Een nieuwe intraperitoneale (IP) injectiemethode bij volwassen zebravissen wordt beschreven. Bij het hanteren van giftige stoffen zoals doxorubicine is deze procedure effectiever dan de twee eerder gerapporteerde IP-methoden. De techniek is zo ontworpen dat het gemakkelijk kan worden toegepast door onderzoekers met beperkte ervaring in het zebravismodel.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een intraperitoneale injectietechniek bij volwassen zebravissen die lichaamsschade en bijbehorende sterfte minimaliseert
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De volwassen zebravis (Danio rerio), die genetisch toegankelijk is, wordt gebruikt als een waardevol model voor gewervelde dieren om menselijke aandoeningen zoals cardiomyopathie te bestuderen. Intraperitoneale (IP) injectie is een belangrijke methode die verbindingen aan het lichaam afgeeft voor het testen van therapeutische effecten of het genereren van ziektemodellen zoals doxorubicine-geïnduceerde cardiomyopathie (DIC). Momenteel zijn er twee methoden voor IP-injectie. Beide methoden hebben beperkingen bij het omgaan met giftige stoffen zoals doxorubicine, die resulteren in bijwerkingen die zich manifesteren als ernstige schade aan de lichaamsvorm en vissterfte. Hoewel deze tekortkomingen kunnen worden overwonnen door uitgebreide training van onderzoekers, is een nieuwe IP-injectiemethode met minimale bijwerkingen wenselijk. Hier wordt een unieke IP-injectiemethode gerapporteerd die in staat is om giftige stoffen aan te pakken. Een consequent verminderde hartfunctie kan het gevolg zijn zonder dat er sprake is van significante vissterfte. De techniek is gemakkelijk onder de knie te krijgen door onderzoekers die minimale ervaring hebben met volwassen zebravissen.
Inleiding
Zebravis (Danio rerio) heeft de aandacht getrokken als een experimenteel model voor het bestuderen van menselijke ziekten, omdat dit dier een hoge gen- en orgaanhomologie met mensen, externe bevruchting, gemak van genetische manipulatie en lichaamstransparantie tot vroege volwassenheid omvat, wat een groot aantal beeldvormingstoepassingen mogelijk maakt. In tegenstelling tot het eenvoudige proces van het rechtstreeks afleveren van medicijnen in het water voor zebravisembryo's en larven, is het toedienen van medicijnen aan volwassen zebravissen een meer ingewikkelde en uitdagende onderneming.
Bij volwassen vissen kunnen verbindingen worden toegediend door middel van passieve medicijnafgiftetechnieken, zoals directe toediening in het water, of door orale medicijnafgiftemethoden zoals gavaging2. Andere benaderingen zijn onder meer het bedekken van visvoer met de verbindingen en vervolgens het voeren van de vissen3, en directe toediening van in water onoplosbare medicijnen in een vooraf bepaalde concentratie, inclusief retro-orbitale of intraperitoneale injecties 4,5. Intraperitoneale toediening heeft de voorkeur voor in vivo studies van ziektemodellen vanwege de duidelijke farmacokinetischevoordelen 6. Deze methode zorgt voor een hoge geneesmiddelconcentratie en een verlengde halfwaardetijd in de peritoneale holte, wat een effectieve route biedt voor medicijnafgifte 7,8. De aanpak wordt vaak gebruikt in onderzoeksomgevingen om een optimale opname en distributie van geneesmiddelen te garanderen 9. Hoewel op injectie gebaseerde methoden efficiënt blijken te zijn voor eenmalige toediening, leiden langdurige en herhaalde injecties vaak tot lichaamsbeschadiging en chronischeinfecties.
Momenteel zijn er twee methoden voor IP-injectie bij volwassen zerbafish 4,10. Beide methoden hebben echter beperkingen bij het toedienen van giftige stoffen zoals doxorubicine, wat leidt tot ernstige schade aan de lichaamsvorm en vissterfte. De bijwerkingen kunnen de interpretatie van gegevens aanzienlijk bemoeilijken. Hoewel deze uitdagingen kunnen worden aangepakt met uitgebreide training10, is er duidelijk behoefte aan een nieuwe IP-injectiemethode die bijwerkingen minimaliseert.
