In-vitro trombolyse-assays hebben vaak moeite om in-vivo-omstandigheden na te bootsen, of het nu gaat om de modeltrombus die wordt verteerd of in de omgeving waarin trombolyse plaatsvindt. Hierin onderzoeken we hoe de koppeling van de Chandler-lus en Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) wordt gebruikt voor high-fidelity, ex-vivo, stolsellysisbewaking.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fibrinolyse volgen van Chandler Loop-gevormde volbloedstolsels onder afschuifstroom in een in-vitro trombolysemodel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Trombo-embolie en gerelateerde complicaties zijn wereldwijd een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit en er zijn verschillende tests ontwikkeld om de efficiëntie van trombolytische geneesmiddelen zowel in vitro als in vivo te testen. Er is een toenemende vraag naar meer fysiologisch relevante in-vitro stolselmodellen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen vanwege de complexiteit en kosten die gepaard gaan met diermodellen, naast hun vaak gebrek aan vertaalbaarheid naar de menselijke fysiologie. Stroming, druk en afschuifsnelheid zijn belangrijke kenmerken van de bloedsomloop, waarbij stolsels die onder stroom worden gevormd andere morfologie- en spijsverteringskenmerken vertonen dan statisch gevormde stolsels. Deze factoren zijn vaak niet vertegenwoordigd in conventionele in-vitro stollingsverteringstests, wat farmacologische implicaties kan hebben die van invloed zijn op de slagingspercentages van geneesmiddeltranslationen.
De Real-T ime Fluorometrische Flowing F-ibrinolyse(RT-FluFF)-test is ontwikkeld als een high-fidelity trombolysetestplatform dat gebruik maakt van fluorescerend gelabelde stolsels die worden gevormd onder afschuifstroom, die vervolgens worden verteerd met behulp van circulerend plasma in de aan- of afwezigheid van fibrinolytische farmaceutische middelen. Door de stroomsnelheden van zowel de stolselvorming als de vergistingsstappen van stolsels aan te passen, kan het systeem arteriële, pulmonale en veneuze omstandigheden imiteren in zeer uiteenlopende experimentele opstellingen. Metingen kunnen continu worden uitgevoerd met behulp van een in-line fluorometer of door discrete tijdstippen te nemen, evenals een conventionele meting van de massa van stolsels op het eindpunt. De RT-FluFF-test is een flexibel systeem dat het mogelijk maakt om de vertering van stolsels in realtime te volgen onder stromingsomstandigheden die de in-vivo fysiologische omstandigheden nauwkeuriger weergeven, terwijl de controle en reproduceerbaarheid van een in-vitro-testsysteem behouden blijven.
Inleiding
Ziekten die fundamenteel voortkomen uit trombo-embolische etiologieën vormen een belangrijke bron van morbiditeit en mortaliteit in de huidige samenleving. Manifestaties van trombo-embolische pathogenese omvatten, maar zijn niet beperkt tot, myocardinfarcten, ischemische beroertes, diepe veneuze trombose en longembolieën1. Er is enorm veel lopend onderzoek, verspreid over meerdere disciplines, dat draait om de ontwikkeling van veilige en effectieve methoden om met pathogene trombose om te gaan. Variaties in arteriële en veneuze manifestaties van trombose en variërende anatomische locaties hebben geleid tot de ontwikkeling van verschillende behandelingsbenaderingen. Acute behandeling is echter over het algemeen gebaseerd op het gebruik van farmacologische trombolyse via plasminogeenactivatoren met de mogelijkheid van mechanische trombectomie onder bepaalde klinische omstandigheden2.
De ontwikkeling van nieuwe farmacologische behandelingsstrategieën is fundamenteel gebaseerd op zowel in-vivo diermodellen als in-vitro vergistingsmodellen voor preklinische tests 3,4. In-vivo-modellen profiteren van nature van hun vermogen om de complexe interactie van verschillende fysiologische parameters op de werkzaamheid van de behandeling vast te leggen, waaronder de klaring van farmaceutische middelen en cellulaire interacties met geneesmiddelen. Deze zelfde complexiteit maakt dergelijke modellen echter vaak behoorlijk kostbaar en introduceert extra problemen bij het isoleren van de onderliggende farmacodynamiek/kinetiek bij dieren die aanzienlijk verschillen van de menselijke fysiologie. De ontwikkeling van in-vitromodellen heeft geholpen door een gedistilleerde testomgeving te vergemakkelijken waarin geneesmiddelenontwikkeling en screening kunnen worden uitgevoerd, maar vaak niet de getrouwheid hebben die nodig is om de bestudeerde ziektetoestand te recapituleren.
