Gemodificeerd muismodel van repetitief mild traumatisch hersenletsel met een verdund schedelvenster en vloeibare percussie

Samenvatting

Dit protocol presenteert een gemodificeerd muismodel van repetitief mild traumatisch hersenletsel (rmTBI) geïnduceerd via een closed-head injury (CHI)-methode. De aanpak omvat een verdund schedelvenster en vloeibare percussie om de ontsteking die vaak wordt veroorzaakt door blootstelling aan hersenvliezen te verminderen, samen met verbeterde reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid bij het modelleren van rmTBI bij knaagdieren.

Samenvatting

Licht traumatisch hersenletsel is een klinisch zeer heterogene neurologische aandoening. Er is dringend behoefte aan zeer reproduceerbare diermodellen voor traumatisch hersenletsel (TBI) met goed gedefinieerde pathologieën voor het bestuderen van de mechanismen van neuropathologie na milde TBI en het testen van therapieën. Het repliceren van de volledige gevolgen van TBI in diermodellen is een uitdaging gebleken. Daarom is de beschikbaarheid van meerdere diermodellen van TBI noodzakelijk om rekening te houden met de diverse aspecten en ernst die bij TBI-patiënten worden gezien. CHI is een van de meest voorkomende methoden voor het vervaardigen van knaagdiermodellen van rmTBI. Deze methode is echter vatbaar voor vele factoren, waaronder de gebruikte impactmethode, de dikte en vorm van het schedelbot, apneu bij dieren en het type hoofdondersteuning en immobilisatie dat wordt gebruikt. Het doel van dit protocol is om een combinatie van de methoden voor verdund schedelvenster en vloeistofpercussieletsel (FPI) te demonstreren om een nauwkeurig muismodel van CHI-geassocieerde rmTBI te produceren. Het primaire doel van dit protocol is het minimaliseren van factoren die van invloed kunnen zijn op de nauwkeurigheid en consistentie van CHI- en FPI-modellering, waaronder de dikte, vorm en hoofdondersteuning van schedelbotten. Door gebruik te maken van een methode met een verdund schedelvenster wordt mogelijke ontsteking als gevolg van craniotomie en FPI geminimaliseerd, wat resulteert in een verbeterd muismodel dat de klinische kenmerken repliceert die worden waargenomen bij patiënten met milde TBI. Resultaten van gedrags- en histologische analyse met behulp van hematoxyline en eosine (HE) kleuring suggereren dat rmTBI kan leiden tot een cumulatief letsel dat veranderingen veroorzaakt in zowel het gedrag als de grove morfologie van de hersenen. Over het algemeen biedt de gemodificeerde CHI-geassocieerde rmTBI een nuttig hulpmiddel voor onderzoekers om de onderliggende mechanismen te onderzoeken die bijdragen aan focale en diffuse pathofysiologische veranderingen in rmTBI.

Inleiding

Milde TBI, inclusief hersenschudding en sub-hersenschudding, zijn goed voor de meerderheid van alle TBI-gevallen (>80% van alle TBI)¹. Milde TBI is meestal het gevolg van vallen, verkeersongevallen, gewelddaden, contactsporten (bijv. voetbal, boksen, hockey) en militaire gevechten ^2,3. Milde TBI kan leiden tot neurobiologische gebeurtenissen die de neurologische gedragsfuncties gedurende het hele leven van de patiënt beïnvloeden en het risico op neurodegeneratieve ziekten^{verhogen4,5,6}. Diermodellen bieden een efficiënte en gecontroleerde manier om milde TBI te bestuderen, in de hoop de diagnose en behandeling van milde TBI verder te verbeteren. Er zijn verschillende modellen ontwikkeld voor milde TBI, zoals de gecontroleerde corticale impact (CCI), gewichtsval (WD), vloeistofpercussieletsel (FPI) en blast-TBI-modellen ^7,8. Geen enkel experimenteel model kan de volledige complexiteit van TBI-geïnduceerde pathologie^{nabootsen 9,10}. De heterogeniteit van deze modellen is voordelig voor het aanpakken van de diverse kenmerken die verband houden met milde TBI-patiënten en het onderzoeken van de overeenkomstige cellulaire en moleculaire mechanismen. Elk diermodel van TBI heeft echter zijn beperkingen³, waardoor onze huidige kennis over milde TBI bij dieren en hun klinische relevantie wordt beperkt.

De WD- en CCI-modellen worden gebruikt om klinische aandoeningen na te bootsen, zoals verlies van hersenweefsel, acuut subduraal hematoom, axonaal letsel, hersenschudding, disfunctie van de bloed-hersenbarrière en zelfs coma na TBI ^3,11,12. Het WD-model omvat het induceren van hersenbeschadiging door met vrij vallende gewichten op de dura mater of de schedel te slaan. De impact van een verzwaard object op een intacte schedel kan gemengde focale/diffuse verwondingen repliceren; Deze methode wordt echter geassocieerd met een slechte nauwkeurigheid en herhaalbaarheid van de plaats van het letsel, rebound-letsel en een hoger sterftecijfer als gevolg van schedelfracturen ^3,11,12. Het CCI-model omvat het toepassen van luchtaangedreven metaal om de blootgestelde dura mater rechtstreeks te raken. Vergeleken met het WD-model is het CCI-model nauwkeuriger en reproduceerbaarder, maar het veroorzaakt geen diffuus letsel vanwege de kleine diameter van de botsende punt¹¹. Tijdens FPI-modellering wordt het hersenweefsel kortstondig verplaatst en vervormd door percussie. FPI kan gemengd focaal/diffuus letsel veroorzaken en intracraniële bloeding, zwelling van de hersenen en progressieve grijze stofschade na TBI repliceren. FPI heeft echter een hoog sterftecijfer als gevolg van hersenstambeschadiging en langdurige apneu ^3,12. De craniotomie die betrokken is bij conventionele WD-, CCI- en FPI-modellen kan leiden tot corticale kneuzing, hemorragische laesies, schade aan de bloed-hersenbarrière, infiltratie van immuuncellen, activering van gliacellen, verlengde modelleringstijd en mogelijke fatale gevolgen ^3,12.

