Methodenartikel

Snelle scheiding en weergave van actieve fibrinogenolytische middelen in Sipunculus nudus door middel van fibrinogeen-polyacrylamide-gelelektroforese

DOI:

10.3791/66536

⸱

19 april 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, 2Medicine School, Huaqiao University, 3Department of Laboratory Medicine, Hospital of Huaqiao University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een fibrinogeen-polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) protocol om de fibrinogenolytische middelen van Sipunculus nudus snel te scheiden en weer te geven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibrinogenolytische middelen die fibrinogeen direct kunnen oplossen, worden veel gebruikt bij antistollingsbehandelingen. Over het algemeen vereist het identificeren van nieuwe fibrinogenolytische middelen dat eerst elke component wordt gescheiden en vervolgens hun fibrinogenolytische activiteiten worden gecontroleerd. Momenteel worden polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) en chromatografie meestal gebruikt in de scheidingsfase. Ondertussen worden de fibrinogeenplaattest en reactieproducten op basis van PAGE meestal gebruikt om hun fibrinogenolytische activiteiten weer te geven. Vanwege de spatiotemporele scheiding van deze twee stadia is het echter onmogelijk om de actieve fibrinogenolytische middelen met dezelfde gel te scheiden en weer te geven. Om de scheidings- en weergaveprocessen van de identificatie van fibrinogenolytische agentia te vereenvoudigen, hebben we een nieuwe fibrinogeen-PAGE-methode geconstrueerd om de fibrinogenolytische agentia van pindawormen (Sipunculus nudus) snel te scheiden en weer te geven in deze studie. Deze methode omvat fibrinogeen-PAGE-bereiding, elektroforese, renaturatie, incubatie, kleuring en ontkleuring. De fibrinogenolytische activiteit en het molecuulgewicht van het eiwit kunnen tegelijkertijd worden gedetecteerd. Volgens deze methode hebben we binnen 6 uur met succes meer dan één actief fibrinogenolytisch middel van pindawormhomogenaat gedetecteerd. Bovendien is deze fibrinogeen-PAGE-methode tijd- en kostenvriendelijk. Bovendien zou deze methode kunnen worden gebruikt om de fibrinogenolytische agentia van de andere organismen te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren zijn trombotische ziekten als gevolg van de voortdurende opkomst van trombotische ziekten een nieuw groot wereldwijd gezondheidsprobleem geworden1. Op dit moment worden antitrombotica ingedeeld in drie groepen: geneesmiddelen tegen bloedplaatjesaggregatie, anticoagulantia en trombolytica. Onder hen zijn trombolytische geneesmiddelen, zoals urokinase (VK), weefselplasminogeenactivator (tPA), enz., de enige klinisch gebruikte geneesmiddelen die trombus2 kunnen hydrolyseren. Ondertussen worden veiligere en effectievere trombolytische geneesmiddelen ontwikkeld door de identificatie van nieuwe trombolytischemiddelen3.

De identificatie van nieuwe trombolytische middelen is echter tijdrovend en arbeidsintensief, waarbij het vooral gaat om de fasen scheiding/zuivering en karakterisering/controle. De eerste is om elk onderdeel te scheiden, en de laatste is om hun fibrino(geno)lytische activiteiten weer te geven 4,5. Ondanks het feit dat we met succes een nieuw fibrino(geno)lytisch enzym (sFE) uit de pindaworm (Sipunculus nudus) hebben geïsoleerd door middel van affiniteitschromatografie en fibrine(ogen) plaattest 6,7,8, zijn deze processen zo tijdrovend en arbeidsintensief. Eerst moet worden bepaald of de homogenaten van de pindaworm fibrino(geno)lytische activiteit hebben door middel van de fibrine(ogen)plaatmethode en reactieproducten op basis van PAGINA9. Vervolgens moet een reeks chromatografie, zoals ionenuitwisselingschromatografie, gelfiltratiechromatografie, affiniteitschromatografie en andere methoden, worden uitgevoerd voor scheiding en zuivering10,11. Vervolgens wordt de fibrineplaattest opnieuw uitgevoerd om de fibrinogenolytische activiteit van elk afzonderlijk bestanddeel te controleren. Ten slotte worden native-PAGE en natriumdodecylsulfaat (SDS)-PAGE uitgevoerd om het molecuulgewicht van de actieve fibrinogenolytische middelen te bepalen12. Daarom is het van cruciaal belang om de actieve fibrinogenolytische middelen snel te scheiden en weer te geven.

