Isolatie van adeno-geassocieerde virale vectoren door middel van een eenstaps en semi-geautomatiseerd heparine-affiniteitschromatografieprotocol

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor het genereren en zuiveren van adeno-geassocieerde virale vectoren met behulp van een geoptimaliseerde op heparine gebaseerde affiniteitschromatografiemethode. Het biedt een eenvoudige, schaalbare en kosteneffectieve aanpak, waardoor ultracentrifugatie niet nodig is. De resulterende vectoren vertonen een hoge zuiverheid en biologische activiteit, wat hun waarde bewijst in preklinische studies.

Samenvatting

Adeno-geassocieerd virus (AAV) is een steeds waardevollere vector geworden voor in vivo genafgifte en ondergaat momenteel klinische proeven bij mensen. De veelgebruikte methoden om AAV's te zuiveren maken echter gebruik van ultracentrifugatie met cesiumchloride of jodixanoldichtheidsgradiënt. Ondanks hun voordelen zijn deze methoden tijdrovend, hebben ze een beperkte schaalbaarheid en resulteren ze vaak in vectoren met een lage zuiverheid. Om deze beperkingen te overwinnen, richten onderzoekers hun aandacht op chromatografietechnieken. Hier presenteren we een geoptimaliseerd op heparine gebaseerd affiniteitschromatografieprotocol dat dient als een universele opnamestap voor de zuivering van AAV's.

Deze methode is gebaseerd op de intrinsieke affiniteit van AAV-serotype 2 (AAV2) voor heparansulfaatproteoglycanen. Concreet omvat het protocol de co-transfectie van plasmiden die coderen voor de gewenste AAV-capside-eiwitten met die van AAV2, wat mozaïek AAV-vectoren oplevert die de eigenschappen van beide ouderlijke serotypen combineren. Kortom, na de lysis van producentencellen wordt een mengsel met AAV-deeltjes direct gezuiverd volgens een geoptimaliseerd eenstaps heparine-affiniteitschromatografieprotocol met behulp van een standaard Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)-systeem. Gezuiverde AAV-deeltjes worden vervolgens geconcentreerd en onderworpen aan een uitgebreide karakterisering in termen van zuiverheid en biologische activiteit. Dit protocol biedt een vereenvoudigde en schaalbare aanpak die kan worden uitgevoerd zonder de noodzaak van ultracentrifugatie en gradiënten, wat schone en hoge virale titers oplevert.

Inleiding

De vector van het adeno-geassocieerde virus (AAV) verovert zijn weg als een van de meest veelbelovende afgiftesystemen in de huidige gentherapiestudies. AAV, oorspronkelijk geïdentificeerd in 1965¹, is een klein, niet-omhuld virus, met een icosahedrale eiwitcapside met een diameter van ongeveer 25 nm, met een enkelstrengs DNA-genoom. AAV's behoren tot de familie Parvoviridae en tot het geslacht Dependoparvovirus vanwege hun unieke afhankelijkheid van co-infectie met een helpervirus, zoals het herpes simplex-virus of, vaker, adenovirus, om hun lytische cyclus te voltooien ^2,3.

Het 4,7 kilobase genoom van AAV's bestaat uit twee open leesframes (ORF's) geflankeerd door twee omgekeerde terminale herhalingen (ITR's) die karakteristieke T-vormige haarspelduiteinden vormen⁴. ITR's zijn de enige cis-acterende elementen die cruciaal zijn voor AAV-verpakking, replicatie en integratie, en zijn daarom de enige AAV-sequenties die worden bewaard in recombinante AAV (rAAV)-vectoren. In dit systeem worden de genen die nodig zijn voor de productie van vectoren afzonderlijk geleverd, in trans, waardoor het gen van belang in de virale capside kan worden verpakt ^5,6.

Elk viraal gen codificeert verschillende eiwitten door middel van alternatieve splitsing en startcodons. Binnen de Rep ORF zijn vier niet-structurele eiwitten (Rep40, Rep52, Rep68 en Rep78) gecodeerd, die een cruciale rol spelen bij replicatie, plaatsspecifieke integratie en inkapseling van viraal DNA ^7,8. De Cap ORF dient als een sjabloon voor de expressie van drie structurele eiwitten die van elkaar verschillen aan hun N-terminus, (VP1, VP2 en VP3), die zich samenvoegen om een virale capside van 60 miljoen te vormen in een verhouding van 1:1:10 ^4,9. Bovendien codeert een alternatieve ORF genesteld in het Cap-gen met een niet-conventioneel CUG-startcodon voor een assemblage-activerend eiwit (AAP). Van dit nucleaire eiwit is aangetoond dat het interageert met de nieuw gesynthetiseerde capside-eiwitten VP1-3 en de capside-assemblage bevordert^10,11.

Verschillen in de aminozuursequentie van de capside zijn verantwoordelijk voor de 11 natuurlijk voorkomende AAV-serotypen en meer dan 100 varianten geïsoleerd uit menselijke en niet-menselijke primatenweefsels ^7,12,13. Variaties in de conformatie van structureel variabele regio's bepalen de verschillende antigene eigenschappen en receptorbindende specificiteiten van capsiden van verschillende stammen. Dit resulteert in verschillende weefseltropismen en transductie-efficiënties in verschillende zoogdierorganen¹⁴.

Vroege productiemethoden van rAAV's waren gebaseerd op adenovirusinfectie voor hulpdoeleinden 15,16,17,18,19. Ondanks dat het efficiënt is en meestal gemakkelijk op grote schaal te produceren, ontstaan er verschillende problemen door deze infectie. Zelfs na de zuivering en een warmtedenaturerende stap voor inactivatie kunnen adenovirale deeltjes nog steeds aanwezig zijn in AAV-preparaten, wat een ongewenst veiligheidsprobleem vormt²⁰. Bovendien is de aanwezigheid van gedenatureerde adenovirale eiwitten onaanvaardbaar voor klinisch gebruik. Andere productiestrategieën maken gebruik van recombinante herpes simplex-virusstammen die zijn ontworpen om de Rep/Cap en het transgen in de doelcellen^{te brengen 21} of van het baculovirus-insectcelsysteem²². Hoewel deze systemen voordelen bieden op het gebied van schaalbaarheid en GMP-compatibiliteit, hebben ze nog steeds te maken met vergelijkbare problemen.

De drievoudige transfectiemethode voor de productie van rAAV is algemeen toegepast om deze problemen gemakkelijk op te lossen. Kort gezegd is de rAAV-assemblage gebaseerd op de voorbijgaande transfectie van cellen met drie plasmiden die coderen voor: 1) de transgenexpressiecassette verpakt tussen de ITR's van het wildtype AAV2-genoom (pITR); 2) de Rep/Cap-sequenties die nodig zijn voor replicatie en virionassemblage (pAAV-RC); en 3) de minimale adenovirale eiwitten (E1A, E1B, E4 en E2A) samen met de adenovirus-geassocieerde RNA's die nodig zijn voor het helpereffect (pHelper)^6,20,23. Hoewel plasmidetransfectiemethoden eenvoud en flexibiliteit bieden voor de productie van rAAV in preklinische studies, hebben deze procedures beperkingen op het gebied van schaalbaarheid en reproduceerbaarheid wanneer ze worden toegepast op grootschalige productie. Als alternatieve benadering kan rAAV-productie worden bereikt door het gebruik van AAV-producentcellijnen (van zowel adherente als suspensiegroei), die stabiel ofwel AAV Rep/Cap-genen ofwel Rep/Cap in combinatie met vectorconstructen tot expressie brengen. In deze systemen worden de adenovirale helpergenen geïntroduceerd via plasmidetransfectie. Hoewel deze strategie de schaalbaarheid van het celkweekproces verbetert, is het technisch complex en tijdrovend 21,24,25.

In beide gevallen worden de productiecellen vervolgens gelyseerd en onderworpen aan een of meerdere zuiveringsstappen. Momenteel omvatten de belangrijkste methoden voor het zuiveren van rAAV's het gebruik van cesiumchloride (CsCl) of jodixanol ultrasnelle dichtheidsgradiëntcentrifugatie, al dan niet gevolgd door chromatografietechnieken²⁶. Het oorspronkelijke zuiveringsschema voor virale precipitatie gebruikte ammoniumsulfaat, gevolgd door twee of drie rondes van ultracentrifugatie door een CsCl-gradiënt. De belangrijkste voordelen van dit proces zijn de mogelijkheid om alle serotypen te zuiveren en de mogelijkheid om volledige deeltjes fysiek te scheiden van lege capsiden op basis van hun verschillende dichtheden. Deze methode is echter uitgebreid, tijdrovend en heeft een beperkte schaalbaarheid, wat vaak resulteert in een slechte opbrengst en een lage monsterkwaliteit 27,28,29,30. Bovendien is dialyse tegen een fysiologische buffer vaak nodig vóór in vivo studies vanwege de toxische effecten die CsCl op zoogdieren kan uitoefenen.

Iodixanol is ook gebruikt als een alternatief iso-osmotisch gradiëntmedium om rAAV-vectoren te zuiveren, met voordelen ten opzichte van CsCl vanuit zowel het oogpunt van veiligheid als vanuit het oogpunt van vectorpotentie. Net als CsCl heeft de jodixanolmethode echter enkele nadelen met betrekking tot de laadcapaciteit van celcultuurlysaat (en dus de schaalbaarheid van rAAV-zuivering) en blijft het een tijdrovende en dure methode^30,31.

