Driedimensionale tomografie van het hele orgaan met hoge resolutie van microbiële infecties

Samenvatting

Hier beschrijven we een procedure die orgaanbrede detectie van pathogene bacteriën tijdens infectie en kwantificering van fluorescerende reporteractiviteiten mogelijk maakt.

Samenvatting

De meeste infecties vinden plaats in driedimensionale gastheerweefsels met een ingewikkelde anatomie en lokaal variërende gastheerfysiologie. De positionering van pathogene cellen in deze diverse omgeving heeft een aanzienlijke invloed op hun stressniveaus, reacties, lot en bijdrage aan de algehele progressie van de ziekte en het falen van de behandeling. Vanwege de technische problemen bij het lokaliseren van pathogene cellen ter grootte van μm in gastheerorganen ter grootte van een cm, is dit onderzoeksgebied echter relatief onontgonnen. Hier presenteren we een methode om deze uitdaging aan te gaan. We maken gebruik van seriële twee-fotontomografie en AI-verbeterde beeldanalyse om individuele Salmonella-cellen te lokaliseren in de hele milt, leverkwabben en hele lymfeklieren van geïnfecteerde muizen. Met behulp van fluorescerende reporters en in vivo toediening van antilichamen kan de replicatiesnelheid van afzonderlijke Salmonella-cellen , hun lokale interactie met specifieke immuuncellen en bacteriële reacties op antibiotica worden bepaald. Deze methodologieën openen wegen voor een uitgebreid onderzoek naar infecties, hun preventie en behandeling binnen de driedimensionale weefselcontext.

Inleiding

Infecties komen voor in weefsels met een complexe anatomie en gecompartimenteerde fysiologie. De diverse micro-omgevingen die naast elkaar bestaan in het geïnfecteerde weefsel, kunnen het lot van lokale pathogene subgroepen en hun bijdragen aan de algehele ziekte-uitkomst bepalen^. Het uitgebreid in 3D in kaart brengen van microbiële pathogenen in weefsels ter grootte van een cm blijft echter een uitdaging⁴. Beeldvorming van de hersenen en andere organen is een zeer actief onderzoeksgebied met voortdurend verbeterende experimentele strategieën⁵, maar veel methoden missen nog steeds de resolutie van minder dan μm die nodig zou zijn om bacteriële pathogenen ter grootte van μm met vertrouwen te identificeren. Seriële twee-foton (STP) tomografie⁶ daarentegen maakt geautomatiseerde meerkleurige, vervormingsvrije beeldvorming van hele weefsels mogelijk met een resolutie van minder dan μm in het vlak, wat volledige volumetrische datasets oplevert. Deze methode combineert herhaalde fysieke doorsnede van het weefsel met behulp van een vibratoom met intermitterende beeldvorming van twee fotonen van de opkomende blokvlakken met infrarood licht. STP-tomografie is veel gebruikt voor het in kaart brengen van dunne axonen in de hersenen om connectiviteitskaarten 7,8,9,10 vast te stellen.

STP-tomografie maakt het ook mogelijk om individuele microbiële pathogene cellen (Salmonella, Toxoplasma) in de gehele geïnfecteerde weefsels in kaart te brengen^11,12 met behulp van een tomograaf. De tweede harmonische generatie onthult collageenomhulsels rond slagaders en in vezelachtige banden zoals de trabeculae van de milt, en biedt zo anatomische context. In vivo geïnjecteerde fluorescerende antilichamen kunnen worden gebruikt om gastheercellen te kleuren om interacties tussen individuele pathogene cellen en infiltrerende immuuncellen zoals neutrofielen te onthullen. Hier wordt de pijplijn beschreven met verwerking van het weefsel, beeldvorming, het naaien van beeldvormingstegels met verlichtingscorrectie, het stapelen van afbeeldingen in drie dimensies en segmentatie met behulp van machine learning-tools. Deze pijplijn levert 3D-posities op van individuele pathogenen, cellen en microkolonies binnen hun gastheercontext. Het tellen van het aantal individuele cellen binnen microkolonies blijft moeilijk vanwege resolutielimieten, maar dergelijke aantallen kunnen worden geschat op basis van de geïntegreerde helderheid van de microkolonie. De pijplijn kan gemakkelijk worden aangepast aan andere infectiemodellen als er recombinante GFP- of YFP-expressieve pathogenen beschikbaar zijn.

Protocol

Alle hier beschreven dierproeven zijn goedgekeurd door de autoriteiten (licentie 2239, Kantonales Veterinäramt Basel) en volgen de lokale richtlijnen (Tierschutz-Verordnung, Basel) en de Zwitserse dierenbeschermingswet (Tierschutz-Gesetz).