Milde TBI wordt gekenmerkt door een GCS-score (Glasgow coma scale, GCS) binnen het bereik van 13 tot 15². Milde TBI kan zowel focaal als diffuus zijn en wordt geassocieerd met zowel acute verwondingen, zoals afbraak van cellulaire homeostase, excitotoxiciteit, glucosedepletie, mitochondriale disfunctie, verstoring van de bloedstroom en axonale schade, evenals subacute verwondingen, waaronder axonale schade, neuro-inflammatie en gliose ^2,3. Ondanks aanzienlijke vooruitgang bij het afbakenen van de ingewikkelde pathofysiologie van TBI, blijven de onderliggende mechanismen van milde TBI/rmTBI ongrijpbaar en vereisen ze verder onderzoek⁹. Aangezien CHI het meest voorkomende type TBI¹² is, presenteert dit protocol een nieuwe benadering voor het creëren van een nauwkeuriger gecontroleerd muismodel van rmTBI met behulp van een gemodificeerd FPI-apparaat om impact uit te voeren in een verdund schedelvenster¹³. Door craniotomie-geïnduceerde verwondingen, variabele schedeldikte en vorm-geïnduceerde onnauwkeurigheden, en rebound-letsel te vermijden, is deze aanpak bedoeld om de belangrijkste nadelen van de WD-, CCI- en FPI-modellen te overwinnen. Het toepassen van FPI-impact op het verdunde schedelvenster is handig voor het evalueren van cerebrale vaatschade na rmTBI en helpt hoge sterftecijfers in sommige modellen te minimaliseren, wat resulteert in een nauwere gelijkenis met de klinische kenmerken van TBI-patiënten.

Protocol

Alle procedures die bij dit protocol betrokken zijn, zijn uitgevoerd onder goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee (Zhejiang Normal University, vergunningsnummer, dw2019005) en in overeenstemming met de ARRIVE en de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Technische specificaties zijn te vinden in de Tabel met Materialen.

1. Procedure voor de behandeling van dieren

1. Huismuizen in een gecontroleerde omgeving met een temperatuur van 22-24 °C, een luchtvochtigheid variërend van 40%-60%, een licht/donkercyclus van 12 uur, en bieden ad libitum toegang tot water en standaard muizenvoer. Voor dit experiment werden 25 ICR mannelijke muizen (25-30 g, 8 weken oud) gebruikt.
2. Wijs de muizen willekeurig toe aan de controlegroep (n=12) of de rmTBI-groep (n=13). Om mogelijke agressie van nepmuizen tegen muizen die rmTBI hebben ondergaan te voorkomen, scheidt u ze in aparte kooien.
3. Geef muizen minstens 1 week de tijd om te acclimatiseren aan hun kooiomgeving voordat ze met het experiment beginnen. Deze acclimatisatieperiode zorgt ervoor dat de muizen vertrouwd raken met hun omgeving en minimaliseert de mogelijke effecten van stress of angst op fysiologische of gedragsreacties tijdens het onderzoek.

2. Voorbereiding van TBI-apparaat

1. Fabriceer het rmTBI-model in muizen met behulp van een gemodificeerd FPI-apparaat (zie Tabel met materialen; Figuur 1A) ¹³. Voordat u het FPI-apparaat gebruikt, moet u alle aansluitingen zorgvuldig inspecteren op tekenen van lekkage of barsten, waarbij u speciale aandacht besteedt aan de verbindingen tussen de cilinder en de slang en tussen de driewegconnector en de slang. Om de impactdruk nauwkeurig te bepalen, werd een drukopnemer geïnstalleerd op het punt van impact op het vloeistofpercussieletselapparaat¹³.
2. Voer een zorgvuldige inspectie van het FPI-apparaat uit om er zeker van te zijn dat de zuiger soepel in de cilinder beweegt en dat schokken effectief kunnen worden uitgevoerd (Figuur 1B). Controleer of er geen luchtbellen in het systeem aanwezig zijn. Als er luchtbellen worden gedetecteerd, voeg dan voorzichtig gedestilleerd water toe aan het systeem met behulp van een spuit van 50 ml en verdrijf de luchtbellen door de cilinderstang snel door een nabijgelegen 3-weg connector en/of door de spuit te duwen.
   NOTITIE: Het FPI-systeem bestaat uit gedestilleerd water in de cilinder en de aangesloten slang. Het is van cruciaal belang om het apparaat vóór gebruik te kalibreren om de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de resultaten te garanderen.

3. Voorbereiding van de verdunde schedel

OPMERKING: De dierchirurgie en de voorbereiding van de uitgedunde schedel mogen niet worden uitgevoerd in het zicht van andere muizen. Het verdunde schedelvenster is nuttig voor het evalueren van schade aan de hersenvaten na een FPI-procedure.

