Methodenartikel

Analyse van DNA-eiwitinteracties met op streptavidine gebaseerde biolaaginterferometrie

DOI:

10.3791/66534

⸱

17 januari 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University Indianapolis, 2Sartorius Corporation, 3Department of Medicine, Indiana University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een protocol voor het bestuderen van DNA-eiwitinteracties met behulp van een op streptavidine gebaseerd biolaaginterferometrie (BLI) systeem. Het schetst de essentiële stappen en overwegingen voor het gebruik van basis- of geavanceerde bindingskinetiek om de evenwichtsbindingsaffiniteit (KD) van de interactie te bepalen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit-DNA-interacties liggen ten grondslag aan essentiële cellulaire processen. Het begrijpen van deze interacties is van cruciaal belang voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen van verschillende routes. Belangrijke factoren zoals de structuur, sequentie en lengte van een DNA-molecuul kunnen de eiwitbinding aanzienlijk beïnvloeden. Biolaaginterferometrie (BLI) is een labelvrije techniek die de bindingskinetiek tussen moleculen meet en een eenvoudige en nauwkeurige benadering biedt om eiwit-DNA-interacties kwantitatief te bestuderen. Een groot voordeel van BLI ten opzichte van traditionele, op gel gebaseerde methoden is het vermogen om real-time gegevens te verstrekken over bindingskinetiek, waardoor een nauwkeurige meting van de evenwichtsdissociatieconstante (KD) voor dynamische eiwit-DNA-interacties mogelijk is. Dit artikel presenteert een basisprotocol voor het bepalen van de KD-waarde van de interactie tussen een DNA-replicatie-eiwit, replicatie-eiwit A (RPA) en een enkelstrengs DNA-substraat (ssDNA). RPA bindt ssDNA met hoge affiniteit, maar moet ook gemakkelijk kunnen worden verplaatst om latere eiwitinteracties binnen biologische routes te vergemakkelijken. In de beschreven BLI-test wordt gebiotinyleerd ssDNA geïmmobiliseerd op een met streptavidine gecoate biosensor. Vervolgens wordt de bindingskinetiek (associatie en dissociatie) van RPA aan het biosensorgebonden DNA gemeten. De resulterende gegevens worden geanalyseerd om met behulp van systeemsoftware nauwkeurige waarden af te leiden voor de associatiesnelheidsconstante (ka), dissociatiesnelheidsconstante (kd) en evenwichtsbindingsconstante (KD).

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellulaire eiwitten spelen een cruciale rol bij het orkestreren van de complexe biologische processen die plaatsvinden in levende organismen. De optimale werking van deze routes is afhankelijk van de wisselwerking tussen eiwitten en andere biomoleculen in de cel, inclusief interacties met partnereiwitten en nucleïnezuren1. Het begrijpen van de fijne kneepjes van cellulaire processen vereist dus een diepgaand begrip van de dynamiek van eiwit-nucleïnezuurinteracties.

Traditioneel worden eiwit-nucleïnezuurinteracties bestudeerd met behulp van elektroforetische mobiliteit gel shift assays (EMSA's)2. In deze test worden eiwitten gedurende een korte periode geïncubeerd met synthetische oligonucleotiden (DNA/RNA, met specifieke lengtes of sequenties) en wordt de reactie vervolgens geëlektroforeerd op een natuurlijke polyacrylamide (PAGE) gel 3,4,5. Om visualisatie van de eiwit-oligonucleotide-interactie mogelijk te maken, worden de oligonucleotiden meestal radioactief gelabeld met 32P of gelabeld met fluorescerende moleculen. Als het eiwit interageert en zich bindt aan het oligonucleotide, vertraagt de binding van het eiwit de mobiliteit van het nucleïnezuur in de gel 6,7. Deze methode wordt dus ook wel de gelverschuiving of gelretardatietest genoemd. Hoewel deze methode op grote schaal is gebruikt, zijn er enkele beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het gebruik van deze methode omKD-waarden te verkrijgen, waaronder een lage resolutie van zwakke of dynamische binding, de vereiste voor een aanzienlijk hoge concentratie eiwitten en meer inspanning. Bovendien zijn EMSA's geen real-time assays en kunnen ze daarom de bindingskinetiek 7,8 niet nauwkeurig meten.

Innovatieve technieken zoals oppervlakteplasmonresonantie (SPR) en biolaaginterferometrie (BLI) zijn ontstaan om deze beperkingen te overwinnen 9,10,11,12. Beide methoden meten associatie-/dissociatiesnelheidsconstanten en affiniteitsconstanten tussen moleculen op een labelvrije manier. Omdat het eiwit niet hoeft te worden gelabeld, elimineren deze technieken het risico van het veranderen van de eigenschappen van het eiwit of het blokkeren van de bindingsplaats. In SPR interageert gepolariseerd licht met een sensor (een metaalgeleidende film, meestal goud), waardoor een elektronenladingsdichtheidsgolf wordt gegenereerd die plasmon wordt genoemd. Deze interactie vermindert de intensiteit van de gereflecteerde straal en een detector meet de verandering in de specifieke hoek, bekend als de resonantiehoek13. Om ligand (nucleïnezuur) - analyt (eiwit) interacties te bestuderen, wordt de ligand geïmmobiliseerd in één stroomcel op de sensorchip en wordt de analyt geïnjecteerd in de stroomcel die de geïmmobiliseerde ligand bevat. Bij het binden van de analyt aan de ligand is er een waarneembare verandering in de brekingsindex nabij het sensoroppervlak, waardoor moleculaire interacties kunnen worden gemeten 14,15,16.