1. Voorbereiding en opslag van geïnfecteerde weefsels

1. Gebruik een infectiemodel naar keuze. Hier worden 10 tot 16 weken oude muizen van beide geslachten geïnfecteerd met ~1.000 kolonievormende eenheden (CFU) door intraveneuze injectie of 5 x 10⁷ CFU door intragastrische toediening met een naald met ronde punt. Geschikte muizenstammen zijn onder meer BALB/c en C57BL/6.
   OPMERKING: Dezelfde aanpak kan gemakkelijk worden aangepast voor andere gastheersoorten.
2. Zorg ervoor dat ziekteverwekkers fluorescerende eiwitten tot expressie brengen om identificatie in ongekleurd weefsel mogelijk te maken. Ziekteverwekkers die GFP.mut2¹³, YPet¹⁴, TIMER^bac15 of mWasabi¹⁶ tot expressie brengen, kunnen allemaal worden gevisualiseerd met behulp van 940 nm excitatie¹⁷. Salmonella die mCherry¹⁸ tot expressie brengt op niveaus die gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd door flowcytometrie¹⁹ , kan worden afgebeeld met behulp van 800 nm excitatie, maar heeft slechte signaal-achtergrondverhoudingen in geïnfecteerde milt en lever die substantiële autofluorescentie vertonen.
3. Zorg ervoor dat alle fluorescerende eiwitten >70% van hun fluorescentie-intensiteit behouden na fixatie met paraformaldehyde bij neutrale pH op basis van kwantificering met flowcytometrie. Hier worden geïnfecteerd muizenweefsel, namelijk milt, lever, lymfeklieren en Peyer's pleisters gebruikt.
4. Kleurig de oppervlaktemarkers van de gastheercel in vivo door 10 minuten voor de perfusie fycoerythrin (PE)-gelabelde antilichamen te injecteren. Om neutrofielen te kleuren, injecteert u intraveneus 4 μg anti-Ly-6G-PE in 100 μL PBS. Om macrofagen in de marginale zone in de milt te kleuren, injecteert u 4 μg anti-CD169-PE in 100 μl PBS (zie Materiaaltabel).
5. Fixeer geïnfecteerde weefsels door middel van standaard transcardiale perfusie²⁰ met 15 ml ijskoude fosfaatbuffer van 50 mM (PB; 10 mM NaH₂PO₄, 40 mMNa₂HPO₄, pH 7,4), gevolgd door 35 ml 4% paraformaldehyde (PFA; fixeermiddel) in PB (Figuur 1A).
   1. Kortom, diepe anesthesie toedienen aan het geïnfecteerde dier door intraperitoneale injectie van 100 mg/kg ketamine en 16 mg/kg xylazine. Zorg voor een goede verdoving door het verlies van de teenknijpreflex te bevestigen.
   2. Desinfecteer de vacht met 70% ethanol, droog deze af met een steriele papieren handdoek en open de borst operatief met een pincet en een schaar. Plaats een steriele naald in de linkerventrikel van het hart, open het rechteratrium met een steriele schaar en laat de eerste buffer en vervolgens het fixeermiddel door de naald, de linkerventrikel en het hele vasculaire systeem lopen met behulp van een pomp. Dit fixeert alle weefsels snel en gelijkmatig en veroorzaakt euthanasie.
6. Verzamel het weefsel na perfusie, incubeer het in 20x volume 4% koud paraformaldehyde in PB-buffer en plaats het een nacht op een shaker bij 4 °C (Figuur 1B). Beeldvorming is mogelijk voor weefsels in het groottebereik van 0,05 tot 2^cm3. Snijd voor grotere weefsels in geschikte stukken.
7. Was de tissue de volgende dag 3x gedurende 10 minuten met PB-buffer en schud op 40 tpm bij kamertemperatuur om PFA te verwijderen.
   OPMERKING: Vanwege de PFA-toxiciteit moeten deze stappen worden uitgevoerd in een zuurkast. Gooi het PFA-afval weg volgens de institutionele richtlijnen.
8. Verwijder eventuele overtollige PB-buffer en voeg 20x volume cryoprotectieve opslagbuffer²¹ (876 mM sucrose, 0,25 mM polyvinylpyrrolidon, 40% (v/v) ethyleenglycol, opgelost in 50 mM PB-buffer) toe aan het monster door te schudden bij 40 rpm bij 4 °C gedurende 6-8 uur of totdat de weefsels naar de bodem zinken. Incubeer monsters bij -20 °C gedurende ten minste 3 dagen om een effectieve vermindering van de autofluorescentie van het weefsel te garanderen¹¹. Monsters kunnen tot 5 jaar worden gebruikt wanneer ze worden bewaard bij -20 °C.
   OPMERKING: Het zinken van het weefsel duidt op een goede penetratie van de opslagbuffer in het weefsel.

2. Voorbeeld inbedding

1. Plaats het weefsel in een agaroseblok voor soepel snijden met een vibratoom. Activeer de agarose chemisch door oxidatie met periodaat en reduceer vervolgens met boorhydride om een dwarsverbinding met het weefsel te vormen voor een betere stabiliteit tijdens het snijproces. Voer de onderstaande stappen uit.
2. Bereid 4% geoxideerde agarose door 2,25 g agarose af te wegen en voeg 0,21 g NaIO₄ toe. Voeg 100 ml PB toe aan de agarose en NaIO₄. Roer op kamertemperatuur in een zuurkast gedurende 2-3 uur met bescherming tegen licht.
   OPMERKING: Kritieke stap: Overschrijd het roeren niet langer dan 3 uur, anders zal de agarose slecht polymeriseren.
3. Recupereer de agarose door membraanfiltratie in een standaard vacuümfilter met een membraan van 0,2 μm. Verwijder de resterende NaIO₄ door 3x te wassen met 50 ml PB-buffer. Resuspendeer de geoxideerde agarose in 50 ml PB-buffer.
   OPMERKING: Smelt de agarose tijdens deze fase niet. De agarose kan tot 2-3 weken beschermd tegen licht bij 4 °C worden bewaard.
4. Bereid boorhydrideoplossing voor door 19 g borax en 3 g boorzuur toe te voegen aan 1 l water. Roer tot het is opgelost en pas de pH aan naar 9-9,5 met 1 M NaOH. Verwarm op een roerplaat in een zuurkast 100 ml boraatbuffer tot 40 °C. Voeg 0,2 g NaBH₄ toe en roer gedurende 15-30 minuten terwijl het beschermt tegen licht.
   OPMERKING: De boorhydrideoplossing kan enkele weken bij kamertemperatuur in het donker worden bewaard. Kritieke stap: Bij het toevoegen van NaBH₄ aan de boraatbuffer wordt gas gevormd, voer deze stap daarom uit in een zuurkast. Voer deze stap niet uit in een goed afgesloten container, omdat dit tot een explosie kan leiden.
5. Haal het zakdoekje uit de vriezer na voldoende incubatie voor verminderde autofluorescentie (≥ 3 dagen), verwijder de overtollige opslagbuffer voor cryoprotectieve middelen en was het zakdoekje 3x gedurende 10 minuten elk met PB-buffer met schudden op 40 tpm bij kamertemperatuur (RT).
6. Smelt ongeveer 20 ml geoxideerde agarosesuspensie (bereid in stap 1) in een magnetron (700 W gedurende ~30 s), laat het voldoende afkoelen om te hanteren (~45 °C) en giet het in een plastic vorm.
   OPMERKING: Kritieke stap: Voeg de agarose niet direct toe nadat deze in de magnetron op het monster is opgewarmd, dit kan leiden tot vernietiging van het weefsel.
7. Gebruik een pincet om het weefsel voorzichtig op te pakken en steek het snel in het onderste midden van de agarose. Incubeer de mal 15 minuten bij RT om de agarose te laten polymeriseren.
8. Open na agarosepolymerisatie de plastic mal met een scalpel uit de vier hoeken en pak de agarosekubus voorzichtig op met gehandschoende vingers.
9. Dompel het monster 2-3 uur onder in een boorhydrideoplossing (bereid in stap 2) bij 4 °C om de verknoping van de geoxideerde agarose en het weefsel op gang te brengen. Dit voorkomt dat het weefsel loslaat tijdens het sectieren.
   OPMERKING: Kritieke stap: Het ondergedompelde monster in boorhydride moet worden geïncubeerd beschermd tegen licht bij 4 °C.
10. Was de agarose blokje met PB buffer 2x gedurende 10 min. Draai de agaroseblokje zodat het weefsel zich aan de bovenkant bevindt en bevestig het blok met een paar druppels instantlijm op een magnetisch objectglaasje (microscoopglaasje met twee magneten aan de achterkant). Het duurt 10-20 minuten voordat de lijm is gestold, dus plaats een papieren zakdoekje met druppels PB-buffer op de agarose en zorg ervoor dat het monster voldoende gehydrateerd blijft (Figuur 1C).

