We beschrijven een protocol voor het extraheren van hoogwaardige kernen uit gecryopreserveerde geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide stromale/endotheel- en bloedceltypen ter ondersteuning van single-nucleus next-generation sequencing-analyses. Het produceren van hoogwaardige, intacte kernen is noodzakelijk voor multiomics-experimenten, maar kan voor sommige laboratoria een barrière zijn voor toegang tot het veld.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Nucleaire isolatie van gecryopreserveerde in vitro afgeleide bloedcellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Op geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) gebaseerde modellen zijn uitstekende platforms om de bloedontwikkeling te begrijpen, en van iPSC afgeleide bloedcellen hebben translationeel nut als reagentia voor klinische tests en therapieën voor transfuseerbare cellen. De komst en uitbreiding van multiomics-analyse, inclusief maar niet beperkt tot single nucleus RNA-sequencing (snRNAseq) en Assay for Transposase-Accessible Chromatin sequencing (snATACseq), biedt het potentieel om een revolutie teweeg te brengen in ons begrip van celontwikkeling. Dit omvat ontwikkelingsbiologie met behulp van in vitro hematopoëtische modellen. Het kan echter technisch uitdagend zijn om intacte kernen te isoleren van gekweekte of primaire cellen. Verschillende celtypen vereisen vaak op maat gemaakte nucleaire preparaten, afhankelijk van de celstijfheid en -inhoud. Deze technische problemen kunnen de gegevenskwaliteit beperken en een barrière vormen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van multiomics-studies. Cryopreservatie van monsters is vaak noodzakelijk vanwege beperkingen bij het verzamelen en/of verwerken van cellen, en ingevroren monsters kunnen extra technische uitdagingen opleveren voor intacte nucleaire isolatie. In dit manuscript bieden we een gedetailleerde methode om hoogwaardige kernen te isoleren uit iPSC-afgeleide cellen in verschillende stadia van in vitro hematopoëtische ontwikkeling voor gebruik in single-nucleus multiomics-workflows. We hebben de ontwikkeling van de methode gericht op de isolatie van kernen van iPSC-afgeleide adhesieve stromale/endotheelcellen en niet-adhese hematopoëtische voorlopercellen, omdat deze zeer verschillende celtypen vertegenwoordigen met betrekking tot structurele en cellulaire identiteit. De beschreven stappen voor probleemoplossing beperkten nucleaire klontering en puin, waardoor het herstel van kernen in voldoende hoeveelheid en kwaliteit mogelijk was voor stroomafwaartse analyses. Vergelijkbare methoden kunnen worden aangepast om kernen van andere ingevroren celtypen te isoleren.
Inleiding
Hematopoëse is een relatief goed gekarakteriseerd ontwikkelingssysteem, maar een onvermogen om de vorming van bloedcellen in vitro te recapituleren, toont een onvolledig begrip van gerelateerde factoren. Op geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) gebaseerde hematopoësemodellen kunnen helpen bij het ophelderen van belangrijke ontwikkelingsfactoren en gerelateerde biologie. Het iPSC-systeem biedt ook een uitstekend model om bloedaandoeningen te bestuderen, en op iPSC gebaseerde bloedcellen zijn ontwikkeld om translationeel en therapeutisch relevante reagentia te produceren 1,2,3,4. Eencellige studies zijn uitgebreid gebruikt om op iPSC gebaseerde ontwikkelingsbiologie te onderzoeken, inclusief celtypen die worden geproduceerd tijdens hematopoëse5. Vergeleken met bulk-RNA-sequencing, die geen verbanden tussen celsubpopulaties kan afleiden6, maken single-cell-modaliteiten beoordelingen van celheterogeniteit mogelijk en kunnen ze de identificatie en karakterisering van celontwikkeling vergemakkelijken 6,7.