Hier is ons doel om een nieuwe methode van IP-injectie te ontwikkelen die is geoptimaliseerd voor de effectieve afgifte van doxorubicine aan volwassen zebravissen, waardoor het genereren van betrouwbare doxorubicine-geïnduceerde cardiomyopathie (DIC)-modellen wordt vergemakkelijkt met minimale lichaamsschade en bijbehorende mortaliteit.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle uitgevoerde procedures zijn goedgekeurd door de Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee, in overeenstemming met de normen die zijn uiteengezet in de 'Guide for the Care and Use of Laboratory Animals' (National Academies Press, 2011). Alle zebravissen in het onderzoek behoren tot de Wild Indian Karyotype (WIK) stam. De details van de reagentia en de apparatuur die voor het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de Tabel met materialen.
1. Bereiding en opslag van doxorubicine bouillonoplossing
- Verkrijg de doxorubicine-bouillon van een commerciële bron.
OPMERKING: Doxorubicine is lichtgevoelig, dus koop het in poedervorm en bewaar het in ondoorzichtige containers om het te beschermen tegen blootstelling aan licht. Voer alle stappen uit voor de Dox-poederbereiding in een chemisch omhulsel. - Los het Dox-poeder volledig op in gedestilleerd water en bereid een bouillonoplossing met een eindconcentratie van 5 mg/ml.
- Aliquot de bouillon door deze te verdelen in buisjes van 1,5 ml.
- Wikkel de buizen in aluminiumfolie om ze te beschermen tegen blootstelling aan licht.
- Bewaar de aliquot Dox-oplossing bij 4 °C voor kortstondige opslag (<1 maand), of -20 °C voor langdurige opslag10.
2. Groeperen van de vissen op basis van hun lichaamsgewicht
- Groepeer de vissen met een BW-verschil van minder dan 10% samen voor de volgende injectie.
OPMERKING: Om in deze fase moeite te besparen, worden vissen met een afwijking van minder dan 10% BW gecategoriseerd als dezelfde grootte. - Laat de vissen 24 uur voor de injectie vasten.
- Verdoof de vissen met embryowater met 0,16 mg/ml tricaïne gedurende 1 minuut.
- Haal de vis met tricaïne uit het water en dep beide kanten van het vislichaam in met schoon filtreerpapier om overtollig water te verwijderen.
- Meet en registreer het lichaamsgewicht van elke vis en breng de vis vervolgens onmiddellijk terug naar een hersteltank gevuld met vers systeemwater.
OPMERKING: Dox-injectie werd uitgevoerd bij vissen na het bereiken van de leeftijd van 3 maanden. In deze studie gebruikten onderzoekers vissen van 3 maanden tot 10 maanden oud. De BW's van volwassen zebravissen van de WIK-stam kunnen variëren van 0,2 g tot 0,5 g. Langdurige anesthesie van meer dan 5 minuten, gevolgd door een Dox-injectie, leidde tot een hoge vissterfte.
3. Voorbereiding van de naald en het station voor injectie
- Bepaal het injectievolume van Dox-bouillonoplossing (bijv. 5 mg/ml) dat nodig is voor elke vis op basis van het gemiddelde lichaamsgewicht om de beoogde dosis van 20 μg/g te bereiken.
- Gebruik de volgende formule om het injectievolume te berekenen:
- Voeg 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) toe om de in stap 1 berekende Dox-oplossing voor injectie te verdunnen tot een totaal volume van 5 μL.
OPMERKING: Gebruik een bulkoplossing voor elke groep vissen op basis van hun lichaamsgewicht en neem in elke groep 3 extra vissen op om ervoor te zorgen dat er in de loop van het experiment geen tekort is aan oplossing voor injectie. - Tik zachtjes op de buis en microcentrifugeer vervolgens kort op topsnelheid om de oplossing gedurende 10 s bij kamertemperatuur op te vangen.
- Plaats de bereide oplossing op ijs en bescherm deze tegen blootstelling aan licht.
