Dit protocol beschrijft een extrachromosomale niet-homologe eindverbindingstest (NHEJ) en een homologe recombinatietest (HR) om de efficiëntie van NHEJ en HR in HEK-293T-cellen te kwantificeren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Analyse van niet-homologe eindverbindingen en homologe recombinatie-efficiëntie in HEK-293T-cellen met behulp van op GFP gebaseerde reportersystemen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB's) vertegenwoordigen de gevaarlijkste DNA-laesies, die in staat zijn om aanzienlijk genetisch informatieverlies en cellulaire sterfte te veroorzaken. Als reactie hierop gebruiken cellen twee primaire mechanismen voor DSB-herstel: niet-homologe eindverbinding (NHEJ) en homologe recombinatie (HR). Het kwantificeren van de efficiëntie van NHEJ en HR afzonderlijk is cruciaal voor het verkennen van de relevante mechanismen en factoren die met elk verband houden. De NHEJ-test en HR-test zijn gevestigde methoden die worden gebruikt om de efficiëntie van hun respectieve reparatieroutes te meten. Deze methoden zijn gebaseerd op zorgvuldig ontworpen plasmiden die een verstoord groen fluorescerend eiwit (GFP) -gen bevatten met herkenningsplaatsen voor endonuclease I-SceI, dat DSB's induceert. Hier beschrijven we de extrachromosomale NHEJ-test en HR-test, waarbij HEK-293T-cellen worden gecoëxfecteerd met EJ5-GFP/DR-GFP-plasmiden, een I-SceI-expressieplasmide en een mCherry-expressieplasmide. Kwantitatieve resultaten van NHEJ- en HR-efficiëntie worden verkregen door de verhouding tussen GFP-positieve cellen en mCherry-positieve cellen te berekenen, zoals geteld door flowcytometrie. In tegenstelling tot chromosomaal geïntegreerde assays, zijn deze extrachromosomale assays meer geschikt voor het uitvoeren van vergelijkend onderzoek met meerdere gevestigde stabiele cellijnen.
Inleiding
Een DNA-dubbelstrengsbreuk (DSB) is de meest schadelijke vorm van DNA-schade, die mogelijk kan leiden tot genoominstabiliteit, chromosomale herschikkingen, cellulaire veroudering en celdood als deze niet onmiddellijk wordt gerepareerd1. Twee gevestigde routes, niet-homologe eindverbinding (NHEJ) en homologe recombinatie (HR), worden erkend voor hun effectiviteit bij het aanpakken van DNA DSB's 2,3. HR wordt beschouwd als een foutloos mechanisme voor DSB-reparatie, waarbij homologe sequenties in de zusterchromatide worden gebruikt als sjabloon om de oorspronkelijke configuratie van het beschadigde DNA-molecuul3 te herstellen. NHEJ, aan de andere kant, is een foutgevoelig DSB-reparatiepad dat de kapotte DNA-uiteinden verbindt zonder te vertrouwen op een sjabloon2.
De NHEJ-test en HR-test zijn klassieke methoden die oorspronkelijk zijn ontwikkeld in het laboratorium van Jasin in het Memorial Sloan-Kettering Cancer Center en worden gebruikt om de efficiëntie van NHEJ en HR te kwantificeren, respectievelijk 4,5,6,7. Deze tests spelen een cruciale rol bij het onderzoeken van de relevante mechanismen en factoren die verband houden met NHEJ en HR 8,9,10,11,12,13,14. Beide tests zijn gebaseerd op de implementatie van twee verstoorde GFP-reporters, EJ5-GFP en DR-GFP, om de reparatie van DSB's geïnduceerd door de I-SceI-endonuclease te monitoren. De EJ5-GFP-reporter wordt gebruikt in de NHEJ-test, terwijl de DR-GFP-reporter wordt gebruikt in de HR-test. Elke reporter is subtiel ontworpen zodat de I-SceI-geïnduceerde DSB's alleen kunnen worden gerepareerd door een specifieke reparatieroute om een GFP-expressiecassette te herstellen 4,5.