De vorming van hematopoëtische cellen uit iPSC's vereist sequentiële differentiatie door primitieve streep-, mesoderm- en endotheeltoestanden om hemogene endotheelcellen te vormen. Hemogene endotheelcellen zijn directe voorlopers van hematopoëtischestam- en voorlopercellen. Deze celtypen hebben opmerkelijk verschillende morfologische en cellulaire eigenschappen. Er is een beperkt begrip van het epigenetische landschap en de ontwikkelingsdynamiek van in vitro afgeleide hematopoëtische celmodellen, hoewel dit essentiële kennis is om het volledige therapeutische potentieel van het iPSC-systeem te ontsluiten. In veel gevallen maken alleen enkelvoudige celanalysemodaliteiten de identificatie mogelijk van celpopulaties, transcriptionele activiteiten, chromatinelandschappen en regulerende mechanismen die de ontwikkeling van heterogene celpreparaten regelen.
Twee methodologieën, single-cell RNA sequencing (scRNAseq) en single nuclei RNA sequencing (snRNAseq), kunnen transcriptionele inzichten onthullen op individueel celniveau9. Een belangrijke factor die de validiteit en betrouwbaarheid van gegevens bepaalt, is de compromisloze behoefte aan monsters die aan strenge kwaliteitscriteria voldoen. Deze omvatten nauwkeurige vereisten voor cel-/kerndichtheid, optimale levensvatbaarheid en minimale klontering. De bereiding van enkelvoudige kernen kan technisch uitdagend zijn. Er kunnen extra uitdagingen zijn verbonden aan het gebruik van eerder gecryopreserveerde cellen.
We merken vier belangrijke potentiële beperkingen op van standaard scRNAseq-benaderingen. Ten eerste verwijzen standaardprotocollen voor het genereren van celsuspensies vaak naar preparaten van verse cellen of weefsels, in plaats van die welke na cryopreservatie worden opgehaald10. Dit kan het nut van potentieel waardevolle hulpbronnen inperken. Ten tweede is de dissociatie-efficiëntie van verschillende celtypen variabel. Veel typen immuuncellen ondergaan bijvoorbeeld relatief gemakkelijk dissociatie. Daarentegen hebben stromale cellen, fibroblasten en endotheelcellen, die normaal gesproken zijn ingebed in de extracellulaire matrix en het basale membraan, unieke celeigenschappen die de isolatie van kernen kunnen bemoeilijken11,12. Deze eigenschappen kunnen agressieve dissociatieprotocollen vereisen, die de structurele integriteit van meer delicate celpopulaties in gevaar kunnen brengen. Ten derde kunnen sommige cellen (bijv. megakaryocyten) een diameter van meer dan 100 μm hebben en problemen opleveren voor verschillende bestaande commerciële eencellige platforms13. Bovendien kan onjuist gebruik leiden tot cellulaire schade en stressreacties tijdens de eerste stappen van celisolatie, waarbij enzymatische hydrolyse en mechanische dissociatie betrokken zijn, wat van invloed kan zijn op genexpressieprofielen11,14.
Om deze en andere redenen kan een benadering met één kern een beter alternatief zijn voor methoden met één cel15. Gezien de superieure stabiliteit van het kernmembraan in vergelijking met het celmembraan, kan de nucleaire envelop intact blijven, zelfs na cryopreservatie vanweefsel16. Dit kan nucleaire extractie vergemakkelijken en de diversiteit aan monstertypes vergroten die geschikt zijn voor sequencingmodaliteiten van de volgende generatie. Ten tweede vertonen kernen een verhoogde weerstand tegen mechanische verstoringen en hebben ze de neiging om minder transcriptieverschuivingen te vertonen tijdens dissociatie14. Daarom kunnen kernen zorgen voor een grotere RNA-stabiliteit en beter reproduceerbare transcriptieprofielen. Een derde opmerkelijk voordeel van methoden met één kern is het ontbreken van beperkingen op de celgrootte en de toepasbaarheid voor grotere cellen, zoals cardiomyocyten of megakaryocyten12. Ten vierde dienen kernen als geschikte substraten voor multiomics-analyses, die uitgebreide inzichten bieden uit geïntegreerde analyse van genexpressie, toegankelijke chromatineregio's en andere parameters17, waardoor een beter begrip van celheterogeniteit, ontwikkeling en functionele toestanden mogelijk wordt18.