Om de actieve fibrinogenolytische middelen in de pindawormhomogenaten snel te scheiden en weer te geven, werd een nieuwe fibrinogeen-PAGE-methode ontwikkeld door de PAGE- en fibrinogeenplaatmethoden te combineren, d.w.z. dat de substraten van fibrinogenolytische middelen fibrinogeen werden toegevoegd aan de native-PAGE-gel. Na native-PAGE werden de componenten gescheiden op basis van hun molecuulgewicht. Ondertussen kan elke actieve fibrinogenolytische component worden weergegeven door kleuring. Met deze methode hebben we binnen 6 uur met succes meer dan één actief fibrinogenolytisch agens van pindawormhomogenaat gedetecteerd. Bovendien is deze fibrinogeen-PAGE-methode tijd- en kostenvriendelijk. Bovendien zou deze methode kunnen worden gebruikt om de fibrinogenolytische agentia van de andere organismen te bestuderen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van het homogenaat van de pindaworm

  1. Voeg 50 g pindawormen en 150 ml zoutoplossing toe aan de homogenisator.
  2. Homogeniseren bij 24000 tpm gedurende 60 s.
    OPMERKING: Herhaal 3 keer.
  3. Centrifugeer het homogenaat bij 9710 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  4. Verzamel het supernatans als het homogenaat van de pindaworm voor verder onderzoek.

2. Fibrinogeen-PAGE gel preparaat

  1. Weeg 0,01 g fibrinogeen af in een glazen bekerglas van 50 ml.
  2. Voeg 1,9 ml DDH2O, 1,3 ml Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) en 0,05 ml SDS (10%, w/v) toe aan het bekerglas; Meng goed door te pipetteren.
  3. Zet het deksel 30 minuten op 37 °C.
    OPMERKING: Deze stap is om het fibrinogeen op te lossen.
  4. Voeg 1,7 ml acrylamide (30%, m/v), 0,05 ml ammoniumpersulfaat (APS; 10%, m/v), 0,002 ml TEMED toe; Meng goed door te pipetteren.
    LET OP: Dit is scheidingsgel.
  5. Giet de scheidingsgel in een gelvorm met 10 putjes.
  6. Voeg 2 ml DDH2O toe aan de gelvorm; Wacht 30 minuten.
  7. Verwijder het water grondig door de vorm ondersteboven te draaien.
  8. Voeg 1,4 ml DDH2O, 0,25 ml Tris-HCl (1,0 M, pH 6,8), 0,02 ml SDS (10%, m/v), 0,33 ml acrylamide (30%, m/v), 0,02 ml APS (10%, m/v), 0,002 ml tetramethylethyleendiamine (TEMED) toe aan het bekerglas; Meng goed door te pipetteren.
    OPMERKING: Dit is het laden van gel.
  9. Giet de laadgel in dezelfde gelvorm als stap 2.5; Plaats de kam onmiddellijk.
    OPMERKING: De fibrinogeen-PAGE-gel die hier wordt gebruikt, is samengesteld uit het fibrinogeen (0,2%) bevattende scheidingsgel en laadgel. De concentratie van fibrinogeen kan naar behoefte worden aangepast.

3. Elektroforese

  1. Plaats de bereide fibrinogeen-PAGE-gel samen met de lijmvorm in de elektroforesetank; giet 1300 ml elektroforese-oplossing (1,963 g Tris, 12,22 g glycine, 0,65 g SDS en 1300 ml DDH2O) in de tank; Haal de kam eruit.
  2. Voeg 5 μL 5x niet-denaturerende laadbuffer toe aan de 20 μL sFE en 20 μL pindawormhomogenaat; meng goed door te pipetteren; laad ze in de voorbereide fibrinogeen-PAGE-gel.
    NOTITIE: Kook het mengsel niet. sFE is een fibrino(geno)lytisch enzymdat eerder 6,7,8 is geïdentificeerd en in deze studie als positieve controle wordt gebruikt. Pindawormhomogenaat is het monster dat moet worden gedetecteerd. Niet-denaturerende laadbuffer zonder broomfenolblauw, β-mercaptoethanol en SDS vergeleken met de SDS-PAGE-laadbuffer. Elke monsterstrook is gescheiden met de 1x SDS-PAGE-laadbuffer om de beweging van het eiwit duidelijk te detecteren.
  3. Voer elektroforese uit bij 80 V gedurende 30 min, of 120 V gedurende 20 min.
  4. Haal de fibrinogeen-PAGE gel uit de lijmvorm.

4. Renaturatie

  1. Breng de fibrinogeen-PAGE-gel over in een plastic doos.
  2. Voeg 100 ml Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) en 2 ml Triton X-100 toe aan de doos. Plaats het op een shaker op 60-70 tpm gedurende 10 minuten.
  3. Verwijder de wasbuffer door te pipetteren.
    OPMERKING: Herhaal dit drie keer.