Om deze beperkingen te overwinnen, richtten onderzoekers hun aandacht op chromatografietechnieken. In dit verband zijn verschillende zuiveringsbenaderingen ontwikkeld die ofwel affiniteits-, hydrofobe of ionenuitwisselingschromatografiemethoden bevatten. Deze methoden zijn gebaseerd op de biochemische eigenschappen van een bepaald serotype, inclusief hun natuurlijke receptoren, of de ladingskenmerken van het virale deeltje³². De ontdekking dat AAV2, AAV3, AAV6 en AAV13 bij voorkeur binden aan heparansulfaatproteoglycanen (HSPG), opende bijvoorbeeld de mogelijkheid om het nauw verwante heparine te gebruiken bij affiniteitschromatografiezuivering. De bindingsplaatsen aan HSPG kunnen echter verschillen tussen serotypen, waardoor AAV-hechting en infectie van doelcellen op verschillende manieren worden bemiddeld 2,33,34,35,36. Aan de andere kant binden AAV1, AAV5 en AAV6 aan N-gebonden siaalzuur (SA), terwijl AAV4 O-gebonden SA ^2,14,34 gebruikt. Volgens dezelfde redenering is ook een eenstaps affiniteitschromatografieprotocol voor de zuivering van rAAV5 ontwikkeld op basis van het gebruik van mucine, een zoogdiereiwit dat sterk verrijkt is met SA³⁷. Net als technieken op basis van heparine is deze zuivering ook afhankelijk van het specifieke serotype dat wordt gegenereerd. Afgezien van heparine en mucine zijn andere liganden onderzocht voor affiniteitschromatografie, zoals het A20 monoklonale antilichaam en kameelachtige single-domain antilichamen (AVB Sepharose en POROS CaptureSelect)22,23,38,39,40,41. Andere innovatieve strategieën om de eerder bestaande zuiveringsmethoden te verbeteren, zijn de introductie van kleine modificaties in de rAAV-capside om specifieke bindende epitopen te presenteren. Hexa-histidine-gelabelde of gebiotinyleerde rAAV's kunnen bijvoorbeeld worden gezuiverd met behulp van liganden die zich richten op die epitopen (respectievelijk nikkelnitrilotriazijnzuur en avidineharsen)42,43,44.

In een poging om de gewenste kenmerken van rAAV's te verbreden, hebben onderzoekers de virionen getravestied door hun capsiden te mengen. Dit wordt bereikt door het capside-gen tijdens de productie te leveren van twee verschillende AAV-serotypen in equimolaire of verschillende verhoudingen, waardoor een capsidestructuur ontstaat die is samengesteld uit een mengsel van capside-subeenheden van verschillende serotypen 34,45,46,47,48,49,50. Eerdere studies leveren fysiek bewijs dat het gelijktijdig tot expressie brengen van capside-eiwitten van AAV2 met AAV1 (1:1-verhouding) en AAV2 met AAV9 (1:1-verhouding) resulteert in het genereren van mozaïek-rAAV1/2- en rAAV2/9-vectoren, respectievelijk 45,46,48. Een groot voordeel van het genereren van mozaïek rAAV's is het vermogen om voordelige eigenschappen van verschillende AAV-serotypen te integreren, wat resulteert in synergetische verbeteringen in transgenexpressie en tropisme, terwijl andere eigenschappen die nuttig zijn tijdens de productie van rAAV behouden blijven. Interessant is dat bepaalde mozaïekvarianten zelfs nieuwe eigenschappen vertonen die verschillen van beide ouderlijke virussen 46,47,49. Door gebruik te maken van het heparinebindende vermogen van AAV2, kunnen mozaïek rAAV-vectoren mogelijk worden gegenereerd en gezuiverd door AAV2 te mengen met andere natuurlijke of nieuwe AAV-capsiden die worden gegenereerd door gerichte evolutie en/of rationeel ontwerp. Desalniettemin hebben eerdere studies het belang van compatibiliteit van capside-subeenheden benadrukt bij het proberen om mozaïekvectoren samen te stellen. Rabinowitz en collega's toonden bijvoorbeeld aan dat hoewel de transcapsidatie van AAV1, AAV2 en AAV3 leidde tot een efficiënte co-assemblage van mozaïekcapsiden, de tradressing van deze serotypen met AAV4 de generatie van stabiele virionen belemmerde 34,45,47. Bovendien vertoonden AAV1, AAV2 en AAV3 een lage compatibiliteit met AAV5, gezien de verminderde virale titers die werden verkregen bij het mengen van deze capsiden in verschillende verhoudingen. Interessant is dat mozaïek rAAV2/5 verminderde heparinebindende eigenschappen vertoonde, terwijl het mucinebindende vermogen zoals ouderlijke AAV5 behouden bleef. Echter, rAAV3/5 in een verhouding van 3:1 behield de dubbele binding aan heparine en mucine. Over het algemeen zou het genereren van nieuwe mozaïek rAAV's met verbeterde transductie, specifiek tropisme of lage immunogeniciteit veel baat kunnen hebben bij ons begrip van capside-assemblage en receptorinteracties, waarbij specifieke combinaties nog steeds grondig onderzoek en optimalisatie vereisen.

In dit werk beschrijven we een stapsgewijs protocol voor de productie en zuivering van rAAV's met behulp van een geoptimaliseerde heparine-affiniteitschromatografiemethode. rAAV's worden geproduceerd door transiënte transfectie en worden gezuiverd met behulp van een Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)-systeem. Na de concentratie van geselecteerde gezuiverde fracties worden de resulterende virale voorraden gekarakteriseerd in termen van titer, zuiverheid, intrinsieke fysische eigenschappen en biologische activiteit in vitro en in vivo. Als proof of concept demonstreren we de verbeteringen en toepasbaarheid van dit protocol voor het genereren van mozaïek rAAV1/2 en rAAV2/9 vectoren. De keuze van elk serotype was gebaseerd op hun opvallend verschillende tropismen, die mogelijk ook hun unieke kenmerken aan de mozaïekversies verleenden. AAV-serotype 1, met een algemeen matig tropisme voor het centrale zenuwstelsel (CZS), heeft het vermogen om neuronen en glia te transduceren (in mindere mate) en ondergaat axonaal transport in anterograde en retrograde richting in vivo ^2,7,8. Bovendien werd AAV-serotype 9 gekozen vanwege zijn natuurlijke vermogen om de bloed-hersenbarrière te passeren en zich op het CZS te richten bij zowel neonatale als volwassen muizen^51,52. Ten slotte werd AAV-serotype 2 geselecteerd gezien het vermogen om te binden aan heparine, waardoor affiniteitschromatografie mogelijk^{is 33}. De gezuiverde rAAV1/2- en rAAV2/9-deeltjes combineren de eigenschappen van beide ouderlijke AAV-serotypen en vormen daarom geschikte vectoren voor de transductie van het CZS 45,46,48,49.

Protocol

OPMERKING: Zie figuur 1 voor een illustratie van de samenvatting van het protocol. Zie de materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, instrumenten en reagentia die in dit protocol worden gebruikt. Alle werkzaamheden waarbij cellen en virussen betrokken zijn, moeten worden uitgevoerd in speciale bioveiligheidskasten en incubatoren, gescheiden van die welke regelmatig worden gebruikt voor het onderhoud van cellijnen. De apparatuur en reagentia die in contact komen met gekweekte cellen en virussen moeten steriel zijn. Het is van essentieel belang dat de verwijdering van gevaarlijke reagentia en met virussen besmette materialen wordt uitgevoerd in overeenstemming met de veiligheidsinformatiebladen en in overeenstemming met de nationale wetten en richtlijnen die worden verstrekt door het milieu-, gezondheids- en veiligheidsbureau van elke instelling. Vanaf april 2019 categoriseren de NIH-richtlijnen voor onderzoek met recombinante of synthetische nucleïnezuurmoleculen alle AAV-serotypen als risicogroep 1-middelen (niet geassocieerd met ziekte bij gezonde volwassen mensen), evenals recombinante of synthetische AAV-constructen. Deze classificatie is van toepassing wanneer het transgen niet codeert voor een potentieel tumorigene genproduct of een toxine, en de constructen worden geproduceerd zonder een helpervirus.

Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de communautaire richtlijn van de Europese Unie (2010/63/EU) voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, die in 2013 in de Portugese wet is omgezet (wetsdecreet 113/2013). Bovendien werden dierprocedures goedgekeurd door de Verantwoordelijke Organisatie voor het Dierenwelzijn van de Faculteit Geneeskunde en het Centrum voor Neurowetenschappen en Celbiologie van de gelicentieerde dierenfaciliteit van de Universiteit van Coimbra. De onderzoekers kregen een adequate opleiding (FELASA-gecertificeerde cursus) en certificering van de Portugese autoriteiten (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Lissabon, Portugal) om de experimenten uit te voeren.

1. Plasmide constructies

1. Volg de instructies van de fabrikant van een maxiprep-endotoxinevrije kit om substantiële hoeveelheden DNA van de volgende plasmiden te isoleren en te zuiveren: i) pITR: de overdrachtsvector van belang; ii) pAAV-RC-plasmide: pRV1, dat de AAV2 Rep- en Cap-sequenties ³⁶ bevat; iii) pAAV-RC-plasmide: pH21, dat de AAV1 Rep- en Cap-sequenties ³⁶ bevat; iv) pAAV-RC-plasmide: pAAV2/9n, dat de AAV2 Rep- en AAV9 Cap-sequenties bevat; v) pHelper: pFdelta6, Adenovirus-helper plasmide³⁶.
2. Screen de integriteit van de gegenereerde plasmiden door de aanbevolen enzymatische beperkingen uit te voeren³⁶. Bewaak de integriteit van pITR-plasmiden door vertering met SmaI, een restrictie-endonuclease, dat twee keer snijdt binnen een onstabiel deel van de ITR's^53,54.
   OPMERKING: Aangezien de ITR's zeer onstabiel zijn en vatbaar voor deleties, wordt het gebruik van SURE 2 supercompetente cellen aanbevolen om recombinatie op deze plaatsen tot een minimum te beperken.

2. Celcultuur

1. Kweek menselijke embryonale nier 293, waarbij de SV40 grote T-antigeen (HEK293T) cellijn stabiel tot expressie wordt gebracht in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hoge glucose, aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine, bij 37 °C, onder een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂, als uitgangspunt voor de volgende stappen.
2. Subcultuur van de cellen met behulp van steriele 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4, om de cellen te wassen voordat 0,05% trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) wordt toegevoegd.
   OPMERKING: Vermijd het gebruik van cellen die een buitensporig aantal passages hebben ondergaan (maximaal 20). Test regelmatig celculturen op mycoplasma-contaminatie.

