De betekenis van kleine kolonies in resistentie tegen geneesmiddelen tegen Candida spp. is nog niet volledig onderzocht. Antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) biedt een veelbelovende strategie tegen resistente schimmelinfecties. Deze studie toont aan dat roos bengaal-gemedieerde aPDT Candida glabrata effectief deactiveert en kleine kolonies induceert, wat een unieke procedure oplevert.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Inductie van kleine kolonies in Candida glabraat via Bengaalse rozengemedieerde fotodynamische therapie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Geconfronteerd met een sterftecijfer van 40% bij candidemiepatiënten, blijven resistente Candida en hun kleine mutanten een grote uitdaging voor de behandeling. Antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) richt zich op meerdere schimmelstructuren, in tegenstelling tot antibiotica/antischimmelmiddelen, waardoor resistentie mogelijk wordt gedwarsboomd. Traditionele methoden voor het induceren van kleine kolonies zijn gebaseerd op ethidiumbromide of fluconazol, die de gevoeligheid voor geneesmiddelen en stressreacties kunnen beïnvloeden. Deze studie onderzocht de toepassing van groen licht (piek 520 nm) en rozenbengaalse (RB) fotosensibilisator ter bestrijding van een resistent Candida glabrata-isolaat. De bevindingen toonden aan dat aPDT-behandeling de celgroei aanzienlijk remde (≥99,9% reductie) en effectief de vorming van kleine kolonies induceerde, zoals blijkt uit verminderde omvang en verlies van mitochondriale redoxindicatorkleuring. Deze studie levert het eerste bewijs dat aPDT in vitro kleine kolonies kan induceren in een multiresistente C. glabrata-stam, wat een potentieel transformatieve benadering biedt voor het bestrijden van resistente schimmelinfecties.
Inleiding
Schimmelinfecties, met name die veroorzaakt door Candida albicans en in toenemende mate resistente Candida glabrata, vormen een ernstigewereldwijde bedreiging. Deze infecties kunnen dodelijk zijn, vooral voor gehospitaliseerde patiënten en mensen met een verzwakt immuunsysteem. Toenemende antischimmelresistentie bedreigt de bestrijding van invasieve candidiasis, een ernstige schimmelinfectie met hoge mortaliteit, vooral van Candida albicans2. Resistente stammen belemmeren een effectieve behandeling, waardoor zowel de complexiteit als de sterftecijfers kunnen toenemen. In Alameda County, Californië, VS, is C. glabrata de meest voorkomende invasieve soort geworden3. Deze verschuiving in de prevalentie en verspreiding van Candida-soorten kan worden beïnvloed door lokale gezondheidspraktijken, demografie van patiënten, het gebruik van antischimmelmiddelen en de prevalentie van risicofactoren voor Candida-infecties.
Kleine mutanten in Candida, zonder functionele mitochondriën, laten zien hoe deze organel de geneesmiddelrespons, virulentie en stressbestendigheid beïnvloedt 4,5. C. glabrata vormt deze kolonies gemakkelijk, wordt gevoeliger voor polyenen en verliest het aan azolen6. Azolgevoeligheid en ademhalingsfunctie zijn nauw met elkaar verbonden, waarbij verminderde ademhaling leidt tot resistentie via mitochondriaal DNA-verlies7. Kleine kolonies van C. glabrata met azolresistentie zijn geïsoleerd uit menselijke ontlastingsmonsters van een ontvanger van een beenmergtransplantatie die een behandeling met fluconazol onderging8 en uit bloedkweekflessen van patiënten met bloedbaaninfecties9. Hun mogelijke implicaties voor resistentie tegen geneesmiddelen, virulentie en stressrespons benadrukken hun klinische betekenis. Bovendien maken hun verschillende eigenschappen ze tot waardevolle hulpmiddelen voor het onderzoeken van fundamentele vragen in de mitochondriale biologie5. Naarmate het onderzoek naar kleine mutanten vordert, zullen hun toepassingen in zowel klinisch als fundamenteel onderzoek zich waarschijnlijk uitbreiden.
