Dit artikel presenteert een gids voor het bemonsteren van zes belangrijke en diverse organen in volwassen Xenopus die snel en gemakkelijk toegankelijk zijn: de hartkamer, de leverkwab, de alvleesklier, de vetlichamen, de gepaarde nieren en de huid.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Technieken voor het snel bemonsteren van zes cruciale organen in volwassen xenopus
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Xenopus is al meer dan honderd jaar een krachtig modelorganisme voor het begrijpen van de ontwikkeling en ziekten van gewervelde dieren. Hoewel experimentele analyse- en dissectietechnieken van het embryo goed gedocumenteerd zijn, zijn beschrijvingen van volwassen Xenopus-structuren en -organen, samen met technieken voor het werken met volwassenen, niet bijgewerkt om rekening te houden met de vereisten van moderne benaderingen zoals kwantitatieve proteomics en single-cell transcriptomics. De celtype- en gencentrische perspectieven vereisen contrasterende waarnemingen in embryonale stadia met die in volwassen weefsels. De organen van de larve ondergaan aanzienlijke veranderingen in hun algehele structuur, morfologie en anatomische locatie langs de overgang van larval naar volwassene, met name tijdens massale metamorfose-remodellering. Het vaststellen van robuuste normen voor orgaanidentificatie en -dissectie is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat datasets die het resultaat zijn van onderzoeken die in verschillende laboratoria zijn uitgevoerd, consistent kunnen zijn. Het huidige protocol identificeert zes van de organen in de volwassen Xenopus, en demonstreert methoden voor dissectie en bemonstering van de hartkamer, de lever, het vetlichaam, de alvleesklier, de gepaarde nier en de huid van de volwassen Xenopus. Afhankelijk van de conserveringsmethoden kunnen de ontlede organen worden gebruikt voor kwantitatieve proteomics, single cell/nuclei transcriptomics, in situ hybridisatie, immunohistochemie, histologie, enz. Dit protocol heeft tot doel weefselbemonstering te standaardiseren en multi-labonderzoek van de volwassen orgaansystemen te vergemakkelijken.
Inleiding
Hoewel de "digitale dissectie" van volwassen Xenopus" beschikbaar is1, blijft repliceerbare orgaan- en weefselbemonstering van volwassen Xenopus een uitdaging zonder de gedetailleerde instructie die beschikbaar is voor andere volwassen modellen (bijv. muizen 2,3,4). Dit artikel is bedoeld om duidelijke richtlijnen te geven voor nauwkeurige en reproduceerbare orgaanbemonstering van volwassen Xenopus, vergelijkbaar met wat momenteel beschikbaar is voor hun larven5. De nadruk wordt gelegd op het gemak van voltooiing om maximale versheid te behouden en het protocol toegankelijk te maken voor alle gebruikers.
Hoewel er een grondige dissectiegids is voor Rana sp.6, evenals tal van klassikale dissectiegidsen voor andere anura's7, is er momenteel geen Xenopus-dissectie- en bemonsteringsgids beschikbaar. Voor degenen die niet bekend zijn met bemonsteringspraktijken of de anatomie van amfibieën, maken de kleine verschillen tussen Xenopus en andere anura's deze bronnen suboptimaal voor repliceerbare weefselbemonstering.
Veel waardevolle weefsels zijn niet opgenomen en worden zelfs weggegooid in de huidige gids; Dit is om de versheid van het weefsel te garanderen. Zes monsters zijn beperkt genoeg om ervoor te zorgen dat deze weefsels kunnen worden verzameld in minder dan een uur nadat het hart begint te kloppen, ongeacht de ervaring of het vaardigheidsniveau van de gebruiker. Meer geavanceerde en gedetailleerde handleidingen voor het verzamelen van vele andere weefsels zijn in voorbereiding als afzonderlijke begeleidende papieren.
