoek de cruciale rol van craniale hechtingen bij de ontwikkeling van de schedel, craniofaciale homeostase en het inherente osteo-herstellendepotentieel 2,3,4,5,6,7,8 benadrukt. Tijdens perioden van groei en ontwikkeling fungeren craniale hechtingen als de belangrijkste groeicentra in de schedel4. Nieuwe botvorming vindt plaats aan de osteogene fronten aan beide zijden van de hechtingen, terwijl de cellen in de hechtingen een ongedifferentieerde mesenchymale toestand behouden, wat zorgt voor een evenwichtige schedelexpansie naast hersengroei1. Het verlies van schedelhechtingen op dit moment resulteert in een discrepantie tussen de groei van de schedel en de hersenen, wat leidt tot ernstige problemen zoals hersenletsel, hydrocephalus, verhoogde intracraniale druk en cognitieve disfunctie 3,9.

Bovendien spelen craniale hechtingen een cruciale rol bij het bepalen van de prognose van calvariale defecten 5,7,10. Het regeneratieve potentieel over het calvariale oppervlak is ongelijk verdeeld, waarbij schedelnaden opmerkelijk superieure mogelijkheden vertonen in vergelijking met niet-hechtdraadregio's10,11. Eén studie geeft aan dat de snelheid van genezing van calvariale defecten omgekeerd evenredig is met de afstand tussen de schedelhechting en de plaats van de verwonding10. In het bijzonder leidt het verwijderen van coronale en sagittale hechtingen tot de niet-genezing van pariëtale botdefecten7, wat de noodzaak van hechtingsregeneratie bij calvariale defecten benadrukt. De focus van de huidige studies ligt echter voornamelijk op het herstel van de craniale botstructuur, terwijl de regeneratie van hechtmesenchym wordt verwaarloosd.

Wat de vooruitgang in de regeneratie van hechtingen betreft, zijn veelbelovende resultaten waargenomen met de transplantatie van hechtdraadbevattende botflappen, mesenchymale stamcellen (MSC's) en kunstmatige biomaterialen. Toen botflappen met hechtingen werden getransplanteerd in calvariale defecten, integreerden ze met succes en genazen ze, in tegenstelling tot die zonder hechtingen die non-union vertoonden en een onvermogen om periosteum, dura mater ofosteocyten te vormen. Evenzo vergemakkelijkte de implantatie van MSC's afkomstig van beenmerg in sagittale hechting-benige composietdefecten de vorming van hechtdraadachtige openingen12. Merk op dat een recente studie de realisatie van hechtdraadregeneratie met Gli1+ MSC's benadrukte, waardoor intracraniale drukregeling, correctie van schedelmisvorming en verbeterde neurocognitieve functie mogelijkis13. Naarmate regeneratieve geneeskunde en biomedische technologie zich ontwikkelen, richten onderzoekers zich steeds meer op biomaterialen voor weefselmanipulatie vanwege hun aanpasbare en aanpasbare eigenschappen14. Met name van polytetrafluorethyleenmembranen is bewezen dat ze effectief zijn bij het gelijktijdig reconstrueren van schedelbot en hechtmesenchym15,16.

craniofaciaal onderzoek mist echter gevestigde modellen voor het verkennen van mesenchymale regeneratieve therapieën met hechtingen, in tegenstelling tot relatief volwassen modellen bij het herstellen van andere weefsels zoals botten, huid, kraakbeen en spieren17. Het ontbreken van een gestandaardiseerd model beperkt de studie van hechtregeneratieve therapieën en maakt het een uitdaging om vergelijkende analyses uit te voeren in verschillende onderzoeken. Daarom heeft onze studie een praktisch en reproduceerbaar calvariaal hechting-benig composietdefect van de rat vastgesteld. Door middel van deze methode streven we ernaar om geschikte klinische interventies te ontwikkelen voor craniale hechtdraadreconstructie, waarbij we nieuwe perspectieven bieden op het functionele herstel van calvariale defecten en het verminderen van ongunstige resultaten als gevolg van hechtingsverlies.