1. Houd u aan de eisen van het dierencentrum door de experimentele operator te instrueren om een steriele jas en masker te dragen tijdens alle procedures voor het hanteren van dieren.
2. Ontsmet het laboratoriumtafelblad, het FPI-apparaat, de verdovingsslang en de aangrenzende aanrechtruimte voordat u begint met experimenteren met een 70% ethanolspray.
3. Weeg de muizen in zowel de schijn- als de rmTBI-groep vóór de operatie en vergelijk hun gewichten met die van 1 week voorafgaand aan het experiment. Sluit muizen met een slechte gezondheid uit, zoals ruwe bontjas, diarree, gewichtsverlies of lethargie. Sluit bovendien muizen uit die minder dan 20 g wegen om ervoor te zorgen dat ze herhaalde schokken kunnen verdragen. Deze maatregelen zijn cruciaal voor het handhaven van het dierenwelzijn en het waarborgen van betrouwbare experimentele resultaten.
4. Verdoof muizen met 4%-5% isofluraan (in 100% zuurstof bij een debiet van 1 l/min) gedurende 3-4 minuten in een inductiekamer. Dien een oogheelkundig smeermiddel (zie Materiaaltabel) toe aan de ogen van het dier om de smering tijdens de operatie op peil te houden. Om de pijn te verzachten, dient u buprenorfine subcutaan (0,05 mg/kg) toe in het midden tussen de oren 20 minuten voor de anesthesie en vervolgens elke 6 uur gedurende een duur van 24 uur. Dien bovendien aan het einde van de anesthesie een enkele subcutane dosis van 5 mg/kg carprofen toe aan elk dier.
5. Desinfecteer het hoofd nadat de muis zijn opricht- en pedaalterugtrekkingsreflexen heeft verloren. Knip de vacht op het hoofd van de muis af met een chirurgische schaar en gebruik een scheerapparaat om de resterende vacht te verwijderen. Desinfecteer de hoofdhuid met drie opeenvolgende toepassingen van 2% chloorhexidine, afgewisseld met 75% ethanol scrubs.
6. Plaats een steriel wegwerpverband onder het dier en de omgeving om een goede hygiëne te garanderen. Maak een incisie van 1,5 cm met behulp van een fijne kleine chirurgische schaar langs de middellijn van de hoofdhuid van de muis om de operatieplaats volledig bloot te leggen (Figuur 2A).
7. Zet de muis vast met behulp van niet-terminale oorbalken in een conventioneel stereotaxisch frame (zie Materiaaltabel). Pas de positie van de muiskop in een stereotaxisch frame aan op een vlakke hoogte of een licht gekantelde hoek, afhankelijk van het specifieke doelgebied dat zal worden onderzocht. Reinig de vacht uit het operatiegebied om later ontstekingen te voorkomen.
8. Houd de lichaamstemperatuur van de muis op 37 °C met behulp van een conventioneel isotherm verwarmingskussen (zie Materiaaltabel).
9. Tijdens het installatieproces van de chirurgische en impacthub (vrouwelijke Luer Lock), handhaaft u de anesthesie van de muis (zonder reactie op teen- of staartknijpen) met een neuskegel die een continue isofluraanconcentratie van 2% levert, gereguleerd door een gekalibreerde verdamper.
10. Reinig het operatiegebied rond het verdunde schedelvenster zorgvuldig met een steriel met zoutoplossing doordrenkt wattenstaafje.
11. Maak een verdund schedelvenster met een diameter van ongeveer 2,5 mm en een dikte van 20 μm in de rechter frontale motorische cortex met behulp van een microboor met platte punt (zie Tabel met materialen, figuur 2B) en een microchirurgisch mes. Lokaliseer de operatieplaats op 1,5 mm vóór het bregma en 1,3-2,0 mm lateraal van de middellijn (Figuur 2C).
    1. Om te voorkomen dat de microboor de schedel binnendringt tijdens het maken van het verdunde schedelvenster, bevochtigt u de schedel met tussenpozen met zoutoplossing terwijl u met de microboor slijpt.
    2. Bevestig de dikte van de schedel door de verdunde schedel voorzichtig te onderzoeken met de afgeplatte punt van een fijne spuitnaald en de zachtheid ervan te beoordelen. Schat de helderheid van de blootgestelde corticale microvaten visueel in om de dikte van de schedel te bepalen.
    3. Om de dikte van de schedel te controleren, brengt u steriele zoutoplossing aan op het uitgedunde gebied en inspecteert u visueel met een conventionele ontleedmicroscoop (zie Tabel met materialen). Deze techniek kan ervoor zorgen dat de schedel voldoende is uitgedund.
       OPMERKING: Smeer het oog van de muis gedurende de gehele voorbereidingsprocedure voor de voorbereiding van de verdunde schedel en de rmTBI-modelleringsprocedure om uitdroging te voorkomen. Het dunner worden van de schedel tot minder dan 15 μm brengt het risico van mild corticaal trauma met zich mee, wat kan leiden tot milde corticale ontsteking¹⁴.
12. Bevestig een aangepaste vrouwelijke Luer Lock (2.2 mm binnendiameter, gemaakt van een 19G-naaldnaaf, zoals weergegeven in afbeelding 2D) op de plaats van de verdunde schedel. Zet de Luer Lock vast met lijm en tandheelkundig cement (Figuur 2E).
    OPMERKING: Wanneer u lijm gebruikt om het vrouwelijke Luer-slot aan het gebied rond het verdunde schedelvenster te bevestigen, is het van cruciaal belang om het schedelgebied grondig te drogen en te voorkomen dat de lijm het raam zelf binnendringt. Lijm in het raam kan de slagkracht van de FPI aanzienlijk verminderen.

4. CHI-geassocieerde rmTBI-modelleringsprocedure

1. Introduceer rmTBI met behulp van de laterale vloeibare percussiemethode met een gemodificeerd FPI-apparaat zoals eerder beschreven^13,15.
2. Na het voltooien van de procedures voor het verdunde schedelvenster en de impacthub, brengt u de muis over van het stereotaxische apparaat naar het impactorplatform.
3. Gezien de mogelijke effecten van anesthesie op de tijd van de oprichtreflex van het dier en de ernst van het letsel na percussie ^9,16, moet u de anesthesiediepte controleren door de ooglid- en pootterugtrekkingsreflexen te evalueren (Figuur 2F).
4. Sluit de vrouwelijke Luer Lock, die op het verdunde schedelvenster was gelijmd, aan op de mannelijke Luer Lock aan het einde van de FPI-apparaatslang (Figuur 2G).
   OPMERKING: In de rmTBI-modellering werd de door isofluraan geïnduceerde anesthesie bij muizen verlengd vanwege de inductie van apneu en bewusteloosheid door percussie.
5. Introduceer twee milde TBI (interval van 48 uur) met het aangepaste apparaat. Pas de eerste FPI-impact toe onmiddellijk na het voltooien van de raamoperatie met verdunde schedel en het installeren van de Luer Lock. Dien de FPI-impact pas toe als de muis bij elke gelegenheid terugkeert van een terugtrekkingsreflex naar een pootknijp (Figuur 2H). Het toepassen van een FPI-impact bij diep verdoofde muizen kan langdurige apneu en de dood veroorzaken.
   1. Om de FPI-impact toe te passen, tilt u de slinger op tot de aangegeven graad langs de gradenboog op het apparaat en laat u de slinger los met behulp van softwarebesturing^13,15. De impact moet een percussie-intensiteit van 2,0 ± 0,1 atm bereiken, volgens de vastgestelde protocollen die worden gebruikt in knaagdierstudies 10,17,18. Sluit dieren uit van verdere tests als de impact niet tussen 1,9-2,1 atm is geregistreerd of als er een schedelfractuur is opgetreden tijdens FPI.
   2. Voor de nepmuizen, bevestig ze op het apparaat, maar lever niet de impact.
6. Maak na de botsing onmiddellijk de Luer Lock-verbinding los en breng de muizen over naar een isotherm verwarmingskussen voor herstel. Nadat de muis weer alert en bij bewustzijn is, brengt u hem terug naar zijn thuiskooi zonder de vrouwelijke Luer-vergrendeling te verwijderen. Dien de tweede FPI-impact op dezelfde manier toe, 48 uur later.
7. Verwijder na de rmTBI voorzichtig de vrouwelijke Luer-lock en het tandcement. Hecht de hoofdhuid met weefsellijm en gebruik een platte pincet om in de hoofdhuid te knijpen om het lijmproces te vergemakkelijken (zie Materiaaltabel; Figuur 2I).
8. Om ontsteking en infectie te voorkomen en postoperatieve pijn en ongemak te verlichten, brengt u een mengsel van erytromycine en natriumdiclofenac-zalf in een verhouding van 1:1 (zie Materiaaltabel) aan op de wond. Breng muizen over naar een isotherm verwarmingskussen voor herstel.
9. Noteer de duur van de oprichtreflex, die begint wanneer de muis uit het stereotaxische apparaat wordt gehaald en zijdelings op het botslichaam voor FPI wordt geplaatst en doorgaat totdat de muis zelfstandig rechtop kan staan.
10. Nadat de muis weer alert en bij bewustzijn is, brengt u hem terug naar zijn thuiskooi. Muizen zijn meestal volledig bij bewustzijn en kunnen binnen 1,5 uur na de verwonding lopen.
11. Observeer de muizen in de dagen na TBI-modellering op verschillende symptomen, waaronder ademhalingspatronen, aanwezigheid van slijm rond de neus en mond, en roodheid, zwelling, exsudaten of heropening van het wondgebied. Sluit dieren uit van het onderzoek met een of meer van de bovenstaande abnormale symptomen.
    OPMERKING: Pre-micro-injectie van AAV-GCaMP6s maakt observatie mogelijk van de onderliggende neuronale Ca2+-homeostase en prikkelbaarheid in de gewonde cortex door het verdunde schedelvenster met behulp van twee-foton-laserscanmicroscopie¹⁵.