Voor minder ervaren gebruikers wordt altijd aanbevolen om dit protocol eerst uit te proberen op dieren die worden geëuthanaseerd om andere redenen dan experimenten, voordat dieren worden bemonsterd die moeilijk te vervangen zijn (d.w.z. transgenen, dieren van hoge leeftijd, enz.). Idealiter zijn alle bemonsterde dieren gezond en, als ze vrouwelijk zijn, hebben ze de afgelopen twee weken geen eisprong gehad.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de regels en voorschriften van de Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3). De representatieve resultaten worden getoond voor zowel een geperfuseerde als een niet-geperfuseerde volwassen albino man Xenopus laevis.
1. Experimentele voorbereiding
OPMERKING: Als perfusieprotocol8 wordt gevolgd vóór de bemonstering, ga dan verder met stap 2.2.
- Zorg ervoor dat de onderzoeksinstelling de in dit protocol beschreven euthanasietechniek heeft goedgekeurd.
- Bereid een oplossing van 5 g/l MS-222 (tricaïne, methaansulfonaat) en 5 g/l natriumbicarbonaat (zie materiaaltabel). Het volume moet groter zijn dan het volume dat nodig is om de dieren die worden geëuthanaseerd volledig te bedekken. Controleer de pH om er zeker van te zijn dat deze ≥7 is.
- Primaire euthanasie uitvoeren door de Xenopus in de euthanasieoplossing te plaatsen; Het dier blijft in totaal 1 uur onder water.
- Stel het dissectiestation zo in dat alle weefsels onmiddellijk na de bemonstering kunnen worden gespoeld in gekoeld PBS of 0,7x PBS9 (afhankelijk van de experimentele behoeften), gecontroleerd en bijgesneden onder een vergrotingslicht van 5x (of hoger). Dit station moet de gebruiker ook in staat stellen om alle tangen en scharen te vervangen of schoon te vegen tussen gebruik.
- Zodra de kikker 1 uur in de oplossing is geweest, is de primaire euthanasie voltooid. Verwijder de straal en controleer het verlies van pijnrespons door een voetknijp uit te voeren.
- Noteer de juiste details voor het dier, zoals soort, stam, geslacht, leeftijd en gezondheidstoestand, en of het is doorbloed. Weeg de Xenopus en voer eventuele aanvullende metingen uit, zoals de lengte van de snuit-vent.
- Leg de kikker op zijn rug en speld de ledematen proximaal van het lichaam vast (Figuur 1).
- Knip met een dissectieschaar door de huid, langs de middellijn en vervolgens lateraal, waarbij u twee flappen maakt.
- Verwijzend naar figuur 2, identificeer de linea alba en gebruik een tang om deze vast te pakken en weg te trekken van de coelomische holte. Knip voorzichtig met een schaar door de spiermassa. Maak twee flappen van de spouwmuur. Knip of speld alle flappen uit de weg.
- Identificeer het hart dat nog zal kloppen. Gebruik een ontleedschaar om de coracoïde botten te verkleinen (Figuur 2) om een betere toegang tot het hart te krijgen.
OPMERKING: Als het hart is gestopt met kloppen vóór de bemonstering, moet worden opgemerkt dat de versheid van het monster in het gedrang is gekomen.
2. Bemonstering
OPMERKING: Als het dier is doorbloed, ga dan verder met stap 2.2.
- Identificeer het dunne hartzakje en trek het strak met een weefselpincet (Figuur 3).
- Perforeer met de punt van de iridectomieschaar voorzichtig het hartzakje en zorg ervoor dat u de onderliggende weefsels niet doorsnijdt. Schil het hartzakje weg, weg van de 3 kamers van het hart.
- Gebruik een pincet om het ventrikel bij de apex vast te pakken, identificeer waar het vastzit aan de oorschelpen en de arteriële romp (Figuur 4) en snijd het onder deze aanhechtingen door (Figuur 5). Snijd indien nodig het ventrikel bij zodat er geen weefsel uit de oorschelpen of arteriële romp zichtbaar is en er nog steeds lichtgekleurd klepweefsel zichtbaar is in het ventrikel.