Vaak gevonden in-vitroprotocollen voor het testen van nieuwe trombolytica zijn gebaseerd op het gebruik van stolsels die onder statische omstandigheden worden gevormd en gelyseerd, waarbij de resterende stolselmassa als het primaire eindpunt dient 5,6. Helaas houden dergelijke technieken geen rekening met de mechanische aspecten van stolsellysis, zoals turbulente stroming en transtrombusdrukdalingen, die de farmacodynamiek van testgeneesmiddelen aanzienlijk kunnen veranderen. Bovendien bevatten stolsels die onder statische omstandigheden worden gevormd microarchitectuur die verschilt van fysiologische stolsels. Het is reproduceerbaar aangetoond dat de aanwezigheid van afschuiving tijdens de vorming van stolsels van invloed is op de resulterende stolselkenmerken zoals activering van bloedplaatjes en fibrine-crosslinking. Stolsels die onder afschuifstroom worden geproduceerd, vertonen een complexe heterogeniteit van punt tot staart die afwezig is in statisch gevormde stolsels 7,8. Dergelijke afwijkingen van de fysiologische stolselarchitectuur kunnen van invloed zijn op belangrijke karakterisering van de ontwikkeling van geneesmiddelen, waaronder de penetratie van geneesmiddelen in een trombus en de daaropvolgende lysisefficiëntie9.
Om enkele van deze beperkingen in verband met het gebruik van statische stollings-/stolsellysemodellen aan te pakken, heeft de toepassing van de Chandler-lus voor zowel stolselvorming als stolsellysis in aanwezigheid van afschuiving een heropleving gekend10. Hoewel dergelijke systemen een betere weergave van de stromingsdynamiek mogelijk maken en stolsels genereren met een meer fysiologisch relevante architectuur in vergelijking met relatief statische tests, vertegenwoordigen hun vereenvoudigde stroomomstandigheden nog steeds een afwijking van de fysiologische omstandigheden. Ten slotte zijn er ook microfluïdische benaderingen toegepast vanwege hun gemakkelijke beeldvorming en uniforme stroompatronen; Ze blijven echter een significante verwijdering van de fysiologische aandoeningen die worden verwacht in de grotere bloedvaten die voornamelijk worden aangetast bij de meeste klinisch relevante trombo-embolische aandoeningen11,12.
Met de bovenstaande discussie in het achterhoofd hebben we een high-fidelity, in-vitro trombolysemodel ontwikkeld voor preklinische screening van trombolytische geneesmiddelen. Het model is gericht op het aanpakken van enkele van de huidige valkuilen die hierboven zijn beschreven op het gebied van screening op nieuwe trombolytische therapie en werd gevalideerd voor reproduceerbaarheid en gevoeligheid bij verschillende concentraties van weefselplasminogeenactivator (tPA). Het hierin beschreven systeem biedt fysiologische afschuifstromen met behulp van een peristaltische pomp, een drukdemper, een verwarmd reservoir, twee druksensoren, een in-line fluorometer en een fluorescerend gelabeld Chandler-lus shear-formed stolselanaloog om real-time tracking van fibrinolyse13 te vergemakkelijken. Alles bij elkaar wordt het totale systeem de Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14 genoemd en dit manuscript bespreekt de fijne kneepjes van het succesvol opzetten en uitvoeren van assays in dit high-fidelity in-vitro trombolysemodel.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle hieronder genoemde methoden zijn in overeenstemming met de protocollen van de Institutional Review Board (IRB) en de institutionele ethische commissie voor menselijk onderzoek. Alle gezonde vrijwilligers gaven schriftelijke en geïnformeerde toestemming voorafgaand aan bloeddonatie. Merk op dat alle materialen waarnaar in het protocol wordt verwezen, te vinden zijn in de materiaaltabel. Hoewel menselijke WB en plasma in dit protocol worden besproken, kan het gebruik van dierlijk bloed voor onderzoek en factorarme bloedproducten worden gekocht en vervangen.
1. Volbloed afname
- Verzamel veneus volbloed (WB) van instemmende gezonde vrijwilligers met behulp van standaard aderlatingstechnieken.