5. Morris waterdoolhof (MWM) test

OPMERKING: De MWM (zie Tabel met materialen) is een algemeen erkende methode voor het evalueren van ruimtelijk leren en geheugentekorten bij muizen na TBI.

1. Voer de MWM-test uit vanaf 7 dagen na het letsel (DPI). Het ronde zwembad van de MWM had een diameter van 120 cm en een hoogte van 50 cm, waarbij de watertemperatuur op 25 °C werd gehouden. Verdeel het cirkelvormige zwembad in vier kwadranten, met het ontsnappingsplatform, een rond platform met een diameter van 6 cm en een hoogte van 30 cm, ondergedompeld 1 cm onder het wateroppervlak in het noordoostelijke kwadrant.
2. Plaats een camera direct boven het cirkelvormige zwembad om het bewegingstraject van de muizen vast te leggen. Markeer de muizen met zwarte tape op hun rug om de herkenning door de beeldacquisitiesoftware te vergemakkelijken en voor het vastleggen van gegevens, inclusief de latentie, zwemafstand en het bewegingstraject.
3. Plaats de muizen in het water, met hun gezicht naar de binnenwand van elk van de vier kwadranten, één keer voor elk kwadrant. Zodra de muizen het platform hebben gevonden, laat je ze daar 10 s rusten. Als een muis het platform niet binnen 60 s kan vinden, vraag dan de operator om de muis naar het platform te leiden, laat hem 10 s op het platform rusten en breng de muis vervolgens terug naar zijn thuiskooi om te rusten.
4. Herhaal voor elke muis de aanschafproef 4x per dag. Voer na de acquisitieproeven op 12 DPI een ruimtelijk sonde-experiment van 60 s uit en noteer het aantal keren dat de muizen het oorspronkelijke platformgebied overstaken en de duur van het muisverblijf in het kwadrant waar het platform zich bevond.
5. Droog de muizen na elke proef snel af met een handdoek of plaats ze onder een warmhoudlamp om hun lichaamstemperatuur op peil te houden en onderkoeling te voorkomen tijdens de jaren 60 Acquisitieproef van DPI 7 tot DPI 11.
6. Na voltooiing van de hierboven beschreven experimentele procedures, verdooft u de muizen met pentobarbital (45 mg/kg, i.p.) bij 13 DPI. Perfuseer isotone zoutoplossing transcardiaal, gevolgd door perfusie met 4% paraformaldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,2). Haal de hersenen op voor conventionele HE-kleuring om grove corticale en hippocampusmorfologische veranderingen te evalueren. Een gedetailleerde beschrijving van het HE-kleuringsprotocol is te vinden in eerdere publicaties ^13,15.
7. Nadat alle experimenten zijn voltooid, euthanaseert u de muis door injectie van een overdosis pentobarbital (≥100 mg/kg, i.p.) als er geen muizenmonsters nodig zijn. Voordat u weefsels oogst of het karkas weggooit, moet u de muis in de gaten houden totdat er gedurende ten minste 60 s geen hartslag is.

Resultaten

Het protocol dat in deze studie wordt beschreven, schetst een methode voor het induceren van rmTBI via een verdund schedelvenster, dat een oplossing biedt voor het hersenletsel veroorzaakt door craniotomievoorbereiding tijdens conventionele percussie-TBI-modellering. Door gebruik te maken van deze aangepaste vloeibare percussieprocedure met het gewijzigde apparaat, werden verbeterde precisie en reproduceerbaarheid van FPI-impact bereikt¹³. Het gemodificeerde botslichaam heeft de veelzijdigheid om te worden gebruikt voor zowel CHI- als FPI-modellering, met of zonder schedelcraniotomie. Bovendien wordt de ernst van het letsel gemoduleerd door letselparameters aan te passen, zoals de valhoek van de impactslinger, of door extra ethyleenvinylacetaatschuimkussens met gesloten cellen van verschillende hardheid toe te voegen aan de eindplaat van de zuigerpaal.

Het gemodificeerde rmTBI-model biedt aanzienlijke voordelen, zoals het produceren van focale en diffuse pathologie zonder de corticale durale bloot te leggen, waardoor ontsteking door blootstelling aan meningeale en/of directe FPI op parenchym wordt geminimaliseerd. Bovendien vermindert dit model variaties in de dikte en vorm van het schedelbot om betrouwbare letselresultaten te produceren. Daarom is het gewijzigde rmTBI-model effectief en betrouwbaar in het simuleren van klinisch relevante post-concussieve symptomen (PCS)-gerelateerde neuropathologische en gedragsstoornissen in verschillende letselgraden. Dit model is met name nuttig voor het onderzoeken van pathologische mechanismen van TBI die afhankelijk zijn van de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van TBI-modellen bij dieren, met name voor het onderzoeken van milde TBI-gerelateerde mechanismen.