Bio-Layer Interferometry (BLI) meet het patroon van lichtinterferentie wanneer licht door een optische vezel gaat met een biolaag, bestaande uit een ligand (aas) en zijn bindende partner (analyt), aan de onderkant van de punt van de biosensor. Licht wordt door de punt doorgelaten en aan beide uiteinden van de biolaag gereflecteerd vanwege de eigenschappen van de biolaag. De dikte van de biolaag is evenredig met het aantal gebonden moleculen dat het patroon van het gereflecteerde licht beïnvloedt. Door de verandering van de curve van relatieve intensiteit te vergelijken met. Golflengte veroorzaakt door interferentie tussen het gereflecteerde licht van het referentie-grensvlak en van het biolaag/buffer-grensvlak, kan de dikteverandering van de biolaag worden bepaald. Wanneer meer moleculen binden, vindt er een grotere verschuiving plaats, waardoor BLI een krachtig hulpmiddel is voor het bestuderen van biomoleculaire interacties in realtime. De verandering in het interferentiepatroon wordt gemeten en op een sensorgram weergegeven als een spectrale verschuiving17,18 (Figuur 1A). De aard van de bindingsinteractie kan nauwkeurig worden bepaald door gebruik te maken van de juiste controles, zoals een opstelling zonder de ligand-variërende concentraties van de bindingspartner 19,20,21. In vergelijking met SPR is BLI kosteneffectief en gebruiksvriendelijk, waardoor het toegankelijk is voor een breed scala aan onderzoekers. Bovendien blijven monsters die in BLI worden gebruikt intact als er geen degradatie of aggregatie is. Hierdoor kunnen ze eventueel worden teruggewonnen en hergebruikt, waardoor afval tot een minimum wordt beperkt. Het BLI-instrument werkt zonder het gebruik van microfluïdica, waardoor de nadelen van het fluidics-systeem worden geëlimineerd, zoals de noodzaak van onderhoud/verzorging, verstopping of het gebruik van ontgaste buffers. Het minimaliseert ook het risico op besmetting van het instrument als gevolg van ongefilterde of ruwe eiwitmonsters.

In een BLI-experiment wordt de biolaag tot stand gebracht door het aasmolecuul op de biosensor te immobiliseren. De biolaag van biosensoren kan interageren met verschillende tags, waardoor het mogelijk wordt om de interacties tussen moleculen (waaronder nucleïnezuren, eiwitten, antilichamen, virussen, kleine moleculen, enz.) te bestuderen.22. Verschillende vangststrategieën, waaronder biotine/streptavidine, 6X-His-tag/Ni-NTA, FLAG/anti-FLAG, GST/anti-GST en antilichaam/anti-Fc, kunnen worden gebruikt om deze immobilisatie vast te stellen. Het behoud van de structuur en activiteit van de geïmmobiliseerde ligand is cruciaal bij de keuze van de biosensor. De veranderingen in het interferentiepatroon worden beïnvloed door de hoeveelheid gebonden molecuul en de matrix23. Eiwit-nucleïnezuurinteracties worden bestudeerd met behulp van gebiotinyleerde oligonucleotide-sondes die kunnen worden geïmmobiliseerd op met streptavidine gecoate biosensoren. Eiwitmonsters waarvan wordt verwacht dat ze interageren met het geïmmobiliseerde aas (oligonucleotide) komen gedurende een bepaalde periode in contact met het oligonucleotide in een bindende buffer om associatie te meten en worden vervolgens overgeschakeld naar een blanco bindingsbuffer om dissociatie te meten. Een schematische weergave van de analytbinding en de bijbehorende veranderingen in de bindingscurve wordt weergegeven in figuur 1B. Bovendien kunnen eiwit-nucleïne-interacties ook worden bestudeerd door een omgekeerde immobilisatieroute, waarbij het eiwit (aas) wordt opgevangen op de biosensor en interageert met het nucleïnezuur (analyt).

Momenteel zijn er meerdere instrumenten in de handel verkrijgbaar die werken volgens het principe van biolaaginterferometrie. Een eenvoudig en kosteneffectief instrument staat bekend als het Octet N1-systeem, dat beschikt over één kanaal voor gegevensdoorvoer. Het vereist handmatige bediening, verbruikt een minimaal monstervolume (4 μL) en voert monsteranalyse uit bij omgevingstemperaturen 9,23. Dit eenkanaalsinstrument kan bindingsefficiënties van eiwitten groter dan 10 kDa detecteren en meet affiniteiten in het bereik van micromolair (μM) tot nanomolair (nM)11,12. Sommige instrumenten met 2, 8, 16 en 96 kanalen voor geautomatiseerd lezen van gegevens zijn ook beschikbaar en compatibel met zowel 96 als 384 well-formaten 19,20. Sommige van deze instrumenten kunnen ook werken tussen 4 °C en 40 °C, biomoleculen detecteren met een molecuulgewicht van slechts 150 Da en affiniteiten meten binnen het millimolaire tot picomolaire bereik19,21. Hoewel het beschreven systeem kosteneffectief is, bieden de duurdere instrumenten met meerdere kanalen automatische verwerking met hoge doorvoer. Deze geavanceerde systemen worden vaak gebruikt bij het karakteriseren en ontwikkelen van biologische geneesmiddelmoleculen 9,23.

