Hier presenteren we een fibrinogeen-polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) protocol om de fibrinogenolytische middelen van Sipunculus nudus snel te scheiden en weer te geven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Snelle scheiding en weergave van actieve fibrinogenolytische middelen in Sipunculus nudus door middel van fibrinogeen-polyacrylamide-gelelektroforese
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fibrinogenolytische middelen die fibrinogeen direct kunnen oplossen, worden veel gebruikt bij antistollingsbehandelingen. Over het algemeen vereist het identificeren van nieuwe fibrinogenolytische middelen dat eerst elke component wordt gescheiden en vervolgens hun fibrinogenolytische activiteiten worden gecontroleerd. Momenteel worden polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) en chromatografie meestal gebruikt in de scheidingsfase. Ondertussen worden de fibrinogeenplaattest en reactieproducten op basis van PAGE meestal gebruikt om hun fibrinogenolytische activiteiten weer te geven. Vanwege de spatiotemporele scheiding van deze twee stadia is het echter onmogelijk om de actieve fibrinogenolytische middelen met dezelfde gel te scheiden en weer te geven. Om de scheidings- en weergaveprocessen van de identificatie van fibrinogenolytische agentia te vereenvoudigen, hebben we een nieuwe fibrinogeen-PAGE-methode geconstrueerd om de fibrinogenolytische agentia van pindawormen (Sipunculus nudus) snel te scheiden en weer te geven in deze studie. Deze methode omvat fibrinogeen-PAGE-bereiding, elektroforese, renaturatie, incubatie, kleuring en ontkleuring. De fibrinogenolytische activiteit en het molecuulgewicht van het eiwit kunnen tegelijkertijd worden gedetecteerd. Volgens deze methode hebben we binnen 6 uur met succes meer dan één actief fibrinogenolytisch middel van pindawormhomogenaat gedetecteerd. Bovendien is deze fibrinogeen-PAGE-methode tijd- en kostenvriendelijk. Bovendien zou deze methode kunnen worden gebruikt om de fibrinogenolytische agentia van de andere organismen te bestuderen.
Inleiding
In de afgelopen jaren zijn trombotische ziekten als gevolg van de voortdurende opkomst van trombotische ziekten een nieuw groot wereldwijd gezondheidsprobleem geworden1. Op dit moment worden antitrombotica ingedeeld in drie groepen: geneesmiddelen tegen bloedplaatjesaggregatie, anticoagulantia en trombolytica. Onder hen zijn trombolytische geneesmiddelen, zoals urokinase (VK), weefselplasminogeenactivator (tPA), enz., de enige klinisch gebruikte geneesmiddelen die trombus2 kunnen hydrolyseren. Ondertussen worden veiligere en effectievere trombolytische geneesmiddelen ontwikkeld door de identificatie van nieuwe trombolytischemiddelen3.
De identificatie van nieuwe trombolytische middelen is echter tijdrovend en arbeidsintensief, waarbij het vooral gaat om de fasen scheiding/zuivering en karakterisering/controle. De eerste is om elk onderdeel te scheiden, en de laatste is om hun fibrino(geno)lytische activiteiten weer te geven 4,5. Ondanks het feit dat we met succes een nieuw fibrino(geno)lytisch enzym (sFE) uit de pindaworm (Sipunculus nudus) hebben geïsoleerd door middel van affiniteitschromatografie en fibrine(ogen) plaattest 6,7,8, zijn deze processen zo tijdrovend en arbeidsintensief. Eerst moet worden bepaald of de homogenaten van de pindaworm fibrino(geno)lytische activiteit hebben door middel van de fibrine(ogen)plaatmethode en reactieproducten op basis van PAGINA9. Vervolgens moet een reeks chromatografie, zoals ionenuitwisselingschromatografie, gelfiltratiechromatografie, affiniteitschromatografie en andere methoden, worden uitgevoerd voor scheiding en zuivering10,11. Vervolgens wordt de fibrineplaattest opnieuw uitgevoerd om de fibrinogenolytische activiteit van elk afzonderlijk bestanddeel te controleren. Ten slotte worden native-PAGE en natriumdodecylsulfaat (SDS)-PAGE uitgevoerd om het molecuulgewicht van de actieve fibrinogenolytische middelen te bepalen12. Daarom is het van cruciaal belang om de actieve fibrinogenolytische middelen snel te scheiden en weer te geven.