Protocol

Alle dierproeven in deze studie zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Ethische Commissie van de West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2021-597). In totaal werden 12 (3 ratten op elk van de vier tijdstippen) Sprague-Dawley (SD) ratten (mannetje, 300 g, 8 weken oud) verkregen van een commerciële bron (zie Materiaaltabel).

1. Preoperatieve voorbereiding

  1. Chirurgische artikelen
    1. Bereid chirurgische instrumenten voor die worden weergegeven in afbeelding 1A, waaronder een gebogen pincet, een steriel wegwerpscalpel, een periostale lift, een irrigatienaald, wattenbolletjes, een handstuk met lage snelheid, een chirurgische motor, ronde boren met tandheelkunde met lage snelheid (Figuur 1B, respectievelijk 1.2 mm en 0.8 mm diameter), een naaldhouder, 3-0 monofilamenthechtingen en een rechte schaar.
  2. Sterilisatie en desinfectie
    1. Steriliseer de instrumenten vooraf door stoomsterilisatie (125-135 °C, 20-25 min).
    2. Gebruik ethanol om warmtegevoelige medische apparatuur, zoals elektrische scheerapparaten, te steriliseren.
    3. Gebruik steriele medische niet-geweven stoffen om het operatieplatform te bedekken en desinfecteer de omgeving met 75% ethanol.
  3. Anesthesie
    1. Bereid dieren voor op een operatie met een acclimatisatieperiode van 1 week.
    2. Injecteer de ratten intraperitoneaal met xylazine (10 mg/kg) en ketamine (100 mg/kg) 20 minuten voor de operatie voor anesthesie of gebruik een geschikt anesthesieprotocol om algemene anesthesie te bereiken.
      OPMERKING: De ketamine-xylazine-verdovingscocktail die intraperitoneaal bij ratten wordt toegediend, treedt doorgaans binnen 10-15 minuten in werking en bereikt ongeveer 35-40 minuten na injectie de piekanesthesie. Om onderkoeling tijdens de narcose te voorkomen, kunnen ratten het beste op een verwarmingskussen worden geplaatst.
    3. Dien een preoperatieve subcutane injectie van carprofen toe in een dosis van 5 mg/kg om analgesie te bieden.
    4. Gebruik de "teenknijpmethode" om te bepalen of de ratten al dan niet bij bewustzijn zijn en reageren.