Deze studie ontdekte dat fotodynamische therapie (PDT) kleine kolonies in C. glabrata kan induceren, waardoor het scala aan methoden wordt uitgebreid buiten de traditionele technieken om C. glabrata bloot te stellen aan ethidiumbromide of fluconazol.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Teelt van C. glabrata
OPMERKING: Een multiresistente C. glabrata (C2-1000907) die resistent is tegen de meeste antischimmelmiddelen, waaronder fluconazol, wordt gebruikt voor de experimenten. Het kan nodig zijn de experimentele omstandigheden aan te passen aan de specifieke stam, aangezien er variaties kunnen bestaan tussen verschillende stammen. Alle experimenten gebruikten log-fase Candida gekweekt bij 25 °C (die een natuurlijke infectie nabootst) voor consistentie. Het ontbreken van hyfen bij C. glabrata vereenvoudigt de kwantificering in vergelijking met C. albicans, die hyfen vormt bij 37 °C10.
- Om een log-fasecultuur van C. glabrata te bereiden, kiest u een enkele kolonie van een agarplaat en brengt u deze over in een glazen reageerbuis met 3 ml steriel gistpeptondextrose (YPD) medium (zie Materiaaltabel). Incubeer gedurende 14-16 uur bij 25 °C met schudden (155 tpm, hoek van 45° om de luchtoverdracht naar het medium te verbeteren).
- Verdun de cultuur na incubatie met verse YPD tot een OD600 van 0,1 met behulp van een steriele techniek. Incubeer bij 25 °C gedurende 6 uur met schudden bij 155 tpm. Controleer de logfase van C. glabrata door de OD600 te meten. Streef naar 0,65-1,00, wat overeenkomt met 1 × 10 7-1,5 × 107 cellen/ml.
2. Inductie van kleine kolonies door ethidiumbromide, fluconazol en fotodynamische therapie
- Ethidiumbromide petite kolonie inductie
- Pas een gistsuspensie aan tot een OD600 van 0,1 (5 × 106 cellen/ml) met YPD tot een eindvolume van 3 ml, voeg vervolgens 30 μl ethidiumbromidebouillon (10 mg/ml) toe (zie materiaaltabel) voor een eindconcentratie van 100 μg/ml.
- Incubeer de gistsuspensie een nacht (16-18 uur) bij 25 °C, 155 tpm, hoek van 45°. Pas aan naar een OD600 van 0,65 (1 × 107 cellen/ml). Voer een 10-voudige verdunningsreeks uit in een plaat met 96 putjes door 20 μl van de aangepaste gistsuspensie toe te voegen aan 180 μl PBS per putje. Hierdoor ontstaan zes verdunningen, variërend van 10-1 tot 10-5.
- Selecteer 4 verdunningsfactoren (bijv. 100, 101, 102 en 103) en plaat 3 druppels (20 μL) elk op 4 kwadranten van YPD-agarplaten (drievoud).
- Broed de platen een nacht uit bij 37 °C. Selecteer kwadranten met 5-80 kolonies uit de eerder gekozen verdunningen voor trifenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuring11 (zie stap 3). Scan platen op 1200 dpi met behulp van een 48-bits full-color optische scanner.
- Fluconazol petite kolonie inductie
OPMERKING: Om het proces te versnellen, gebruikt u T3-cellen (een mengsel van normale en kleine cellen verkregen na 3 RB-PDT-behandelingen; zie stap 2.3) voor de vorming van door fluconazol geïnduceerde kleine kolonies. Dit komt omdat standaardbehandeling doorgaans resulteert in een langzamere vorming.- Bereid een gistcelsuspensie voor en stel deze af zoals beschreven in stap 2.1.1.
- 's Nachts (16-18 uur) bij 25 °C incuberen. Stel de OD600 opnieuw in op 0,1.
- Breng 1 ml van de aangepaste suspensie over in een steriele tube van 5 ml.
- Dompel een steriel wattenstaafje (15 cm lang, met een punt van 0,9 cm x 2,6 cm, zie Materiaaltabel) in de gistsuspensie, zorg ervoor dat het contact maakt met de bodem van de buis en draai om overtollige vloeistof van de buiswand te verwijderen.
- Bereid de platen in de kap voor met behulp van Mueller-Hinton-agar (zie Materiaaltabel).
- Veeg het katoen heen en weer op de agar, draai twee keer 60° en veeg vervolgens de omtrek af voor een gelijkmatige dekking.
- Steriliseer een tang boven een vlam gedurende 1-2 s, laat ze kort afkoelen en gebruik ze vervolgens om de lege schijven op te pakken.