Om de actieve fibrinogenolytische middelen in de pindawormhomogenaten snel te scheiden en weer te geven, werd een nieuwe fibrinogeen-PAGE-methode ontwikkeld door de PAGE- en fibrinogeenplaatmethoden te combineren, d.w.z. dat de substraten van fibrinogenolytische middelen fibrinogeen werden toegevoegd aan de native-PAGE-gel. Na native-PAGE werden de componenten gescheiden op basis van hun molecuulgewicht. Ondertussen kan elke actieve fibrinogenolytische component worden weergegeven door kleuring. Met deze methode hebben we binnen 6 uur met succes meer dan één actief fibrinogenolytisch agens van pindawormhomogenaat gedetecteerd. Bovendien is deze fibrinogeen-PAGE-methode tijd- en kostenvriendelijk. Bovendien zou deze methode kunnen worden gebruikt om de fibrinogenolytische agentia van de andere organismen te bestuderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van het homogenaat van de pindaworm
- Voeg 50 g pindawormen en 150 ml zoutoplossing toe aan de homogenisator.
- Homogeniseren bij 24000 tpm gedurende 60 s.
OPMERKING: Herhaal 3 keer. - Centrifugeer het homogenaat bij 9710 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Verzamel het supernatans als het homogenaat van de pindaworm voor verder onderzoek.
2. Fibrinogeen-PAGE gel preparaat
- Weeg 0,01 g fibrinogeen af in een glazen bekerglas van 50 ml.
- Voeg 1,9 ml DDH2O, 1,3 ml Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) en 0,05 ml SDS (10%, w/v) toe aan het bekerglas; Meng goed door te pipetteren.
- Zet het deksel 30 minuten op 37 °C.
OPMERKING: Deze stap is om het fibrinogeen op te lossen. - Voeg 1,7 ml acrylamide (30%, m/v), 0,05 ml ammoniumpersulfaat (APS; 10%, m/v), 0,002 ml TEMED toe; Meng goed door te pipetteren.
LET OP: Dit is scheidingsgel. - Giet de scheidingsgel in een gelvorm met 10 putjes.
- Voeg 2 ml DDH2O toe aan de gelvorm; Wacht 30 minuten.
- Verwijder het water grondig door de vorm ondersteboven te draaien.
- Voeg 1,4 ml DDH2O, 0,25 ml Tris-HCl (1,0 M, pH 6,8), 0,02 ml SDS (10%, m/v), 0,33 ml acrylamide (30%, m/v), 0,02 ml APS (10%, m/v), 0,002 ml tetramethylethyleendiamine (TEMED) toe aan het bekerglas; Meng goed door te pipetteren.
OPMERKING: Dit is het laden van gel. - Giet de laadgel in dezelfde gelvorm als stap 2.5; Plaats de kam onmiddellijk.
OPMERKING: De fibrinogeen-PAGE-gel die hier wordt gebruikt, is samengesteld uit het fibrinogeen (0,2%) bevattende scheidingsgel en laadgel. De concentratie van fibrinogeen kan naar behoefte worden aangepast.
3. Elektroforese
- Plaats de bereide fibrinogeen-PAGE-gel samen met de lijmvorm in de elektroforesetank; giet 1300 ml elektroforese-oplossing (1,963 g Tris, 12,22 g glycine, 0,65 g SDS en 1300 ml DDH2O) in de tank; Haal de kam eruit.
- Voeg 5 μL 5x niet-denaturerende laadbuffer toe aan de 20 μL sFE en 20 μL pindawormhomogenaat; meng goed door te pipetteren; laad ze in de voorbereide fibrinogeen-PAGE-gel.
NOTITIE: Kook het mengsel niet. sFE is een fibrino(geno)lytisch enzymdat eerder 6,7,8 is geïdentificeerd en in deze studie als positieve controle wordt gebruikt. Pindawormhomogenaat is het monster dat moet worden gedetecteerd. Niet-denaturerende laadbuffer zonder broomfenolblauw, β-mercaptoethanol en SDS vergeleken met de SDS-PAGE-laadbuffer. Elke monsterstrook is gescheiden met de 1x SDS-PAGE-laadbuffer om de beweging van het eiwit duidelijk te detecteren. - Voer elektroforese uit bij 80 V gedurende 30 min, of 120 V gedurende 20 min.