LET OP: Zorg ervoor dat universele voorzorgsmaatregelen worden gevolgd om het risico op contact met bloed of ander mogelijk besmettelijk materiaal in dit protocol te verminderen. Het gebruik van handschoenen, een laboratoriumjas en een gelaatsscherm is noodzakelijk. - Verzamel ~50 ml WB rechtstreeks in 3,2% natriumcitraatbuisjes en doe het onmiddellijk in 50 ml-buisjes voor later gebruik.
OPMERKING: Het is noodzakelijk om de buis vóór de bloedafname in de citraatbuis weg te gooien en ervoor te zorgen dat de buisjes zijn gevuld tot het door de fabrikant aanbevolen volume. Vers verzamelde WB zal het beste de stollingsdynamiek van de gastheer samenvatten. Kortstondige opslag van WB bij kamertemperatuur (≤4 uur voor gebruik) is toegestaan. WB wordt niet 's nachts bewaard, omdat is aangetoond dat dit de stollingsdynamiek beïnvloedt bij onderzoek via trombo-elastografie15.
2. Vorming van stolsels
- Voeg aan 3 ml gecitreerd volbloed fluorescerend (fluoresceïneisothiocyanaat [FITC]) gelabeld fibrinogeen (FITC-Fg) toe tot een eindconcentratie van 60 μg/ml (verhouding van 1:50 fluorescerend gelabeld fibrinogeen tot niet-gemodificeerd fibrinogeen, uitgaande van een endogene plasmafibrinogeenconcentratie van 3 mg/ml).
OPMERKING: Deze verhouding kan worden verhoogd tot 1:10 met minimale impact op de morfologie van stolsels. 13,14 Fluorescerend gelabeld fibrinogeen kan worden gekocht of gegenereerd door fibrinogeen te laten reageren met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC). Het mengen van fibrinogeen moet ≤5 minuten voor aanvang van de run worden gedaan.- Als fibrinogeen eerder is gealiquoteerd en ingevroren, inspecteer dan de ontdooide FITC-Fg om er zeker van te zijn dat de polymerisatie niet voortijdig is begonnen, waardoor deze onbruikbaar wordt (zorg ervoor dat er geen deeltjes of vezels in de oplossing zitten).
- Bereid de opstelling van de Chandler-lus voor met een trommel met een diameter van 120 mm in een waterbad van 37 °C (Figuur 1). Zorg ervoor dat het Chandler-lusapparaat in staat is om te draaien met een vaste rotatiesnelheid van 0-90 tpm tijdens het gehele stolselvormingsproces.
OPMERKING: Aanvullende Chandler-lusinstellingen en -aanpassingen zijn te vinden in Zeng et al.16. okt. - Snijd de slang (binnendiameter 5/32", buitendiameter 7/32") en vorm lussen die stevig maar niet strak om de trommel passen. Voor de aanbevolen slangmaat die hier wordt besproken, snijdt u een standaard PCR-slang van 200 μL voor gebruik als fitting om de uiteinden van de slang te verbinden om de gesloten lus te vormen.
OPMERKING: Verschillende slangmaten kunnen worden gebruikt om stolsels van verschillende grootte te produceren16. - Start de bloedstolling door 200 mM calciumchloride-oplossing toe te voegen in een verhouding van 1:17 calciumoplossing tot volbloed. Laad het bloed in de slang (vul ~50% van het volume van de buis) met behulp van een spuit van 3 ml. Plaats de lus onmiddellijk op de Chandler-lustrommel die de uiteinden verbindt en begin met draaien.
- Zorg voor een juiste menging met zachte inversie voordat u gaat laden om problemen te voorkomen die voortvloeien uit de bezinking van WB-componenten.
- Zorg ervoor dat elke run een gelijke hoeveelheid bloed aan elke buis wordt toegevoegd, omdat dit de grootte van het stolsel kan beïnvloeden als het niet consistent wordt gehouden.
- Aangezien luchtbellen in de bloedkolom ook van invloed kunnen zijn op de bloedstolling, verwijdert u ze door de buis voorzichtig op een "wip"-achtige manier te bewegen om het ontsnappen van luchtbellen te vergemakkelijken voordat u ze in de trommel laadt.