Door iPSC's tijdens de hematopoëtische ontwikkeling te profileren, kunnen multiomics-benaderingen helpen bij het definiëren van ontwikkelingsprocessen in normale of pathologische ziektemodellen. Vergelijkingen van iPSC-afgeleide cellen met primaire cellen of weefsels kunnen ook een beoordeling opleveren van de trouw van het iPSC-model aan de in vivo biologie, waardoor iPSC-modelverbetering en de ontdekking van nieuwe celpopulaties en factoren die de bloedvorming stimuleren, worden vergemakkelijkt.
Hoewel veel groepen met succes nucleaire isolatie en de daaruit voortvloeiende sequencing-analyse van de volgende generatie hebben doorstaan, blijft het isoleren van kernen van hoge kwaliteit een barrière voor sommige laboratoria die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van analyses op basis van één kern. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het isoleren van kwaliteitskernen uit eerder gecryopreserveerde iPSC-afgeleide cellen. We hebben ons gericht op adherente stromale/endotheelcellen en niet-advente hematopoëtische voorlopercellen, omdat deze zeer verschillende celtypen vertegenwoordigen met betrekking tot structuur en inhoud die op maat gemaakte aanpassingen en probleemoplossing vereisen om het herstel van hoogwaardige kernen te verhogen die geschikt zijn voor sequencing van de volgende generatie of andere experimenten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Cryopreservatie van cellen
- Vries >1 x 106 geïsoleerde iPSC-afgeleide cellen per ml in 1 ml 90% FBS en 10% DMSO in. Doe de cryovials in een vriescontainer bij -80°C om de snelheid van invriezen te verminderen en levensvatbaar celherstel te optimaliseren (Materiaaltabel). Anticipeer op aanzienlijk celverlies, dat kan variëren op basis van kweekomstandigheden en celidentiteit.
- Verplaats binnen 24 uur van -80 °C naar opslag van vloeibare stikstof.
2. Ontdooien van cellen
- Haal cryovial uit de opslag van vloeibare stikstof en ontdooi gedurende 2 minuten in een waterbad van 37 °C. Haal uit het waterbad terwijl kleine ijskristallen nog zichtbaar zijn.
- Breng de cellen over van de cryovial naar een lege tube van 15 ml en voeg langzaam 10 ml voorverwarmd medium (RPMI 1640 + 10% FBS) toe terwijl u voorzichtig mengt. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 3 minuten bij 25 °C.
- Aspireer het supernatans en reconstitueer in 1 ml DPBS aangevuld met 2% FBS en 1 mM CaCl2 (Tabel met materialen). Meng voorzichtig door 3x te pipetteren met een micropipet van 1000 μL. Breng over naar een 5 ml polystyreen ronde bodembuis.
3. Verwijdering van dode cellen
- Voeg 50 μL cocktail van dode celverwijdering (Materiaaltabel) toe aan 1 ml celsuspensie. Voeg 50 μL Biotine selectiecocktail toe aan het celmengsel. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min. Deze stappen labelen dode cellen van Annexine V+ in de celsuspensie met biotine.
- Krachtig vortex gedurende 30 s, de dextran kralen ontworpen voor de uitputting van ongewenste celtypen gelabeld met biotine (Tabel met materialen). Voeg 100 μL dextrankorrels toe aan de celsuspensie en meng door 2x zachtjes op en neer te pipetteren met een micropipet van 1000 μl (Materiaaltabel).