5. Incubatie

  1. Voeg 50 ml Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) toe aan de plastic doos.
  2. Incubeer bij 37 °C gedurende 4 uur.
    OPMERKING: De incubatietijd kan worden aangepast aan de sterkte van de fibrinogenolytische activiteit.

6. Vlekken

  1. Verwijder de incubatiebuffer door te pipetteren.
  2. Voeg 50 ml Coomassie Brillant Blue Staining Solution toe aan de doos en plaats de doos op een shaker op 60-70 rpm gedurende 30 minuten.

7. Ontkleuring

  1. Verwijder de kleuroplossing door te pipetteren.
  2. Voeg 50 ml DDH2O toe aan de doos.
  3. Plaats de doos op een shaker op 60-70 rpm gedurende 30 minuten.
    OPMERKING: DD H2O werd hier gebruikt als ontkleuringsoplossing. De schudtijd kan worden aangepast aan de sterkte van de fibrinogenolytische activiteit.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na elektroforese waren alle banden van de marker duidelijk zichtbaar. De 1x SDS-PAGE laadbanen vertoonden slechts 10 kDa banden (broomfenol blauw). De monsters van sFE en pindawormen vertoonden geen waarneembare banden (figuur 1). Hoewel de banden van de monsters niet zichtbaar zijn, gaven de prestaties van de marker en broomfenolblauw aan dat de elektroforese succesvol was en werden de monsters gescheiden op basis van hun molecuulgewicht.

Hoewel de hele gel blauw werd door de kleuring, maakte de verkleuring het gebied waar fibrinogeen werd afgebroken door fibrinogenolytische middelen transparant. Vergeleken met de marker gaf de sFE een actieve fibrinogenolytische band aan in de buurt van 25 kDa. Het homogenaat van de pindaworm vertoonde 25 kDa, 33 kDa, 43 kDa en een reeks banden groter dan 70 kDa (Figuur 2). De resultaten gaven aan dat sFE alleen een fibrinogenolytische component van 25 kDa bevatte, maar dat het homogenaat van de pindaworm sFE-componenten en andere fibrinogenolytische middelen bevatte. Aanvullende figuur 1 is een voorbeeld van een gelafbeelding waarop de marker in diepblauw is weergegeven en de doelmonsters als heldere banden.

figure-results-1
Figuur 1: Gel na elektroforese. M: Markering; Baan 1: 1x SDS-PAGE laadbuffer; Baan 2: sFE; Baan 3: 1x SDS-PAGE laadbuffer; Baan 4: pindaworm homogeniseren; Baan 5: 1x SDS-PAGE laadbuffer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Gel na ontkleuring. M: Markering; Baan 1: 1x SDS-PAGE laadbuffer; Baan 2: sFE; Baan 3: 1x SDS-PAGE laadbuffer; Baan 4: pindaworm homogeniseren; Baan 5: 1x SDS-PAGE laadbuffer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Gelafbeelding met de marker in diepblauw en de doelmonsters als heldere banden. M: Markering; Baan 1: 1x SDS-PAGE laadbuffer; Baan 2: sFE; Baan 3: 1x SDS-PAGE laadbuffer; Baan 4: pindaworm homogeniseren; Baan 5: 1x SDS-PAGE laadbuffer. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sFE is een nieuw fibrino(geno)lytisch enzym dat eerder door ons team uit pindawormen werd geïsoleerd 3,6,8,13. De identificatieprocessen van sFE waren echter tijdrovend en arbeidsintensief, waarbij de fibrinogenolytische activiteitsdetectie, de scheiding van eiwitcomponenten en de activiteitsbevestigingsfasen betrokken waren. Als eenvoudige methode wordt de fibrinogeenplaattest meestal gebruikt in de voorbereidende screeningfase om de fibrinogenolytische activiteit van de monsters te controleren. De fibrinogeenplaattestmethode kan echter niet scheiden welke component actief is. Daarom moeten chromatografie en native/SDS-PAGE worden gebruikt om hun componenten te scheiden na activiteitsdetectie. Vervolgens worden reactieproducten opnieuw opgelost door de SDS-PAGE om de afbraak van substraatfibrinogeen te bevestigen. In dit werk werd het substraat fibrinogeen toegevoegd aan PAGE-gel om het fibrinogenolytische middel te detecteren. Na elektroforese, renaturatie, incubatie, kleuring en ontkleuring werden het molecuulgewicht en de fibrinogenolytische activiteit van de actieve fibrinogenolytische middelen duidelijk weergegeven met dezelfde gel. Met deze methode hebben we binnen 6 uur met succes meer dan één actief fibrinogenolytisch middel uit pindawormhomogenaat gedetecteerd.