3. Voorbereiding van de microtoom en het instellen van de toon

1. Plaats de magnetische schuif op het metaal in het midden van de monsterdoos van de tomograaf.
2. Vul de doos met PB-buffer en plaats deze voorzichtig op de tafel en draai de schroef aan de linkerkant vast om de monsterdoos op de tafel van de tomograaf vast te zetten.
   NOTITIE: Draai de schroeven niet te vast aan, anders beschadigt dit de plastic doos.
3. Plaats het mes op de microtoom en verschuif de positie van het monster voorzichtig in de buurt van en onder de microtoom. Het bovenoppervlak van de agarose moet zich op hetzelfde niveau bevinden als het blad van de microtoom.
   OPMERKING: Als u het te laag plaatst, verspilt u snijtijd, terwijl als u het te hoog plaatst, een groot deel van het blok bij de eerste snede wordt verwijderd.
4. Verplaats de tafel om de agarosekubus naar het midden van het doel te positioneren en klik herhaaldelijk op de Slice-knop in de tomograafsoftware totdat je een intact plakje van de hele agarosekubus krijgt.

4. Toewijzing van het oppervlak en het verkrijgen van 2D-beelden

1. Centreer de objectieflens op het weefselmonster in x- en y-richtingen.
2. Open de lasersoftware en zet de laser aan in de software. Als u een tikkend geluid hoort, zet u de laserschakelaar aan en stelt u de golflengte in op 800 nm.
   NOTITIE: De laserbron moet ten minste 30 minuten, idealiter 1 uur, worden opgewarmd voordat de beeldvorming wordt gemaakt.
3. Sluit de kastdeuren van de microscoop, schakel alle lichtbronnen in de kamer uit en zet de PMT's aan en stel de spanning in op 750 V.
   OPMERKING: Kritieke stap: PMT's zijn erg gevoelig voor licht, houd het uit tenzij de kastdeuren gesloten zijn en alle lichtbronnen in de kamer zijn uitgeschakeld.
4. Pas de protocolinstellingen van de tomograafsoftware aan zoals aangegeven en stel de microscoopsluiter in op automatisch en de spanning op 20 en 3 voor respectievelijk V1 en V2.
5. Klik op de 2D-knop in de tomograafsoftware om een foto van het monster te maken.
6. Zodra een afbeelding met zichtbare autofluorescentie verschijnt, past u de z-piëzo aan om het brandpuntsvlak op het oppervlak van de agarose-kubus in te stellen. De eerste scan bevindt zich 20 μm onder het oppervlak om een stabiel beeld van het monster te krijgen.
   1. Als er geen autofluorescentieachtergrond zichtbaar is, verhoog dan het contrast totdat er een signaal verschijnt. Het kan voorkomen dat er geen zichtbaar signaal is (d.w.z. vanwege de agarose bovenop het weefsel). Pas in dit geval de z-as aan met behulp van het z-piëzo-apparaat totdat deze het agarose-oppervlak bereikt. Handmatige beweging van de lens kan nodig zijn als de gewenste positie zich buiten het bereik van het z-piëzo-apparaat bevindt.
7. Snijd meerdere plakjes van 50 μm na het vinden van het oppervlak van het monster en maak na elke snede 2D-beelden om ervoor te zorgen dat het brandpuntsvlak goed is ingesteld op het oppervlak van het blokoppervlak.

5. De randen van de monsters vinden en de laser instellen op het startpunt

1. Op basis van de xy-coördinaten van het laserscangebied (4 hoekcoördinaten), beperkt u het beeldvormingsgebied tot het weefsel met minimale beeldvorming van het omringende agaroseblok.
2. Schakel de PMT's uit, stel de lasergolflengte in op 800 nm, zet de lasersluiter op open. De positie van het laserlicht dat het agaroseblok binnenkomt, is zichtbaar als een rode vlek van verstrooid licht (Figuur 2A,B).
   Kritieke stap: Wees bijzonder voorzichtig met de klasse 4 laser. Het kan menselijke weefsels en ogen snel beschadigen. Het personeel heeft een speciale opleiding nodig om zo'n instrument veilig te bedienen.
3. Gebruik de laserspot tijdens het verschuiven van de werktafel om de coördinaten van de weefselranden te vinden met behulp van de volgorde achter, rechts, voor en links.
4. Controleer de coördinaten nogmaals en plaats de laserspot in de rechtervoorhoek, het standaard startpunt voor het afbeelden van het weefsel.
5. Zet de coördinaten van het consolevenster om in machineherkenbare blokgroottes, die worden gedefinieerd door de xy-stappen. Voer deze stapmetingen in het protocol van de software in. Sluit de kastdeuren.