- Voeg 1,3 ml DPBS met 2% FBS en 1 mM CaCl2 toe aan de celsuspensie en meng door 2x zachtjes op en neer te pipetteren met een micropipet van 1000 μl. Plaats de buis in de magneet (Tabel met materialen) en incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Keer de magneet en het buisje om om de verrijkte levende celsuspensie in een nieuwe conische buis van 15 ml te gieten. Centrifugeer op 400 x g gedurende 3 minuten bij 4°C. Verwijder het grootste deel van het supernatans en resuspendeer in 1 ml DPBS + 0,04% BSA. Meng voorzichtig door 3x te pipetteren met een micropipet van 1000 μL.
4. Isolatie van kernen
- Centrifugeer de levende celsuspensie bij 460 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en zuig vervolgens supernatant op, zodat de celpellet niet wordt onderbroken.
- Voeg 100 μL vers bereide 0,5x lysisbuffer gekoeld op ijs toe (tabel 1) en meng voorzichtig door 10x te pipetteren met een micropipet van 100 μL. Incubeer 3 minuten op ijs.
- Voeg 500 μL gekoelde wasbuffer (tabel 2) toe aan de tube zonder te mengen. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
5. Wassen en beoordelen van kernen
- Zuig bovendrijvend aan en voeg 500 μL gekoelde wasbuffer toe om de resterende intacte pellet op te lossen zonder te mengen. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder al het supernatans zonder de kernkorrel te verstoren.
- Resuspenderen in 120 μl gekoelde verdunde kernbuffer (tabel 3). Filtreer de celsuspensie met behulp van een celzeef van 40 μm (Materiaaltabel).
- Kleur met 0,4% trypan blauw en beoordeel visueel de kwaliteit van geïsoleerde kernen onder 10x microscoop (Tabel met materialen).
6. Verwerking van geïsoleerde kernen
- Houd kernen op ijs. Ga onmiddellijk verder met de verwerking, aangezien nucleaire klontering na verloop van tijd kan optreden en extra filtratiestappen noodzakelijk kan maken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We gebruikten het bovengenoemde protocol om kernen te extraheren uit gecryopreserveerde iPSC-afgeleide aanhangende stromale/endotheelcellen en niet-hechtende (zwevende) hematopoëtische voorlopercellen. Een gedetailleerde schematische weergave van de nucleaire isolatieprocedure is te vinden in figuur 1.
Voor morfologisch onderzoek werden geïsoleerde kernen gekleurd met trypanblauw en gevisualiseerd onder een microscoop. Nucleair morfologisch onderzoek is van crucia...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Cruciale stappen binnen het protocol
Het isoleren van kernen van hoge kwaliteit is essentieel voor de succesvolle implementatie van de huidige op één kern gebaseerde sequencingmodaliteiten van de volgende generatie, die snel evolueren. Als erkenning van de bestaande barrières voor laboratoria die geïnteresseerd zijn in deze benaderingen, met name voor gecryopreserveerde monsters, was het onze bedoeling om een nucleaire isolatietechniek te ontwikkelen die op maat is gemaakt voor eerder ingevroren celle...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflict bekend te maken.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Jason Hatakeyama (10x Genomics) en Diana Slater (Children's Hospital of Philadelphia Center for Applied Genomics) voor begeleiding en suggesties. Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health (HL156052 tot CST).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Celcultuur Reagentia | |||
| Dimethyl sulfaat oplossing (DMSO) | Sigma | 673439 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| Fetaal bovien serum (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| Cellen | |||
| Geïnduceerde pluripotente stamcellen | N/A | N/A | De iPSC's die in dit onderzoek werden gebruikt, werden verkregen via de CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility |
| Celkleuring Reagentia | |||
| Trypan Blauw oplossing | Corning | 25900CI | |
| Dood Cel Verwijdering Reagentia | |||
| Calciumchloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| EasySep Dood Cel Verwijdering (Annexin V) Kit | StemCell Technologies | 17899 | Dit kit is ontworpen voor de verwijdering van ongewenste celtypen die zijn gelabeld met biotine. De kit bevat Dood Cel Verwijdering (Annexin V) Cocktail, Biotin Keuze Cocktail, en Dextran kralen. Deze kit richt zich op fosfatidylserine op de buitenste laag van het celmembraan van apoptotische cellen met behulp van Annexin V. Ongewenste cellen worden gelabeld met Annexin V, Biotine gelabelde antilichamen, en magnetische deeltjes, en gescheiden zonder kolommen met behulp van een EasySep magneet. Gewenste cellen worden eenvoudig in een nieuwe buis gegoten. |