Om de optimale resultaten te bereiken, moet meer aandacht worden besteed aan de fibrinogeen-PAGE-gelpreparaat, renaturatie en incubatie. Over het algemeen geldt: hoe lager de concentratie fibrinogeen, hoe kleurlozer de fibrinogenolytische zone, wat wijst op fibrinogenolytische activiteit van de middelen. Hoe lager de concentratie fibrinogeen, hoe kleurlozer de achtergrond en hoe moeilijker het is om de fibrinogenolytische zone van de achtergrond te onderscheiden. De renaturatietijd zal de fibrinogenolytische activiteit van componenten aanzienlijk beïnvloeden. Als deze tijd te kort is om het SDS in de PAGE-gel af te wassen, wordt de fibrinogenolytische activiteit van componenten geremd door remanente SDS. Evenzo, als de incubatietijd te kort is, is de fibrinogenolytische reactie niet grondig. Hoewel de incubatietijd te lang is, wordt de marker die wordt gebruikt om het molecuulgewicht aan te geven, weggespoeld. In deze studie, hoewel die omstandigheden zijn geoptimaliseerd, werden deze voorwaarden ingesteld om de fibrinogenolytische middelen van pindawormen te scheiden en weer te geven. Gepersonaliseerde voorwaarden van die kritieke stappen moeten dus worden ingesteld op basis van specifieke fibrinogenolytische middelen.

Het is belangrijk om te vermelden dat deze fibrinogeen-PAGE alleen geschikt is voor het screenen van de fibrinogenolytische middelen met fibrinogeen-lytische activiteit, maar niet voor de middelen met fibrinogeen-lytische activiteit of plasminogeen-activeringsactiviteit. Als we die activiteiten willen weergeven, kan de methode worden geoptimaliseerd door het fibrinogeen te vervangen door fibrine of plasminogeen. Een ander punt dat het vermelden waard is, is dat de actieve fibrinogenolytische middelen die in deze studie werden getest, monomeren waren, die niet werden beïnvloed onder de SDS-elektroforese-conditie. Daarom, als de geteste middelen polymeren zijn, moet deze methode worden aangepast aan een native-PAGE-conditie die het molecuulgewicht niet kan weergeven. Daarom was de hier geïntroduceerde fibrinogeen-PAGE-methode slechts een algemene basisversie, die kan worden geoptimaliseerd om de andere fibrinogenolytische middelen snel te screenen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gefinancierd door het Bureau voor Wetenschap en Technologie van de stad Xiamen (nr. 3502Z20227197), het Bureau voor Wetenschap en Technologie van de provincie Fujian (nr. 2019J01070; Nr. 2022J01311), en Talenteninnovatie- en ondernemerschapsproject op hoog niveau van het wetenschaps- en technologieplan van Quanzhou (nr. 2022C015R). We danken Fucai Wang (Huaqiao University) en Lei Tong (Huaqiao University) voor hun technische assistentie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1  M Tris-HCl (pH 6.8)SolarbioT1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)SolarbioT1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamideBiosharpBL513B
Ammonium persulfateXiLONG SCIENTIFIC7727-54-0
BeakerPYREX2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)BiosharpBS-15-M
Constant Temperature IncubatorJINGHONGJHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solutionBeyotimeP0017F
Electronic Analytical BalanceDENVERTP-213
FibrinogenSolarbioF8051
Gel loading pipette tips, BulkBiosharpBS-200-GTB
HomogenizerAHSATS-1500
Horizontal rotation oscillatorNuoMiNMSP-600
Milli-Q ReferenceMilliporeZ00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra CellBIO-RAD165-8000~165-8007
N,N,N',N'-TetramethylethylenediamineSigmaT9281
Pipette Tip (1 mL)AxygeneT-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)AxygeneT-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)AxygeneT-200XT-C
Pipettor (1 mL)Thermo Fisher ScientificZY18723
Pipettor (10µL)Thermo Fisher ScientificZX98775
Pipettor (200 µL)Thermo Fisher ScientificZY20280
Pipettor (50 µL)Thermo Fisher ScientificZY15331
Refrigerated CentrifugecenceH1650R
Sodium dodecyl sulfateSigma-AldrichV900859
TrisSolarbioT8060
Tris-HClSolarbioT8230
Triton X-100SolarbioT8200

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
  2. Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
  3. Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
  4. Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
  5. Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
  6. Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791(2023).
  7. Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631(2023).
  8. Tang, M., Lin, H., Huang, Y., Xu, R., Cui, X., Yan, H. Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023).
  9. Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
  10. Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
  11. Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764(2023).
  12. Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920(2021).
  13. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fibrinogen PAGEpinda wormenfibrinogeenplaatassaytrombolytische middeleneiwitscheidingdetectie van molecuulgewichtcardiovasculaire aandoeningen

Gerelateerde artikelen