- Draai de trommel gedeeltelijk ondergedompeld in het waterbad met een rotatiesnelheid van 40 RPM om een berekende afschuifsnelheid van ~450 s-1 te bereiken.
OPMERKING: Raadpleeg Zeng et al. voor informatie over berekende scharen op basis van slanggrootte en rotatiesnelheid (20 tot 60 RPM)16. Typische veneuze en arteriële afschuifsnelheden zijn respectievelijk 20-200 s-1 en 300-1.000 s-1, waarbij ~400-500 s-1 representatief is voor de longslagader. - Laat stolsels zich 40-60 minuten vormen bij weinig licht om fotobleken van het fluorescerend gelabelde fibrinogeen te minimaliseren.
- Nadat de gewenste stollingstijd is bereikt, verwijdert u de stolsels uit de slang en gebruikt u ze onmiddellijk. Om ervoor te zorgen dat de stolsels voorzichtig worden verwijderd zonder de structuur in gevaar te brengen, keert u de slang voorzichtig om zodat het stolsel langzaam uit de buis in een kleine container kan glijden.
OPMERKING: Het 's nachts bewaren van gevormde stolsels in gecittraat plasma of PBS bij 4 °C kan van invloed zijn op de daaropvolgende analyse van de stolselvertering in de stroomlus.
3. Opstelling van het RT-FluFF-instrument
- Zorg ervoor dat het stroomlusapparaat is aangesloten zoals te zien is in afbeelding 2 en dat alle verbindingen goed vastzitten. In het kort omvat het stroomlusapparaat, in de volgorde van de stroomrichting: pomp > demper > inlaatdruksensor > stollings- > uitlaatdruksensor > fluorometer > verwarmd reservoir > pomp. Pas de selectie van de pompcapaciteit, het experimentele debiet, de diameter en de lengte van de slang, de temperatuur, het reservoirvolume en de stolselgrootte/geometrie aan om te voldoen aan de experimentele behoeften die uniek zijn voor elk onderzoek.
OPMERKING: Voor dit voorbeeld werden slangen met dezelfde diameter gebruikt in de Chandler-lus voor RT-FluFF. De slang kan voor meerdere runs op dezelfde dag worden gebruikt, maar moet worden gecontroleerd op degradatie of lekken en indien nodig worden vervangen/gespoeld. Spoelen wordt aanbevolen met warm gedestilleerd water tussen de runs door. Afhankelijk van het experimentele ontwerp kan het nodig zijn om de slang na elke run te vervangen. - Zodra alle slangen zijn vastgezet, zet u de drukmonitor aan. Controleer of de drukmonitor 0 mmHg aangeeft voor zowel de inlaat- als de uitlaatsensoren. Als dit niet het geval is, opent u de kleppen om ervoor te zorgen dat de druksensoren open zijn voor atmosferische druk en zetten u de sensoren op nul.
- Zet het verwarmingsblok of het waterbad dat wordt gebruikt aan en houd de temperatuur in de loop van het experiment in de gaten. Houd de temperatuur dicht bij 37 °C om de fysiologische temperatuur van het menselijk lichaam na te bootsen.
- Zet de pomp aan tot het gewenste debiet om te controleren op lekken en controleer of de druksensoren werken.
OPMERKING: Een debiet van ~160 ml/min in deze slangmaat vertegenwoordigt een afschuifsnelheid van ~500 s-1. - Schakel de pomp uit om het laden van stolsels te vergemakkelijken.
4. Het stolsel in de stroomlus laden
- Als een eerder gemaakt stolsel dat is opgeslagen wordt gebruikt, zorg er dan voor dat u het stolsel op kamertemperatuur brengt voordat u het in het stroomlussysteem laadt.
- Massaverlies van stolsels is een belangrijke eindpuntmeting voor trombolysetests. Het is het beste om de massa van het stolsel te meten vlak voordat het in de stroomlus wordt geladen in plaats van te vertrouwen op eerdere metingen.
- Metingen van de massa van stolsels moeten altijd op dezelfde manier worden uitgevoerd om consistentie tussen monsters en over testdagen te garanderen, aangezien de vloeistofinhoud in en op de stolsels hun massa aanzienlijk kan beïnvloeden. De beste praktijk is om stolsels op laboratoriumdoekjes voorzichtig te deppen totdat er geen significante hoeveelheid vloeistof meer op het doekje afgeeft, en zorg ervoor dat u het stolsel niet samendrukt tijdens het meetproces.