2. Chirurgisch proces

  1. Voorbereiding van de locatie
    1. Plaats de rat in een buikligging met zijn kop op natuurlijke wijze verticaal uitgestrekt, zonder dat er speciale hulpmiddelen of beperkingen nodig zijn om deze houding aan te houden (Figuur 2A).
    2. Breng veterinaire zalf, d.w.z. vaseline, aan op de ogen van de rat om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
    3. Verwijder het haar van de hoofdhuid tussen de neusbrug en het cervicale wervelkolomgewricht met een elektrisch scheerapparaat (Figuur 2B). Desinfecteer het operatiegebied in cirkelvormige bewegingen vanuit het midden met 2% jodoforoplossing gevolgd door 75% ethanol. Gebruik een chirurgisch laken om de rug van het dier en de vacht rond de incisie te bedekken.
  2. Opening van de operatieplaats
    1. Maak vanaf het middelpunt van het neusbeen een incisie in de lengterichting van de huid met een wegwerpscalpel van 2 cm langs de middellijn van de schedel (Figuur 2C).
    2. Maak met een scalpel een periostale incisie in de middellijn en spiegel het beginpunt en de omvang van de huidlaag (Figuur 2D). Til vervolgens het periosteum aan beide zijden van de incisie voorzichtig op met een periostale lift (Figuur 2E1) om pariëtale botten, frontale botten en coronale hechtingen bloot te leggen (Figuur 2E2).
      OPMERKING: Zorg er bij het insnijden van het periost voor dat u de schedelhechtingen niet beschadigt om overmatig bloeden tijdens het snijden te voorkomen. Adequate blootstelling van de coronale hechting is van het grootste belang voor de volgende procedures.
    3. Spoel de wond af met een zoutoplossing en droog het operatiegebied af met wattenbolletjes.
  3. Oprichting van het model voor hechtingsbenige composietdefecten
    1. Stel de chirurgische motor in op 35.000 tpm door aan de knop te draaien (Figuur 1A, gele pijl) en zet vervolgens de schakelaar aan (Figuur 1A, witte pijl).
    2. Begin vanaf elk punt op de coronale hechting en oefen verticale kracht uit met behulp van een ronde boor met een diameter van 1.2 mm totdat een gevoel van doorbraak wordt gevoeld.
      OPMERKING: Beveel het middelpunt van de coronale hechting aan (aangegeven met gele pijlen in figuur 2E2) als startpunt voor penetratie. Bij het slijpen moeten tandboren loodrecht op het schedeloppervlak worden gehouden. Wees voorzichtig om niet door te gaan met boren nadat u de volledige dikte van de schedel hebt doorgedrongen om verdere schade aan de ratten te voorkomen, inclusief hersenbeschadiging of hersenbloeding.
    3. Beweeg de boor vanaf het penetratiepunt zijwaarts langs de coronale hechtdraad om een ongeveer 4 mm lange positioneringsgroef te creëren (Figuur 2F1). Verwijder botweefsel met de boor aan beide zijden van de positioneringsgroef om in eerste instantie een rechthoekig defect van volledige dikte te vormen (Figuur 2F2).
    4. Gebruik een ronde boor met een diameter van 0,8 mm om details te verfijnen (Figuur 2G1), waarbij rechte hoeken worden geslepen en defectmarges worden gladgestreken, om uiteindelijk een standaard rechthoekig defect te bereiken van 2 mm breed en 4,5 mm lang (Figuur 2G2).
      OPMERKING: Om volledige verwijdering van de coronale hechting te bereiken met behoud van de sagittale en frontale hechtingen bij 300 g SD-ratten, is de maximaal haalbare defectlengte ongeveer 4,5 mm. Rekening houdend met de breedte van de coronale hechting in de anterieure-posterieure richting (aanvullende figuur S1), werd de defectbreedte vastgesteld op 2 mm.
    5. Maak twee defecten over de linker- en rechterhelft van de coronale hechting voor zelfvergelijking.
    6. Zorg voor continue irrigatie van de zoutoplossing tijdens de boorprocedure om thermische schade aan de schedel en de hersenen te voorkomen. Gebruik ondertussen wattenbolletjes om het operatiegebied te drogen.
  4. Verificatie van de afmetingen van het monster
    1. Controleer regelmatig de lengte en breedte van de defecten met behulp van een schuifmaat (Figuur 2H1, H2) om consistentie in alle monsters te garanderen.
  5. Sluiting van de operatieplaats
    1. Sluit de huid met 3-0 monofilament hechtingen (Figuur 2I).
  6. Onmiddellijke postoperatieve in vivo microcomputertomografie (μCT)
    1. Voer indien mogelijk in vivo μCT-scans uit op alle ratten onmiddellijk na de operatie om het succes van de chirurgische ingreep te bevestigen en de trends in het herstel van defecten voor elk individu te volgen.

3. Postoperatieve zorg

  1. Dien, volgens de protocollen voor dierverzorging, indien nodig na de operatie gevestigde pijnstillers toe, bijvoorbeeld carprofen (5 mg/kg, subcutaan gebruik).
  2. Breng de ratten over naar een constant verwarmingskussen (37 °C) voor postoperatief herstel.
  3. Eenmaal volledig bij bewustzijn, verplaats je de ratten naar hun woonkooi met schoon beddengoed.
    OPMERKING: Houd de ratten na de operatie continu in de gaten. Laat ze niet onbeheerd achter totdat ze sternale lighouding kunnen behouden. Houd geopereerde ratten geïsoleerd van anderen totdat ze volledig hersteld zijn.
  4. Voer analgesiebeheer en postoperatieve monitoring uit gedurende 24 uur, gevolgd door dagelijkse beoordelingen gedurende de eerste week na de operatie. Houd de ratten daarna minimaal 1-2x per week in de gaten.