6. 3D scannen / segmenteren

1. Verander de golflengte in 940 nm om GFP, mWasabi of YPet en PE te exciteren.
   OPMERKING: De laser is op deze golflengte onzichtbaar voor het menselijk oog. Om de signaal-naar-achtergrond voor GFP, mWasabi en de groene emitterende component van TIMER^bac te verbeteren, plaatst u een smalbanddoorlaatfilter 510/20 nm voor PMT 2. Dit vermindert interferentie door autofluorescentie van groengeel weefsel.
2. Zet de sluiter van de microscoop in de automatische modus en de instellingen van de sluiterspanning op 20 voor V1 en 1.71 voor V2.
3. Pas de volgende drie parameters aan in de software: Doorsnededikte- voor de meeste doeleinden, ingesteld op 50 μm. Voor de lever ingesteld op 30 μm vanwege de beperkte beelddiepte. Het aantal fysieke secties - dit bepaalt de totale weefseldiepte die wordt afgebeeld, dienovereenkomstig ingesteld. Het aantal vlakken dat voor elke sectie moet worden vastgelegd - dit bepaalt de z-resolutie. Gebruik 5 vlakken (met een verticale resolutie van 10 μm) voor de meeste doeleinden. Gebruik voor de lever 3 of minder vliegtuigen.
4. Stel de laserversterking in. Dit moet empirisch worden getest voor verschillende weefsels en scandiepten.
5. Definieer het mappad en de naam voor het opslaan van de verkregen afbeeldingen en verstrek de juiste informatie voor het metabestand van de afbeelding.
6. Controleer alle ingevoerde waarden nogmaals.
7. Klik op de 3D-mozaïekinstelling om het scanproces te starten (Figuur 1D).
8. Nadat de beeldvorming is voltooid, verzamelt u de weefselsecties voorzichtig uit het waterreservoir en bewaart u ze in de opslagbuffer bij -20 °C tot verder gebruik (Figuur 1E; Figuur 2C,D).