- Verdeel de plaat met behulp van een stift in drie gelijke sectoren. Plaats een lege schijf in het midden van elke sector.
- Voeg 12,5 μl fluconazool (2 mg/ml, zie materiaaltabel) toe aan elke schijf (25 μg/schijf), meng grondig om luchtbellen te voorkomen en incubeer bij 37 °C gedurende 20-24 uur.
- Voer de TTC-kleuring uit (zie stap 3). Scan platen op 1200 dpi met behulp van een 48-bits full-color optische scanner.
- PDT petite kolonie inductie
OPMERKING: Verschillende schimmels kunnen na PDT verschillende aantallen kleine kolonies produceren. Sommige soorten produceren er helemaal geen.- Bereid het aPDT-systeem voor.
OPMERKING: De installatieprocedure voor het aPDT-systeemapparaat volgt de methode gerapporteerd door Hung et al12. Kort gezegd bestaat het aPDT-systeem uit een groene LED-array met een piek van 520 nm (zie Materiaaltabel), die vanaf de onderkant licht schijnt met een goede uitlijning met elk putje van een plaat met 96 putjes. - Stel de gistcelsuspensie in het YPD-medium in op een OD600 van 0,65 (ongeveer 1 × 107 cellen/ml).
- Meng 1 ml van de gistsuspensie met 111 μl 2% bengaalse roos (RB, figuur 1) (zie materiaaltabel) in een buisje met ronde dop om een uiteindelijke RB-concentratie van 0,2% te verkrijgen. Incubeer het mengsel bij 25 °C gedurende 15 minuten en draai het in een hoek van 45° bij 155 tpm.
- Breng het mengsel over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 2,5 minuut (bij kamertemperatuur) op 16.100 x g .
- Gooi het supernatans weg en schraap de buis voorzichtig vijf keer over de vloer van de afzuigkap om de pellet opnieuw te suspenderen.
- Was de suspensie vier keer met 1x PBS om alle RB te verwijderen. Elke wasbeurt wordt gevolgd door resuspensie van de pellet met korte vortexen of pipetteren voor een grondige resuspensie.
- Voeg na de laatste wasbeurt 1000 μL PBS toe. De oplossing is lichtroze van kleur. Breng 200 μl van de gewassen RB-geladen gistsuspensie over naar elk van de drie putjes in een plaat met 96 putjes (drievoud).
- Plaats de plaat met 96 putjes op het fotodynamische lichtsysteem met LED-lampen die van onderaf groen licht schijnen. Schakel de kamerverlichting uit om een gelijkmatige verlichting te garanderen en interferentie te voorkomen. Activeer het LED-lichtsysteem om de PDT-dosis van 4,38 J/cm2 gedurende 2 minuten af te geven; Zorg ervoor dat het systeem goed is uitgelijnd met de putten.
- Verdun na doorstraling de gistsuspensie in een plaat met 96 putjes. Voeg 20 μL gistsuspensie toe aan een putje met 180 μL PBS, waardoor een 10-voudige verdunning ontstaat. Herhaal dit voor de resterende verdunningen om een bereik van 10-1 tot 10-5 te bereiken.
- Kies vier verdunningsfactoren (bijv. 10-2 tot 10-5) op basis van de aanpassing van de gistcelconcentratie.
- Voor elke verdunningsfactor plaat 3 druppels (elk 20 μl) per kwadrant op YPD-agarplaten.
- Nadat de gistsuspensie volledig is geabsorbeerd, ongeveer 10 minuten door de agarplaten, omkeren en een nacht incuberen bij 37 °C.
- Definieer T0 als de ouderlijke controle C. glabrata zonder PDT-behandeling. Bereid T0-schimmels voor in de groeifase van het hout, zoals hierboven beschreven, en stel ze bloot aan 4,38 J/cm2 groen licht in aanwezigheid van 0,2% RB. Deze PDT-aandoening remt consequent 3 tot 3,5 logs schimmelgroei.
- Duid de overleefde schimmels aan als T1 en stel ze opnieuw bloot aan dezelfde PDT-dosis nadat ze in vitro zijn uitgebreid tot een loggroeifase. De overlevende schimmels na de tweede PDT worden aangeduid als T2, enzovoort.