OPMERKING: Bij niet-geperfuseerde dieren kan het verwijderen van de ventrikel kwalificeren als secundaire euthanasie. - De 3 lobben van de lever zullen zichtbaar zijn (Figuur 6 en Figuur 7). Pak de lip van de linkerkwab vast (aan de rechterkant van de kijker) en til deze voorzichtig op zodat de lever- en cystische kanalen zichtbaar zijn (Figuur 8). Bemonstering van de onderste 1/3 van de lob onder deze hulpstukken (Figuur 9).
- Om betere toegang te krijgen tot de weefsels van een vrouwelijke kikker, is het nuttig om de eierstok te verwijderen. Identificeer de eierstok die is omhuld door een laag visceraal peritoneum dat het kiemepitheel wordt genoemd. Verschuif de lobben voorzichtig totdat ze zich op hun respectieve zijden bevinden om het bevestigingsgebied zichtbaar te maken (Figuur 10). Deze aanhechtingen zijn direct ventraal ten opzichte van de gepaarde nier.
- Verwijder met een schaar de eierstokken zo dicht mogelijk bij de nieren zonder ze te beschadigen (Figuur 11).
- Inspecteer de mediale kwab (ook wel de voorkwab genoemd) van de lever en merk op hoe deze verbinding maakt met de maag en de twaalfvingerige darm via het mesenterium en de ductus hepatopancreatica (ook wel het gemeenschappelijke galkanaal genoemd) (Figuur 6, Figuur 7 en Figuur 8).
- Snijd het mesenterium, het hepatoduodenale ligament door met een iridectomieschaar en het hepatopancreatische kanaal waar het de twaalfvingerige darm ontmoet. Verbreek de verbinding van de alvleesklier en de ductus hepatopancreatica met de mediale kwab van de lever, zodat er geen donker leverweefsel aan vastzit (figuur 12).
- Pak de maag vast met een getande tang en het bovenste uiteinde van de alvleesklier met een weefseltang. Onder een vergroting van 5x plaag je de alvleesklier voorzichtig van de maag (Figuur 13).
OPMERKING: Als het niet schoon wegkomt, is het resterende pancreasweefsel zichtbaar en kan het in fragmenten worden verwijderd. Als alternatief kan de alvleesklier methodisch worden losgemaakt met behulp van een iridectomieschaar en een weefselpincet. - Identificeer aan de hand van figuur 14A de urineblaas en verwijder deze, waarbij u zo dicht mogelijk bij de cloaca snijdt. Gooi dit zakdoekje weg.
- Identificeer aan de hand van figuur 14B de dikke darm en trek deze strak om de dikke darm zo dicht mogelijk bij de cloaca door te snijden. Verwijder en gooi het hele spijsverteringskanaal weg, snijd het buikvlies door waar het aan de milt hecht. De vetlichamen zullen nu volledig toegankelijk zijn.
- Plaag de vetlichamen uit elkaar zodat ze op hun respectievelijke zijden liggen. Het gebied boven de nier, waar het vetlichaam aansluit op het buikvlies, zal zichtbaar zijn. Pak de basis van het linker vetlichaam vast (aan de rechterkant van de kijker) en gebruik een schaar om het weg te knippen van het buikvlies, waarbij u een kleine marge overlaat zodat de nier niet wordt beschadigd (Figuur 15).
- Verwijder het resterende vetlichaam en gooi het weg. De gekoppelde nieren zijn nu volledig zichtbaar.
- Bij vrouwelijke kikkers of mannetjes met duidelijke rudimentaire eileiders, pak je een eileider vast en trek je deze weg van de nier en cloaca (Figuur 16). Snijd de eileider door waar deze de cloaca ontmoet en blijf deze wegtrekken van de nier, waarbij u eventuele duidelijke peritoneale aanhechtingen doorsnijdt zodra deze duidelijk worden. Gooi dit zakdoekje weg.
- Herhaal dit proces met de resterende eileider.