7. Beeldverwerking en data-analyse

1. Download de MATLAB-scripts op een Linux-computer van https://github.com/BumannLab/Li_BumannLab_2020. Kopieer de scripts naar een map, bijvoorbeeld /home/user/Program/.
   OPMERKING: De Computer Vision Toolbox-add-on voor MATLAB en Fiji (of ImageJ) moet op Linux-computers worden geïnstalleerd om het script volledig te laten functioneren.
2. Naai tegelafbeeldingen zoals hieronder beschreven.
   1. Gegevens overbrengen van de tomograafserver naar de Linux-computer.
   2. Open het MATLAB-script StepOneStitchingAndArchive.m en zoek de bronmap met de onbewerkte gegevens. Definieer de bron- en doelmappen in het script.
   3. Ga naar het tabblad Editor en klik op Uitvoeren. Voortgangsinformatie wordt weergegeven in het opdrachtvenster. De verwerking omvat het lezen van informatie uit het Mosaic-bestand, het genereren van een tegelindex voordat de afbeelding wordt samengevoegd, correctie van de achtergrondverlichting met Cidre²² (Figuur 3) en verlichtingscorrectie tussen optische lagen die op verschillende dieptes zijn verkregen. Zoek de samengevoegde afbeeldingen in een submap met de naam stitchedImages_100 in de bronmap. Comprimeer de onbewerkte gegevens voor langdurige opslag met behulp van de tar-opdracht en sla ze op als een enkel bestand met de bestandsnaamextensie tar.bz2 (Figuur 1F).
3. Voer modeltraining en segmentatie uit met een ondersteunende vectormachine. Volg de onderstaande stappen om de ondersteuningsvectormachine te trainen en de segmentatie uit te voeren.
   OPMERKING: De samengevoegde afbeeldingen voor elk van de drie fluorescentiekanalen worden opgeslagen in 3 submappen (genaamd 1, 2 en 3, overeenkomend met rode, oranje en groene fluorescentie) van stitchedImages_100. Elke submap bevat alle samengevoegde afbeeldingen van hetzelfde kanaal.
   1. Bekijk een voorbeeld van de gestikte afbeeldingen. Open één afbeelding met dezelfde bestandsnaam uit elke submap met Fiji (of ImageJ). Voeg de drie kanalen samen tot één kleurenafbeelding. Pas de helderheid van elk kanaal aan totdat er duidelijke signalen te zien zijn van autofluorescentie van bacteriën en weefsel. Noteer het aangepaste maximale intensiteitsniveau van elk kanaal voor de volgende stap.
   2. Open het MATLAB-script StepTwoSegmentationAndAnalysis.m en blader naar de bron. Definieer de bronmap en de afbeeldingsnamen voor de training. Bijvoorbeeld
      sourceD = '/' ;
      red_name = [bronD '1/section_020_01.tif']; green_name = [bronD '2/section_020_01.tif'];
      blue_name = [bronD '3/section_020_01.tif'];
   3. Ga naar het tabblad Editor en klik op Uitvoeren.
   4. Er verschijnt een dialoogvenster waarin om kleurdrempels wordt gevraagd, vul het op basis van eerdere handmatige controle met Fiji (stap 7.3.1).
   5. Selecteer regio's voor achtergrond en interessante regio's (d.w.z. bacteriën) volgens de dialoogvensters. Er verschijnen grafieken die laten zien hoe goed het model is getraind en met de vraag of er meer regio's moeten worden toegevoegd. Voeg meer interessegebieden en achtergrondgebieden toe totdat de bacteriën duidelijk kunnen worden gesegmenteerd (Figuur 4A,B).
   6. Geef het model een naam en sla het op. Het script laadt automatisch de afbeeldingen en past een mediaanfilter toe (straal 2 pixels).
   7. Het segmentatieproces wordt automatisch uitgevoerd en voortgangsinformatie wordt weergegeven in het opdrachtvenster. Bekijk de voortgang van de segmentatie. Als de segmentatie niet goed werkt met het model op andere gestikte afbeeldingen, herhaalt u de modeltraining om meer achtergrond- en bacteriële gebieden op te nemen.
   8. Als u de resultaten van de segmentatie wilt zien, controleert u het bestand met de naam Allpositions_filter3D.txt. Dit bestand bevat de coördinaten van het zwaartepunt voor elke bacterie of bacteriële microkolonie en de bijbehorende geïntegreerde fluorescentie-intensiteit (Figuur 1G).
4. Verwijder extra artefacten met een convolutioneel neuraal netwerk zoals hieronder beschreven.
   OPMERKING: Voor sommige bacteriën bevat eenvoudige segmentatie met de Support Vector Machine nog steeds enkele beeldvormingsartefacten. Dit geldt met name voor bacteriën die YPet tot expressie brengen. Segmentatie op basis van neurale netwerken kan deze artefacten efficiënt verwijderen (Figuur 4C). De Computer Vision Toolbox-add-on voor MATLAB en Fiji (of ImageJ) moet op Windows-computers worden geïnstalleerd om het script volledig te laten functioneren. Voor informatie over het onderliggende neurale netwerk zie: https://ch.mathworks.com/help/deeplearning/ug/create-simple-deep-learning-network-for-classification.html
   1. Bereid de afbeeldingen voor. Converteer tif-bestanden naar jpg-bestanden met verschillende helderheidsaanpassingen met behulp van Fiji. Identificeer met handmatige curatie ten minste 600 bacteriën en 600 artefacten en veilige bijgesneden afbeeldingen van deze objecten in de juiste mappen.
   2. Open het MATLAB-script CNNtestV4.m en blader naar de bronbestanden met de objectafbeeldingen van stap 7.4.1.
   3. Definieer de afbeeldingsmap voor training. Bijvoorbeeld
      digitDatasetPath = fullfile ('D:\20200602_CNN','fortrainingPixel12Folder2');
      Definieer het aantal afbeeldingen voor training, bijv. numTrainFiles = 600.
   4. Ga naar het tabblad Editor en klik op Uitvoeren. Na de training wordt het CNN-modelbestand opgeslagen als gregnet1.mat in de bronmap.
   5. Definieer een map met testafbeeldingen. Bijvoorbeeld
      digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp').
      De resultaten worden opgeslagen in een bestand YourFile.txt dat informatie bevat over de naam van de afbeelding en de classificatie als bacterie of artefact.
   6. Definieer de map met testafbeeldingen. Bijvoorbeeld
      digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp').
      De resultaten worden opgeslagen in een bestand YourFile.txt, dat informatie bevat over de naam van de afbeelding en de classificatie als bacterie of artefact.
5. Schat de grootte van microkolonies op basis van de fluorescentie-intensiteit van afzonderlijke bacteriën, zoals hieronder beschreven.
   OPMERKING: De ruimtelijke resolutie van de tomograaf is onvoldoende om individuele bacteriële cellen in dicht opeengepakte microkolonies op te lossen. Het aantal bacteriën in elke microkolonie kan echter worden geschat op basis van de totale fluorescentie van de microkolonie in relatie tot de fluorescentie van afzonderlijke bacteriën. De nauwkeurigheid van deze schatting hangt af van de homogeniteit van de fluorescentie-intensiteit in de bacteriepopulatie.
   1. Bevestig de identiteit van GFP-positieve gebeurtenissen in de STP-tomografie door bacteriële componenten zoals lipopolysaccharide te kleuren met behulp van immunohistochemie van opgehaalde secties van de tomograaf (Figuur 1H; Figuur 5).
   2. Identificeer ten minste 30 afzonderlijke bacteriën en haal hun fluorescentie-intensiteit uit de overeenkomstige segmentatieresultaten. Gebruik de mediane intensiteitswaarde als referentie voor een enkele bacterie. Bereken het aantal bacteriën van elke microkolonie door de totale fluorescentie-intensiteit van de microkolonie te delen door de referentiewaarde voor een enkele bacterie (Figuur 1I).
6. Voer een 3D-reconstructie uit met visualisatiesoftware zoals hieronder beschreven.
   1. Voorbereiding van de afbeelding
      1. Neem de beelden van het blauwe kanaal, die tweede harmonische signalen van collageen bevatten die een nuttige anatomische referentie vormen, waaronder weefselcapsules, slagaders en trabeculae. Gebruik afbeeldingen die zijn gesegmenteerd voor bacteriën als het^2e kanaal.
      2. Zet de afbeeldingen van het 1e^kanaal 10-voudig op in zowel de x- als de y-as en sla de verkleinde afbeeldingen op in een nieuwe map. Maak 3 replica's van verkleinde afbeeldingen in dezelfde map. De naam van nieuwe replicaten moet dezelfde volgorde behouden. Bijvoorbeeld: section_001_01.tif, repliceer 1 met naam section_001_01-copy.tif, section_001_01-copy-copy.tif. Pas deze stappen ook toe op de afbeeldingen van het^2e kanaal. De inkrimping levert beter beheersbare bestandsgroottes op. De drievoudige afbeeldingen zullen de z-as vloeiender maken.
      3. Voeg de afbeeldingen van elk kanaal samen om afbeeldingsstapels te vormen met Fiji. Klik op Afbeelding > Stapels > Hulpmiddelen > Stapelsorteerder > Sorteren op labels.
      4. Voer 3D-filtering uit. Klik op Verwerken > filters > 3D-filter en stel de Z-filtergrootte in op 6. Sla de afbeeldingsstapels op.
   2. Voer 3D-visualisatie uit zoals hieronder beschreven.
      1. Open het visualisatiesoftwarepakket in de Arena-weergave (standaardinstelling). Gebruik het pictogram Horlogemap om mappen toe te voegen aan de Arena-weergave. Dubbelklik om het bestand *.ims of *.tif te openen (voorbereid in 7.6.1).
      2. Gebruik Edit>Image Properties om de kleurrepresentaties (LUT's) van de verschillende kanalen in het venster Display Adjustment aan te passen.
      3. Klik op Geavanceerd om handmatig de min/max-waarden en een waarde voor gammacorrectie in te stellen.
         Klik op de kanaalnamen om de namen en LUT's te wijzigen.
      4. Nadat u het uiterlijk van de afbeelding hebt aangepast, exporteert u de huidige weergave met behulp van de Snapshot-tool.
      5. Gebruik het pictogram Animatie om de 3D-gegevens weer te geven als een film. Gebruik de navigatieaanwijzer om een perspectief/weergave te vinden en in te zoomen en gebruik + Toevoegen om hoofdframes toe te voegen. Ga naar een andere positie en voeg het volgende hoofdframe toe. Druk op de rode opnameknop om de film te maken. Sla het op in de gewenste bestemmingsmap en het gewenste bestandstype (Figuur 1J).