- Dompel het stolsel onder in het plasma (autoloog of type-matched) of een andere mobiele fase-oplossing die in de stroomlus wordt gebruikt (zoals PBS of gedefinieerde media) in een ondiepe container zoals een weegschaal. De mobiele fase-oplossing moet rechtstreeks uit het systeemreservoir van 50 ml worden genomen om het totale systeemvolume te controleren. Er mag geen trombolytisch of farmaceutisch testmiddel aanwezig zijn tijdens de fase van het laden van stolsels. Het totale volume van de mobiele fase voor het uitvoeren van de stroomlus wordt aanbevolen om ≥50 ml te zijn en moet consistent zijn voor alle monsters.
- Verwijder het centrale deel van de stroomlusslang (tussen inlaat- en uitlaatsensoren) en bevestig een spuit van 10 ml aan het ene uiteinde van de slang.
- Gebruik het vrije uiteinde van de slang, plaats deze in het plasma (of mobiele fase) en neem een klein volume van de oplossing op om de slang te vullen. Plaats vervolgens de inlaat van de slang in de buurt van het stolsel en onderzoek het stolsel zorgvuldig om de kop (meestal het iets dikkere uiteinde van het stolsel) en de staart (uiteinde tegenover de kop) te identificeren. De kop van het stolsel moet in de richting van de inlaatdruksensor worden geplaatst en weg van de uitlaat. Plaats de slang aan het "staart"-uiteinde van het stolsel en zuig deze met de spuit in de slang.
OPMERKING: in gevallen waarin de richting van de stolselkop/staart niet visueel kan worden bepaald, kan de richting het beste worden toegewezen op basis van het kennen van de draairichting van de Chandler-lus - de stollingskop wijst in de tegenovergestelde richting van de rotatie van de trommel. - Bevestig de slang terug aan het hoofdapparaat, zodat het stolsel zich het dichtst bij de uitlaatdruksensor bevindt (de kop van het stolsel moet van de uitlaatsensor af wijzen). Zet het stolsel op zijn plaats vast door de slang en de stolselkop te doorboren met twee naalden van 30 G in een "X"-patroon. Laat deze naalden zitten voor de duur van de run.
NOTITIE: Afhankelijk van de instellingen van de demper en de pomp kunnen extra naalden nodig zijn om ervoor te zorgen dat het stolsel niet voortijdig fragmenteert. Indien nodig kan een zeef worden toegevoegd aan de slang stroomafwaarts van het stolsel om te voorkomen dat stolselfragmenten in het systeem circuleren. Zodra een bepaald aantal naalden is vastgesteld om het stolsel vast te houden, houdt u dit consistent onder alle omstandigheden. - Neem de rest van de mobiele fase-oplossing en doe deze in een buis van 50 ml als reservoir.
- Plaats het reservoir in het waterbad en plaats het in de inlaat- en uitlaatslang (de uitlaat is van de fluorometer en de inlaat gaat in de pompkop).
- Controleer of de gebruikte fluorometer is aangesloten en bewaakt. Controleer aan het begin van het experiment of de beginwaarde geschikt is in vergelijking met de basislijn van een mobiel fasesysteem.
OPMERKING: Als er geen in-line fluorometer beschikbaar is, kan seriële periodieke bemonstering van het reservoir worden uitgevoerd met gedefinieerde tussenpozen gedurende de analyseperiode van de stroomlus. Verzamelde fracties kunnen onmiddellijk na voltooiing van het experiment worden afgelezen met behulp van een plaat met 96 putjes op een in de handel verkrijgbare spectrofotometer. - Voeg 500 μL 100.000 ng/ml tPA rechtstreeks toe aan het reservoirvolume om een uiteindelijke tPA-concentratie van 1.000 ng/ml in 50 ml te bereiken. Het volume, de concentratie en het specifieke medicijn dat wordt toegevoegd, zijn afhankelijk van de gewenste doelcirculatieconcentratie en het volume van het systeemreservoir.
- Controleer het volgende voordat u de pomp start:
- Alle knooppunten zijn beveiligd.
- De twee kleppen boven de druksensoren bevinden zich in de daarvoor bestemde gesloten positie.
- Eventueel achtergebleven plasma (of vloeistof) is in het reservoir vervangen.
- Het trombolyticum is aan het reservoir toegevoegd en goed gemengd.