Het huidige protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het meten van de bindingsparameters van replicatie-eiwit A (RPA) aan enkelstrengs DNA (ss-DNA) met behulp van het enkelkanaals, handmatige biolaaginterferometriesysteem. RPA is een heterotrimeer, ssDNA-bindend eiwitcomplex dat een cruciale rol speelt in bijna alle aspecten van het DNA-metabolisme, inclusief DNA-replicatie, -herstel en -recombinatie24. Vanwege zijn hoge affiniteit voor ssDNA (gemeten in het sub-nanomolaire bereik), kan het snel binden aan ssDNA dat is gegenereerd tijdens verschillende DNA-transacties, het beschermen tegen nucleolytische degradatie en geïmproviseerde binding van andere stroomafwaartse eiwitten voorkomen. RPA speelt ook een cruciale rol bij het voorkomen van de vorming van niet-canonieke secundaire en tertiaire structuren, zoals G-quadruplexen25. Menselijke RPA bestaat uit drie subeenheden: RPA70 (70 kDa), RPA32 (32 kDa) en RPA14 (14 kDa), ook wel RPA 1, RPA 2 en RPA 3 genoemd, respectievelijk 24,26,27. Deze subeenheden bevatten zes oligonucleotide/oligosacharide bindende vouwen (OB-vouwen) met het label A tot F. Hiervan bevinden de DNA-bindende domeinen (DBD's) zich op de subeenheden RPA1 (DBD-A, DBD-B, DBD-C) en RPA2 (DBD-D)28. Eerst werd gedacht dat, afhankelijk van de lengte van het DNA, RPA verschillende bindingsmodi vertoont waarbij verschillende DBD's werden ingeschakeld voor specifieke DNA-lengtes29. Gegevens uit recente structurele en enkelvoudige molecuulstudies hebben bijgedragen aan het verfijnen van deze modellen om te suggereren dat de binding van verschillende DBD's van RPA dynamischer is dan aanvankelijk werd gesuggereerd 30,31,32,33,34,35,36. Deze eigenschap van de dynamische bindingseigenschap is essentieel voor de functie van RPA, omdat RPA tijdens bepaalde DNA-transacties stevig aan het DNA-substraat moet kunnen binden; Het moet echter ook in staat zijn om tijdens het biologische proces van het substraat te verdringen om het substraat over te dragen aan het volgende eiwit. Met behulp van verschillende biochemische technieken is de KD voor RPA bepaald op ongeveer 0,4 nM voor een ss-(polydT)30-substraat en 80 nM en 200 nM voor respectievelijk ss-(polydA)257 en dG-(polydG)602-substraten, zoals gemeten door fluorescentiepolarisatie-anisotropie (FPA)37,38. RPA vertoont ook een ongeveer 50-voudig hogere voorkeur voor binding aan pyrimidinerijke sequenties in vergelijking met purines. Hoewel verschillende biochemische technieken verschillende KD-metingen voor RPA hebben bepaald, lagen alle metingen in het nanomolaire bereik, wat wijst op de hoge bindingsaffiniteit van RPA voor ssDNA. Door gebruik te maken van totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie (TIRFM), werd ontdekt dat op basis van de lengte van het DNA, RPA geassocieerd was met ten minste twee bindingsmodi: een die werd gedefinieerd bij snel dissociërend (Kd, 680 pM) en een langzaam dissociërend (Kd, 60 pM) complex33,39. Gezien de cruciale betrokkenheid bij bijna alle DNA-metabole routes, is er een grote belangstelling voor het creëren van remmers die de interactie tussen RPA en enkelstrengs DNA (ssDNA) kunnen belemmeren. Deze chemische remmers zijn van vitaal belang bij het verstoren van de reactie op DNA-schade, waardoor kankercellen vatbaarder worden voor DNA-beschadigende middelen die worden gebruikt in klinische therapieën. Door gebruik te maken van de BLI-test kan de werkzaamheid van de remmer nauwkeurig kwantitatief worden geëvalueerd bij het moduleren van de bindingsfunctie van RPA40,41.

BLI-instellingen maken verschillende instellingen mogelijk: basis- en geavanceerde kinetiek. In de basiskinetiekmodus bestaat de test uit drie primaire fasen: basislijnvaststelling, associatie en dissociatie. Voordat deze test wordt uitgevoerd, moeten de biosensoren echter afzonderlijk worden gecoat, met behulp van het instrument of handmatig op de laboratoriumtafel. Omgekeerd gaat de geavanceerde kinetiekmodus verder dan de drie fundamentele stappen, waardoor extra stappen kunnen worden opgenomen. Deze aanvullende stappen kunnen verschillende doelen dienen, zoals het conditioneren van de biosensor voor de bufferveranderingen of het vergemakkelijken van de detectie van daaropvolgende eiwitinteracties. Geavanceerde kinetiek maakt het ook mogelijk om de biosensor van de analyt te strippen door middel van een goede regeneratiemethode voor mogelijk hergebruik, op voorwaarde dat het aas en de biosensor intact blijven. Over het algemeen wordt geavanceerde kinetiek gebruikt in plaats van basiskinetiek wanneer er meerdere stappen bij de test betrokken zijn, of wanneer de test in een complexer formaat moet worden uitgevoerd.

Dit protocol schetst beide methoden met hetzelfde aas [3'Bio-ss-poly (dT)32] en analyt (RPA). Een met streptavidine beklede biosensor zal worden gebruikt om het aas te immobiliseren ener zullen KD-metingen voor de analyt worden verkregen. Dit protocol beschrijft een complete aanpak voor het uitvoeren van een BLI-test met behulp van een eenkanaals instrument biolaaginterferometrie, met inbegrip van de voorbereiding van biosensor-aas, bufferoverwegingen en een stapsgewijs overzicht van de procedure.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Details van de reagentia en de apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van aas, analyt, buffers en reiniging van de druppelhouder