De NHEJ-test en HR-test kunnen worden uitgevoerd met behulp van een chromosomaal geïntegreerde of een extrachromosomale benadering15,16. De chromosomaal geïntegreerde benadering vereist de integratie van de verstoorde GFP-reporters in het genoom, waardoor de analyse van DSB-herstel binnen een chromosomale context mogelijk is 6,15. Deze benadering vereist echter langdurige celpassaging en is ongeschikt voor vergelijkende studies met meerdere cellijnen vanwege willekeurige chromosomale integratie, waardoor naast inherente verschillen ook een extra verstorende factor wordt geïntroduceerd. In dit protocol beschrijven we de extrachromosomale NHEJ-assay en HR-assays, waarbij de voorbijgaande transfectie van de verstoorde GFP- en I-SceI-plasmiden in HEK-293T-cellen omvat, gevolgd door flowcytometrie-analyse (de experimentworkflow wordt weergegeven in figuur 1). Deze niet-geïntegreerde reporter-assays werden oorspronkelijk gerapporteerd door het laboratorium van Jasin om DNA-interstrand cross-links reparatie16 te bestuderen en zijn gebruikt om NHEJ-efficiëntie en HR-efficiëntie te beoordelen door verschillende laboratoria 9,10,11,12,13,14,17,18,19, inclusief de onze11. Deze extrachromosomale benaderingen vergemakkelijken de analyse van DSB-herstel in vergelijkende studies waarbij meerdere gevestigde stabiele cellijnen betrokken zijn.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Plasmide isolatie
- Transformeer competente E. coli met de plasmiden EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (I-SceI die plasmide tot expressie brengt) en PCI2-HA-mCherry (plasmide die mCherry tot expressie brengt) (zie Materiaaltabel) volgens het standaard transformatieprotocol20.
OPMERKING: PCI2-HA-mCherry kan worden vervangen door andere plasmiden die mCherry of DsRed tot expressie brengen. - Kweek de getransformeerde E. coli in 500 ml vloeibaar LB-medium aangevuld met 100 μg/ml ampicilline 's nachts bij 37 °C met schudden.
- Isoleer de plasmiden met behulp van een in de handel verkrijgbare endotoxinevrije plasmide maxi-isolatiekit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
- Kwantificeer de plasmideconcentraties met behulp van nanodruppel microvolume spectrofotometers. Pas de plasmideconcentratie aan naar 1 μg/μL.
2. Celvoorbereiding en transfectie
- Kweek HEK-293T cellen in DMEM medium aangevuld met 10% foetaal runderserum. Zorg ervoor dat de HEK-293T-cellen of gevestigde HEK-293T-stalcellen zich in een goede groeistatus bevinden.
OPMERKING: Ingevroren cellen moeten ten minste twee splitsingsrondes ondergaan voordat ze worden getransfecteerd. - Zaai op de dag voorafgaand aan de transfectie HEK-293T-cellen in een plaat met 6 putjes bij 2 × 105 cellen/putje om de volgende dag ongeveer 60% confluentie te bereiken.
- Bevestig op de dag van transfectie de samenvloeiing van de cellen, met als doel ongeveer 60%. Transfecteer voor de NHEJ-test de experimentele monstercellen in een plaat met 6 putjes met 1 μg EJ5-GFP, 1 μg pCBASceI en 1 μg PCI2-HA-mCherry-plasmiden, met behulp van een in de handel verkrijgbaar transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Vervang voor de HR-test het EJ5-GFP-plasmide door het DR-GFP-plasmide.
- Laat voor FACS-kalibratiecontroles een putje met cellen ongeschonden als negatieve controle. Transfecteer de cellen in een plaat met 6 putjes met ofwel (1) 1 μg EJ5-GFP (voor NHEJ-test) of 1 μg DR-GFP (voor HR-test), samen met 1 μg pCBASceI als een GFP-eenkleurige controle, of (2) 1 μg PCI2-HA-mCherry als een mCherry-eenkleurige controle.
3. Analyse van de GFP-positieve en mCherry-positieve cellen door middel van flowcytometrie
- Bevestig twee dagen na transfectie de expressie van GFP- en mCherry-eiwitten met behulp van een fluorescerende microscoop.
- Verwijder drie dagen na transfectie de media uit de putjes, was eenmaal met PBS en voeg 500 μL trypsine toe aan elk putje. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C om alle cellen van de plaat los te maken. Bescherm de cellen tijdens deze en de volgende stappen tegen direct licht.