- Plaats een schoon petrischaaltje van 100 mm met een spons onder een snijmicroscoop en pas vervolgens de scherpstelling aan.
LET OP: De spons bevat een 4 cm lange groef. De elastische terugtrekking van de spons biedt de vis ondersteuning en houdt het lichaam van de vis op zijn plaats. De spons kan worden hergebruikt. - Rust een microspuit van 10 μl uit met een afgeschuinde naald van 34 G.
- Spoel de naald met 1x HBSS-buffer om eventuele luchtbellen te verwijderen en mogelijke verstoppingen van de spuit te verwijderen.
- Meet 5 μl van de in stap 4 bereide oplossing voor de injectie af.
4. IP Dox-injectieprocedure
- Zet de volwassen vissen gedurende 1 minuut in water met 0,16 mg/ml tricaïne om een staat van bewusteloosheid op te wekken.
- Plaats de vis in de groef van de ingebedde spons met de buik naar boven gericht (Figuur 1A).
- Steek de naald in met een hoek van bijna 0°, beginnend vanaf het middelpunt van de borstvin naar de achterkant van de hartholte (Figuur 1B).
OPMERKING: Vermijd elk contact met het hart tijdens de procedure. - Richt de naald naar de staart en ga onder de zilveren huid.
OPMERKING: Plaats de naald in de buurt van de zilveren huid en zorg ervoor dat u niet krabt of doorboort. - Controleer de naaldpunt in de buikholte gedurende de gehele operatie (Figuur 1C).
OPMERKING: Vermijd beschadiging van de lever, darmen, zwemblaas en andere organen. Zorg ervoor dat de naald het einde van de darm bereikt, in de buurt van het cloacale foramen. - Doseer geleidelijk en gelijkmatig de Dox-oplossing van 5 μL en trek de naald vervolgens langzaam terug langs het oorspronkelijke pad om lekkage te voorkomen (Figuur 1D).
- Controleer de buikholte op de aanwezigheid van Dox door een rode verkleuring van de Dox-oplossing te observeren (Figuur 1E).
- Verplaats de geïnjecteerde vissen snel naar een schoon oversteekaquarium gevuld met vers systeemwater om de vissen te helpen herstellen.
OPMERKING: Spoel de naald tussen de injecties door één keer door met 1x HBSS-buffer.
5. Beheer van vissen na injectie
- Breng de vissen na de injectie terug in het systeem met circulatie.
- Vasten van alle geïnjecteerde vissen gedurende nog eens 24 uur om hun herstel te vergemakkelijken.
- Houd de vissen de eerste week goed in de gaten. Verwijder de overleden vissen zo snel mogelijk om besmetting van de andere vissen te voorkomen.
OPMERKING: Vissterfte binnen de eerste 24 uur is waarschijnlijk te wijten aan lichamelijk letsel door de injectie of langdurige anesthesie. Registreer visaantallen om een overlevingscurve te genereren. - Voer echocardiografie uit om de met Dox geïnjecteerde vis 56 dagen na injectie te fenotypen11.