  1. Het instrument instellen: Zet het instrument ten minste 1 uur voor het starten van het experiment aan. Hierdoor kan de lamp opwarmen.
  2. Voorbereiding van strip- en reinigingsbuffers
    1. Stripbuffer: Bereid 50 ml 0,15 M fosforzuur [pH 2,0]).
    2. Reinigingsbuffer: Bereid 10 ml 0,5 N HCl voor.
  3. Voorbereiding van de BLI-buffer
    1. Bereid 50 ml 1x BLI-buffer voor (50 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.1 mg/ml BSA, 1 mM DTT, 0.05% Tween 20). Bewaar deze buffer bij 4 °C. Voordat u deze test instelt, brengt u de buffer op kamertemperatuur.
      OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen om nieuwe buffers voor te bereiden voor de test, aangezien verouderde buffers pH-veranderingen of vorming van aggregaten kunnen ondergaan en microbiële verontreinigingen kunnen hebben, waardoor de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van de resultaten in gevaar kunnen komen. Het wordt niet aanbevolen om buffers te gebruiken die langer dan twee weken zijn bewaard.
  4. Bereiding van aas/substraat
    1. Bereid 12,5 nM 3'Bio-ss-poly (dT)32 substraat voor (5' TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT 3'Bio) met behulp van BLI buffer.
  5. Bereiding van eiwitconcentratievoorraden
    1. Bereid vier concentraties RPA voor (5 nM, 10 nM, 20 nM, 40 nM) met behulp van de BLI-buffer. De hoogste concentratie van het eiwit (40 nM) wordt verkregen door het bouilloneiwit te verdunnen in BLI-buffer. De daaropvolgende verdunningen worden bereid door seriële verdunning van de 40 nM werkoplossing. Zorg ervoor dat alle eiwitvoorraden tijdens het experiment op ijs worden gehouden om de stabiliteit te behouden.
  6. De druppelhouder schoonmaken
    1. Voeg 4 μL gedestilleerd water toe en reinig de druppelhouder met een pluisvrij doekje (herhaal 3x). Herhaal deze stap vervolgens met 4μL 70% ethanol en reinig met een pluisvrij doekje. Deze stap zorgt voor de verwijdering van oppervlakteverontreinigingen en stofdeeltjes.
    2. Voeg 4μL 0,5N HCl toe en laat het 1 minuut in de druppelhouder staan. Maak het schoon met een pluisvrij doekje en herhaal deze stap nog een keer. Dit zorgt voor een grondige reiniging van de druppelhouder. Dieptereiniging is vooral handig om de druppelhouder te reinigen van opgedroogde druppels van eerder gebruik.
    3. 1Herhaal stap 1 om de druppelhouder te wassen met gedestilleerd water en 70% ethanol en veeg hem droog met een pluisvrij doekje. De druppelhouder is nu klaar voor gebruik.