- Kies de volgende dag kwadranten met kolonietellingen tussen 5 en 80. Tel het aantal kolonies in elk kwadrant en bereken de titer met de volgende formule: Kolonievormende eenheid (CFU)/ml = Aantal kolonies (gemiddelde van drievoud) × verdunningsfactor × 50.
- Voer de TTC-kleuring uit (zie stap 3). Scan de plaat zoals eerder beschreven (stap 2.2).
- Bereid het aPDT-systeem voor.
3. Mitochondriale functieanalyse (TCC-kleuringstest)
OPMERKING: TTC is een redoxindicator en een elektronenacceptor. Het wordt rood wanneer witte verbindingen worden gebroken door elektronen11. Merk op dat niet alle cellen noodzakelijkerwijs zichtbare kolonies vormen binnen 24 uur na het kweken op een agarplaat. Kolonies met functionele mitochondriën worden rood, terwijl die met niet-functionele mitochondriën wit blijven. Dit maakt differentiatie mogelijk tussen kolonies met verschillende mitochondriale functionaliteit.
- Verdun na de behandeling Candida suspensies op YPD-agarplaten volgens de gewenste celdichtheid om duidelijke kolonies te verkrijgen voor eenvoudige visualisatie en kleuring.
- Na 24 uur groei bij 37 °C worden zichtbare kolonies gevormd uit een enkele cel. Pipetteer 20 μL 20% TTC rechtstreeks op het midden van elke kolonie.
- Na volledige absorptie, ongeveer 10 minuten TTC door de kolonies, incuberen bij 37 °C gedurende 30-40 minuten.
4. Groeikinetiek van normale en tengere C. glabrata
OPMERKING: Drie giststammen werden vergeleken: C. glabrata C2-1000907 T0 (klinisch isolaat zonder PDT-behandeling), T3n (C. glabrata C2-1000907 na 3 opeenvolgende RB-PDT-kolonies met een gemiddelde diameter van 1,5 ± 0,8 mm vergelijkbaar met de oudercellen), en T3p (kleine kolonies van C. glabrata C2-1000907 na 3 opeenvolgende RB-PDT).
- Stel de gistcelsuspensie in YPD-medium in op een OD600 van 0,1 (5 × 106 cellen/ml) in een buisje van 3 ml.
- Meet automatisch de OD600 van de statische cultuur elke 20 minuten met behulp van de multi-mode microplaatlezer (zie Materiaaltabel) gedurende 24 uur.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde met ± standaardfout en zijn verkregen uit drie onafhankelijke experimenten, met ten minste drievouden in elke groep. Experimentele gegevens, waaronder kolonietellingen, OD600-metingen en TTC-kleuringsresultaten, werden in een grafiek weergegeven en statistisch geanalyseerd met behulp van grafische en statistische software (zie Materiaaltabel). Eenrichtings-ANOVA of t-test werd gebruikt om de gegevens te analyseren en een p-waarde...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze studie onthult PDT als de eerste gerapporteerde methode om de vorming van kleine kolonies in Candida te induceren, en overtreft de gevestigde effecten van ethidiumbromide en fluconazol. Deze nieuwe waarneming vereist verder onderzoek om de implicaties ervan te ontrafelen voor zowel de uitroeiing van schimmels door het verminderen van virulentie als de opkomst van resistentiemechanismen.
RB-gemedieerde PDT remt effectief de groei van C. glabrata, wat een mogelijke alternatieve beh...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
Dit werk heeft financiering ontvangen van het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan [MOST 110-2314-B-006-086-MY3], National Cheng Kung University [K111-B094], [K111-B095], National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11204031], [NCKUMCS2022057].