- De nieren zijn nog steeds bedekt met helder buikvlies (retroperitoneaal)10. Gebruik een tang om de nieren vast te pakken en snijd het buikvlies aan hun inferieure uiteinde door.
- Til de nieren uit de coelomische holte en gebruik een schaar om het buikvlies zo dicht mogelijk bij de nieren door te snijden zonder ze te beschadigen (Figuur 17).
- Snijd onder een vergroting van 5x overtollig buikvlies en ander achtergebleven weefsel (vetlichamen, milt) weg. Als de kikker een vrouwtje is, zorg er dan voor dat eventueel achtergebleven eierstokweefsel wordt verwijderd (Figuur 18). Als de kikker een mannetje is, verwijder dan voorzichtig de testis en controleer op een rudimentaire eileider, die mogelijk niet zichtbaar is zonder vergroting (Figuur 19).
- Verwijder de pinnen van het dier, draai het op zijn ventrum en speld de ledematen van het dier opnieuw vast.
- Selecteer een van de achterpoten om van te bemonsteren en speld de voet van die ledemaat vast.
- Verwijder een amandelvormige huidflap van over de gastrocnemius/tibiofibula (figuur 20).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Door gebruik te maken van figuur 1 tot figuur 20 en alle stappen van dit protocol te volgen, werden de hartkamer, de linker leverkwab, de alvleesklier, de linker vetlichamen, gepaarde nieren en een huidflap binnen een uur na euthanasie netjes weggesneden. Binnen deze tijd worden de monsters gespoeld en bijgesneden zodat ze verschijnen, zoals weergegeven in figuur 21.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Omdat dit protocol tot doel heeft de versheid te maximaliseren, kunnen sommige monsters ongewenste weefsels bevatten. Het hepatopancreatische kanaal en een deel van het mesenterium worden bijvoorbeeld bemonsterd met de alvleesklier, en een deel van het buikvliesweefsel, de bijnieren en de urineleiders zullen altijd worden bemonsterd met de gepaarde nieren. Als versheid geen probleem is, kan een nauwkeurigere bemonstering worden bereikt met behulp van gewijzigde technieken.
Het uiterlijk en de...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de OD-subsidie van de NIH R24OD031956. We danken Samantha Jalbert, Jill Ralston en Cora Anderson voor hun hulp en steun, evenals onze redacteur en anonieme peer reviewers voor hun nuttige feedback
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 5x Vergrootglas met LED-licht en standaard | amazon.com | B08QJ6J8P1 | licht mag geen hitte produceren |
| Disposible overdrachtpijpjes | VWR | 414004-036 | |
| Dissectietang met fijne punt | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissectie schaar scherpe punt, recht 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissectielade | Fisher Scinetific | 14-370-284 | schuimplastic platen zijn een acceptabele alternatief |
| Euthanasiecontainer | US Plastic | Item 2860 | alternatieve ondoorzichtige containers acceptabel |
| Deksel voor euthanasiecontainer | US Plastic | Item 3047 | |
| Iridectomieschaar 6" | vwr | 470018-938 | iris schaar is een acceptabel alternatief |
| MS-222: Syncaine (voorheen tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Natriumbicarbonaat, Poeder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimentang, Gekarteld | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins voor dissectie | Fisher Scinetific | S99385 |
Referenties
- Porro, L. B., Richards, C. T. Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography. J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).
- Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).
- Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).
- Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. Xenopus tadpole tissue harvest. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), 097675(2017).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Dissection of a Frog (Rana sp.). Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).
- O'Rourke, D. P. Amphibians used in research and teaching. ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).
- Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Effective rapid blood perfusion in Xenopus. JoVE. (issue), e65287(2023).
- Balls, M., Worley, R. S. Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus. Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).
- Holz, P. H., Raidal, S. R. Comparative renal anatomy of exotic species. Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).
- Trott, K. A., et al. Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis). Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).
- Fremont-Rahl, J. J., et al. Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs. Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).
- Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).
- Vitt, L. J., Caldwell, J. P. Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol. Herpetol. , 35-81 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