4. Monsterverzameling en gegevensanalyse

  1. Voorbereiding van het monster
    1. Verzamel schedelmonsters op postoperatieve dag 0, week 2, week 6 en week 12. Euthanaseer de ratten door CO2 -inhalatie.
    2. Fixeer de monsters in 4% paraformaldehyde bij 4 °C gedurende 24 uur voordat ze verder worden geanalyseerd.
  2. μCT-evaluatie
    1. Voer μCT-scans uit op schedelbeenderen van postoperatieve dag 0, week 6, week 12 met de volgende scanparameters: röntgenbuispotentiaal, 70 kVp; Röntgenintensiteit, 0,2 mA; filter, AL 0,5 mm; integratietijd, 1 x 300 ms; en voxelgrootte, 10 μm.
    2. Verkrijg 3D-reconstructie- en dwarsdoorsnedebeelden met beeldverwerkingssoftware (zie Materiaaltabel).
    3. Meet het resterende defectvolume en voer statistische analyses uit met bijbehorende software (zie Materiaaltabel).
  3. Histologische kleuring
    1. Ontkalk de schedelbeenderen in 12% (m/v) ethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (pH = 7,2) bij 4 °C gedurende 6 weken.
      OPMERKING: Ontkalk de monsters door de oplossing elke 3 dagen te vervangen. Gebruik een shaker om het proces te versnellen. Voltooiing wordt aangegeven wanneer een naald van 25 G gemakkelijk door het monster dringt.
    2. Ga verder met uitdroging, paraffine-inbedding en voorbereiding van secties van 6 μm met behulp van standaardprotocollen18.
    3. Voer histologische analyse uit met behulp van hematoxyline en eosine (H&E) en Masson's trichrome kleuring volgens kitprotocol18.

Resultaten

In deze studie werd het calvariale hechting-benige composietdefect van de rat vastgesteld door een rechthoekig gat van 4,5 mm x 2 mm over de coronale hechting te boren. De chirurgische schematische illustratie en het onderzoeksstroomschema zijn weergegeven in figuur 3. Het 3D-beeld en de dwarsdoorsnede van postoperatieve 0-dagmonsters, d.w.z. monsters die onmiddellijk na de operatie werden verzameld, bevestigden de succesvolle creatie van een calvariaal defect over de volledige dikte, waarbij de coronale hechting en de aangrenzende botstructuren aan beide uiteinden volledig werden verwijderd (Figuur 4A). μCT-beelden en de bijbehorende statistische analyseresultaten 6 weken na de operatie toonden een natuurlijke neiging tot het sluiten van defecten, vergezeld van onregelmatige verkalkte knobbeltjes die binnen het defect werden gevormd (figuur 4). Deze neiging werd 12 weken na de operatie meer uitgesproken (figuur 4), wat wijst op de mogelijke hechtingsfusie naarmate de tijd vorderde. Verdere histologische analyse werd uitgevoerd met behulp van H&E en Masson's trichrome kleuring. Twee weken na de operatie zagen we een opmerkelijke uitbreiding en continuïteit van het periosteum en de dura mater, die dicht en dik vezelig weefsel vormden en het defectgebied effectief afsloten (Figuur 5). Met name op dit vroege tijdstip werd de opkomst van blauw gekleurde gemineraliseerde vezels gedetecteerd, waarvan de aanwezigheid een aanzienlijke toename onderging tegen de tijd van 6 weken na de operatie (Figuur 5). Tegen postoperatieve 12 weken werden grote stukken nieuw bot waargenomen in het defectcentrum (figuur 5), wat de ongunstige prognose van stromale calcificatie en hechtingssluiting opnieuw bevestigde. De ongunstige natuurlijke genezingsresultaten van hechtingsbenige composietdefecten benadrukken de noodzaak van craniale hechtingsregeneratie door middel van therapeutische interventies, zoals de implantatie van biomaterialen 13,15,16.