- Voeg 500 μL volledig DMEM-media toe aan elk putje, resuspendeer de cellen en zorg ervoor dat er geen klonten zichtbaar zijn.
- Breng alle cellen van elk putje over in centrifugebuisjes van 1,5 ml en centrifugeer de cellen vervolgens 2 minuten bij 1000 × g bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatans voorzichtig door te pipetteren en was het eenmaal met 1,0 ml PBS.
- Nogmaals, verwijder het supernatans voorzichtig door te pipetteren, resuspendeer de cellen in 500 μL PBS en breng de cellen over naar FACS-buizen (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Voor optimale resultaten begint u onmiddellijk na de celoogst met flowcytometrieanalyse. Als alternatief kunnen cellen enkele uren op ijs worden bewaard. - Kalibreer de FACS met niet-getransfecteerde cellen (negatieve controle), EJ5-GFP/DR-GFP en pCBASceI-getransfecteerde cellen (GFP-eenkleurige controle) en mCherry-getransfecteerde cellen (mCherry eenkleurige controle). Pas de spanning en compensatie aan om fluorescentie-spillover tussen GFP en mCherry te minimaliseren.
- Verwerf en registreer ten minste 10.000 intacte cellen van elke buis.
4. Analyse van de gegevens
OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd met behulp van FlowJo-software (zie Materiaaltabel) om de FACS-gegevens te analyseren. Vergelijkbare procedures kunnen worden uitgevoerd in alternatieve analysesoftware.
- Sleep alle FACS-bestanden naar het dashboard. Dubbelklik op een van de bestanden om de FSC/SSC-plot weer te geven.
- Maak een polygoonpoort om intacte cellen te selecteren, met uitzondering van puin in de linkerbenedenhoek. Noem deze subpopulatie "Intacte cellen" en sleep deze poort naar de balk "Alle voorbeelden". Blader door elk monster met behulp van de knop Volgende monster om ervoor te zorgen dat elk monster op de juiste manier wordt afgeschermd (Figuur 2A).
- Dubbelklik op de subpopulatie Intacte cellen van het negatieve controlemonster (niet-getransfecteerde cellen) om een nieuwe grafiek te openen. Verander de assen in FL1-H (x-as, GFP) en FL2-H (y-as, mCherry).
- Selecteer het gereedschap Quad Gating en klik op het uiterste rechtsboven van de negatieve celpopulatie (Figuur 2B). Sleep de vier rechthoekige poorten naar de balk "Intacte cellen". Blader door voorbeelden van GFP-eenkleurige controle of mCherry eenkleurige controle met behulp van de knop Volgende monster om ervoor te zorgen dat GFP-positieve of mCherry-positieve van negatieve controlecellen worden onderscheiden (Figuur 2C,D). Verfijn de kwadrant-gating indien nodig en pas deze gating toe op alle "Intact Cells"-populaties.
- Klik op de lay-outeditor. Klik met de rechtermuisknop op de representatieve plots en kies Kopiëren naar lay-outeditor. Selecteer alle representatieve plots en dubbelklik vervolgens om Graph Definition te openen. Pas het aslabel, de annotatie en de legenda naar wens aan.