2. Basiskinetiek

  1. Instellen van het instrument en de software
    1. Open de software en selecteer Basiskinetiek in het linkerdeelvenster (aanvullende afbeelding 1).
    2. Haal het rek met biosensoren uit de bak (verkregen uit commerciële bronnen) en plaats een plaat met 96 putjes in de bak. Voeg 200 μL BLI-buffer toe aan het eerste putje. Plaats vervolgens de bak met biosensoren terug op de plaat met 96 putjes en zorg ervoor dat elke biosensor in de overeenkomstige put wordt geplaatst. De eerste biosensor moet nu worden ondergedompeld in de BLI-buffer in de eerste put.
    3. Klik in de software op Hydrateer en zet de timer 10 minuten aan, zodat de enkele biosensor minimaal 10 minuten kan hydrateren. De stap hydrateert de biosensor om deze klaar te maken voor BLI-test.
    4. Terwijl de biosensor wordt gehydrateerd, pipetteer 250 μL BLI-buffer in twee buisjes van 0,5 ml. Label de ene als "A" (associatie) en de andere als "D" (dissociatie).
    5. Vul de gegevens van de software in (Naam: Substraatcoating en beschrijving van de test: RPA-3'Bio-ss-poly (dT)32: Basiskinetiek).
    6. Pas de run-instelling voor elke stap aan: Basislijn (30 s), Associatie (120 s), Dissociatie (120 s) (Tabel 1). Houd de shaker aan voor de buis en druppelhouder. Het schudtoerental is ingesteld op 2200 tpm (bereik, 1000-2600 tpm), wat de massatransporteffecten voorkomt die worden veroorzaakt door de beperkte diffusie in de buurt van het biosensoroppervlak.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de duur voor elke stap (baseline, laden, associëren, dissociëren) te optimaliseren bij het opzetten van een bindingskinetiektest om de gegevensverzameling te verbeteren.
  2. Een basislijncurve vaststellen
    1. Plaats buis A in de buishouder en bevestig de gehydrateerde biosensor aan het BLI-systeem. Schuif de slanghouder onder de biosensor (positie A, Figuur 2).
      OPMERKING: Biosensoren mogen op geen enkel moment tijdens het experiment volledig gedroogd zijn. Als het wordt gedroogd, kunnen de metingen van het experiment aanzienlijk scheef zijn.
    2. Druk op Uitvoeren en volg de instructies in het promptbericht.
    3. Nadat u de eerste basislijn hebt voltooid, opent u het deksel en voegt u 4 μL BLI-buffer toe aan de druppelhouder. Schuif hem naar rechts onder dezelfde biosensor (positie B, Figuur 2). Sluit het deksel en bewaak de BLI-curve op de software (Figuur 3, blauwe curve).
    4. Open na voltooiing het deksel om buis 'A' te vervangen door 'D' en schuif deze onder de biosensor (positie A, Figuur 2). Sluit het deksel en ga verder met de dissociatiestap. Open na voltooiing het deksel, verwijder de biosensor, plaats deze terug in de bak en zorg ervoor dat de biosensor in de BLI-buffer is gedoopt.
    5. Verwijder het monster/de buffer, reinig de druppelhouder met een buffer voordat u deze afdroogt met pluisvrije doekjes en verwijder buis 'D' uit de buishouder.
  3. Coating van de ondergrond
    1. Plaats buis A in de buishouder en bevestig de gehydrateerde biosensor aan het BLI-systeem. Schuif de slanghouder onder de biosensor en druk op Rennen.
    2. Voeg na de eerste basisstap 4 μL 12,5 nM substraat [3'Bio-ss-poly (dT)32] toe aan de druppelhouder en schuif deze onder de biosensor. Sluit het deksel en controleer de BLI-curve op de software. Zorg ervoor dat deze respons hoger is dan de basislijn (Figuur 3).
      OPMERKING: De substraatconcentratie kan worden geoptimaliseerd door biosensoren te coaten met verschillende concentraties (slechts één concentratie per biosensor) en de bindingscurven te observeren. Een bindingscurve met een zichtbaar hoger signaal in vergelijking met de basislijn is voldoende om de substraatcoating te bevestigen. Overbelasting van de biosensor kan leiden tot sterische hinder of drukte op het oppervlak. Figuur 3toont de curven voor vijf concentraties gebiotinyleerd 3'Bio-ss-poly (dT)32 substraat. Bovendien kunnen de biosensoren, nadat het laden van het aas is voltooid, gedurende 30 s in streptavidine-blokkerende buffer (biocytine) worden gedompeld, gevolgd door wassen in BLI-buffer. Dit blokkeert het ongebonden streptavidine-oppervlak en voorkomt niet-specifieke binding.
    3. Open na het voltooien van de koppelingsstap het deksel en vervang buis 'A' door buis 'D'. Schuif deze onder de biosensor en sluit het deksel.
    4. Nadat de dissociatiestap is voltooid, opent u het deksel, maakt u de biosensor los en plaatst u deze in de biosensorbak met de BLI-buffer. Zorg ervoor dat de biosensor volledig in de buffer is ondergedompeld en voldoende gehydrateerd is voor de volgende stappen. Reinig de druppelhouder met analysebuffer, droog deze af met pluisvrije doekjes en verwijder buis 'D' uit de buishouder. De biosensor is nu gecoat met het 3'Bio-ss-poly (dT)32 substraat.
  4. Eiwit binden
    1. Pipetteer 250 μL BLI buffer in tien zwarte microfuge buisjes van 0,5 ml. Label ze A1 tot A5 en D1 tot D5.
    2. Voeg in een andere plaat met 96 putjes 200 μL stripbuffer toe aan de put, overeenkomend met de positie van de gehydrateerde biosensor.
    3. Voordat u met de test begint, reinigt u de druppelhouder 3x met BLI-buffer.
    4. Open een nieuw bestand in de software en selecteer Basiskinetiek in het linkerdeelvenster. Geef de test een naam en voeg indien nodig een beschrijving toe (aanvullende afbeelding 2). Pas de instellingen van de uitvoering naar wens aan (Tabel 1).