figure-results-1
Figuur 1: Chirurgische instrumenten. (A) De chirurgische artikelen waren genummerd in volgorde van gebruik, waaronder (1) gebogen pincet, (2) steriel wegwerpscalpel, (3) periostale lift, (4) irrigatienaald, (5) katoenen balletjes, (6) handstuk met lage snelheid, (7) chirurgische motor (gele pijl vertegenwoordigt de RPM-knop en witte pijl vertegenwoordigt de schakelaar), (8) tandheelkundige ronde boren met lage snelheid, (9) naaldhouder, (10) 3-0 monofilament hechtingen en (11) rechte schaar. (B) Ronde boren met een lage snelheid met een diameter van 1,2 mm en een diameter van 0,8 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Chirurgische ingreep. (A) Plaats de rat in buikligging. (B) Scheer het haar van de hoofdhuid met een elektrisch scheerapparaat. (C) Snijd de huid in met een wegwerpscalpel. (D) Snijd het botvlies in met een scalpel. (E1, E2) Verhoog het periosteum om coronale hechtingen bloot te leggen met een periostale lift. De gele pijlen geven coronale hechtingen aan. (F1) Boor een positioneringsgroef. (F2) Maak eerst een rechthoekig defect met een ronde boor van 1,2 mm (G1, G2) Snijd het defect bij met een ronde boor van 0,8 mm om een standaard rechthoekige vorm van 4,5 x 2 mm te verkrijgen. (H1, H2) Kalibreer de breedte en lengte van het defect met een schuifmaat. (I) Sluit de huid met 3-0 monofilament hechtingen. Deze afbeelding maakt gebruik van een kadaver, dat opzettelijk niet is gedrapeerd om een betere anatomische visualisatie mogelijk te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Schematische weergave van het calvariale hechtdraad-benige composietdefect en onderzoeksstrategie van deze studie. Afkortingen: H&E = hematoxyline en eosine; μCT = micro-computertomografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Sluitingstendens van het calvariale hechting-benige composietdefect. (A) Representatieve μCT-beelden en dwarsdoorsnedeweergaven van hechting-benige composietdefecten op postoperatieve dag 0, week 6 en week 12. De doorsneden geven de locaties weer die zijn aangegeven door de gele stippellijnen in 3D-afbeeldingen. Schaalbalken = 2 mm. (B) Kwantitatieve analyse van het resterende defectvolume na de operatie door middel van μCT-beoordelingen. n = 6 replicaten/groep. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. One-way ANOVA gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett. Blz<0,001. Afkortingen: PO = postoperatief; μCT = micro-computertomografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Histologische variaties in hechting-benige composietdefecten. (A) H&E en (B) Masson's trichrome kleuring van hechting-benige composietdefecten in PO week 2, week 6 en week 12. De rode stippellijnen geven het vezelige weefsel aan dat het defecte gebied inkapselt. De zwarte pentagrammen vertegenwoordigen de blauw gekleurde gemineraliseerde vezels. De gele pentagrammen markeren het nieuwe bot dat in het defectcentrum is gevormd. Schaal balken = 500 μm; 200 μm (inzetstukken). Afkortingen: PO = postoperatief; H&E = hematoxyline en eosine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Breedte van de coronale hechting in de anterieure-posterieure richting (sagittaal vlak calvariaal beeld). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Conventionele modellen met calvariale defecten, al dan niet met craniale hechtingen, concentreren zich voornamelijk op het herstel van hard weefsel, waarbij vaak de vitale regeneratie van hechtmesenchym wordt verwaarloosd19,20. In onderzoek naar hechtingsregeneratie resulteerden eerdere modellen, zoals die van Mardas et al.15,16, waarbij een trephineboor werd gebruikt om een cirkelvormig defect van 5 mm over de sagittale hechting van ratten te creëren, in aanzienlijk verlies van hard weefsel, waardoor werd afgedwaald van het primaire doel van hechtdraadregeneratie. Evenzo introduceerde de methodologie van Wilk et al.7, die de verwijdering van zowel de sagittale als de rechter coronale hechtingen omvat en het creëren van een kritiek botdefect in het rechter pariëtale bot, hoewel informatief, complexiteiten en mogelijke verstorende variabelen als gevolg van de aanwezigheid van meerdere defectplaatsen. Ons protocol daarentegen creëert bilaterale rechthoekige defecten langs de coronale hechting, met als doel een meer gestroomlijnd en gericht onderzoeksmodel. De belangrijkste craniale hechtingen zijn de coronale, sagittale, metopische en lambdoïde hechtingen21. Anders dan de metopische en sagittale hechtingen, die in de lengterichting op de schedel zijn aangebracht, bevinden de coronale en lambdoïde hechtingen zich dwars en kunnen ze in twee helften worden verdeeld, waardoor het ontstaan van twee defecten met identieke omstandigheden wordt vergemakkelijkt. In tegenstelling tot de lambdoïde hechting, is het operatieveld dat wordt blootgesteld door de incisie in de hoofdhuid toegankelijker voor een reeks procedures bij de coronale hechting. Het creëren van defecten in zowel de linker- als de rechterhelft van de coronale hechting en het toepassen van verschillende interventies op elke plaats vergemakkelijkt een eenvoudigere vergelijking van verschillende therapieën door middel van zelfcontrole. Bovendien maakt deze benadering een vergelijking mogelijk tussen behandelde en onbehandelde zijden, waardoor inzicht wordt verkregen in de verschillen tussen het tussenliggende genezingsproces en het natuurlijke genezingsproces. Daarom suggereert onze studie dat het creëren van hechtingsbenige composietdefecten aan beide zijden van de coronale hechtingen bij ratten een geschikt chirurgisch model is voor het bestuderen van hechtdraadregeneratieve therapieën.