3. rAAV-productie door voorbijgaande transfectie

1. Dag 1: Cel plateren
   1. Plaat HEK293T voor elke virale productie de cellen in 10 behandelde kweekschaaltjes (15 cm diameter) de dag vóór transfectie, met een dichtheid van 10,5 × 10⁶ cellen per schaaltje in 22 ml gesupplementeerd kweekmedium en incubeer gedurende 24 uur totdat de cellen voor 70%-80% samenvloeien en klaar zijn voor transfectie.
2. Dag 2: Celtransfectie met behulp van polyethylenimine (PEI)
   1. Voor elke virale productie (overeenkomend met 10,5 schaaltjes) wordt het volgende transfectiemengsel in een microcentrifugebuisje aangebracht: 54,6 μg pITR; 45.675 μg pRV1; 45,675 μg pH21 of pAAV2/9n; 109,2 μg pFdelta6. Meng door te tikken.
   2. Voeg het mengsel toe aan 4,557 ml niet-aangevuld DMEM in een centrifugebuisje van 50 ml. Meng door te tikken.
   3. Voeg druppel voor druppel 1,365 ml steriele PEI-oplossing toe van 1 mg/ml (pH 7,4). Meng door te tikken. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de vorming van DNA-PEI-complexen mogelijk te maken.
   4. Voeg dit mengsel toe aan 231 ml voorverwarmde gesupplementeerde DMEM. Vervang het hele kweekmedium van elk gerecht door 22 ml van dit transfectiemengsel. Incubeer de cellen gedurende 48 uur.
      OPMERKING: Deze stap moet met zorg worden uitgevoerd om celloslating te voorkomen.
3. Dag 4: Cel oogst
   1. Wanneer de pITR codeert voor een fluorescerende reporter, visualiseer je de getransfecteerde cellen onder een fluorescentiemicroscoop.
   2. Verzamel het medium van elke schaal in centrifugebuisjes van 50 ml en centrifugeer ze gedurende 10 minuten op 800 × g . Gooi het supernatant weg.
      OPMERKING: Deze stap is optioneel en is bedoeld om getransfecteerde cellen te herstellen die mogelijk zijn losgekomen als gevolg van een zeer hoge confluentie.
   3. Voeg 10 ml voorverwarmde PBS toe aan elk bord. Verwijder de cellen voorzichtig met een celschraper en vang de suspensie op in de centrifugebuisjes van 50 ml uit stap 3.3.2.
   4. Was 5 vaat per keer met een extra 10 ml PBS en breng de suspensie over in de centrifugebuisjes van 50 ml uit stap 3.3.3. Pelleteer de cellen bij 800 × g gedurende 10 minuten en gooi het supernatant weg.
   5. Vries de celpellets in bij -80 °C.
      OPMERKING: Celpellets kunnen enkele maanden worden bewaard (pauzepunt).

4. rAAV-extractie en FPLC-zuivering

1. Dag 5: Bereiding van cellysaat
   1. Ontdooi de celpellets bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen die zijn verzameld uit de 10 schaaltjes in 100 ml van een steriele buffer met 150 mM natriumchloride (NaCl) en 20 mM Tris, pH 8,0, in ultrapuur (type I) water. Meng de suspensie door op en neer te pipetteren om een homogene suspensie te garanderen.
   2. Voeg 12,5 ml van een vers bereide steriele oplossing van 10% natriumdeoxycholaat toe in ultrapuur water om cellyse te induceren. Meng door op en neer te pipetteren.
      OPMERKING: Gooi natriumdeoxycholaat weg, evenals de materialen die ermee in contact komen, in overeenstemming met het veiligheidsinformatieblad en de richtlijnen van het milieugezondheids- en veiligheidsbureau van de instelling. Het wordt ook aanbevolen om een gezichtsmasker te dragen tijdens het hanteren van dit poeder. Na het mengen wordt de oplossing zeer stroperig.
   3. Voeg 27 μL benzonasenuclease toe aan het vorige mengsel. Meng grondig door op en neer te pipetteren totdat het monster niet meer stroperig is. Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur en voer elke 10 minuten een vortex uit.
      OPMERKING: Deze endonuclease is in staat om alle vormen van DNA en RNA efficiënt af te breken zonder enige proteolytische activiteit te vertonen.
   4. Verwijder celresten door het mengsel 60 minuten bij 25 °C te centrifugeren bij 3.000 × g . Filtreer het supernatans met een 0,45 μm steriel polyvinylideendifluoride (PVDF) spuitfilter en breng het over in een nieuwe steriele container.
      OPMERKING: Deze belangrijke stap zorgt ervoor dat het meeste cellulaire afval wordt verwijderd, waardoor verstopping van chromatografiekolommen wordt voorkomen. Bewaar een kleine hoeveelheid van dit mengsel voor analyse (optionele stap).
2. Dag 5 (vervolg): Heparinekolomzuivering van rAAV's
   NOTITIE: Monstertoepassing kan worden uitgevoerd met behulp van een monsterpomp of een superloop van 50 ml of 150 ml als onderdeel van het systeem. Aangezien er bij lagere temperaturen meer lucht wordt opgelost, is het belangrijk om de buffers en oplossingen (meestal opgeslagen bij 4 °C) voldoende tijd te geven om aan kamertemperatuur te acclimatiseren voordat ze in het FPLC-systeem worden gebruikt.
   1. Optioneel: Als het systeem gedurende lange perioden is opgeslagen, vul dan het systeem en alle inlaten met vers bereide opslagoplossing (20% ethanol) met behulp van handmatige instructies of een vooraf gedefinieerde systeemreinigingsmethode (systeem-CIP).
   2. Was het vloeistofstroompad volledig met steriel ultrapuur water met behulp van handmatige instructies of een vooraf gedefinieerde CIP-methode van het systeem.
   3. Sluit een voorverpakte heparinekolom van 1 ml aan, stel het drukalarm in en was met vijf kolomvolumes (CV's) ultrapuur water met een debiet van 1 ml/min.
   4. Schakel de oplossingen in de bufferbak over van ultrapuur water naar buffer A (steriele oplossing van 100 mM NaCl en 20 mM Tris, pH 8, in ultrapuur water) voor inlaat A (systeempomp A) en naar buffer B (steriele oplossing van 500 mM NaCl en 20 mM Tris, pH 8, in ultrapuur water) voor inlaat B (systeempomp B). Als het systeem een bemonsteringspomp heeft, plaatst u de bufferinlaat van de bemonsteringsinlaatklep in buffer A.
   5. Was de systeempomp B met buffer B en vul de rest van het vloeistofstroompad met buffer A.
      NOTITIE: Koppel indien nodig de kolom los van het stroompad en sluit deze daarna weer aan.
   6. Plaats een monsterinlaatslang van de monsterinlaatklep, bijvoorbeeld S1, in de container met het virale preparaat dat in stap 4.1.4 is verkregen. (van het preparaat van cellysaat). Vul het stroompad van monsterinlaat S1 naar de injectieklep voor met de monsteroplossing. U kunt ook een superloop van 50 ml of 150 ml vullen met het monster dat rAAV's bevat met behulp van een spuit van 50 ml.
   7. Breng de kolom in evenwicht met een totaal volume van vijf CV's met behulp van 12,5% buffer B met een snelheid van 1 ml/min.
   8. Breng het totale volume van het monster aan in de kolom met behulp van de monsterpomp (selecteer injecteer alle monsters met behulp van de luchtsensor) of de superloop met 0.5 ml/min en verzamel de doorstroom met behulp van de uitlaatpoort in een nieuwe steriele container.
      NOTITIE: Wanneer de stroomregeling om overdruk te voorkomen is ingeschakeld, zal het debiet automatisch afnemen in geval van verstopping van de kolom. Als het debiet aanzienlijk onder 0,5 ml/min daalt, stop dan de monstertoepassing, voer een wasbeurt uit met 2-5 CV's buffer A en hervat vervolgens de monstertoepassing.
   9. Was de kolom met 1 ml/min met 20 CV's buffer A en vang de doorstroom op met behulp van de uitlaatpoort.
   10. Eluer het monster bij 1 ml/min met het volgende schema: i) lineaire gradiënt met een doel van 50% van buffer B voor vijf CV's; ii) stap met een streefcijfer van 90% van buffer B gedurende vijf CV's; iii) stap met een doel van 100% buffer B gedurende vijf CV's.
   11. Verzamel het geëlueerde monster in fracties van 1 ml met behulp van een fractiecollector en microcentrifugebuisjes met lage retentie (2 ml) en bewaar ze bij -20 °C.
       OPMERKING: De rAAV-fracties kunnen enkele weken worden bewaard (pauzepunt).
   12. Breng de kolom opnieuw in evenwicht bij 1 ml/min met 12,5% buffer B voor vijf CV's.
   13. Schakel de inlaten van de bufferoplossingen over op ultrapuur water en was de kolom met 1 ml/min voor vijf CV's.
   14. Schakel de inlaten over van ultrapuur water naar 20% ethanol en was de kolom met 1 ml/min voor vijf CV's. Koppel de kolom los en bewaar deze bij 4 °C.
       OPMERKING: Kolommen kunnen meerdere keren worden hergebruikt zonder andere grote reinigings- en ontsmettingsprocedures als hetzelfde rAAV-serotype en transgen worden gebruikt.
   15. Was het vloeistofstroompad volledig met 20% ethanol met behulp van handmatige instructies of een vooraf gedefinieerde systeem-CIP-methode.

5. Concentratie van gezuiverde rAAV's

1. Dag 6: Concentratie stap 1
   1. Concentreer rAAV's met behulp van een centrifugaalfiltereenheid van 15 ml met een grenswaarde van 100 kDa molecuulgewicht. Laad de gewenste fracties met rAAV's (FPLC-fracties 7 tot 16) in de centrifugaalfiltereenheid van 15 ml en centrifugeer deze bij 2.000 × g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat het geconcentreerde volume in de filtereenheid ongeveer 500 μL is. Als het geconcentreerde volume grotendeels groter is dan 500 μL, herhaal dan de centrifugatiestappen met tussenpozen van 1 minuut totdat het gewenste volume is bereikt.
2. Dag 6 (vervolg): Buffer uitwisseling
   1. Voeg 1 ml steriele PBS toe aan de centrifugaalfiltereenheid met de rAAV's. Pipeteer voorzichtig op en neer om het filter te wassen. Centrifugeer bij 2.000 × g met tussenpozen van 1 minuut tot het uiteindelijke volume van 500 μl is bereikt.
3. Dag 6 (vervolg): Concentratiestap 2
   1. Breng de 500 μl geconcentreerde rAAV's die in de vorige stap zijn verkregen, over in een centrifugaalfiltereenheid van 0,5 ml met een molecuulgewichtgrens van 100 kDa en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 6.000 × g . Herhaal indien nodig de centrifugeerstap totdat een eindvolume van minder dan 100 μl is bereikt.
4. Dag 6 (vervolg): Herstel
   1. Om de geconcentreerde rAAV terug te winnen, plaatst u het filterapparaat ondersteboven in een nieuwe microcentrifuge-verzamelbuis. Plaats de buis in een microcentrifuge met de dop naar het midden en draai langdurig in de stroomkamer om geconcentreerde rAAV's van het apparaat naar de microcentrifugebuis over te brengen. U kunt ook centrifugeren bij 1.000 × g gedurende 2 minuten.
   2. Supplement met steriele Pluronic F-68 0,001% (optioneel).
      OPMERKING: Pluronic F-68 is een niet-ionische oppervlakteactieve stof die is goedgekeurd voor menselijk gebruik door de Food and Drug Administration en die in staat is om verliezen van rAAV's te verminderen door hun interacties met de oppervlakken van materialen (kunststoffen) te voorkomen die worden gebruikt tijdens de verdunningsvoorbereiding, het laden van spuiten en toedieningsapparatuur^55,56.
   3. Aliquot rAAV's in microcentrifugebuisjes met lage retentie en bewaren bij -80 °C (pauzepunt).