    5. Plaats de buis met het label A1 in de buishouder en bevestig de 3'Bio-ss-poly (dT)32-gecoate biosensor aan het BLI-systeem. Schuif de buis onder de biosensor en druk op Rennen.
    6. Na het voltooien van de eerste basisstap, opent u het deksel, voegt u 4 μL van de BLI-buffer toe aan de druppelhouder en schuift u deze onder de biosensor. Dit is de eiwitconcentratie van 0 nM en dient als referentiecurve.
    7. Vervang na het voltooien van de koppelingsstap buis A1 door D1 en schuif deze onder de biosensor.
    8. Zodra de dissociatiestap is voltooid, verwijdert u de biosensor en plaatst u deze terug in de lade. Zorg ervoor dat de biosensor volledig in de buffer is ondergedompeld en voldoende gehydrateerd is voor de volgende stappen. Verwijder buis D1, reinig de druppelhouder met analysebuffer en droog deze af met een pluisvrij doekje.
    9. Vervolgens wordt de bindingscurve voor 5 nM RPA-aandelen verkregen. Vul de details van het monster in (concentratie: 5 nM, molecuulgewicht: 116 KDa) en druk op Calc. Hiermee wordt de eiwitconcentratie in μg/μL berekend.
    10. Bevestig de 3'Bio-ss-poly (dT)32-gecoate biosensor en plaats buis A2 in de buishouder. Schuif hem onder de biosensor en druk op Rennen.
    11. Voeg na de basislijn 4 μL 5 nM RPA toe aan de druppelhouder en schuif deze onder de biosensor. Sluit het deksel en controleer de associatiecurve. Eiwitbinding aan aas kan worden gevisualiseerd door een curve die hoger is dan de basislijncurve. Vervang na de associatiestap A2 door D2, schuif deze onder de biosensor en voltooi de dissociatiestap.
    12. Verwijder de biosensor, dompel hem 30 s in de stripbuffer en dompel hem vervolgens 3 minuten in de BLI-buffer.
      OPMERKING: De regeneratie-efficiëntie is afhankelijk van het geïmmobiliseerde aas en de verstoorde analyt. Sommige geïmmobiliseerde biosensoren zijn bestand tegen tien of meer regeneratiecycli. We zouden het gebiotinyleerde 3'Bio-ss-poly (dT)32-substraat meer dan drie keer kunnen strippen (aanvullende figuur 3) zonder een merkbare verandering in de respons waar te nemen.
    13. Herhaal stap 2.4.9–2.4.12 voor de andere drie concentraties van RPA 10 nM, 20 nM en 40 nM. Zorg ervoor dat u de biosensor voor elke concentratie stript.
      OPMERKING: Voor BLI-assays raden experts aan om vier concentraties (exclusief de referentiecurve) te gebruiken, variërend van ongeveer 0,1x tot 10x de verwachte KD voor nauwkeurige kinetische metingen. Hier werden de vier concentraties verkregen door seriële verdunningen.
  5. Analyseren van gegevens en berekenen van KD-waarden
    1. Alvorens de KD-waarde te berekenen, is het noodzakelijk om het sensorgram visueel te inspecteren voor elke concentratie RPA-binding op het 3'Bio-ss-poly (dT)32-substraat . Zorg ervoor dat het BLI-signaal toeneemt met toenemende concentratie RPA totdat het geïmmobiliseerde DNA verzadigd is (Figuur 4).
      OPMERKING: Voor betrouwbare resultaten moet u ervoor zorgen dat ten minste vier eiwitconcentraties met succes aan het substraat zijn gebonden, met uitzondering van de 0 nm-analytconcentratie. Raadpleeg het discussiegedeelte om mogelijke fouten op te lossen.
    2. Controleer in de tabel 'Lijst uitvoeren' Ref voor 0 nM analytconcentratie om als referentiecurve te dienen. Controleer Analyseren op alle concentraties van de analyt.
    3. Selecteer vervolgens zowel Start van associatie als Start van dissociatie voor stapcorrectie. Hierdoor wordt het begin van de associatie afgestemd op het einde van de basislijn en het begin van de dissociatie op het einde van de associatie, wat meestal wordt veroorzaakt door verschillende reflectiepatronen tussen de druppelhouder en de buis als de buffer goed overeenkomt.
    4. Selecteer Global Fitting (1:1) voor deze test. Globale analyse berekent de KD-waarden voor een hele reeks eiwitconcentraties, terwijl lokale analyse voor een enkele eiwitconcentratie is.
      OPMERKING: De software die bij het instrument wordt geleverd, maakt alleen een 1:1 aanpassing mogelijk. Dit kan een mogelijk voorbehoud zijn wanneer het aas en de analyt naar verwachting in andere passende modellen passen. Gegevens van deze software kunnen worden geëxporteerd naar andere plotsoftware en worden ingepast in de vereiste pasmodellen.
    5. Selecteer vervolgens Analyseren. Hiermee worden de waarden KD, ka/kd berekend (tabel 2). De ka en kd fout binnen 10% van de waarde wordt over het algemeen als acceptabel beschouwd.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat deze waarden binnen redelijke grenzen liggen. Als de fout minder dan 10% is, suggereert dit dat de aanpassing van gegevens betrouwbaar is voor het bestuderen van interacties tussen biologische moleculen. Bovendien zou de berekende KD (evenwichtsdissociatieconstante) met behulp van deze ka - enkd-waarden voldoende nauwkeurig moeten zijn voor de meeste praktische toepassingen18.
    6. Als u de aangepaste gegevens wilt exporteren, klikt u met de rechtermuisknop op de grafiek die is gegenereerd met behulp van de geanalyseerde gegevens. Kies Gegevens exporteren en selecteer vervolgens Tekst/gegevens. Klik op Bestand en Bladeren om gegevens op te slaan in '.dat'-indeling. Dit bestand kan worden geopend in Microsoft Excel en worden gebruikt in andere software voor het plotten van grafieken.
      OPMERKING: Globale aanpassing houdt rekening met alle gegevens van de bindingscurve binnen de groep, terwijl lokale aanpassing zich uitsluitend richt op de kinetische parameters voor elke individuele analytconcentratie.