Resultaten

De beschreven procedure maakt detectie mogelijk van individuele Salmonella-cellen in volledige muizenorganen zoals milt, lever, mesenteriale lymfeklieren en Peyer's patches¹¹ (Figuur 5 en Figuur 6). Het detecteert ook Toxoplasma gondii-parasieten in de hersenen van muizen¹². Sommige geïnfecteerde weefsels, waaronder de lever, Peyer's pleisters en milt, zenden substantiële autofluorescentie uit in het groen-gele bereik. Autofluorescentie wordt verder versterkt door de fixatie met paraformaldehyde, die nodig is om de weefselstructuur te behouden. De detectie van groene fluorescentie van GFP, mWasabi en de groene component van TIMER^bac tegen deze autofluorescentieachtergrond wordt verbeterd door een smalbanddoorlaatfilter 510/20 nm (dat de meeste GFP-emissies doorgeeft maar een groot deel van het autofluorescentiespectrum blokkeert) voor fotomultiplicator 2 (die groene emissies verzamelt) te plaatsen en door weefselautofluorescentie te verminderen door vaste weefsels gedurende 3 of meer dagen op te slaan in cryoprotectant¹¹. Bacteriën moeten echter nog steeds ten minste een paar duizend kopieën per cel van GFP of andere fluorescerende eiwitten tot expressie brengen. Aan de andere kant moeten overmatige fluorescerende eiwitniveaus worden vermeden om de fitnesskosten te minimaliseren die kunnen leiden tot verzwakte virulentie^.

Correcte segmentatie van fluorescerende bacteriën in de weefsels kan worden bevestigd door immunohistochemie van opgehaalde weefselsecties na beeldvorming. In het bijzonder kunnen objecten die zijn gekleurd met een antilichaam tegen bacteriële oppervlaktecomponenten zoals lipopolysaccharide worden uitgelijnd met het fluorescentiebeeld dat is verkregen door STP-tomografie (Figuur 5). Het is belangrijk op te merken dat sommige gekleurde Salmonella-cellen geen fluorescerende eiwitten hebben en dus detecteerbare fluorescentie in zowel confocale microscopie als STP-tomografie. Deze cellen zijn Salmonella die zijn gedood door het immuunsysteem van de gastheer, zoals aangetoond door flowcytometrische sortering en groeiculturen van enkelvoudig gesorteerde cellen, evenals de nauwe correlatie tussen het aantal kolonievormende eenheden op agarplaten en het aantal fluorescerende Salmonella-cellen zoals bepaald door flowcytometrie²⁴. Bovendien kan plasmideverlies resulteren in niet-fluorescerende levensvatbare cellen en dit moet worden getest door plating op media met en zonder geschikte antibiotica die overeenkomen met de selectiemarker op het plasmide. Voor pSC101-afgeleide plasmiden is plasmideverlies in vivo zeldzaam¹⁹. Voor de meeste chromosomaal geïntegreerde expressiecassettes zoals sifB::gfp die in¹¹ worden gebruikt, is verlies van expressie in vivo niet detecteerbaar. Als de segmentatie niet consistent is met immunohistochemische gegevens, moet de segmentatiepijplijn worden gewijzigd.

De resolutie van STP-tomografie is onvoldoende om individuele bacteriële cellen in dicht opeengepakte microkolonies op te lossen. De totale fluorescentie-intensiteit van de microkolonie maakt het echter mogelijk om het aantal Salmonella-cellen te schatten. Dit vereist een fluorescerende stam met zeer homogene fluorescentieniveaus zoals Salmonella sifB::gfp¹¹. Het combineren van het geschatte aantal Salmonella-cellen voor alle microkolonies en afzonderlijke cellen levert totale bacteriële weefselbelastingen op die consistent zijn met alternatieve methoden zoals plating of flowcytometrie van weefselhomogenaten¹¹. Plateren en flowcytometrie kunnen niet rechtstreeks vanuit dezelfde weefsels worden uitgevoerd, omdat ze perfusie-gefixeerd moeten zijn voor STP-tomografie. In plaats daarvan moeten ze worden gedaan met extra dieren die niet zijn gefixeerd. Als de mediane bacteriële belasting zoals bepaald door de verschillende benaderingen meer dan 3-voudig verschilt, kan de levensvatbaarheid van fluorescerende bacteriën in het gedrang komen (in het geval van lagere kolonievormende eenheden) of kunnen sommige bacteriën de fluorescerende reporterconstructie hebben verloren (in het geval van hogere kolonievormende eenheden). Er is een controle-experiment nodig om de bron van dergelijke discrepanties te identificeren.

STP-tomografie biedt de lokalisatie van bacteriële cellen binnen de 3D-structuur van de geïnfecteerde weefsels. De tweede harmonische signalen van collageen zorgen voor anatomische oriëntatiepunten zoals slagaders en trabeculae. Bovendien kunnen gastheercellen in vivo worden gekleurd door voorafgaand aan de perfusie een antilichaam tegen oppervlaktemarkers te injecteren (Figuur 5 en Figuur 6). Deze kleuring biedt extra oriëntatiepunten voor weefselcompartimenten en specifieke micro-omgevingen, waaronder ontstekingshaarden (intracellulaire markers en sommige compartimenten met diffusiebarrières zoals de witte miltpulp of de hersenen zijn niet gemakkelijk toegankelijk, geschikt voor deze in vivo kleuring). Deze benadering onthulde de witte miltpulp als een weefselcompartiment dat overleving van Salmonella op lange termijn mogelijk maakt tijdens antimicrobiële chemotherapie¹¹.

Ten slotte kan Salmonella die zich met matige of langzame snelheden repliceert, worden geïdentificeerd en gelokaliseerd binnen de 3D-structuur van weefsels met behulp van stammen die timer^bac uitdrukken, een enkele celreporter voor replicatiesnelheid^11,15.