6. Kwantificering van gezuiverde rAAV's

1. Dag 6 (vervolg): Bepaal de titer van rAAV-preparaten, uitgedrukt in virale genomen/μL (vg/μL), door middel van real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) met behulp van een commerciële kit en volgens de instructies van de fabrikant.
   1. Incubeer de rAAV-deeltjesoplossing met DNase I bij 37 °C gedurende 20 min.
      OPMERKING: Deze procedure bevordert de vertering van vrij genomisch DNA en plasmide-DNA afkomstig van gastheercellen, en zorgt er zo voor dat alleen de nucleïnezuursequentie in intacte rAAV-deeltjes behouden blijft.
   2. Warmte-inactiveer DNase I bij 95 °C gedurende 10 min.
   3. Voeg Lysis Buffer toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 70 °C om warmtedenaturatie van de eiwitten van rAAV-deeltjes te bevorderen.
   4. Verdun de verkregen rAAV-genoomoplossing in verdunningsbuffer voordat u overgaat tot de RT-qPCR. Maak een set serieel verdunde standaarden van de positieve controle (van 2 × 10⁷ vg/μl tot 2 × 10² vg/μl) die bij de kit wordt geleverd.
   5. Voer een reactiemengsel uit met 12,5 μl Taq II-mix, 0,5 μl verdund primermengsel, 7 μl water en 5 μl verdund rAAV-DNA (onbekend AAV-monster en standaarden uit stap 6.1.4.).
   6. Voer de RT-qPCR uit in een real-time PCR-detectiesysteem, met behulp van het volgende protocol: 1 cyclus bij 95 °C gedurende 2 minuten (initiële denaturatie) en 40 cycli bij 95 °C gedurende 5 s (denaturatie) en 60 °C gedurende 30 s (gloeien, extensie en plaatlezing), gevolgd door een smeltcurve-analyse.
   7. Bereken de absolute monsterconcentratie op basis van de standaardcurve (lineaire regressielijn), rekening houdend met de verdunningsfactor die het resultaat is van de rAAV-monstervoorbereiding.
      OPMERKING: De kwantificering van het aantal virale genomen wordt bereikt door de amplificatie van de ITR-sequentie van AAV2 (doelsequentie van de primers die door de kit worden geleverd).

7. SDS-PAGE, Coomassie blauwe kleuring en western blot

1. Denatureer 40 μl van elk monster (elke FPLC-fractie; de doorstroom; de voorkolommonsters, en in totaal 2,3 × 10¹⁰ vg van het geconcentreerde eindproduct) door 6x monsterbuffer toe te voegen (0,5 M Tris-HCl/0,4% natriumdodecylsulfaat (SDS) pH 6,8, 30% glycerol, 10% SDS, 0,6 M dithiothreitol (DTT), 0,012% broomfenol blauw) en de monsters gedurende 5 minuten bij 95 °C te incuberen.
2. Laad de gedenatureerde monsters (48 μL) in een SDS-polyacrylamidegel (4% stapel- en 10% oplossende gel) en voer de elektroforetische scheiding uit bij 100 V gedurende 70 minuten, naast een eiwitladder.
3. Eiwit analyse
   OPMERKING: Coomassie blauwe kleuring of western blotting kan worden uitgevoerd.
   1. Coomassie blauwe kleuring
      1. Om eiwitbanden te visualiseren, kleurt u de gel gedurende 10 minuten met een 0,25% Coomassie blue G250-oplossing opgelost in 50% methanol en 10% azijnzuur ijszuur.
      2. Voer gelkleuring uit door het meerdere keren te wassen met een oplossing met 25% methanol en 5% azijnzuur glaciaal totdat duidelijke banden met een lage achtergrond zichtbaar worden.
      3. Leg beelden vast met behulp van een geschikt beeldvormingssysteem.
   2. Westelijke vlek
      1. Breng de eiwitten over op een PVDF-membraan volgens standaardprotocollen.
      2. Blokkeer het membraan door incubatie in 5% magere melk verdund in TBS-T (0,1% Tween 20 in Tris-gebufferde zoutoplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
      3. Gebruik de volgende primaire antilichamen (verdund in blokkeringsoplossing) voor de nachtelijke incubatie bij 4 °C: monoklonale anti-AAV bij muizen, VP1, VP2, VP3-antilichaam (B1, 1:1.000) of monoklonale anti-AAV, VP1, VP2-antilichaam bij muizen (A69, 1:1.000).
      4. Was de membranen gedurende 3 x 15 minuten in TBS-T en incubeer met een alkalisch fosfatase-gekoppeld geitenanti-muis secundair antilichaam (1:10.000), gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
      5. Was de membranen 3 x 15 min in TBS-T. Voeg verbeterd chemifluorescerend substraat (ECF) toe en visualiseer eiwitbanden door middel van chemifluorescentiebeeldvorming.

8. Transmissie elektronenmicroscopie (TEM)

1. Plaats een met Formvar-koolstof gecoate 200 mesh grid ondersteboven op een druppel van een rAAV-monster en laat het 1 minuut bezinken.
2. Was de roosters in een druppel water en droog de overtollige vloeistof af met filtreerpapier.
3. Kleurig de roosters negatief met 1% uranylacetaatoplossing (pH 7) gedurende 1 minuut om de virale deeltjes te fixeren en te contrasteren.
4. Was de roosters in een druppel water en droog de overtollige vloeistof af met filtreerpapier.
5. Onderzoek de monsters in een transmissie-elektronenmicroscoop.
   OPMERKING: Hoge zoutconcentraties kunnen een directe invloed hebben op de binding van rAAV's aan het rooster en leiden tot de visualisatie van kristalachtige structuren.

9. Opeenvolgende absorptie van ultraviolet-zichtbaar licht, statische lichtverstrooiing en dynamische lichtverstrooiingsanalyse

1. Laad op een kwantificeringsplaat met 96 putjes 2 μL van een rAAV-monster en 2 μL PBS om als buffer te gebruiken (voer dit in duplicaten uit).
2. Gebruik de AAV Quant-applicatie in de clientanalysesoftware, plaats de namen van de monsters op de juiste locatie van de plaat, selecteer het AAV-serotype en klik op Volgende.
3. Plaats de kwantificeringsplaat met 96 putjes in de daarvoor bestemde apparatuur en ga verder met plaatlezen voor gegevensverzameling.

10. In-vitrotransductietests

1. Verschillende cellijnen kunnen worden gebruikt om snel de transductie-efficiëntie van rAAV's te analyseren.
   1. Gelijkmatig HEK293T cellen zaaien in platen met 24 putjes (met een dichtheid van 137.500 cellen/put) en een neuroblastoom-2A-cellijn (Neuro2a) bij muizen in platen met 24 putjes (50.000 cellen/putje) of in een kamerglaasje met 8 putjes (27.000 cellen/putje), met behulp van DMEM hoge glucose, aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine, zoals hierboven beschreven. Laat de cellen een nacht hechten bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂ .
   2. Verzamel geconditioneerd medium uit elk putje (250 μl van platen met 24 putjes en 50 μl van het kamerglaasje met 8 putjes) en bewaar het bij 4 °C voor later gebruik.
   3. Voeg de volgende rAAV-preparaten toe aan elk putje en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO₂ .
      1. Voeg 50 μL van de FPLC-verzamelde fracties F2-F16 toe en stroomt door naar HEK293T cellen die zijn bekleed met platen met 24 putjes.
      2. Voeg in totaal 5,5 × 10⁹ vg van de geconcentreerde rAAV's verdund in 50 μL PBS toe aan Neuro2a-cellen geplateerd in platen met 24 putjes (inclusief een negatief controleputje, door 50 μL PBS aan de cellen toe te voegen).
      3. Voeg in totaal 2,75 × 10⁹ vg van de geconcentreerde rAAV's verdund in 25 μL PBS toe aan Neuro2a-cellen geplateerd in een kamerglaasje met 8 putjes (inclusief de negatieve controleconditie, door 50 μL PBS aan de cellen toe te voegen).
   4. Voeg het eerder opgeslagen geconditioneerde medium (stap 10.1.2) toe aan elk putje en incubeer gedurende 24 uur.
   5. Gooi het medium weg en was de cellen 2x met PBS.
   6. Voeg aan elk putje een oplossing van 4% paraformaldehyde (PFA) toe, aangevuld met 4% sucrose in PBS, voorverwarmd tot 37 °C, en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
   7. 2x wassen met PBS en bewaren bij 4 °C totdat de beeldvorming is uitgevoerd (pauzepunt).
   8. Verkrijg beelden op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 10x/0.30 objectief, of een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een 40x/1.4 Oil DIC-objectief.
2. Om een relevanter en reflectiever model van de in vivo omgeving te hebben, gebruikt u primaire neuronale culturen als volgt:
   1. Bereid primaire culturen van corticale neuronen voor zoals eerder beschreven door Santos et al.⁵⁷. Kortom, zaai 200.000 cellen/ml in platen met 12 putjes en houd ze in cultuur tot de dag in vitro 16.
   2. Verzamel geconditioneerd medium uit elk putje (100 μL) en bewaar het bij 4 °C voor later gebruik.
   3. Voeg de te testen rAAV's toe aan elk putje: in totaal 2,75 × 10⁹ vg van de geconcentreerde rAAV's verdund in 25 μL PBS (inclusief de negatieve controle: 25 μL PBS). Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO₂ .
   4. Voeg het eerder opgeslagen geconditioneerde medium toe en incubeer gedurende 24 uur.
   5. Gooi het medium in elk putje weg en was 2x met PBS.
   6. Fixeer de cellen met 4% PFA/4% sucrose in PBS, zoals beschreven in stap 10.1.6. 2x wassen met PBS.
   7. Incubeer elk putje met 5 μg/ml tarwekiemagglutinine (WGA) geconjugeerd met Alexa Fluor 633 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (optionele stap: voer in plaats daarvan immunocytochemie uit). 2x wassen met PBS.
   8. Incubeer in 0,25% Triton X-100 in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Wassen met PBS.
   9. Incubeer met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. 2x wassen met PBS.
   10. Verkrijg beelden op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een 40x/0,95 objectief, of een omgekeerde confocale microscoop die is uitgerust met een 40x/1.4 Oil DIC-objectief.