| Materiaal | |||
| 10 µl Micropipet | Wards science | 470231606 | |
| 100 µl Micropipet | Wards science | 470231598 | |
| 1000 µl Extended Universal Tip | Oxford Lab Products | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 µl Micropipet | Wards science | 470231602 | |
| 2.0 ml Cryogene vloeibare bekers | Corning | 431386 | |
| 20 µl Micropipet | Wards science | 470231608 | |
| 200 µl Micropipet | Wards science | 470231600 | |
| 5ml Polystyreen Ronde Bodembuis | Falcon | 352063 | |
| Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station | Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station | Corning | 4144 | |
| Tellingkamer | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi Cel Zeef, 40 µm | Bel-Art | H136800040 | |
| Magneet | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1°C Bevriezing Container | Nalgene | 51000001 | |
| Kern Isolatie Reagentia | Kern isolatie reagentia omvatten Lysis Buffer, Was buffer, en Verdunde Kern Buffer, en Lysis Dilutie Buffer. De samenstelling van deze buffers staan in Tabel 1, 2, en 3. Onze kern isolatie methode verbeterde de isolatie van de standaard kit protocollen (bijv. 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expressie Gebruikershandleiding [CG000338]). Dit protocol kan worden gebruikt met verschillende commerciële kits, inclusief het Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expressie Reagentia Bundel, 16 reacties (PN-1000283). | ||
| Dood Cel Verwijdering kit | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| DL-Dithiothreitol oplossing (DTT) | Sigma | 646563 | |
| Flowmi Cel Zeef, 40 µm | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS bovien serum albumine (BSA) stock Oplossing | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| Magnesium Chloride Oplossing, 1 M | Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 Vervanger | Sigma | 74385 | |
| Nuclease-Vrije Water | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| Kern Buffer (20X) | 10X Genomics | 2000153 | |
| Protector RNase inhibitor | Sigma | 3335399001 | |
| Natriumchloride (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| Natrium Chloride Oplossing, 5 M | Sigma | 59222C | |
| Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4 | Sigma | T2194 | |
| Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Ander materiaal | |||
| Automatische celteller | CytoSMART | 699910591 | |
| Microscoop | Zeiss | Primostar 3 |
Referenties
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- An, H. H., et al. The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine. Blood. 140 (15), 1723-1734 (2022).
- Zeng, J., Tang, S. Y., Toh, L. L., Wang, S. Generation of "Off-the-Shelf" Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rep. 9 (6), 1796-1812 (2017).
- Pavani, G., et al. Modeling primitive and definitive erythropoiesis with induced pluripotent stem cells. Blood Adv. , (2024).
- Chen, X., et al. Integrative epigenomic and transcriptomic analysis reveals the requirement of JUNB for hematopoietic fate induction. Nat Comm. 13 (1), 3131(2022).
- Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat med. 26 (5), 792-802 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
- Nadelmann, E. R., et al. Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling. Curr Protoc. 1 (5), e132(2021).
- Del-Aguila, J. L., et al. A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain. Alzheimer's Res Ther. 11 (1), 71(2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS one. 13 (12), e0209648(2018).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).
- Maciejowski, J., Hatch, E. M. Nuclear membrane rupture and its consequences. Ann Rev Cell Dev Biol. 36, 85-114 (2020).
- Fang, R., et al. Comprehensive analysis of single cell ATAC-seq data with SnapATAC. Nat Comm. 12 (1), 1337(2021).
- Baysoy, A., Bai, Z., Satija, R., Fan, R. The technological landscape and applications of single-cell multi-omics. Nat Rev. Mol Cell Biol. 24 (10), 695-713 (2023).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