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.22 μm filter | Merck, Taipei, Taiwan | Millex, SLGVR33RS | |
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, VS | #3745 | |
| 20% Trifenyltetrazoliümchloride (TTC) | Sigma-Aldrich, MO, VS | T8877 | |
| 5 mL polypropyleen ronde bodem buis | Corning, AZ, VS | 352059 | |
| 5 mL ronde bodem buis met celstrainer dop | Corning, AZ, VS | Falcon, #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Agar | BRS, Tainan, Taiwan | AG012 | |
| Blanco schijf | Advantec, Tokyo, Japan | 49005040 | |
| Centrifuge | Eppendorf, VK | 5415R | |
| Ethidiumbromide oplossing | Sigma-Aldrich, MO, VS | E1510 | |
| Fluconazol, 2 mg/mL | Pfizer, NY, VS | BC18790248 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Versie 7.0 | |
| Groen licht emitterende diode (LED) strip | Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan | 5050 | Excitatiegolf: 500~550 nm |
| Koud temperatuur. schudden Incubators | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
| Mondverzorging katoenen watten | Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan | 161357 | |
| Muller Hinton II agar | BD biosciences, California, VS | 211438 | |
| Multimode microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3x | |
| OD600 spectrofotometer | Biochrom, Londen, VK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, VS | 330000 | voorraadconcentratie 40 mg/mL = 4%, bereid in PBS, bewaard bij 4 °C |
| Gesteriliseerde glazen buis | Sunmei, Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Gist Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
Referenties
- Soriano, A., et al. Invasive candidiasis: current clinical challenges and unmet needs in adult populations. J Antimicrob Chemother. 78 (7), 1569-1585 (2023).
- Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nat Rev Dis Primers. 4, 18026(2018).
- Meyahnwi, D., Siraw, B. B., Reingold, A. Epidemiologic features, clinical characteristics, and predictors of mortality in patients with candidemia in Alameda County, California; a 2017-2020 retrospective analysis. BMC Infect Dis. 22 (1), 843(2022).
- Whittaker, P. A. The petite mutation in yeast. Subcell Biochem. 6, 175-232 (1979).
- Hatab, M. A., Whittaker, P. A. Isolation and characterization of respiration-deficient mutants from the pathogenic yeast Candida albicans. Antonie Van Leeuwenhoek. 61 (3), 207-219 (1992).
- Defontaine, A., et al. In-vitro resistance to azoles associated with mitochondrial DNA deficiency in Candida glabrata. J Med Microbiol. 48 (7), 663-670 (1999).
- Brun, S., et al. Relationships between respiration and susceptibility to azole antifungals in Candida glabrata. Antimicrob Agents Chemother. 47 (3), 847-853 (2003).
- Bouchara, J. P., et al. In-vivo selection of an azole-resistant petite mutant of Candida glabrata. J Med Microbiol. 49 (11), 977-984 (2000).
- Badrane, H., et al. Genotypic diversity and unrecognized antifungal resistance among populations of Candida glabrata from positive blood cultures. Nat Commun. 14 (1), 5918(2023).
- Shantal, C. -J. N., Juan, C. -C., Lizbeth, B. -U. S., Carlos, H. -G. J., Estela, G. -P. B. Candida glabrata is a successful pathogen: An artist manipulating the immune response. Microbiol Res. 260, 127038(2022).
- Gamarra, S., Mancilla, E., Dudiuk, C., Garcia-Effron, G. Candida dubliniensis and Candida albicans differentiation by colony morphotype in Sabouraud-triphenyltetrazolium agar. Rev Iberoam Micol. 32 (2), 126-128 (2015).
- Hung, J. H., et al. Rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit Candida albicans. J Vis Exp. (181), e63558(2022).
- Cardoso, D. R., Franco, D. W., Olsen, K., Andersen, M. L., Skibsted, L. H. Reactivity of bovine whey proteins, peptides, and amino acids toward triplet riboflavin as studied by laser flash photolysis. J Agric Food Chem. 52 (21), 6602-6606 (2004).
- Hall, R. M., Trembath, M. K., Linnane, A. W., Wheelis, L., Criddle, R. S. Factors affecting petite induction and the recovery of respiratory competence in yeast cells exposed to ethidium bromide. Mol Gen Genet. 144 (3), 253-262 (1976).
- Chen, X. J., Clark-Walker, G. D. The petite mutation in yeasts: 50 years on. Int Rev Cytol. 194, 197-238 (2000).
- Piskur, J. Inheritance of the yeast mitochondrial genome. Plasmid. 31 (3), 229-241 (1994).
- Wong, T. W., Wang, Y. Y., Sheu, H. M., Chuang, Y. C. Bactericidal effects of toluidine blue-mediated photodynamic action on Vibrio vulnificus. Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 895-902 (2005).
- Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant Staphylococcus aureus drug resistance. J Clin Med. 8 (3), 411(2019).
- Warrier, A., Mazumder, N., Prabhu, S., Satyamoorthy, K., Murali, T. S. Photodynamic therapy to control microbial biofilms. Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102090(2021).
- Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011(2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