OPMERKING: Zorg voor uniformiteit in omstandigheden en procedures voor de overeenkomstige controlegroep die met HBSS-oplossing wordt geïnjecteerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Eerder zijn twee intraperitoneale (IP) methoden gebruikt voor de toediening van doxorubicine bij volwassen zebravissen 4,10. Bij methode I, ook wel bekend als de klassieke IP-injectiemethode zoals beschreven door Kinkel et al.4, werd de naald ingebracht in een hoek van 45° ten opzichte van de middellijn tussen de buikvinnen met de buik naar boven. Bij methode II, of de alternatieve IP-injectiemethode zoals beschreven door Ma et
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Anders dan de twee bestaande IP-injectiemethoden 4,10, wordt de nieuwe IP-injectiemethode gekenmerkt door de volgende onderscheidende kenmerken. Ten eerste wordt een unieke naaldpenetratiehoek gebruikt (bijna nul); ten tweede dringt de naald de vis binnen via een unieke locatie, d.w.z. een natuurlijk gat in het ventrale oppervlak van een vis, wat de injectie zou vergemakkelijken; En tot slot is de beweging van de naald van vooraan naar achter. Deze aanpa...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door de NIH (HL107304 en HL081753) en de Mayo Foundation (Center for Biomedical Discovery and Cardiovascular Research Center) naar X.X. J.L. wordt gefinancierd door de Fundamental Research Funds for the Central Universities of Central South University, No. 56021702. Speciale dank aan Beninio Gore en Quentin Stevens voor het beheer van de zebravisfaciliteit.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10 μL NanoFil-spuit | World Precision Instruments, Inc | NANOFIL | injectietool |
| 34 G naald | World Precision Instruments, Inc | NI34BV-2 | injectietool |
| 60 mm Petri-schaal | fisher scientific/fisherbrand | FB0875713A | het plaatsen van de spons |
| Dissectiemicroscoop | Nikon | SMZ800 | Het injecteren van de Dox |
| Doxorubicine hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | medicijn voor het creëren van DIC-model |
| Echocardiografie | VISUAL SONICS | Vevo 3100 | meten van de hartfunctie |
| Schuimspons | Jaece Industries | L800-D | het plaatsen van de vis |
| Hank's gebalanceerde zout oplossing (HBBS) | Thermo Fisher | 14025076 | Drager voor Dox |
| Microcentrifuge | southernlabware | MyFuge/C1012 | de Dox-oplossing verzamelen |
| Precisiebalansweegschaal | Torbal | AD60 | Digitale weegschaal |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Verdoving van vissen |
| Buis | Eppendorf | 1,5 mL | opslag |
| vevo LAB software | FUJIFILM VISUAL SONICS | 5.6.0 | kwantificering van het hart |
Referenties
- Tavares, B., Lopes, S. S. The importance of Zebrafish in biomedical research. Acta Medica Portuguesa. 26 (5), 583-592 (2013).
- Dang, M., Henderson, R. E., Garraway, L. A., Zon, L. I. Long-term drug administration in the adult zebrafish using oral gavage for cancer preclinical studies. Disease Model Mech. 9 (7), 811-820 (2016).
- Sciarra, J. B., Tyler, A., Kolb, A. A gelatin-based diet for oral dosing juvenile to adult zebrafish (Danio rerio). Lab Animal Sci Prof. , https://api.semanticscholar.org/CorpusID:85611302 32-35 (2014).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), e2126(2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), e1645(2009).
- Liu, J., et al. Intraperitoneally delivered mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis through THBS1-mediated induction of IL-10-competent regulatory B cells. Front Immunol. 13, 853894(2022).
- De Smet, L., Ceelen, W., Remon, J. P., Vervaet, C. Optimization of drug delivery systems for intraperitoneal therapy to extend the residence time of the chemotherapeutic agent. The Scientific World Journal. 2013, 720858(2013).
- Dakwar, G. R., et al. Nanomedicine-based intraperitoneal therapy for the treatment of peritoneal carcinomatosis-Mission possible. Adv Drug Deliv Rev. 108, 13-24 (2017).
- Al Shoyaib, A., Archie, S. R., Karamyan, V. T. Intraperitoneal route of drug administration: should it be used in experimental animal studies. Pharmaceutical Res. 37, 1-17 (2020).
- Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish. J Vis Exp. (136), e57567(2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
- Christidi, E., Brunham, L. R. Regulated cell death pathways in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Dis. 12 (4), 339(2021).
- Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatric Res. 64 (5), 488-494 (2008).
- Podyacheva, E. Y., Kushnareva, E. A., Karpov, A. A., Toropova, Y. G. Analysis of models of doxorubicin-induced cardiomyopathy in rats and mice. A modern view from the perspective of the pathophysiologist and the clinician. Frontiers Pharmacol. 12, 670479(2021).
- Chaoul, V., et al. Assessing drug administration techniques in zebrafish models of neurological disease. Int J Mol Sci. 24 (19), 14898(2023).
- Lu, X., Lu, L., Gao, L., Wang, Y., Wang, W. Calycosin attenuates doxorubicin-induced cardiotoxicity via autophagy regulation in zebrafish models. Biomed Pharmacother. 137, 111375(2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