- Haal de fibrinogeen-PAGE gel uit de lijmvorm.
4. Renaturatie
- Breng de fibrinogeen-PAGE-gel over in een plastic doos.
- Voeg 100 ml Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) en 2 ml Triton X-100 toe aan de doos. Plaats het op een shaker op 60-70 tpm gedurende 10 minuten.
- Verwijder de wasbuffer door te pipetteren.
OPMERKING: Herhaal dit drie keer.
5. Incubatie
- Voeg 50 ml Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) toe aan de plastic doos.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 4 uur.
OPMERKING: De incubatietijd kan worden aangepast aan de sterkte van de fibrinogenolytische activiteit.
6. Vlekken
- Verwijder de incubatiebuffer door te pipetteren.
- Voeg 50 ml Coomassie Brillant Blue Staining Solution toe aan de doos en plaats de doos op een shaker op 60-70 rpm gedurende 30 minuten.
7. Ontkleuring
- Verwijder de kleuroplossing door te pipetteren.
- Voeg 50 ml DDH2O toe aan de doos.
- Plaats de doos op een shaker op 60-70 rpm gedurende 30 minuten.
OPMERKING: DD H2O werd hier gebruikt als ontkleuringsoplossing. De schudtijd kan worden aangepast aan de sterkte van de fibrinogenolytische activiteit.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na elektroforese waren alle banden van de marker duidelijk zichtbaar. De 1x SDS-PAGE laadbanen vertoonden slechts 10 kDa banden (broomfenol blauw). De monsters van sFE en pindawormen vertoonden geen waarneembare banden (figuur 1). Hoewel de banden van de monsters niet zichtbaar zijn, gaven de prestaties van de marker en broomfenolblauw aan dat de elektroforese succesvol was en werden de monsters gescheiden op basis van hun molecuulgewicht.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
sFE is een nieuw fibrino(geno)lytisch enzym dat eerder door ons team uit pindawormen werd geïsoleerd 3,6,8,13. De identificatieprocessen van sFE waren echter tijdrovend en arbeidsintensief, waarbij de fibrinogenolytische activiteitsdetectie, de scheiding van eiwitcomponenten en de activiteitsbevestigingsfasen betrokken waren. Als eenvoudige methode wordt de fib...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Bureau voor Wetenschap en Technologie van de stad Xiamen (nr. 3502Z20227197), het Bureau voor Wetenschap en Technologie van de provincie Fujian (nr. 2019J01070; Nr. 2022J01311), en Talenteninnovatie- en ondernemerschapsproject op hoog niveau van het wetenschaps- en technologieplan van Quanzhou (nr. 2022C015R). We danken Fucai Wang (Huaqiao University) en Lei Tong (Huaqiao University) voor hun technische assistentie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | |
| 30% Acrylamide/Bis-acrylamide | Biosharp | BL513B | |
| Ammonium persulfate | XiLONG SCIENTIFIC | 7727-54-0 | |
| Beaker | PYREX | 2-9425-02 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Coomas Brillant Blue Stainning solution | Beyotime | P0017F | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Fibrinogen | Solarbio | F8051 | |
| Gel loading pipette tips, Bulk | Biosharp | BS-200-GTB | |
| Homogenizer | AHS | ATS-1500 | |
| Horizontal rotation oscillator | NuoMi | NMSP-600 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | BIO-RAD | 165-8000~165-8007 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| Pipette Tip (1 mL) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | T-10XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (10µL) | Thermo Fisher Scientific | ZX98775 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Pipettor (50 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY15331 | |
| Refrigerated Centrifuge | cence | H1650R | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | V900859 | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| Tris-HCl | Solarbio | T8230 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
Referenties
- Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
- Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
- Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
- Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
- Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
- Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791(2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631(2023).
- Tang, M., Lin, H., Huang, Y., Xu, R., Cui, X., Yan, H. Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023).
- Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
- Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
- Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764(2023).
- Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920(2021).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