De selectie van de afmetingen van het defect wordt nauwgezet geleid door praktische en anatomische overwegingen. Voor dit specifieke diermodel ligt de primaire uitdaging in het volledig verwijderen van de coronale hechting met behoud van de sagittale en frontale hechtingen, met minimale verwijdering van botweefsel. De optimale strategie omvat daarom het creëren van een nauwkeurig rechthoekig defect langs de coronale hechting. Deze strategische beslissing is onmisbaar, omdat elk achtergebleven mesenchym in de coronale hechting of aangrenzende hechtingen onnauwkeurigheden kan introduceren bij het evalueren van de werkelijke regeneratieve impact van de behandeling. Daarom hebben we de grootst haalbare defectlengte voor 300 g mannelijke SD-ratten vastgesteld op ongeveer 4,5 mm. Bovendien stellen we, rekening houdend met de breedte van de coronale hechting in de anterieure-posterieure richting (ongeveer 1,5 mm in het sagittale vlak, zoals weergegeven in aanvullende figuur S1), de defectbreedte in op 2 mm om ervoor te zorgen dat de hechting volledig van het schedeloppervlak tot zijn diepte wordt verwijderd. Het is vermeldenswaard dat de specifieke afmetingen van het defect, zowel in lengte als in breedte, aanpassing kunnen vereisen op basis van factoren zoals het type en de leeftijd van het dier, evenals de experimentele doelstellingen. Een andere studie creëerde een slank, 0,3-0,4 mm breed, rechthoekig defect langs de coronale hechting, geschikt voor de kleinere omvang van muizen13.

De moeilijkheid bij het genereren van dit chirurgische model ligt met name in het construeren van standaard en uniforme rechthoekige defecten. Het is absoluut noodzakelijk om consistentie in de vorm van het defect te behouden om een uniforme dosering van bioactieve factoren in monsters te garanderen, waardoor zowel variaties tussen groepen als variaties binnen de groep tot een minimum worden beperkt. In dit opzicht hebben we tijdens het verwijderen van het hecht-botcomplex in eerste instantie een ronde boor met een diameter van 1,2 mm gebruikt om de coronale hechting te lokaliseren en om een ruwe schets te maken van het rechthoekige defect over de volledige dikte (Figuur 1B). Vervolgens zijn we overgestapt op de kleinste ronde boor (diameter 0,8 mm) om de haakse bochten te verfijnen en de defecte randen glad te strijken (Figuur 1B). Om de consistentie van de lengte en breedte van elk defect te garanderen, werd een schuifmaat gebruikt om over- of onderslijpen tijdens het boorproces te voorkomen. Ondanks deze aanpak bleek uit de μCT-scan dat het rechthoekige defect dat we hebben gegenereerd nog steeds enigszins boogvormig is (Figuur 4), wat suggereert dat de modelleringsmethode verder moet worden geoptimaliseerd om nauwkeurige slijpvormen te verkrijgen.