11. In-vivo-experimenten

OPMERKING: De dieren werden gehuisvest in een ruimte met temperatuurregeling, die op een licht/donker-cyclus van 12 uur werd gehouden. Voedsel en water werden ad libitum verstrekt. Alles werd in het werk gesteld om dierenleed tot een minimum te beperken.

1. Stereotaxische injectie in het cerebellum
   1. Verdoof 9 weken oude C57BL/6-dieren door inademing van 2% isofluraan in aanwezigheid van zuurstof (0,8 l/min) in een kamer die is aangesloten op een verdamper.
   2. Plaats het verdoofde dier in het stereotaxitische apparaat (op een verwarmd kussen van 35 °C) en plaats het isofluraanmasker in de neus van het dier. Verlaag het isofluraangehalte tot 1,3-1,7%.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het dier correct is verdoofd voordat u verder gaat (verlies van de reflex voor flexie in beide achterpoten).
   3. Breng smeermiddel oogzalf aan om uitdroging van de hoornvliezen te voorkomen en injecteer het dier met een goedgekeurd pijnstiller.
      OPMERKING: Alle volgende stappen moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd.
   4. Na het scheren van de vacht van het hoofd van het dier en het desinfecteren van het operatiegebied, legt u de schedel bloot en plaatst u de punt van een injectienaald met stompe punt van 30 G, aangesloten op een Hamilton-spuit van 10 μL, direct boven bregma (gebruik bregma als nul voor de berekening van stereotaxische coördinaten).
   5. Verplaats de naald naar het beoogde coördinaat en boor een gat door de schedel waar de naald naar binnen gaat.
      OPMERKING: In het kader van deze studie werd een enkele injectie centraal in het cerebellum uitgevoerd.
   6. Injecteer 4 μl van een oplossing van rAAV's met in totaal 8 × 10⁹ vg, verdund in PBS, met een infusiesnelheid van 0,5 μl/min met behulp van een automatische injector. Gebruik de volgende coördinaten, berekend op basis van bregma, om een enkele injectie centraal in het cerebellum van een volwassen C57BL/6-muis uit te voeren: antero-posterieur: -6,5 mm; lateraal: 0 mm; Ventraal: -2,9 mm.
      OPMERKING: Deze coördinaten kunnen variëren afhankelijk van de muizenstam, het geslacht en de leeftijd van de dieren die worden gebruikt.
   7. Om terugstroming tot een minimum te beperken en de virale vectordiffusie mogelijk te maken, laat u, zodra de infusie is voltooid, de naald van de spuit 3 minuten op deze coördinaten staan, trekt u deze vervolgens langzaam 0,3 mm terug en laat u deze nog 2 minuten op zijn plaats blijven voordat deze volledig uit de muizenhersenen wordt verwijderd.
   8. Sluit de incisie en reinig deze met een ontsmettingsmiddel (bijv. 10% povidon-jodium).
   9. Laat de dieren herstellen van de narcose voordat u ze terugbrengt naar hun thuiskooien.
2. Weefselafname en -voorbereiding
   OPMERKING: In dit experiment werden de transductieniveaus 12 weken na injectie waargenomen, maar dezelfde procedure kon al 4 weken na de injectie worden geëvalueerd.
   1. Eindverdoving van de dieren door intraperitoneale toediening van een overdosis xylazine/ketamine (8/160 mg/kg lichaamsgewicht).
   2. Perfiltreer de dieren transcardisch met ijskoude PBS gedurende 6 minuten met een snelheid van 2,5 ml/min, gevolgd door de perfusie met een vers bereide ijskoude 4% PFA-oplossing gedurende 10 minuten met dezelfde snelheid.
   3. Fixeer de weggesneden hersenen een nacht bij kamertemperatuur in 4% PFA en breng ze vervolgens over naar een 25% sucrose/PBS-oplossing voor cryoprotectie. Zodra de hersenen zijn gezonken (ongeveer 48 uur later), bewaar ze dan bij -80 °C.
   4. Snijd seriële sagittale secties met een dikte van 30 μm met behulp van een cryostaat bij -21 °C. Verzamel voor elk dier 96 sagittale secties van een hersenhelft in anatomische reeksen als vrij zwevende secties in PBS aangevuld met 0,05% natriumazide. Bewaren bij 4 °C tot verdere verwerking.
3. Standaard fluorescentie-immunohistochemie
   1. Selecteer acht sagittale secties per dier, op een afstand van 240 μm van elkaar.
   2. Incubeer de vrij zwevende secties in een blok-/permeabilisatieoplossing (0,1% Triton X-100 met 10% normaal geitenserum (NGS) in PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
   3. Incubeer de secties een nacht bij 4 °C met kip polyklonaal anti-GFP primair antilichaam (1:1.000).
   4. Was gedurende 3 x 15 minuten in PBS en incubeer de secties gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met het secundaire antilichaam geit polyklonaal anti-kip antilichaam geconjugeerd aan Alexa Fluor 488 fluorofoor (1:200).
   5. Was gedurende 3 x 15 minuten in PBS. Incubeer met DAPI gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   6. Was gedurende 3 x 15 minuten in PBS. Plaats de secties in met gelatine beklede objectglaasjes en dekglaasje met fluorescentie-montagemedium.
   7. Maak beelden op een fluorescentiemicroscoop met een diascanner die is uitgerust met een 20x/0.8 objectief.

Resultaten

In dit werk presenteren we een gedetailleerd protocol voor de productie, zuivering en karakterisering van mozaïek-rAAV's (samengevat in figuur 1), die het potentieel hebben om het CZS te richten en te transduceren (bijv. AAV1 en AAV9), en tegelijkertijd geschikt zijn voor heparine-affiniteitschromatografiezuivering (AAV2). Om dat te bereiken, werden capsiden van natuurlijke AAV-serotypen 1, 2 en 9 gebruikt om mozaïek rAAV1/2- en rAAV2/9-vectoren te ontwikkelen.

Voordat werd begonnen, werden plasmidepreparaten gescreend op structurele integriteit. Naast de digesties die nodig zijn om de juiste insertie van kloonfragmenten te valideren, is het essentieel om pITR-plasmiden consequent te screenen om mogelijke ITR-deleties/inserties te detecteren. Zo werd bijvoorbeeld de integriteit van ITR's in verschillende klonen van een pITR-plasmide na de plasmidevertering gecontroleerd met het restrictie-enzym SmaI (aanvullende figuur S1).

Beide soorten mozaïekvectoren werden gegenereerd door de co-transfectie van de respectieve AAV-capsideplasmiden in een verhouding van 1:1, volgens standaard transfectiemethoden⁶. In het kort werden HEK293T cellen getransfecteerd met i) een plasmide met het betreffende transgen verpakt tussen de ITR (pITR) sequenties, ii) een plasmide met de wild-type AAV genoom Rep en Cap ORF's van AAV2 en AAV1 of AAV9 (pAAV-RC plasmiden) en iii) een plasmide codificeert de adenovirale eiwitten (E1A, E1B, E4 en E2A) evenals de adenovirus-geassocieerde RNA's die essentieel zijn voor helperfuncties (pHelper). Achtenveertig uur later werden de cellen ^6,36 geoogst en werden rAAV's uit het celhomogenaat gezuiverd door affiniteitschromatografie met behulp van een FPLC-systeem. Zoals weergegeven in figuur 2A, werd na kolomevenwicht (evenwichtsstap) het cellysaat met de rAAV's op de kolom aangebracht (monsterbelasting). Vanwege de natuurlijke affiniteit van rAAV2 voor heparine³³ bonden rAAV's zich aan de hars van de kolom, terwijl andere componenten in de lopende buffer werden uitgevoerd en werden gedetecteerd door de UV-monitor (doorstroom), wat resulteerde in een toename van de absorptie. De kolom werd vervolgens gewassen (wasstap) en rAAV's werden uiteindelijk geëlueerd door een verhoging van de NaCl-concentratie (elutiestap). De geëlueerde virussen werden gedetecteerd door de UV-monitor en verzameld in fracties van 1 ml.

Een representatief elutiepiekprofiel van rAAV1/2 en rAAV2/9 wordt weergegeven in respectievelijk figuur 2B en aanvullende figuur S2A, waarbij verschillende virale batches consequent een enkele piek vertonen, beginnend bij fractie F7 tot F16. De piekhoogte is variabel bij rAAV-producties, waarbij hogere pieken meestal leiden tot hogere rAAV-opbrengsten. Elke fractie van de geproduceerde rAAV1/2 en rAAV2/9 werd vervolgens gekarakteriseerd met RT-qPCR om virale titers te beoordelen (Figuur 2C en Aanvullende Figuur S2B).

Om de zuiverheid van het geëlueerde materiaal te karakteriseren, werd 40 μL van elke fractie en van de respectieve doorstroming onderzocht met behulp van 10% SDS-polyacrylamidegelelektroforese (Figuur 2D voor rAAV1/2 en Aanvullende Figuur S2C voor rAAV2/9). Coomassie blauwe kleuring onthulde drie belangrijke banden in de fracties F7-F16, met molecuulgewichten die overeenkomen met de VP1 (87 kDa), VP2 (72 kDa) en VP3 (62 kDa) capside-eiwitten van AAV's in de juiste verhoudingen 1:1:10, zoals eerder beschreven door Van Vliet en collega's¹⁴. In beide gevallen, en op basis van UV-absorptie, RT-qPCR en gelbandintensiteit, is het duidelijk dat de meerderheid van de mozaïek-rAAV's aanwezig is in de fracties F7 en F8 en geleidelijk begint af te nemen in de fracties F9-F16. Naast de drie virale capside-eiwitten werd/werden een ander eiwit (of eiwitten) van ongeveer 17 kDa in grootte gedetecteerd in de fracties F8-F16.