- Het percentage mCherry-positieve cellen in experimentele monsters dient als controle van de transfectie-efficiëntie. Bereken de relatieve efficiëntie van DNA-herstel door het aantal GFP-positieve cellen te vergelijken met het aantal mCherry-positieve cellen in hetzelfde perceel.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de nauwkeurigheid van de NHEJ- en HR-analyse te garanderen, is de implementatie van een geschikte strategie voor het aanpassen van vergoedingen en het afschermen noodzakelijk. Doorgaans manifesteert mCherry-fluorescentie zich niet in de GFP-detector bij gebruik van een filter van 530 nm. In gevallen van cellen die een extreem hoge GFP-expressie vertonen, kan de GFP-fluorescentie de mCherry-detector echter besmetten bij gebruik van een filter van 575 nm. Om deze zorgen weg te nemen, werden negatieve controle, GFP-eenkl...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven methode is in verschillende artikelen gebruikt om de NHEJ-efficiëntie en HR-efficiëntie te beoordelen 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Deze methode is relevant voor het op...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er zijn geen belangenconflicten om bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gefinancierd door de Natural Science Foundation van de provincie Heilongjiang in China (YQ2022C036) en de Graduate Innovation Foundation van de Qiqihar Medical University (QYYCX2022-06). Figuur 1 geproduceerd met behulp van MedPeer.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 6 cm dishes | BBI | F611202-9001 | |
| 6 well plates | Corning | 3516 | |
| Ampicillin | Beyotime | ST007 | Werkconcentratie: 100 μg/mL |
| DH5α Competent Cells | TIANGEN | CB101 | |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| DR-GFP | Addgene | 26475 | |
| EJ5-GFP | Addgene | 44026 | |
| EndoFree Maxi Plasmid kit | TIANGEN | DP117 | alternatieve endotoxine-vrije plasmide-extractiekit kan worden gebruikt |
| FACS tubes | FALCON | 352054 | |
| Fetal bovine serum | CLARK | FB25015 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | |
| FlowJo V.10.1 | Treestar | alternatieve analysesoftware kan worden gebruikt | |
| HEK-293T cellen | National Infrastructure of Cell Line Resource | 1101HUM-PUMC000091 | |
| Lipo3000 | Invitrogen | L3000015 | alternatieve transfectiereagentia kunnen worden gebruikt |
| PBS | Biosharp | BL601A | |
| pCBASceI | Addgene | 26477 | I-SceI expresserend plasmide |
| PCI2-HA-mCherry | alternatieve plasmiden met DsRed kunnen worden gebruikt | ||
| Trypsine | Gibco | 25200-056 |
Referenties
- Huang, R., Zhou, P. K. DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).
- Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).
- Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).
- Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
- Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. Alternative-NHEJ Is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair. PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).
- Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).
- Zuo, N., et al. Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays. Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).
- Schrank, B. R., et al. Nuclear ARP2/3 drives DNA break clustering for homology-directed repair. Nature. 559 (7712), 61-66 (2018).
- Lu, H., Saha, J., Beckmann, P. J., Hendrickson, E. A., Davis, A. J. DNA-PKcs promotes chromatin decondensation to facilitate initiation of the DNA damage response. Nucleic Acids Res. 47 (18), 9467-9479 (2019).
- Xu, R., et al. hCINAP regulates the DNA-damage response and mediates the resistance of acute myelocytic leukemia cells to therapy. Nat Commun. 10 (1), 3812(2019).
- Wang, T., et al. WASH interacts with Ku to regulate DNA double-stranded break repair. iScience. 25 (1), 103676(2022).
- Guo, G., et al. Reciprocal regulation of RIG-I and XRCC4 connects DNA repair with RIG-I immune signaling. Nat Commun. 12 (1), 2187(2021).
- Watkins, J., et al. Genomic complexity profiling reveals that HORMAD1 overexpression contributes to homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancers. Cancer Discov. 5 (5), 488-505 (2015).
- Chen, Y., et al. USP44 regulates irradiation-induced DNA double-strand break repair and suppresses tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma. Nat Commun. 13 (1), 501(2022).
- Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. Analysis of DNA double-strand break (DSB) repair in mammalian cells. JoVE. (43), e2002(2010).
- Nakanishi, K., Cavallo, F., Brunet, E., Jasin, M. DNA recombination: Methods and Protocols. Tsubouchi, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 283-291 (2011).
- Cavallo, F., et al. Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition. PLoS One. 7 (12), e51563(2012).
- Unfried, J. P., et al. Long noncoding RNA NIHCOLE promotes ligation efficiency of DNA double-strand breaks in hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 81 (19), 4910-4925 (2021).
- Cavallo, F., Caggiano, C., Jasin, M., Barchi, M. Testicular Germ Cell Tumors: Methods and Protocols. Bagrodia, A., Amatruda, J. F. , Springer US. New York, NY. 113-123 (2021).
- Green, M. R., Sambrook, J. The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).
- Stark, J. M., Pierce, A. J., Oh, J., Pastink, A., Jasin, M. Genetic steps of mammalian homologous repair with distinct mutagenic consequences. Mol Cell Biol. 24 (21), 9305-9316 (2004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