3. Het instrument instellen om geavanceerde kinetiek uit te voeren

  1. Open de software en selecteer Geavanceerde kinetiek in het linkerdeelvenster (aanvullende afbeelding 1).
  2. Plaats een plaat met 96 putjes in de bak met de biosensoren. Voeg 200 μL BLI-buffer toe in vijf putjes. Plaats de bak met biosensoren op de plaat met 96 putjes zodat vijf biosensoren in de put met de buffer duiken.
  3. Klik in de software op Hydrateer en zet de timer 10 minuten aan, zodat de enkele biosensor minimaal 10 minuten kan hydrateren.
  4. Terwijl de biosensoren hydrateren, pipetteert u 250 μL BLI-buffer in tien zwarte centrifugebuisjes van 0,5 ml. Label ze als A1 tot A5 en D1 tot D5.
  5. Vul de gegevens in de software in (Naam: Substraatcoating en beschrijving van de test: RPA-3'Bio-ss-poly (dT)32: Advanced Kinetics).
  6. Voer de duur voor elke stap in (aanvullende afbeelding 4). Initiële basislijn (30 s), belasting (120 s), basislijn (30 s), associatie (120 s), dissociatie (120 s). Pas de instellingen van de uitvoering naar wens aan (Tabel 1).
    1. Vul de gegevens van de software in (concentratie: 0 nM, molecuulgewicht: 116 kDa) en druk op Calc.
  7. Plaats buis A1 in de buishouder en bevestig de biosensor. Schuif de buishouder onder de biosensor en druk op Run om de initiële basislijn te verkrijgen.
  8. Voeg 4 μL 12,5 nM substraat toe aan de druppelhouder en schuif deze onder de biosensor. Sluit het deksel. Hierdoor wordt het substraat op de biosensor geladen. Vervang A1 door D1 in de slanghouder en schuif deze onder de biosensor. Dit geeft de basislijncurve.
  9. Reinig de druppelhouder met een pluisvrij doekje en plaats 4 μL van de BLI-buffer. Schuif deze onder de biosensor en sluit het deksel. Dit is de eiwitconcentratie van 0 nM en dient als referentiecurve.
  10. Schuif na het voltooien van de koppelingsstap de D2-buis onder de biosensor. Ga verder met de dissociatiestap. Laat de dissociatie voltooien.
  11. Maak de biosensor los, verwijder de D2 uit de slanghouder en reinig de druppelhouder met een pluisvrij doekje.
  12. Voer de gegevens in (concentratie: 5 nM, molecuulgewicht: 116 kDa) voor de volgende run en druk op Calc.
  13. Bevestig de tweede biosensor aan het BLItz systeem, plaats buis A2 in de buishouder en schuif deze onder de biosensor.
  14. Nadat de initiële basislijn is vastgesteld, voegt u 4 μL 12,5 nM substraat toe aan de druppelhouder. Schuif deze onder de biosensor en sluit het deksel. Vervang buis A2 door D3 en schuif deze onder de biosensor. Voeg vervolgens 4 μL 10 nM voorraad RPA toe aan de slanghouder en schuif deze onder de biosensor.
  15. Schuif na associatie D4 onder biosensor voor dissociatie.
  16. Herhaal stap 3.1.12–3.1.15 voor de volgende drie concentraties RPA (10 nM, 20 nM, 40 nM). Bindingscurven voor deze concentraties zijn weergegeven in figuur 5.
  17. Gegevensanalyse enK-D-waarde kunnen in dezelfde procedure worden ingepast als de BLI-basiskinetiek (stap 2.5, tabel 2).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In BLI wordt wit licht gereflecteerd van de interface van biolaag/buffer en de interne referentie-interface naar de spectrometer. Het resulterende interferentiepatroon wordt geregistreerd en de spectrale verschuiving wordt over een bepaalde periode gemeten en weergegeven als bindingscurven in nm. Een representatieve figuur die de biosensortip met en zonder analytbinding en de bijbehorende spectrale golflengteverschuiving (nm) weergeeft, wordt weergegeven in figuur 1<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De mogelijkheid om de bindingskinetiek van elk eiwit aan zijn substraat te analyseren met behulp van BLI biedt de middelen om de specifieke factoren (zoals sequentie, structuur of lengte van een DNA) die bepalende zijn voor eiwit-DNA-interacties binnen de cel te isoleren en te karakteriseren19. Het Octet N1-systeem, dat gebaseerd is op de principes van biolaaginterferometrie, maakt kwantitatieve metingen van eiwit-eiwit en eiwit-nucleïnezuren interacties mogelijk....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs hebben geen belangenconflict te verklaren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de National Science Foundation (1929346) en de American Cancer Society (RSG-21-028-01). We willen ook de leden van het Balakrishnan-laboratorium bedanken voor de nuttige discussies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0,5 mL Micro Centrifuge TubesGlobe Scientific111554A
96 Well Standard Black MicroplateDot Scientific4ti-0223
Biotinyleren poly dT OligonucleotideIDT
Bovine Serum Albumine (BSA)Sigma-AldrichA2153-10G
Dithiothreitol (DTT)Dot ScientificDSD11000-10
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Dot ScientificDSE57020-500
ZoutzuurFisher ScientificA144-500
Kimtec Science KimwipesKimtech34120
Octet N1 SoftwareSartorius1.4.0.13
Octet SA BiosensorSartorius18-5019
PBS pH 7,2 (10x)Gibco1666711
Personal Assay Octet N1 SystemSartorius
FosforzuurWard's Science470302-024
Natriumchloride (NaCl)Dot ScientificDSS23020-5000
Tris BaseDot ScientificDST60040-5000
Tween20Bio-Rad170-6531
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kalodimos, C. G., et al. Structure and flexibility adaptation in non-specific and specific protein-DNA complexes. Science. 305 (5682), 386-389 (2004).
  2. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9 (23), 6505-6525 (1981).
  3. Lane, D., Prentki, P., Chandler, M. Use of gel retardation to analyze protein-nucleic acid interactions. Microbiol Rev. 56 (4), 509-528 (1992).
  4. Dyer, R. B., Herzog, N. K. Immunodepletion EMSA: A novel method to identify proteins in a protein-DNA complex. Nucleic Acids Res. 23 (16), 3345-3346 (1995).
  5. Dudley, R. K. A laboratory guide to in vitro studies of protein-DNA interactions. FEBS Lett. 306, 2-3 (1991).
  6. Tsai, C., Smider, V., Hwang, B. J., Chu, G. Electrophoretic mobility shift assays for protein-DNA complexes involved in DNA repair. Methods Mol Biol. 920, 53-78 (2012).
  7. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  8. Heffler, M. A., Walters, R. D., Kugel, J. F. Using electrophoretic mobility shift assays to measure equilibrium dissociation constants: GAL4-p53 binding DNA as a model system. Biochem Mol Biol Educ. 40 (6), 383-387 (2012).
  9. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. J Vis Exp. (84), e51383(2014).
  10. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J Pharm Biomed Anal. 72, 150-154 (2013).
  11. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  12. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
  13. Schasfoort, R. B. M., Tudos, A. J. Handbook of surface plasmon resonance. , RSC Pub. (2008).