De frontale laterale tak van de middelste hersenslagader van de muis en de caudale rhinale ader¹⁹, gelegen onder de verdunde schedel, zorgden voor een duidelijke visualisatie onder de camera. Na twee rmTBI-percussieën, elk met een druk van ongeveer 2,0 atm, vertoonden alle muizen subdurale hematomen bij 0 DPI. Hoewel de integriteit van de uitgedunde schedel niet in het gedrang leek te komen; er werd echter een vermindering van het aantal microvaten waargenomen naast veranderingen in de morfologie van microvasculatuur (figuur 2H), zoals eerder gerapporteerd¹⁵. Bij 2 DPI verdwenen de hematomen grotendeels. Mortaliteit is voornamelijk het gevolg van een botsing terwijl de muis onder diepe narcose is, wat apneu aanzienlijk kan verlengen. Regelmatig beoordelen van de diepte van de anesthesie vóór de botsing door middel van de ooglid- en pootterugtrekkingsreflexen kan de mortaliteit aanzienlijk verminderen. Aanvullende factoren die van invloed kunnen zijn op de sterftecijfers na vloeibare percussie zijn onder meer de belasting van de muis, de hardheid van de schedel, het geslacht en de leeftijd. In een eerdere studie die hetzelfde rmTBI-protocol gebruikte, was één C57BL/6J-muis¹⁵ overleden. In dit protocol werden alleen mannelijke ICR-muizen gebruikt om de hele procedure te introduceren.

Zowel studies bij mensen als bij dieren hebben aangetoond dat zelfs herhaalde subconcussieve botsingen met het hoofd wijdverspreide microstructurele verwondingen aan de witte stof kunnen veroorzaken 20,21,22, die in verband worden gebracht met slechtere cognitieve prestaties ^21,22. Bij 7-12 DPI kan rmTBI stoornissen veroorzaken in ruimtelijk leren en geheugen, die werden onderzocht met behulp van het MWM-paradigma. Figuur 4 illustreert de resultaten van deze beoordeling.

Analyse van de laatste acquisitieproef in de MWM toonde een significante toename (p< 0,05) van de latentie van rmTBI-muizen om het ondergedompelde platform te bereiken, vergeleken met de controlegroep. In de sondeproef toonde de analyse van het percentage van de tijd doorgebracht in het oorspronkelijke platformkwadrant een significante vermindering (p<0,01) aan in de rmTBI-groep ten opzichte van de controlegroep, wat wijst op een afname van het ruimtelijk referentieleren en geheugenvermogen bij muizen met rmTBI.

De hier beschreven methode werd gebruikt in een eerdere publicatie¹⁵ met behulp van de C57BL/6J muizen. Naast de MWM zijn er nog drie aanvullende analyses uitgevoerd, zoals hieronder beschreven.

De OFT werd gebruikt om de voortbewegings- en verkenningsmogelijkheden te beoordelen door de gemiddelde reissnelheid, de totale afgelegde afstand en het percentage van de afgelegde afstand in de centrumzones te meten. Voer een openveldtest (OFT) uit bij 6 DPI om voortbeweging, verkenning en angst bij muizen te evalueren. Het testapparaat van 40 x 40 x 40 cm, dat was verdeeld in 16 zones (elk van 18 x 18 cm). De muis werd in het midden van het apparaat geplaatst en mocht 5 minuten vrij verkennen. Er werd een registratie gemaakt van de afgelegde afstand in de middelste 4 zones, de totale afgelegde afstand, de gemiddelde bewegingssnelheid en de tijd doorgebracht in de grenszones. Angstniveaus werden geëvalueerd op basis van het percentage van de afgelegde afstand in de centrale zones en de tijd die knaagdieren in de aangrenzende zones doorbrachten gedurende een observatieperiode van 5 minuten. Bij 6 DPI heeft rmTBI mogelijk geen significante invloed op de algemene locomotiefvaardigheden van de muizen, het kan aanzienlijke angst veroorzaken en verkennend gedrag veranderen, zoals weergegeven in figuur 4¹⁵. Bovendien induceert het gewijzigde rmTBI-model diffuse axonale verwondingen, die kunnen worden geëvalueerd door middel van aanvullende gedragstests, zoals de cognitieve capaciteitentest die in dit protocol wordt beschreven.

Het is aangetoond dat RmTBI de ruimtelijke werking en het referentiegeheugen bij muizen schaadt, zoals geïllustreerd in figuur 5¹⁵. Deze cognitieve functies werden beoordeeld met behulp van de Y-maze-test. De test werd uitgevoerd bij 8 DPI om tekorten in het kortetermijnwerkgeheugen bij muizen te meten. Voor spontane afwisseling werd een acryl Y-doolhof apparaat (20 cm hoog, 50 cm lang en 10 cm breed aan de onderkant) gebruikt. Nadat de muis in het midden van het apparaat was geplaatst en 8 minuten had kunnen verkennen, werden de armingangen geregistreerd. Spontane afwisselingsgedrag wordt gedefinieerd als de opeenvolgende binnenkomst van de muis in de drie armen op tripletsets. Bereken de spontane afwisselingssnelheid (%) als (opeenvolgende tripletsets / totaal aantal armingangen min 2) x 100. Voor ruimtelijk referentiegeheugen sluit u tijdens de training van 8 minuten willekeurig één arm van het Y-doolhofapparaat af. Na 1 uur na de eerste belichting wordt de muis opnieuw in het doolhof geïntroduceerd met alle drie de armen open en laat hem gedurende 3 minuten vrij verkennen. De tijd die wordt besteed aan het verkennen van de nieuwe arm versus de andere twee armen wordt geregistreerd. Bereken de voorkeursindex als de tijd doorgebracht in de nieuwe arm versus de tijd doorgebracht in alle drie de armen.