Om deze meezuiverende eiwitten te elimineren, werden vervolgens de fracties F7-16 gefilterd en geconcentreerd met behulp van 100 KDA-centrifugaalfiltereenheden en werd de uiteindelijke rAAV-titer bepaald met RT-qPCR (zoals weergegeven in figuur 3A,B voor rAAV1/2). De uiteindelijke opbrengst van een rAAV-productie is afhankelijk van de lengte en complexiteit van de pITR, de integriteit van ITR-sequenties, celkweekomstandigheden (bijv. aantal celpassages) en transfectie-efficiëntie 24,58,59,60,61. Desalniettemin kan de uiteindelijke titer worden aangepast door meerdere centrifugaties van het rAAV-preparaat uit te voeren met behulp van centrifugaalfiltereenheden van 0,5 ml (concentratiestap 2). Volgens dit protocol worden voor een eindvolume in het bereik van 50 tot 100 μl meestal concentraties tussen 2 × 10⁹ en 5 × 10^{10 vg}/μl (kwantificering uitgevoerd met behulp van de titratiekit waarnaar wordt verwezen).

De zuiverheid van de uiteindelijke rAAV-preps werd vervolgens geëvalueerd op een 10% SDS-polyacrylamidegel. Zoals weergegeven in figuur 3C, werden slechts drie banden die de rAAV's capside-eiwitten vertegenwoordigen, waargenomen voor het rAAV1/2-preparaat en werden er geen detecteerbare co-zuiverende eiwitten geïdentificeerd. Deze resultaten kwamen overeen met die verkregen voor rAAV2/9 (aanvullende figuur S2C). Om de identiteit te bevestigen en de zuiverheid van rAAV1/2- en rAAV2/9-vectoren verder te karakteriseren, werden virale fracties en geconcentreerde voorraden geanalyseerd door western blot, met de specifieke antilichamen B1 (aanvullende figuur S3A en aanvullende figuur S4A) en A69 (aanvullende figuur S3B en aanvullende figuur S4B). Terwijl het antilichaam B1 een C-terminaal epitoop herkent dat gemeenschappelijk is voor alle VP-eiwitten van de meeste AAV-serotypen⁶², herkent de kloon A69 alleen epitopen van VP1 en VP2⁶³. Desalniettemin kunnen sommige zwakke banden met molecuulgewichten lager dan VP3 (<62 kDa) ook worden gedetecteerd op B1- en A69-etikettering.

Om de structurele morfologie te karakteriseren en de zuiverheid van rAAV's verder te evalueren, werden de virale deeltjes direct gevisualiseerd door TEM. Deze techniek is de standaardprocedure geweest om de integriteit en zuiverheid van monsters in virale monsters te beoordelen, omdat het de kwantificering van lege en volle rAAV-deeltjes mogelijk maakt, evenals de beoordeling van besmetting in een monster 29,64,65,66,67. Zoals te zien is in figuur 3D, konden grote hoeveelheden rAAV-deeltjes, ~25 nm in diameter, worden waargenomen op een schone achtergrond. Lege deeltjes (zwarte pijl) met een elektronendicht centrum, evenals volledige vectoren (witte pijl) konden ook in het hele monsterveld worden waargenomen.

We voerden ook kwaliteitscontroles uit van de gezuiverde rAAV's met behulp van Stunner, een platform dat ultravioletzichtbare (UV-Vis) spectroscopie, statische lichtverstrooiing (SLS) en dynamische lichtverstrooiing (DLS) ^combineert68. Voor elk monster werd de totale hoeveelheid eiwit, ssDNA, evenals het absorberen van onzuiverheden en achtergrondtroebelheid, gemeten met behulp van UV-VIS-spectroscopie (Figuur 3E en aanvullende figuur S5A). SLS en DLS werden vervolgens toegepast om het lichtverstrooiingsgedrag van rAAV-capsiden te beoordelen. Aangezien AAV's een gemiddelde diameter van 25 nm hebben, worden deeltjes binnen een diameterbereik van 15-45 nm als intact beschouwd. Grotere deeltjes vertegenwoordigen doorgaans virale aggregaten, en alles wat kleiner is, bestaat hoogstwaarschijnlijk uit kleine deeltjes, inclusief niet-geassembleerde capside-eiwitten⁶⁸. Voor rAAV1/2 werd een enkele piek waargenomen die overeenkomt met intacte capsidedeeltjes bij 30 nm (figuur 3F), met 0% van de aggregaatintensiteit en 0% van de intensiteit van kleine deeltjes. Voor het rAAV2/9-preparaat werd ook een piek bij 30 nm gedetecteerd, wat neerkomt op een capside-intensiteit van 78% (aanvullende figuur S5B). Hoewel de intensiteit van kleine deeltjes 0% bedroeg, werd voor dit monster een aggregaatintensiteit van 22% gemeten (weergegeven in grijs), met de belangrijkste bijdrage (19,9%) van grote aggregaten met een gemiddelde diameter van 620 nm (aanvullende figuur S5B). Door de combinatie van UV-VIS-spectroscopie met SLS- en DLS-informatie onthulde Stunner de totale capsidetiter, de volledige capsidetiter, het vrije en geaggregeerde eiwit, evenals vrij en geaggregeerd ssDNA voor de twee virale preparaten, weergegeven in figuur 3G en aanvullende figuur S5C (specifieke waarden aangegeven in elke figuurlegenda).

Om de biologische activiteit van de ontwikkelde mozaïek AAV-vectoren te evalueren, werden HEK293T cellen tegelijkertijd geïnfecteerd met 50 μL van elke FPLC-verkregen fractie (F2-F16) van het rAAV1/2- of rAAV2/9-preparaat. Aangezien de rAAV1/2-vector codeert voor een enkelstrengs groen fluorescerend eiwit (GFP), onder controle van een CMV-promotor (pAAV-CMV-ssGFP), en de rAAV2/9-vector codeert voor een zelfcomplementair GFP, onder controle van de CMV-promotor (pAAV-CMV-scGFP⁵³), werd directe GFP-fluorescentie 48 uur na infectie in deze cellen onderzocht (aanvullende figuur S6 en aanvullende figuur S7). In overeenstemming met de eerdere waarnemingen voor RT-qPCR, Coomassie blue en western blot, werd het hoogste besmettelijkheidsniveau bereikt voor virale fracties F7 en F8, geleidelijk afnemend in fracties F9 tot F16.

Om te bevestigen of de biologische activiteit van rAAV's behouden bleef na ultrafiltratie- en concentratiestappen, werden Neuro2A-cellen, geplateerd in zowel 24-wells platen als een 8-wells kamerobjectglaasje, geïnfecteerd met de geconcentreerde rAAV1/2-vector, die codeert voor scGFP onder controle van CMV-promotor (pAAV-CMV-scGFP⁵³). Helderveld- en fluorescentiebeelden werden 48 uur na infectie verkregen (figuur 4A,B voor beelden met een hogere resolutie).

Met het oog op het verkennen van de infectieuze capaciteit van de geproduceerde rAAV's in een relevanter en reflectiever celmodel, werden semi-dichte primaire neuronale culturen uit de cortex gezaaid op een plaat met 12 putjes en geïnfecteerd met de eerder gebruikte rAAV1/2 - CMV-scGFP. Achtenveertig uur na infectie werden cellen gefixeerd en gelabeld met DAPI en WGA geconjugeerd met Alexa Fluor 633, Een veel gebruikte lectine om vaste cellen te labelen. De beelden in figuur 4C,D zijn gemaakt met een Zeiss Axio Observer Z1 en met een Zeiss confocale LSM 710. Zoals in deze figuren wordt weergegeven door directe GFP-fluorescentie, behouden geconcentreerde mozaïekvirussen hun genoverdrachtseigenschappen voor neuronale cellen.

Nadat we mozaïek-rAAV's hadden gekarakteriseerd in termen van zuiverheid, fysische eigenschappen en functionaliteit in vitro, evalueerden we vervolgens de mogelijkheid om de gezuiverde rAAV1/2-mozaïekvectoren te gebruiken om het cerebellum van C57BL/6-muizen te transduceren. Daarvoor werd een stereotaxische injectie uitgevoerd bij muizen van 9 weken oud en werd de GFP-expressie 12 weken later geëvalueerd. Zoals verwacht vertoonden dieren die met PBS werden geïnjecteerd geen fluorescentie bij GFP-immunolabeling. Epifluorescentiebeelden van muizen geïnjecteerd met rAAV1/2-vectoren die coderen voor GFP onder controle van synapsine 1-promotor (rAAV1/2 - Syn-ssGFP) toonden aan dat rAAV1/2-vectoren met succes verschillende regio's van het cerebellum transduceerden, namelijk het diepe cerebellaire kernen (DCN) -gebied, evenals de verschillende lobben van het cerebellum (Figuur 5). Deze resultaten tonen de langdurige expressie van het transgen in de hersenen van zoogdieren (12 weken).