- De inlaatslang bevindt zich in de buurt van de bodem van het reservoir (dit zorgt voor minimale luchtbellen).
- De uitlaatslang is veilig en op de juiste hoogte voor de gewenste druk (afhankelijk van de locatie van het vat die wordt gemodelleerd).
- De draairichting van de pomp is correct (Stroomvolgorde: Pomp > Demper > Stolsel > Fluorometer > Reservoir > Pomp).
- Als het toerental van de pomp erg hoog is ingesteld (>150 tpm), begin dan met een lagere snelheid en voer het op om ervoor te zorgen dat de snelle drukverandering het stolsel niet fragmenteert of lekkage van de slang veroorzaakt.
- Zorg ervoor dat het systeem de gegevens van de fluorometer op de juiste manier registreert en/of dat de benodigdheden zijn voorbereid voor periodieke bemonstering van de mobiele fase voor het aflezen van het tijdstip na het experiment.
- Zet de pomp aan en stel deze in om het gewenste volumedebiet van 160 ml/min te bereiken of verhoog het debiet totdat de gewenste druk is bereikt. Het systeem vult zich met vloeistof en bubbels. De bubbels zullen de fluorometrische waarden kunstmatig verhogen, dus kijk of de bubbels zijn verdwenen. Zodra ze dat doen, doet u de lichten uit en begint u met het verzamelen van gegevens.
- Laat de pomp draaien totdat het stolsel aanzienlijk is afgebroken of de gewenste experimentele tijd is verstreken (≥60 min). Voeg indien nodig reagentia toe aan het systeem tijdens het experiment via het reservoir om unieke experimentele omstandigheden te creëren voor het testen van een verscheidenheid aan trombolytische variaties.
OPMERKING: De experimentele tijd is afhankelijk van het pompdebiet (afschuifniveau) en de concentratie van het trombolyticum. - Zodra de test is voltooid, verlaagt u het volumetrisch debiet en verwijdert u de inlaatslang terwijl de pomp nog draait om het grootste deel van de vloeistof in het systeem in het reservoir te duwen (er zal een mobiele fase in de slang achterblijven). Koppel het stollingshoudende slanggedeelte aan de uitlaatdruksensorzijde van de slang los en laat deze in een weegboot zakken.
- Verwijder de naalden die het stolsel op zijn plaats houden om de resterende vloeistof uit het systeem te verzamelen en fragmenten te stollen/stolsels. Gebruik indien nodig een spuit om het systeem te reinigen.
- Weeg en verwerk het resterende stolsel voor aanvullende analyse, zoals de berekening van het percentage verloren massa of voor histologie.
5. Reiniging van het systeem
- Spoel tussen de monsters door het hele systeem met warm water op een hoog toerental (>150 tpm). Laad het water in het reservoir en laat het minstens 2 minuten door het systeem lopen, leeg het en laat het opnieuw draaien voor twee volledige systeemspoelingen. Als de fluorometerwaarde na deze spoelingen niet terugkeert naar de basislijn, herhaal dan het spoelproces voor een extra cyclus. Als het nog steeds niet is teruggekeerd naar de basislijn, vervang dan de slang volledig voordat u het volgende monster analyseert.