Om de prognose te evalueren, bieden μCT-scans de meest directe middelen, waaronder de beoordeling van de genezing van botweefsel en de status van schedelhechtingen, of ze nu gesloten of onbelemmerd zijn. Bovendien is onderzoek op histopathologisch niveau essentieel voor de studie van craniale hechtingsregeneratie. Histopathologische kleuring helpt bij het differentiëren van het niet-sluiten van defecten als gevolg van mesenchymale weefselvorming, botherstellende remming of materiaalruimte-innemend. Alleen benaderingen die de regeneratie van mesenchymaal weefsel vergemakkelijken, hebben waarschijnlijk het potentieel voor regeneratie van craniale hechtingen. Bovendien wordt het, ondanks het ontbreken van relevante experimenten tijdens de modelconstructie, ten zeerste aanbevolen om expressie op eiwitniveau van hechtdraad-MSC-markers in het geregenereerde weefsel te detecteren na therapeutische interventies. Deze analyse, waarbij gebruik wordt gemaakt van technieken zoals immunofluorescentie, immunohistochemie of flowcytometrie, draagt bij aan het bevestigen van het succes van hechtdraadregeneratie. Specifieke hechting MSC-markers zijn onder meer Cd51, Cd200, Gli1, Axin2, Prrx1, Ctsk en meer 1,22.

Samenvattend rapporteerde deze studie het gedetailleerde modelleringsproces van calvariale hechtdraad-benige composietdefecten bij ratten om de prognose van kruishechtende calvariale defecten te bestuderen en geschikte therapieën te ontwikkelen voor het regenereren van schedelhechtingen. Het is relevant op te merken dat het gebied van craniale hechtingsregeneratie inderdaad een niche is, zonder standaardmodellen of methoden die in de literatuur gangbaar zijn voor het regenereren van craniale hechtingen. Daarom zijn wij van mening dat ons protocol een solide methodologische basis biedt voor het onderzoeken van hechtingsregeneratieve benaderingen en innovatieve perspectieven introduceert op het functionele herstel van calvariale defecten, met als uiteindelijk doel de kwaliteit van leven van patiënten te verbeteren.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China 82100982 (F.L.), 82101000 (H.W.), 82001019 (B.Y.), Science and Technology Department of Sichuan Province 2022NSFSC0598 (B.Y.), 2023NSFSC1499 (H.W.) en Research Funding van West China School/Hospital of Stomatology Sichuan University (RCDWJS2021-5). Figuur 3 is gemaakt met Biorender.com.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4% paraformaldehydeBiosharpBL539A
2% Iodophor-oplossingChengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.Geen
75% EthanolChengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.Geen
WattenschijfjesHaishi Hainuo Group Co., Ltd. Geen
WattenstaafjesLakong Medical Devices Co., Geen
Gebogen pincettenChengdu Shifeng Co., Ltd.Geen
Dataviewer en Ctan software voor beoordelingen van resterend defectvolumeBrukerGeen
Tandheelkundige laagsnelheids ronde borenDreybird Medical Equipment Co., Ltd.RA3-012
RA1-008
Wegwerp steriele scalpelHangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.Geen
Wegwerpspuiten (22 G)Chengdu Shifeng Co., Ltd.SB1-089(IX)
Elektrisch scheerapparaatJASEBM320210
Ethyleen Diamine Tetraacetisch Zuur (EDTA)BioFroxx1340GR500
Hematoxyline en Eosine KleurkitBiosharpBL700B
Irrigatienaald (23 G)Sichuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd.Geen
Laagsnelheids handapparaatGuangzhou Dental Guard Technology Co., Ltd.Geen
Masson’s Trichrome KleurkitSolarbioG1340
Medische niet-geweven stoffenHenan Yadu Industrial Co., Ltd. Geen
Micro-computed tomography (µCT) Scanco Medical AGµCT45
Mimics 20.0 voor doorsnedebeeldenMaterialiseGeen
NaaldhaakjesChengdu Shifeng Co., Ltd.Geen
Periostale elevatorChengdu Shifeng Co., Ltd.Geen
Fysiologische zoutoplossingSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.Geen
Scanco medische visualizer-software voor 3D-beeldreconstructieScanco Medical AGGeen
SPSS Statistics 20.0 voor statistische analyseIBMGeen
Sprague-Dawley-ratten Byrness Weil Biotech LtdGeen
Rechte schaarChengdu Shifeng Co., Ltd.Geen
Chirurgische motorMARATHONN3-140232
Chirurgische hechtdraden (3-0 monofilament)Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.Geen