Figuur 1: Schematische weergave van het rAAV-productie- en zuiveringsprotocol. rAAV's worden geproduceerd door voorbijgaande transfectie van HEK293T cellen met behulp van polyethylenimine (PEI). Vervolgens worden cellen geoogst en gelyseerd, en rAAV's worden via affiniteitschromatografie uit het celhomogenaat gezuiverd. De verzamelde fracties die rAAV's bevatten, worden vervolgens geconcentreerd en de uiteindelijke virale voorraden worden gekarakteriseerd in termen van titer, zuiverheid, morfologische kenmerken en biologische activiteit. Afkortingen: rAAV = recombinant adeno-geassocieerd virus; PEI = polyethyleenimine; RT-qPCR = real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie; SDS-PAGE = elektroforese van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: FPLC-zuiveringsprotocol en representatief elutieprofiel van rAAV1/2. (A) Schematische weergave van een volledig chromatogramprofiel, met de verschillende stadia van het rAAV-zuiveringsproces. Na een kolomevenwichtsstap wordt het monster toegepast. De kolom wordt vervolgens gewassen en de elutie wordt uitgevoerd met toenemende concentraties NaCl. Het ongebonden materiaal (doorstroom) en fracties van 1 ml van de geëlueerde virussen worden verzameld voor analyse. De extinctie bij 280 nm wordt uitgedrukt in mAU en de x-as geeft het volume in ml aan. (B) Vergrote gedeeltelijke chromatogram met een rAAV1/2-elutiepiek (in zwart), met de bijbehorende fractienummers (F2-F16) en afval (aangegeven in rood). De afgegeven concentratie van buffer B en geleidbaarheid (uitgedrukt in mS/cm) worden ook weergegeven in respectievelijk groen en paars. (C) RT-qPCR van elke fractie die wordt verzameld tijdens affiniteitszuivering (F2-F16) en doorstroom. De titer in vg/μL wordt weergegeven op een logaritmische schaal. (D) SDS-PAGE-analyse van de verzamelde virale fracties. Gelijke volumes (40 μL) van elke fractie uit de elutiestap (F2-F16) en de respectieve doorstroming werden geladen en opgelost op een 10% SDS-polyacrylamidegel. Eiwitbanden werden gevisualiseerd door Coomassie blauwe kleuring. Banden die overeenkomen met AAV-capside-eiwitten VP1, VP2 en VP3 zijn aangegeven. De standaard eiwitgrootteladder wordt aangeduid als (L) en de bijbehorende molecuulgewichten worden ook aangegeven. Afkortingen: rAAV = recombinant adeno-geassocieerd virus; RT-qPCR = real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie; SDS-PAGE = elektroforese van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Karakterisering van de geconcentreerde rAAV1/2-vectoren. (A) Amplificatiecurven van een geconcentreerd rAAV1/2-monster (in blauw), serieel verdunde standaarden van 2 × 10⁷ vg/μL tot 2 ×^{10 2} vg/μL (in zwart) en een controle zonder sjabloon (in groen), verkregen tijdens RT-qPCR. (B) Standaardcurve (lineaire regressie) voor de bepaling van de titer van een rAAV-monster in vg/μL. (C) SDS-PAGE-analyse van de geconcentreerde virale deeltjes. In totaal werd 2,3 × 10¹⁰ vg van de geconcentreerde voorraad op de gel gepoold. (D) Transmissie-elektronenmicroscopiebeeld van rAAV1/2-deeltjes met een diameter van ~25-30 nm. Lege deeltjes met een elektronendicht centrum (te zien aan zwarte pijlen) kunnen worden onderscheiden van volle capsiden (te zien aan witte pijlen). Schaalbalk = 100 nm. (E) Absorptiespectrum van een rAAV1/2-preparaat gemeten door Stunner (in zwart). De bijdrage van eiwitten (in blauw), ssDNA (in groen), andere UV-absorberende verbindingen of onzuiverheden (in paars) en achtergrondtroebelheid (in grijs) worden ook getoond. (F) DLS-intensiteitsverdeling van rAAV1/2 met een enkele piek bij 30 nm, gemeten door Stunner. Een capside-verstrooiingsintensiteit van 100% werd bepaald door het gebied onder de curve te meten van 15 tot 45 nm (groen gearceerd). (G) Verbluffende analyse van een rAAV1/2-vectorpreparaat met een totale capsidetiter van 1,19 × 10¹⁴ cp/ml (donkerblauw) en een volledige capsidetiter van 1,73 × 10¹³ vg/ml (donkergroen). Een vrij en geaggregeerd eiwit van 7,16 ×^{10 12} cp/ml-equivalenten (lichtblauw), evenals een vrij en geaggregeerd ssDNA van 1,04 ×^{10 12} vg/ml-equivalenten (lichtgroen), werden ook gemeten. Afkortingen: rAAV = recombinant adeno-geassocieerd virus; RT-qPCR = real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie; SDS-PAGE = elektroforese van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel; ssDNA = enkelstrengs DNA; DLS = dynamische lichtverstrooiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: In-vitrobeoordeling van de infectiviteit van een geconcentreerd rAAV1/2-monster. (A) Neuro2A-cellen werden geïnfecteerd met rAAV1/2 - CMV-scGFP of geïncubeerd met een equivalent volume PBS, als negatieve controle. Helderveld- en fluorescentiebeelden van cellen die 48 uur na infectie zijn afgebeeld. Beelden zijn gemaakt in een Zeiss Axio Observer Z1 (10x objectief). Schaalbalken = 100 μm. (B) Gedetailleerde beelden van Neuro2A-cellen 48 uur na infectie met rAAV1/2 - CMV-scGFP. Beelden werden verkregen in een Zeiss LSM 710 (40x objectief). Schaalbalken = 20 μm. (C) Semi-dichte primaire neuronale culturen geïnfecteerd met rAAV1/2 - CMV-scGFP of geïncubeerd met een equivalent volume PBS, die als negatieve controle dienen. Cellen werden gelabeld met een nucleaire kleuring (DAPI in blauw) en een membraankleuring (WGA in wit). Beelden zijn gemaakt in een Zeiss Axio Observer Z1 (40x objectief). Schaalbalken = 20 μm. (D) Gedetailleerde beelden van semi-dichte primaire neuronale culturen 48 uur na infectie met rAAV1/2 - CMV-scGFP. Beelden werden verkregen in een Zeiss LSM 710 (40x objectief). Schaal balken = 20 μm. Afkortingen: rAAV = recombinant adeno-geassocieerd virus; CMV = cytomegalovirus; scGFP = zelfcomplementair groen fluorescerend eiwit; PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylinde; WGA = agglutinine van tarwekiemen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: In vivo transductie-efficiëntie van rAAV1/2 na een intraparenchymale injectie. Representatieve immunofluorescentiebeelden die de wijdverspreide GFP-expressie (in groen) in het hele cerebellum tonen na een centrale injectie van rAAV1/2 - Syn-ssGFP in het cerebellum. Kernen werden gekleurd met DAPI (in blauw). Schaal balken = 500 μm. Afkortingen: rAAV = recombinant adeno-geassocieerd virus; Syn = Synapsine 1; ssGFP = enkelstrengs groen fluorescerend eiwit; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylinde; PBS = fosfaat gebufferde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Agarosegelanalyse van een rAAV-vectorplasmide verteerd met SmaI. Zes klonen (C1-C6) van een pITR werden verteerd met het SmaI-restrictie-enzym (banen 2, 4, 6, 8, 10 en 12), dat twee keer knipt binnen elke omgekeerde terminale herhaling. In dit geval zou een volledige vertering van deze pITR naar verwachting twee banden genereren (3.796 bp en 3.013 bp). Bij succesvolle preparaten (C1, C3, C4 en C5) is nog steeds een band van 6809 bp, afkomstig van gedeeltelijke vergisting, zichtbaar (~5% van het totaal). Bij preparaten met ITR-recombinatie zijn de verhoudingen omgekeerd (C2) of heeft de vertering niet plaatsgevonden (C6). De respectievelijke niet-verteerde klonen worden ook gepresenteerd (banen 3, 5, 7, 9, 11, 13). Afkortingen: rAAV = recombinant adeno-geassocieerd virus; ITR = omgekeerde terminale herhaling. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: rAAV2/9-zuivering door middel van affiniteitschromatografie op basis van heparine. (A) Elutieprofiel van rAAV2/9 met een enkele piek (in zwart), na een toename van de concentratie van NaCl. De verzamelde fracties worden aangegeven met cijfers (2-16) in rood onderaan de grafiek, de absorptie bij 280 nm wordt uitgedrukt in mAU, de geleidbaarheid wordt uitgedrukt in mS/cm en de x-as geeft het volume in ml aan. (B) rAAV-titers gekwantificeerd door RT-qPCR voor elke gepoolde fractie (F2-F16) en doorstroom. Waarden worden weergegeven op een logaritmische schaal. (C) Zuiverheidstest door SDS-PAGE en Coomassie blauwkleuring. Gelijke volumes (40 μL) van elke fractie (F2-F16) en de respectieve doorstroming werden geladen en opgelost op een SDS-PAGE van 10%. Geconcentreerde voorraad werd gekwantificeerd met RT-qPCR en 2,3 × 10¹⁰ vg werden verdund in 40 μL PBS en gepoold op de gel. Eiwitbanden werden gevisualiseerd door Coomassie blauwe kleuring. De AAV-capside-eiwitten (VP1, VP2 en VP3) zijn geïndiceerd. De standaard eiwitgrootteladder wordt aangeduid met (L) en de bijbehorende molecuulgewichten worden ook aangegeven. Afkortingen: rAAV = recombinant adeno-geassocieerd virus; RT-qPCR = real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie; SDS-PAGE = elektroforese van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S3: Western blot-analyse van rAAV1/2-vectoren gezuiverd door FPLC. (A) De verzamelde fracties en geconcentreerde rAAV1/2-vectoren werden opgelost op een SDS-PAGE-gel en onderzocht met monoklonaal anti-AAV-antilichaam (B1) van muizen dat VP1-, VP2- en VP3-capside-eiwitten herkent. (B) De verzamelde fracties en geconcentreerde rAAV1/2-vectoren werden opgelost op een SDS-PAGE-gel en gesondeerd met monoklonaal anti-AAV-antilichaam van muizen (A69) dat VP1- en VP2-capside-eiwitten herkent. Afkortingen: rAAV = recombinant adeno-geassocieerd virus; FPLC = snelle proteïne vloeistofchromatografie; SDS-PAGE = elektroforese van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel; L = standaard eiwitgrootteladder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S4: Western blot-analyse van rAAV2/9-vectoren gezuiverd door FPLC. (A) De verzamelde fracties en geconcentreerde rAAV2/9-vectoren werden opgelost op een SDS-PAGE-gel en onderzocht met monoklonaal anti-AAV-antilichaam (B1) van muizen dat VP1-, VP2- en VP3-capside-eiwitten herkent. (B) De verzamelde fracties en geconcentreerde rAAV2/9-vectoren werden opgelost op een SDS-PAGE-gel en onderzocht met monoklonaal anti-AAV-antilichaam van muizen (A69) dat VP1- en VP2-capside-eiwitten herkent. Afkortingen: rAAV = recombinant adeno-geassocieerd virus; FPLC = snelle proteïne vloeistofchromatografie; SDS-PAGE = elektroforese van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel; L = standaard eiwitgrootteladder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S5: kwantificering en karakterisering van rAAV2/9-vectoren via Stunner. (A) Absorptiespectrum (zwart) van een rAAV2/9-vector gemeten door Stunner. De bijdrage van eiwitten (blauw), ssDNA (groen), andere UV-absorberende verbindingen of onzuiverheden (paars) en troebelheid op de achtergrond (grijs) worden ook weergegeven. (B) DLS-intensiteitsverdeling van rAAV2/9 met een grote piek bij 30 nm die overeenkomt met een capside-verstrooiingsintensiteit van 78%, zoals bepaald door het gebied onder de curve te meten van 15 tot 45 nm (groen gearceerd). Er werd ook een totale aggregaatintensiteit van 22% (grijs gearceerd) gemeten, met een belangrijke bijdrage van grote aggregaten (19,9%) met een gemiddelde diameter van 620 nm. (C) Verbluffende analyse van een rAAV2/9-vectorpreparaat met een totale capsidetiter van 2,18 × 10¹⁴ cp/ml (donkerblauw) en een volledige capsidetiter van 2,35 × 10¹³ vg/ml (donkergroen). Een vrij en geaggregeerd eiwit van 2,92 ×^{10 13} cp/ml-equivalenten (lichtblauw), evenals een vrij en geaggregeerd ssDNA van 3,14 × 10¹² vg/ml-equivalenten (lichtgroen), werden ook in dit preparaat gemeten. Afkortingen: rAAV = recombinant adeno-geassocieerd virus; ssDNA = enkelstrengs DNA; DLS = dynamische lichtverstrooiing. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S6: In-vitrotransductie-efficiëntie en levensvatbaarheid van de gezuiverde fracties van rAAV1/2. HEK293T cellen die 48 uur na de transductie GFP (directe fluorescentie) tot expressie brengen met 50 μL FPLC-fracties van een rAAV1/2-vector die codeert voor ssGFP (rAAV1/2 - CMV-ssGFP). Schaal balken = 100 μm. Afkortingen: rAAV = recombinant adeno-geassocieerd virus; FPLC = snelle proteïne vloeistofchromatografie; ssGFP = enkelstrengs groen fluorescerend eiwit. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S7: In-vitrotransductie-efficiëntie en levensvatbaarheid van de gezuiverde fracties van rAAV2/9. HEK293T cellen werden geïnfecteerd met 50 μL van elke FPLC-fractie (F2-F16) of doorstroming van een rAAV2/9-vector die codeert voor scGFP onder controle van de CMV-promotor. De GFP-expressiecellen werden 48 uur na infectie gevisualiseerd. Schaal balken = 100 μm. Afkortingen: rAAV = recombinant adeno-geassocieerd virus; FPLC = snelle proteïne vloeistofchromatografie; scGFP = zelfcomplementair groen fluorescerend eiwit; CMV = cytomegalovirus. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De snel groeiende AAV-vectortoolkit is uitgegroeid tot een van de meest veelbelovende genafgiftesystemen voor een breed scala aan celtypen via verschillende toedieningsroutes. In dit werk wilden we een verbeterd protocol ontwikkelen voor de productie, zuivering en karakterisering van mozaïek rAAV-vectoren die hun waarde zouden kunnen bewijzen in preklinische studies. Voor dat doel wordt hier het genereren van rAAV1/2- en rAAV2/9-mozaïekvectoren beschreven, maar de procedure kan ook worden toegepast om standaard rAAV2-vectoren te zuiveren (gegevens niet weergegeven).