Bovendien raden we aan om grove structurele laesies in de hersenen te evalueren met behulp van eenvoudige HE-kleuring (Figuur 6)¹⁵ na het voltooien van alle gedragstests. Gebruik het corticale gebied coronaal doorsnede van 1 mm vóór de laesieplaats tot de achterrand van de laesie, en het hippocampusgebied coronaal doorsnede in de typische halvemaanvormige zone (Bregma: -1,7 tot -2,2 mm). Het tellen van neuronen in elk objectglaasje uit zes willekeurige velden met behulp van een oculair raster (vergroting 400x) en het gemiddelde van het neuronale aantal leverde de cijferdichtheid per gezichtsveld (numerieke dichtheid) op. De hersengebieden die door rmTBI zijn aangetast, bleken verschillende gradaties van neuronbeschadigingen te vertonen¹⁵. In het bijzonder vertoonde de motorische cortex een krachtigere en gevarieerdere omvang van dergelijke verwondingen dan de hippocampus. HE-kleuring vertoonde een aanzienlijke verschuiving naar pyknotische morfologie van normale neuronen (Figuur 6A, B, E, F). Bovendien werd waargenomen dat de extracellulaire matrix specifiek in het gebied van de laesie loskwam (figuur 6F). Naast de waargenomen matrix-losgemaakte gebieden, vertoonden rmTBI-muizen ook een significante toename van hyperchrome kleuring, gezien als een donkerdere rode kleur, in een significant aantal subgranulaire neuronen in de dentate gyrus en sommige corticale en CA1-neuronen. Intrigerend genoeg vertoonden deze kleuringspatronen geen begeleidende tekenen van cytoplasmatische krimp of pyknotische kern (Figuur 6C,D,G,H,K)¹⁵. De hierboven genoemde gedrags- (met uitzondering van WMM-test) en HE-kleuringsmethoden werden gedetailleerd beschreven in een recente publicatie, waarin het gewijzigde rmTBI-model¹⁵ werd geïntroduceerd.

Afbeelding 1: Het gewijzigde FPI-apparaat en de schermafbeelding van de software. (A) Het gewijzigde FPI-apparaat . (B) De schermafbeelding toont de FPI-drukgolfvorm en de automatische meting en export van real-time impactdrukparameters zoals stijgtijd, valtijd en halve breedteduur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Het gemodificeerde muismodel van rmTBI in ICR-muizen. (A) Er wordt een incisie in de middellijn gemaakt om het operatiegebied bloot te leggen. (B) Een verdund schedelvenster werd gefabriceerd op de motorische cortex. De helderheid van de blootgestelde corticale microvaten wordt gebruikt om de dikte van de schedel te bepalen. (C) De dikte van de schedel kan ook worden geverifieerd door de verdunde schedel voorzichtig te onderzoeken met de afgeplatte punt van een fijne spuitnaald en de zachtheid ervan te beoordelen. (D) De vrouwelijke Luer Lock was vastgelijmd aan het uitgedunde schedelraam. (E) De bevestigde vrouwelijke Luer Lock werd vastgezet door het tandcement aan te brengen. (F) De diepte van de anesthesie werd gecontroleerd door de ooglid- en pootterugtrekkingsreflexen te controleren. (G) De FPI-impact werd toegediend na de terugkeer van een terugtrekkingsreflex naar een pootknijp. (H) Post-rmTBI-beeld van een verdund schedelvenster bij 0 DPI. (I) De hoofdhuid werd gehecht met weefsellijm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: De effecten van rmTBI op ruimtelijk referentieleren en geheugen bij ICR-muizen. (A) Het navigatiespoor voor muizen tijdens de laatste acquisitieproef geregistreerd bij 11 DPI, (B) de ruimtelijke sonderoute in de sondeproef geregistreerd bij 12 DPI, en (C) de ontsnappingstijd die muizen nodig hadden om het platform te lokaliseren tijdens de laatste acquisitieproef. Uit de resultaten bleek dat de rmTBI-groep er significant langer over deed om het verborgen platform te bereiken dan de controlegroep (p<0,05). (D) Het percentage tijd dat muizen in het oorspronkelijke platformkwadrant doorbrachten ten opzichte van de totale navigatietijd tijdens de sondeproef was significant lager in de rmTBI-groep dan in de controlegroep (p<0,01). n=8. *p<0.05, **p<0.01 vs. controle door ongepaard t-toets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: De effecten van rmTBI op voortbeweging, exploratie en angst bij C57BL/6J muizen. (A) Representatieve sporen van controle- en rmTBI-muizenbeweging gedurende 5 minuten OFT. (B-E) Samengevatte gegevens tonen respectievelijk de afgelegde afstand in de centrumzones, de totale afgelegde afstand, de gemiddelde reissnelheid en de tijd doorgebracht in de periferiezones. Controle, n=13; rmTBI, n = 12. blz<. 01 vs. controle door ongepaard T-test. Dit cijfer is gewijzigd van¹⁵. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: De effecten van rmTBI op ruimtelijk werken en referentiegeheugen in C57BL/6J muizen. (A, B) Representatieve sporen van controle en rmTBI-muizenbeweging tijdens de ruimtelijke werk- en referentiegeheugenbeoordelingen in Y-doolhof. De spontane afwisselingstest in het Y-doolhof is een veelgebruikte methode voor het beoordelen van het kortetermijngeheugen in knaagdiermodellen¹⁵. (C) Samenvatting van spontane afwisselingssnelheden van controle- en rmTBI-muizen tijdens beoordeling van ruimtelijk werk. Knaagdieren geven er meestal de voorkeur aan om een nieuwe arm van het doolhof te verkennen in plaats van een nieuwe arm te bezoeken die ze al hebben verkend. Een voorkeursindex wordt berekend op basis van de tijd die knaagdieren in de nieuwe arm doorbrengen in vergelijking met de tijd die in alle drie de armen wordt doorgebracht, en deze index wordt vervolgens geanalyseerd. (D) Samenvatting van de voorkeursindex van controle- en rmTBI-muizen tijdens de beoordeling van de ruimtelijke werking. Controle, n=13; rmTBI, n=12. blz<. 01 vs. controle door ongepaard T-test. Dit cijfer is gewijzigd van¹⁵. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Vergelijking van HE-kleuring van de ipsilaterale gewonde motorische cortex en hippocampale dentate gyrus subregio tussen controle en rmTBI bij C57BL/6J-muizen. (A, B) Normale motorische cortex; en (C, D) het hippocampusgebied van controlemuizen in verschillende vergrotingen. (E, F) Gewonde motorische cortex en (G, H) hippocampusgebieden van rmTBI-muizen. Hyperchrome neuronen in de cortex en CA1 kunnen licht zijn aangetast door de voorbereiding van een operatie of aanhoudende rmTBI; hypochrome (mogelijk intermediair gewonde) en pyknotische (apoptotische neuronen) neuronen werden echter waargenomen in de motorische cortex van rmTBI-muizen in vergelijking met normale neuronen in de controlemuizen. Deze kenmerken van neuronale apoptose omvatten neuronale cytoplasmatische krimp en krimp van de kern, vergezeld van schijnbare vacuolatie. Met name de witte afbakeningslijn in (E) vertegenwoordigt de grens tussen het beschadigde en het omringende weefsel. Bovendien verwezen de hyperchrome neuronen in de DG-subregio (H) mogelijk naar nieuw gegenereerde onrijpe en rijpe granulaire neuronen. De onderstaande staafdiagrammen tonen de verdeling van normale en door rmTBI aangetaste neuronen in de subregio's (I) motorische cortex en hippocampus (J) CA1 en (K) DG. Controle, n=13; rmTBI, n=12, ***p<. 001 vs. controle door ongepaarde T-test. Dit cijfer is gewijzigd van¹⁵. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