Referenties

  1. Li, B., et al. Cranial suture mesenchymal stem cells: insights and advances. Biomolecules. 11 (8), 1129(2021).
  2. Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Dev Dyn. 219 (4), 472-485 (2000).
  3. Lenton, K. A., Nacamuli, R. P., Wan, D. C., Helms, J. A., Longaker, M. T. Cranial suture biology. Curr Top Dev Biol. 66 (4), 287-328 (2005).
  4. Slater, B. J., et al. Cranial sutures: A brief review. Plast Reconstr Surg. 121 (4), 170-178 (2008).
  5. Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nat Cell Biol. 17 (4), 386-396 (2015).
  6. Maruyama, T., Jeong, J., Sheu, T. -J., Hsu, W. Stem cells of the suture mesenchyme in craniofacial bone development, repair and regeneration. Nat Commun. 7 (1), 10526(2016).
  7. Wilk, K., et al. Postnatal calvarial skeletal stem cells expressing PRX1 reside exclusively in the calvarial sutures and are required for bone regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
  8. Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial suture-derived stem cells and their contribution to cranial bone repair. Front Physiol. 8, 956(2017).
  9. Kajdic, N., Spazzapan, P., Velnar, T. Craniosynostosis-recognition, clinical characteristics, and treatment. Bosn J Basic Med Sci. 18 (2), 110-116 (2018).
  10. Park, S., Zhao, H., Urata, M., Chai, Y. Sutures possess strong regenerative capacity for calvarial bone injury. Stem Cells Dev. 25 (23), 1801-1807 (2016).
  11. Quarto, N., Behr, B., Longaker, M. T. Opposite spectrum of activity of canonical Wnt signaling in the osteogenic context of undifferentiated and differentiated mesenchymal cells: Implications for tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (10), 3185-3197 (2010).
  12. Kaku, M., et al. Mesenchymal Stem Cell-Induced Cranial Suture-Like Gap in Rats. Plast Reconstr Surg. 127 (1), 69-77 (2011).
  13. Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), e18 243-256 (2021).
  14. Koons, G. L., Diba, M., Mikos, A. G. Materials design for bone-tissue engineering. Nat Rev Mater. 5 (8), 584-603 (2020).
  15. Mardas, N., Kostopoulos, L., Karring, T. Bone and suture regeneration in calvarial defects by e-PTFE-membranes and demineralized bone matrix and the impact on calvarial growth: an experimental study in the rat. J Craniofac Surg. 13 (3), 453-462 (2002).
  16. Kostopoulos, L., Karring, T. Regeneration of the sagittal suture by GTR and its impact on growth of the cranial vault. J Craniofac Surg. 11 (6), 553-561 (2000).
  17. Mosaddad, S. A., Hussain, A., Tebyaniyan, H. Exploring the use of animal models in craniofacial regenerative medicine: A narrative review. Tissue Eng Part B Rev. , (2023).
  18. Tan, X., et al. PgC3Mg metal-organic cages functionalized hydrogels with enhanced bioactive and ROS scavenging capabilities for accelerated bone regeneration. J Mater Chem B. 10 (28), 5375-5387 (2022).
  19. Yazdanian, M., et al. Fabrication and properties of βTCP/Zeolite/Gelatin scaffold as developed scaffold in bone regeneration: in vitro and in vivo studies. Biocybern Biomed Eng. 40 (4), 1626-1637 (2020).
  20. Soufdoost, R. S., et al. In vitro and in vivo evaluation of novel Tadalafil/β-TCP/Collagen scaffold for bone regeneration: A rabbit critical-size calvarial defect study. Biocybern Biomed Eng. 39 (3), 789-796 (2019).
  21. Russell, W. P., Russell, M. R. Anatomy, head and neck, coronal suture. StatPearls. , (2022).
  22. Menon, S., et al. Skeletal stem and progenitor cells maintain cranial suture patency and prevent craniosynostosis. Nat Commun. 12 (1), 4640(2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Calvaria defectenregeneratie van suturenratmodelcoronale sutuurbotgenezingmicro CT beeldvorminghistologische kleuringcomposietdefectmodeldisruptie van de crani le sutuurnieuwe botvorming

Gerelateerde artikelen