Figuur 1: Procedure voor beeldvorming van het hele orgaan met behulp van seriële twee-foton (STP) tomografie. (A-B) Het orgaan wordt geoogst na transcardiale perfusie en 's nachts bewaard in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 °C. (CE) Het orgaan is ingebed in geoxideerde agarose en verknoopt, vervolgens wordt het weefsel gescand en gesneden met behulp van STP-tomografie. De plakjes worden verzameld voor latere immunohistochemie. (F-J) Computationele analysepijplijnen voor het kwantificeren van bacterieaantallen, bevestiging van fluorescerende bacteriën en 3D-reconstructie van bacterieposities. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Seriële opstelling van twee-foton (STP) tomografie. (A) Tomograaf met (B) 2-fotonbeeldvorming met (C) geautomatiseerde seriële weefselsectie. (D) Verzamelde weefselplakken voor vervolgonderzoek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 3: Tegelstiksels en verlichtingscorrectie. Tegels worden gestikt en ongelijkmatige verlichting wordt gecorrigeerd voor het gebruik van gecorrigeerde intensiteitsverdelingen met behulp van geregulariseerde energieminimalisatie (CIDRE). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Segmentatie van Salmonella die het groen fluorescerende eiwit (GFP) tot expressie brengt met behulp van een Support Vector Machine (SVM) en een Convolutional Neural Network (CNN). (A) Representatieve afbeeldingen van GFP-objecten gesegmenteerd door SVM (links) en overeenkomstige afbeeldingen (rechts) met regio's gesegmenteerd door SVM (schaalbalk: 10 μm). (B) Geclusterde rood-groen-blauwe (RGB) waardenverdeling voor de gesegmenteerde regio's. (C) Representatieve afbeeldingen van niet-GFP-objecten die door de SVM ten onrechte als bacteriën zijn geïdentificeerd (links). CNN doet ze terecht af als achtergrond (rechts, schaalbalk: 10 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Detectie van Salmonella die het groen fluorescerende eiwit (GFP) tot expressie brengt door tomografie en bevestiging door immunohistochemie. Beelden van hetzelfde gedeelte verkregen door tomografie (links) of confocale microscopie na kleuring met een antilichaam tegen Salmonella lipopolysaccharide (rechts). Neutrofielen (rood) werden gekleurd door in vivo injectie van een PE-gelabeld anti-Ly-6G-antilichaam voorafgaand aan perfusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: 3D reconstructie en lokalisatie van Salmonella in geïnfecteerde muizenmilt. (A) Driedimensionale (3D) reconstructie van een 5 mm dikke miltplak en in vivo gekleurd vóór perfusie met anti-CD169 antilichaam (rood). Het blauwe signaal vertegenwoordigt collageen gedetecteerd door tweede harmonischen. (B) Een optisch vlak van de 3D-stapel weergegeven in (A). De posities van Salmonellacellen of microkolonies worden aangegeven met sterren. (C) 3D reconstructie van Salmonella posities (sterren) in geïnfecteerde lever. De slagaders zijn zichtbaar op basis van hun collageenomhulsels (blauw). Schaalbalk: 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De lokale weefselcontext van bacteriële pathogenen is cruciaal voor het bepalen van lokale gastheeraanvallen, bacteriële aanpassingen, de lokale uitkomst van de interacties tussen gastheerpathogenen en antimicrobiële chemotherapie, en de individuele bijdragen aan de algehele uitkomst van de ziekte. Het afbeelden van bacteriën ter grootte van een micrometer in organen ter grootte van een centimeter was een uitdaging. Seriële twee-foton (STP) tomografie biedt voldoende ruimtelijke resolutie om individuele bacteriële cellen in hele organen te detecteren, geautomatiseerde secties en beeldvorming, en voldoende doorvoer (~1 orgaan per dag)¹¹. Hoewel gastheerantigenen in vivo kunnen worden gekleurd, moeten pathogene cellen geschikte fluorescerende eiwitten tot expressie brengen om uitgebreide detectie van intracellulaire pathogene cellen te garanderen. De resulterende datasets (0,5-1,5 TeraByte per orgaan) vormen een grote uitdaging voor IT-infrastructuren voor data-analyse en -opslag.

Er zijn verschillende kritieke stappen in deze methode. Ten eerste is een pathogene stam met detecteerbare en homogene expressie van fluorescerend eiwit GFP of YFP vereist. Idealiter wordt een chromosomale expressiecassette²⁵ gebruikt om de heterogeniteit van fluorescentie als gevolg van variatie in het plasmide-kopiegetal te minimaliseren. Voldoende fluorescentie-intensiteit is vereist, maar overmatige niveaus van fluorescerend eiwit moeten worden vermeden om fitnessstoornissen van de ziekteverwekker te^voorkomen23. Geschikte expressieniveaus kunnen worden verkregen door selectie van een geschikte promotor en fijnafstemming van de ribosomale bindingsplaats²⁵ of het gehele 5' niet-getransleerde gebied (UTR)²⁶. Ten tweede moet de perfusiefixatie een eerste wasbeurt met buffer omvatten om zoveel mogelijk erytrocyten uit de bloedcirculatie te verwijderen. Dit is met name van cruciaal belang voor milt en lever (hoewel volledige verwijdering van erytrocyten uit deze organen moeilijk is). Resterende erytrocyten absorberen licht in het zichtbare deel van het spectrum, waardoor de beeldkwaliteit in gevaar komt²⁷. Ten derde is de opslag van de vaste weefsels in de cryoprotectivum van cruciaal belang om de autofluorescentie van het weefsel te verminderen, die bijzonder hoog is in ontstoken weefsels en de relatief zwakke fluorescentie van de pathogene cellen kan overschaduwen^. Ten vierde is de effectieve verknoping van het weefsel met het omringende agaroseblok van cruciaal belang voor een soepele vibratoomsnede zonder dat het weefsel uit het agaroseblok springt. Ten vijfde moeten fluorescerende signalen en hun identificatie als pathogene cellen onafhankelijk worden geverifieerd met behulp van orthogonale benaderingen zoals kleuring met antilichamen tegen pathogene componenten (zoals lipopolysaccharide voor Gram-negatieve bacteriën) en confocale microscopie van de secties die uit de tomograaf¹¹ zijn gehaald. Sommige geïnfecteerde weefsels bevatten autofluorescerende deeltjes met een vergelijkbare vorm en overlappende fluorescentiespectra die gemakkelijk verkeerd kunnen worden geïnterpreteerd als pathogene cellen. Ten zesde moet de hoeveelheid pathogene cellen in microkolonies worden vergeleken met orthogonale benaderingen zoals confocale microscopie om de nauwkeurigheid te beoordelen. De totale bacteriële belasting op basis van deze berekeningen moet worden geverifieerd in vergelijking met orthogonale benaderingen zoals flowcytometrie en plating.