TBI verwijst naar twee primaire typen, gesloten en penetrerend, waarbij de laatste wordt gekenmerkt door een verstoring van de schedel en dura mater. Klinische gegevens suggereren dat CHI's vaker voorkomen dan penetrerende verwondingen ^1,2. Na een enkele milde TBI ervaren de meeste patiënten PCS-symptomen die doorgaans in korte tijd verdwijnen, en er is controverse over het percentage patiënten bij wie PCS zich ontwikkelt tot langdurige gevolgen^23,24. Daarom hebben onderzoekers hun focus verlegd naar repetitieve CHI-modellen om de cumulatieve effecten van meerdere hersenschuddingen²⁵ beter te begrijpen, die vaak voorkomen bij vallen, verkeersongevallen en contactsporten. Deze herhaalde effecten kunnen leiden tot ernstigere en langetermijneffecten^26,27. Door repetitieve CHI-modellen te gebruiken, kunnen onderzoekers de mogelijke additieve of synergetische effecten van meerdere hersenschuddingen onderzoeken en een beter begrip krijgen van de onderliggende mechanismen die bijdragen aan PCS. Dergelijke modellen kunnen de ontwikkeling van gerichte therapeutische interventies vergemakkelijken om de langetermijngevolgen van herhaalde botsingen met het hoofd te verzachten.

Hoewel sommige CHI-modellen proberen zowel focale enkelvoudige als rmTBI te simuleren door zowel lineaire als rotatiekrachten op te nemen, kunnen deze modellen leiden tot rebound-letsel en onnauwkeurigheden in de ernst van het letsel als gevolg van factoren zoals schedelfractuur, schedelmorfologie en -dikte, verlengde apneu^{bij dieren 10} en variabiliteit in mechanische invoerparameters, vooral wanneer roterende hoofdbewegingen worden opgenomen⁹. Zuigergecontroleerde impact- en weight-drop-methoden worden vaak gebruikt om rmTBI te induceren in diermodellen van CHI²⁵. Zuigergestuurde impact maakt een nauwkeurige en instelbare instelling van impactparameters mogelijk door het gebruik van elektromagnetische of pneumatisch aangedreven impactoren, waardoor een hoge reproduceerbaarheid van de impact mogelijk is. Het gebruik van zuigergecontroleerde impact, of het nu op de blootgestelde cortex is zoals bij CCI of op de gesloten schedel, vereist echter nog steeds strikte immobilisatie van het hoofd van het dier in een stereotaxisch frame tijdens de impact. Omgekeerd vereisen methoden voor gewichtsval eenvoudige en kosteneffectieve materialen die gemakkelijk in te stellen zijn, maar de afweging is een enigszins hoge variabiliteit in de ernst van het letsel²⁵.

Het FPI-model induceert doorgaans gemengde focale en diffuse verwondingen, waardoor de fabricage van TBI van verschillende ernst mogelijk is. Ondanks de voordelen heeft het FPI-model ook potentiële beperkingen. Net als het CCI-model vereist FPI nog steeds craniotomie, een chirurgische ingreep die ontstekingen in het hersenweefsel kan veroorzaken¹⁷. Bovendien dringt zelfs milde FPI vaak op verschillende diepten door in de dura, wat verwarring kan veroorzaken bij de interpretatie van gegevens. CCI- en FPI-modellen hebben dus beperkingen bij het repliceren van de klinische kenmerken die worden waargenomen bij milde TBI-patiënten⁹. Daarom presenteren we een protocol dat de verdunde schedelvenster- en FPI-methoden combineert, die kunnen worden gebruikt om een nauwkeuriger muismodel van CHI-geassocieerde rmTBI te produceren. Het doel van dit protocol is om de klinische kenmerken van milde TBI-patiënten nauwkeurig na te bootsen. Een zeer reproduceerbaar model zou een hulpmiddel van onschatbare waarde zijn voor het onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathofysiologie van milde TBI en het evalueren van mogelijke therapeutische interventies.

Onze onderzoeksresultaten over rmTBI komen overeen met eerdere publicaties die verdunde schedelvensters gebruikten voor milde TBI-onderzoeken^28,29. Ren et al. creëerden bijvoorbeeld een verdund schedelvenster met een dikte van ongeveer 30 μm in de linker pariëtale associatiecortex, waarbij milde TBI werd geïnduceerd door het venster voorzichtig in te drukken met een stomp uiteinde met een diameter van 1 mm van een chirurgisch stereotaxisch instrument²⁹. Hun studie toonde een opmerkelijke uitbreiding van celdood en expressie van reactieve oxidatieve species (ROS) in de gewonde cortex²⁹. Om rmTBI te onderzoeken, pasten Nguyen et al. drie CCI's toe met een gemodificeerde impactortip (ronde siliconentip met een diameter van 3 mm en een dikte van 1,5 mm) op een muizenschedelvenster (20-40 μm dik) in de pariëtale associatiecortex²⁸. Om de transparantie van het verdunde schedelgebied te beschermen en te behouden voor langdurige beeldvorming, bedekten ze het verdunde schedelvenster met een dunne laag cyanoacrylaatlijm. De drie CCI's werden gedurende 3 weken eenmaal per week uitgevoerd, met impactparameters van 4 m/s in snelheid en 2 mm in diepte. Als gevolg van de drie CCI's vertoonden de muizen duidelijke astrogliose en microgliale activering²⁸. Aangezien het gebruik van een verdund schedelvenster als model voor milde TBI/rmTBI relatief recent is, is verder onderzoek nodig om de relatie tussen de ernst/progressie van het letsel en verschillende impacttechnieken te onderzoeken. In een eerdere studie konden we bijvoorbeeld duidelijke veranderingen in de celmorfologie waarnemen na twee FPI's die werden toegediend met een interval van 2 dagen¹⁵. Ondertussen, in andere studies, induceerde een enkele zachte compressie van het verdunde schedelvenster milde TBI met duidelijke celdood en expressie van reactieve oxidatieve soorten²⁹, en drie wekelijkse CCI's resulteerden in robuuste astrogliose en microgliale activering²⁸.