  14. Douzi, B. Surface plasmon resonance: A sensitive tool to study protein-protein interactions. Methods Mol Biol. 2715, 363-382 (2024).
  15. Douzi, B. Protein-protein interactions: Surface plasmon resonance. Methods Mol Biol. 1615, 257-275 (2017).
  16. Drescher, D. G., Selvakumar, D., Drescher, M. J. Analysis of protein interactions by surface plasmon resonance. Adv Protein Chem Struct Biol. 110, 1-30 (2018).
  17. Martin, S. R., Ramos, A., Masino, L. Biolayer interferometry: Protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 2263, 351-368 (2021).
  18. Apiyo, D. Biomolecular binding kinetics assays on the Octet BLI platform. , https://www.sartorius.com/resource/blob/742330/05671fe2de45d16bd72b8078ac28980d/octet-biomolecular-binding-kinetics-application-note-4014-en-1--data.pdf (2022).
  19. Barrows, J. K., Van Dyke, M. W. Biolayer interferometry for DNA-protein interactions. PLoS One. 17 (2), e0263322(2022).
  20. Desai, M., Di, R., Fan, H. Application of biolayer interferometry (BLI) for studying protein-protein interactions in transcription. J Vis Exp. (149), e59687(2019).
  21. Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic acid interactions by biolayer interferometry. Curr Protoc Protein Sci. 79, 19.25.1-19.25.26 (2015).
  22. Petersen, R. L. Strategies using bio-layer interferometry biosensor technology for vaccine research and development. Biosensors (Basel). 7 (4), 49(2017).
  23. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
  24. Wold, M. S. Replication protein A: A heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem. 66, 61-92 (1997).
  25. Qureshi, M. H., Ray, S., Sewell, A. L., Basu, S., Balci, H. Replication protein A unfolds G-quadruplex structures with varying degrees of efficiency. J Phys Chem B. 116 (19), 5588-5594 (2012).
  26. Wold, M. S., Kelly, T. Purification and characterization of replication protein A, a cellular protein required for in vitro replication of simian virus 40 DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (8), 2523-2527 (1988).
  27. Bochkareva, E., Korolev, S., Lees-Miller, S. P., Bochkarev, A. Structure of the RPA trimerization core and its role in the multistep DNA-binding mechanism of RPA. EMBO J. 21 (7), 1855-1863 (2002).
  28. Brosey, C. A., et al. NMR analysis of the architecture and functional remodeling of a modular multidomain protein, RPA. J Am Chem Soc. 131 (18), 6346-6347 (2009).
  29. Fanning, E., Klimovich, V., Nager, A. R. A dynamic model for replication protein A (RPA) function in DNA processing pathways. Nucleic Acids Res. 34 (15), 4126-4137 (2006).
  30. Gibb, B., et al. Protein dynamics during presynaptic-complex assembly on individual single-stranded DNA molecules. Nat Struct Mol Biol. 21 (10), 893-900 (2014).
  31. Nguyen, B., et al. Diffusion of human replication protein A along single-stranded DNA. J Mol Biol. 426 (19), 3246-3261 (2014).
  32. Brosey, C. A., et al. Functional dynamics in replication protein A DNA binding and protein recruitment domains. Structure. 23 (6), 1028-1038 (2015).
  33. Chen, R., Subramanyam, S., Elcock, A. H., Spies, M., Wold, M. S. Dynamic binding of replication protein a is required for DNA repair. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5758-5772 (2016).
  34. Kemmerich, F. E., et al. Force regulated dynamics of RPA on a DNA fork. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5837-5848 (2016).
  35. Pokhrel, N., et al. Dynamics and selective remodeling of the DNA-binding domains of RPA. Nat Struct Mol Biol. 26 (2), 129-136 (2019).
  36. Wang, Q. M., et al. Human replication protein A induces dynamic changes in single-stranded DNA and RNA structures. J Biol Chem. 294 (38), 13915-13927 (2019).
  37. Wyka, I. M., Dhar, K., Binz, S. K., Wold, M. S. Replication protein A interactions with DNA: Differential binding of the core domains and analysis of the DNA interaction surface. Biochemistry. 42 (44), 12909-12918 (2003).
  38. Kim, C., Snyder, R. O., Wold, M. S. Binding properties of replication protein A from human and yeast cells. Mol Cell Biol. 12 (7), 3050-3059 (1992).
  39. Caldwell, C. C., Spies, M. Dynamic elements of replication protein A at the crossroads of DNA replication, recombination, and repair. Crit Rev Biochem Mol Biol. 55 (5), 482-507 (2020).
  40. Mishra, A. K., Dormi, S. S., Turchi, A. M., Woods, D. S., Turchi, J. J. Chemical inhibitor targeting the replication protein A-DNA interaction increases the efficacy of Pt-based chemotherapy in lung and ovarian cancer. Biochem Pharmacol. 93 (1), 25-33 (2015).
  41. Gavande, N. S., et al. Structure-guided optimization of replication Protein A (RPA)-DNA interaction inhibitors. ACS Med Chem Lett. 11 (6), 1118-1124 (2020).
  42. Ana Jug, T. B., Janez Ilaš, Biolayer interferometry and its applications in drug discovery and development. TrAC Trends Anal Chem. 176, 117741(2024).
  43. Gator Bio, I. Using BLI for viral and lipid-based vector analytics. , News Medical. https://www.news-medical.net/whitepaper/20230322/Using-BLI-for-viral-and-lipid-based-vector-analytics.aspx (2023).
  44. Noy-Porat, T., et al. Characterization of antibody-antigen interactions using biolayer interferometry. STAR Protoc. 2 (4), 100836(2021).
  45. Onyekachi Ononye, S. S., et al. Biochemical impact of p300-mediated acetylation of replication protein A: Implications for DNA metabolic pathway choice. bioRxiv. , (2024).
  46. Weeramange, C. J., Fairlamb, M. S., Singh, D., Fenton, A. W., Swint-Kruse, L. The strengths and limitations of using biolayer interferometry to monitor equilibrium titrations of biomolecules. Protein Sci. 29 (4), 1018-1034 (2020).
  47. Artem Stetsenko, A. G. An Overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), 197(2017).
  48. Hubbe, M. A., Szlek, D. B., Vera, R. E. Detergency mechanisms and cellulosic surfaces: A review. BioResources. 17 (4), 7167-7249 (2022).
  49. Renee Tobias, S. K., Apiyo, A. Research the Industry Standard for Label-Free of Biomolecular Interactions Analysis (BIA). , https://www.sartorius.com/en/products/biolayer-interferometry/bli-resources (2021).
  50. Octet NTA Biosensor Kinetic Assays. , Sartorius. https://www.sartorius.com/resource/blob/552398/b27ccc2fdfde7a9320909572ced3f6a1/ni-nta-biosensor-kinetic-assays-technical-note-en-sartorius-data.pdf (2024).
  51. Application Guides: Kinetics and affinity measurements with Biacore systems. , Cytiva. Available from: https://cdn.cytivalifesciences.com/api/public/content/digi-33042-pdf (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Eiwit DNA interactiesstreptavidine biosensorbindingskinetiekreplicatie eiwit Aenkelstrengs DNAequilibrium dissociatieconstantereal time bindingposttranslationele modificatiesgenoomstabiliteit

Gerelateerde artikelen