Belangrijke aanpassingen van het veelgebruikte STP-protocol zijn onder meer het plaatsen van een smalbanddoorlaatfilter 510/20 nm voor fotomultiplier 2¹¹, om interferentie van groen-gele autofluorescentie te verminderen die bijzonder sterk is in geïnfecteerde en ontstoken lever-, milt- en Peyer-pleisters. De sterke autofluorescentie en verhoogde lichtverstrooiing van dergelijke organen in vergelijking met de hersenen (die andere toepassingen van STP domineren) genereert ook een behoefte aan effectievere correctie voor ongelijkmatige verlichting. Als andere wijziging maakt dit protocol voor dit doel gebruik van de CITERRE-benadering²² (figuur 3) en op AI gebaseerde segmentatie van bacteriën. Ten slotte werd de voorbewerking van het weefsel gewijzigd door een incubatiestap in cryoprotectant bij -20 °C op te nemen, wat de autofluorescentie van het weefsel vermindert en zo de detectie van kleine pathogene cellen met een relatief zwakke fluorescentie vergemakkelijkt¹¹.

Probleemoplossing kan nodig zijn als er geen pathogene signalen kunnen worden gedetecteerd, of segmentatie onvoldoende gevoeligheid oplevert (er worden te veel pathogene cellen gemist) of onvoldoende precisie (te veel achtergronddeeltjes worden gesegmenteerd als pathogene cellen). Als autofluorescentie van het achtergrondweefsel detecteerbaar is, maar er te weinig pathogene signalen zijn, kunnen de pathogenen onvoldoende hoeveelheden fluorescerende eiwitten bevatten. Dit kan worden getest met behulp van confocale microscopie van weefselsecties van hetzelfde geïnfecteerde weefsel of flowcytometrie van weefselhomogenaten^19,28. Onderliggende redenen kunnen zijn: onvoldoende expressieniveaus of instabiliteit van de expressiecassette. Mitigatiestrategieën kunnen alternatieve promotoren omvatten om expressie te stimuleren, codon-aanpassing van de genen die coderen voor het fluorescerende eiwit voor de pathogene soorten, gebruik van episomale constructen met een hoger aantal kopieën, of stabilisatie van expressiecassettes door chromosomale integratie of gebalanceerde-letale complementatie²⁹. De keuze van het fluorescerende eiwit is ook belangrijk, maar detectie is mogelijk met GFP.mut2, mWasabi, YPet en TIMER^bac. Als segmentatie onnauwkeurig is, kan dit worden veroorzaakt door een te zwakke pathogene fluorescentie die kan worden aangepakt zoals hierboven beschreven, of door een te hoge autofluorescentieachtergrond in het weefsel. Uitgebreide perfusie van de wasoplossing of langdurige incubatie in de opslagbuffer onmiddellijk voor inbedding in het agaroseblok en tomografie kunnen deze problemen oplossen. Ten slotte is voldoende training van het neurale netwerk vereist voor nauwkeurige classificatie, maar overmatige training kan leiden tot overfitting die de prestaties van nieuwe monsters schaadt.

Momenteel is er geen andere methode die hele organen met voldoende ruimtelijke resolutie in 3D kan afbeelden voor het detecteren van individuele bacteriën. Toekomstige verbeteringen in weefselopruiming en light-sheet-microscopie zouden een vergelijkbare resolutie kunnen bereiken. Dit kan beeldvorming met hogere snelheid en met meer fluorescerende kanalen mogelijk maken.

Een belangrijke beperking van STP is de pixelresolutie in het vlak van ~0,5 μm en de verticale resolutie van 5 tot 10 μm, wat onvoldoende is voor het oplossen van dicht bij elkaar gelegen bacteriën, bijvoorbeeld in een dicht opeengepakte microkolonie. Het is echter mogelijk om weefselsecties na tomografie te verwijderen voor secundaire confocale microscopie met hoge resolutie van geselecteerde weefseldelen. Een andere beperking van STP is de beschikbaarheid van slechts drie fluorescentiekanalen, waardoor het aantal fluoroforen dat tegelijkertijd kan worden afgebeeld, wordt beperkt. Nogmaals, secundaire analyse van opgehaalde weefselsecties met multiplexing-methoden kan de locatie en intensiteit van veel meer markers voor geselecteerde weefseldelen onthullen. Deze informatie kan worden geïntegreerd in de algehele 3D-structuur van het omliggende weefsel zoals bepaald met STP.

Concluderend maakt dit protocol gedetailleerd onderzoek mogelijk naar interacties tussen gastheer en ziekteverwekker op lokaal en orgaanniveau. Het protocol moet gemakkelijk kunnen worden aangepast aan andere ziekteverwekkers (op voorwaarde dat ze kunnen worden verkregen als fluorescerende stammen), andere organen en verschillende gastheersoorten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chemische stoffen
Agarose Low Melt	Roth	Art. 6351.5 25g
Boorzuur	Sigma-Aldrich	6768-500G
Instantlijm Loctite 435	Henkel
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Poly(ethyleenglycol)	Sigma-Aldrich	P5413-1kg
Polyvinylpyrrolidon	Sigma-Aldrich	PVP-100G
Natriumborohydride	Sigma-Aldrich	71321-25g
Natriumhydroxide	Merck	106453
Natriummetaperiodaat	Sigma-Aldrich	311448-100G
Dinatriumfosfaat dibasisch	Sigma-Aldrich	71640-250G
Natriumfosfaat monobasisch dihydraat	Sigma-Aldrich	71500-1KG
Natriumtetraboraat	Sigma-Aldrich	221732-100g
Sucrose	AppliChem	A4734,1000
Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS)	Merck	T5912-1L
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Vacuumfiltratie 500	TPP	TPP99250
Apparatuur
Mes	Campden Instruments Limited	01-01-4692
MAITAI Laser	Spectra-Physics
Plastic mal om af te pellen	Sigma-Aldrich	E6032-1CS
TissueCyte 1000 tomograaf	TissueVision
Antilichamen/kleurstof
DAPI	Merck	D9542-5MG
Primaire antilichamen
anti-LPS Salmonella, konijn	Sifin	REF TS 1624
anti-CD169-PE, clone 3D6.112	Biolegend	142403
anti-Ly-6G-PE, clone 1A8	Biolegend	127608
Secundaire antilichamen	Invitrogen
chicken anti-rabbit Alexa 647	Invitrogen	A-21443
Software	Bedrijf	Versie
Fiji	Image J	1.54g of nieuwer
MATLAB	MathWorks	2017b/2018b of nieuwer
Orchestrator (tomograaf)	TissueVision
Visualisatiesoftware Imaris	Oxford Instruments	9.9.0 of nieuwer