OPMERKING: Tijdens de experimenten kunnen slangen worden hergebruikt tussen monsters; Vanwege de perforatie met naalden die worden gebruikt om het stolsel op zijn plaats te houden, moet het slanggedeelte tussen de inlaat- en uitlaatdruksensoren echter na elke run worden vervangen. Onder sommige experimentele omstandigheden kan het nodig zijn om de hele slangenset na elke run of clustering-assays te vervangen om kruisbesmetting van het monster te elimineren. - Nadat alle monsters zijn uitgevoerd voor het experiment van die dag, verwijdert u alle slangen en gooit u deze weg. Schrob de T-splitsingen met heet water en een borstel tot ze schoon zijn en laat ze drogen en spoel de spuitdempers af met heet water. Gebruik 70% EtOH om te helpen bij de steriliteit.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Vorming van stolsels in de Chandler-lus
Bij het vormen van stolsels streefden we over het algemeen naar viervoudige stolsels om ervoor te zorgen dat als er stolseluitschieters (op basis van grove morfologie en massa) bestonden, we nog steeds de mogelijkheid hadden om drievoudige trombolyse-assays uit te voeren. Uitgaande van optimale beladingsomstandigheden, zouden de stolsels allemaal vrij uniform moeten zijn in lengte (~3,3 cm), gewicht (~100 mg) en uiterlijk zoals weergegeven in
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Vorming en etikettering van stolsels
Het is aangetoond dat de Chandler-lus een gemakkelijke en effectieve manier is om reproduceerbaar stolsels te genereren die in-vivo trombi16 nabootsen. Fijnafstemmingsparameters zoals slanggrootte, rotatiesnelheden, trommeldiameter en stollingstijd zorgen voor een snelle generatie van stolsels onder verschillende afschuifomstandigheden die architecturale kenmerken kunnen vastleggen die worden gewaardeerd in een reeks trombi die zowe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Dankbetuigingen
Onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd ondersteund door het National Heart, Lung, And Blood Institute van de National Institutes of Health onder Award Number R01HL167877. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 30 G Disposable Hypodermic Needles | Exel International | 26439 | Other Consumables |
| 6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long | uxcell | B07SXGSQ82 | Chandler loop, |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes | Air-Tite | MLB3 | RT-FluFF Apparatus, dampeners |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Calcium Chloride | Millipore Sigma | C5670 | Other Consumables |
| Disposable BP Transducers | AD Instruments | MLT0670 | RT-FluFF Apparatus |
| Drager Siemans HemoMed Pod | Drager | 5588822 | RT-FluFF Apparatus |
| Drager Siemans Patient Monitor | Drager | SC 7000 | RT-FluFF Apparatus |
| Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm) | Chandler loop, | ||
| Face Shield | Moxe | SHIELDS10 | Chandler loop, |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Scientific | F13191 | Other Consumables |
| Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile | Masterflex | 30600-04 | RT-FluFF Apparatus |
| Fluorescein (FITC) | Thermo Scientific | 119245000 | Other Consumables |
| General-Purpose Water Bath | Thermo Scientific | 2839 | Chandler loop, |
| Hotplate 4 × 4 | Fisher Scientific | 1152016H | RT-FluFF Apparatus |
| Human Source Plasma Fresh-Frozen | Zen-Bio | SER-SPL | Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant |
| Human Whole Blood | Zen-Bio | SER-WB-SDS | Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant |
| L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | 77200-62 | RT-FluFF Apparatus, Pump Head |
| L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC | Masterflex | 7528-10 | RT-FluFF Apparatus, Pump |
| Motor Speed Controller | CoCocina | ZK-MG | Chandler loop, |
| Nalgene Tubing T-Type Connectors | Thermo Scientific | 6151-0312 | RT-FluFF Apparatus |
| Peristaltic pump tubing | Masterflex | 06424-15 | Other Consumables |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Switching Power Supply | SoulBay | UC03U | Chandler loop, |
| Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL | Thermo Scientific | S751010 | Other Consumables |
| Tissue plasminogen activator, human | Millipore Sigma | T0831 | Other Consumables |
| Tubing ID 1/4'', OD 3/8'' | Fisher Scientific | AGL00017 | Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors |
| Tubing ID 5/32", OD 7/32" | Tygon | ND-100-65, ADF 00009 | Other Consumables |
| V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight | uvBeast | uvB-V3-365-MINI | Chandler loop, used to check completed clots |
| ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm | Pangyoo | ZGA37RG | Chandler loop, |
Referenties
- Ali, M. R., et al. Aspect of thrombolytic therapy: a review. Scientific World Journal. 2014, 586510(2014).
- Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke. Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
- Kaiser, E. E., West, F. D. Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology. Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).
- Elnager, A., et al. In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy. Adv Hematol. 2014, 814684(2014).
- Prasad, S., et al. Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs. Thromb J. 4, 14(2006).
- Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution. Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).
- Mutch, N. J., et al. Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis. J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).
- Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis. Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).
- Mutch, N. J., et al. The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro. Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).
- Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows. Biomicrofluidics. 12 (4), 042201(2018).
- Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. Microfluidics in haemostasis: A review. Molecules. 25 (4), 833(2020).
- Zeng, Z., et al. Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis. J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).
- Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model. Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511(2023).
- Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets. Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).
- Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture. J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24(2023).
- Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop. J Biomech Eng. 136 (7), (2014).
- Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps. J Biomed Opt. 17 (9), (2012).
- Wu, J. H., Diamond, S. L. A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis. Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