Er moeten verschillende stappen worden ondernomen om een consistent letselmodel te fabriceren met behulp van de beschreven methode. Tijdens de operatie van het verdunde schedelvenster, op basis van een ander doelgebied (we concentreerden ons bijvoorbeeld op de motorische cortex), moet het hoofd van de muis worden gefixeerd in een stereotactisch frame op horizontaalniveau of in een lichte zijhoek naar de andere kant van het verdunde schedelvenster in dit protocol. Deze specifieke positionering kan de vorming van het verdunde schedelvenster vergemakkelijken in het gebied dat overeenkomt met de motorische cortex. Het nauwkeurig plaatsen van de oordopjes is een van de meest uitdagende aspecten van deze procedure en het kan tijd en oefening kosten om het onder de knie te krijgen. Voordat u de operatie met een verdund schedelvenster probeert of CHI induceert, is het essentieel om ervoor te zorgen dat de schedel waterpas is. Als de schedel niet correct is gepositioneerd, moet het hoofd dienovereenkomstig worden aangepast. Vanwege de ongelijke vorm en dikte van het schedelbot is de schedelgroei variabel, zelfs binnen een specifiek bot³⁰, het is van cruciaal belang om de positionering van het hoofd aan te passen voordat u de procedure voor het verdunnen schedelvenster of CHI uitvoert. Als u dit niet doet, verhoogt u het risico op schedelfracturen, wat de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van CHI aanzienlijk kan beïnvloeden. Voor meer uitgebreide richtlijnen over de procedure voor het verdunnen van het schedelvenster, zie het protocol beschreven door Guang et ^al.14.

De keuze van het TBI-modelleringsgebied varieert tussen onderzoekers op basis van hun onderzoeksfocus. Gezien de aanzienlijke variabiliteit in de werkelijke locatie van de verwonding bij CHI, ondanks dat de meeste studies melden dat de impactlocatie centraal gelegen is tussen bregma en lambda, wordt aanbevolen om de impactlocatie in toekomstige experimentele studies te variëren, zoals opgemerkt in een overzicht van CHI-diermodellen²⁵. Om het gewijzigde CHI-model voor dunnere schedelbeschadiging te valideren, raden we aan om te beginnen met de motorische cortex, zoals beschreven in dit protocol. De rmTBI kan focale motorische cortexletsels veroorzaken, die gemakkelijk kunnen worden geëvalueerd met behulp van locomotorische beoordelingsbenaderingen zoals de OFT in dit protocol. De incisie die tijdens deze procedure wordt gemaakt, heeft tijd nodig om te genezen, en dit kan mogelijk een perifere immuunrespons veroorzaken, waardoor uiteindelijk variabiliteit in het experiment wordt geïntroduceerd. Om het risico op ontsteking, infectie en postoperatieve pijn en ongemak te minimaliseren, raden we aan om een topische zalf met een combinatie van erytromycine en natriumdiclofenac op de wond aan te brengen. Het is aangetoond dat deze aanpak effectief is bij het verminderen van ontstekingen en pijn die gepaard gaan met chirurgische ingrepen bij dieren.

Het op een verdunde schedel gebaseerde vloeistofpercussieprotocol is een veelbelovende methode voor het modelleren van rmTBI bij knaagdieren, omdat het de ontsteking vermindert die gewoonlijk wordt veroorzaakt door de hersenvliezen bloot te stellen aan FPI. Deze techniek, te zien in het venster met de verdunde schedel, kan effectief klinisch relevante PCS genereren in verschillende mate, wat een potentieel alternatief biedt voor onderzoekers die rmTBI bestuderen. Bovendien vergemakkelijkt het verdunde schedelvenster de observatie van Ca²⁺ homeostase en neuronale hyperexcitabiliteit in de cortex in vivo¹⁵. Het gebruik van deze techniek kan ons begrip van de onderliggende mechanismen van PCS-progressie op korte/matige/lange termijn verbeteren, waardoor het vermogen om de ontwikkeling ervan te voorspellen en effectievere therapeutische behandelingen te ontwikkelen, wordt verbeterd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
75% ethanol	Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd.	220502
Buprenorfine hydrochloride	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd	H12020272	Solution, Pijnstiller
Carprofen	Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd	53716-49-7	Poeder, Pijnstiller
Chlorhexidine digluconaat	Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd.	18472-51-0	19%-21% waterige oplossing, Antimicrobieel
Tandheelkundig cement en oplosmiddel set	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	20220405, 3#	Poeder hersteld in bijpassend oplosmiddel
Dissectiemicroscoop	Shenzhen RWD Life Science Inc.	77019
Erytromycinezalf	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.	220412	Antibioticum
Vezeloptische koude lichtbron	Shenzhen RWD Life Science Inc.	F-150C
Microboor met platte punt	Shenzhen RWD Life Science Inc.	HM31008	2 mm, staal
FPI-apparaat software	Jiaxing Bocom Biotech Inc.	Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR muizen	Jinhua Laboratory Animal Center	Stock#2023091	25 Mannelijke muizen, 25-30g, 8 weken oud
Isofluraan	Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd.	2023090501
Isotherm verwarmingskussen	Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd.
Luer Loc hup			Op maat gemaakt met een 19G naaldhub
Micro draagbare schedelboor	Shenzhen RWD Life Science Inc.	78001	Max: 38.000rpm
Gemodificeerde FPI-apparaat	Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Morris water doolhof	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63031	Evalueer ruimtelijk leer- en geheugenvermogen van muizen
Open veld	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63008	Evalueer locomotie en angst bij muizen
Oftalmisch glijmiddel	Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd.	SC230724B
Natriumdiclofenac zalf	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.	221207	Niet-steroïdale anti-inflammatoire drug
Klein dier anesthesiesysteem-Verbeterd	Shenzhen RWD Life Science Inc.	R530IP
Smart video-tracking systeem	Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, USA	V3.0	Dier tracking en analyse
Stereotactisch frame	Shenzhen RWD Life Science Inc.	68043
Vetbond weefselkleefmiddel	3M, St Paul, MN, USA	202402AX	Naai het wond van het dier
Y-labyrint	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63005	Evalueer ruimtelijk werkgeheugen van muizen