Mozaïek rAAV's werden geproduceerd volgens een geoptimaliseerde transfectiemethode met PEI als transfectiereagens. Er werd gekozen voor een transiënte transfectiemethode vanwege de grotere flexibiliteit en snelheid, aanzienlijke voordelen in preklinische studies in een vroeg stadium. Zodra een bepaald transgen en serotype zijn gevalideerd, kan het productiesysteem worden verfijnd om een betere schaalbaarheid en kosteneffectiviteit te bereiken door een stabiele getransfecteerde cellijn tot stand te brengen die een subset van de specifieke Rep/Cap-genen tot expressie brengt, met extra genen die worden geleverd door een infectieproces²⁴. In vergelijking met calciumfosfaattransfectie biedt PEI verschillende voordelen. Het is een stabiel en kosteneffectief transfectiereagens dat effectief werkt binnen een breder pH-bereik. Bovendien elimineert het de noodzaak om het celmedium na transfectie te vervangen, wat resulteert in een aanzienlijke vermindering van zowel de kosten als de werklast⁶⁹.

In een poging om enkele van de beperkingen van CsCl- of jodixanolgradiënten te omzeilen, werden de geproduceerde rAAV's geoogst en gezuiverd door middel van affiniteitschromatografie. Deze strategie biedt een vereenvoudigde en schaalbare aanpak die kan worden uitgevoerd zonder de noodzaak van ultracentrifugatie en gradiënten, wat schone en hoge virale titers oplevert. Chromatografietechnieken met behulp van een FPLC-systeem kunnen inderdaad worden geautomatiseerd en opgeschaald door meer harsvolume in een kolom met een hogere bedhoogte te verpakken. Het hierin beschreven protocol kan eenvoudig worden aangepast om 5 ml HiTrap Heparin HP-kolommen op te nemen (gegevens niet weergegeven). Bovendien kunnen heparinekolommen meerdere keren worden hergebruikt, wat bijdraagt aan de kosteneffectiviteit van deze methode.

De gezuiverde rAAV's werden vervolgens gekarakteriseerd in termen van titer, zuiverheid, morfologische kenmerken en biologische activiteit. Interessant is dat bij Coomassie blauwe kleuring een band met ongeveer 17 kDa werd gedetecteerd in fracties F8-F16 naast de drie typische virale capside-eiwitten. Deze band is echter niet meer aanwezig na de concentratiestap van rAAV's. Bovendien kunnen sommige vage banden met molecuulgewichten lager dan VP3 (<62 kDa) ook worden gedetecteerd op B1- en A69-etikettering, wat suggereert dat dit fragmenten kunnen zijn van de VP1-, VP2- en VP3-capside-eiwitten⁷⁰. Een andere mogelijkheid is dat dit in feite andere medezuiverende eiwitten zijn, zoals ferritine of andere cellulaire eiwitten met polypeptiden die vergelijkbare eiwitvingerafdrukken delen met de AAV-capside-eiwitten en betrokken zouden kunnen zijn bij de AAV-biologie, zoals eerder werd gesuggereerd 26,71,72.

TEM- en verdoveringsanalyse onthulde ook de aanwezigheid van lege deeltjes op variabele niveaus in verschillende producties. Evenzo rapporteerden andere studies eerder het genereren van variabele en hoge niveaus (>65%) van lege capsiden voor rAAV's bereid door transfectie- of infectiemethoden^24,73. Het mechanisme achter het genereren van rAAV begint met de snelle vorming van lege capsiden uit nieuw gesynthetiseerde VP-eiwitten, gevolgd door een langzame snelheidsbeperkende stap van genoomverpakking in de voorgevormde capsiden gemedieerd door Rep-eiwitten^74,75. Daarom worden lege capsiden gegenereerd in rAAV-producties, hoewel de verhouding tussen lege en volle capsiden kan variëren afhankelijk van de grootte en sequentie van het betreffende transgen en de celcultuuromstandigheden^58,73. Lege capsiden geven aanleiding tot enige bezorgdheid, omdat ze, door het ontbreken van het genoom van belang, geen therapeutisch effect kunnen bieden en mogelijk ook een aangeboren of adaptieve immuunrespons kunnen versterken. Sommige rapporten hebben echter ook aangetoond dat, door hun verhouding aan te passen, lege AAV-capsiden kunnen dienen als zeer effectieve lokvogels voor AAV-specifieke neutraliserende antilichamen en daarom de transductie-efficiëntie kunnen verhogen 60,76,77. Als de aanwezigheid van lege capsiden kritisch schadelijk is en gezien het iets minder anionische karakter van lege deeltjes in vergelijking met volle vectoren, zou een mogelijke oplossing kunnen bestaan uit het uitvoeren van een tweede polijstzuiveringsstap met behulp van anionuitwisselingschromatografietechnieken⁶⁴.

Deze studie levert ook overtuigend bewijs dat de gegenereerde mozaïek rAAV's in staat zijn om niet alleen in vitro neuronale culturen efficiënt te transduceren, maar ook het CZS na intracraniële injectie van rAAV1/2. Over het algemeen suggereren deze resultaten dat het beschreven productie- en zuiveringsprotocol zeer zuivere en biologisch actieve rAAV's binnen 6 dagen klaar voor gebruik maakt, wat zichzelf presenteert als een veelzijdige en kosteneffectieve methode voor het genereren van rAAV's in preklinische studies.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10% povidone-jodium	Medline	MDS093943
12-well platen	Thermo Scientific	11889684
24-well platen	VWR	734-2325
4’,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)	Invitrogen	D1306
96-well Stunner plate	Unchained Labs	701-2025	96-well kwantificeringsplaat voor de opeenvolgende ultraviolet-zichtbare lichtabsorptie, statische lichtverstrooiing en dynamische lichtverstrooiing analyse van rAAV-monsters
AAVpro titratieset (voor Real-Time PCR) Ver.2	Takara	6233	Voor het bepalen van het titer van AAV met behulp van RT-qPCR. Deze kit bevat DNase I, Lysis Buffer, Dilution Buffer, positieve controle, Taq II mix, primer forward, primer reverse, water
Glazuurazijn	Fisher Chemical	A/0360/PB17
ÄKTA pure 25	Cytiva	29018224	FPLC-systeem bestuurd door UNICORN-software, versie 6.3
Alkaline fosfatase-gekoppelde geiten-anti-muis	Invitrogen	31328
Amicon ultra-0,5 centrifugale filtereenheid	Merck Millipore	UFC5100
Amicon ultra-15 centrifugale filtereenheid	Merck Millipore	UFC9100
Benzonase Nuclease	Merck Millipore	E1014
Bromofenolblauw	Sigma-Aldrich	B0126
CFX96 Real-Time PCR detectiesysteem	Biorad	184-5096
ChemiDoc Touch Imaging System	Bio-Rad Laboratories	1708370
Chicken polyklonaal anti-GFP primaire antilichaam	Abcam	ab13970
Coomassie Blue G250	Fisher Chemical	C/P541/46
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Bioreagents	BP17225
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
ECF Substraat voor Western Blotting	Cytiva	RPN5785
FastDigest SmaI	Thermo Scientific	FD0663
FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin	FEI	Biotwin	Transmissie elektronenmicroscoop
Fetaal bovien serum	Biowest	S1810
Fluorescentie montagemedium	Dako	S3023
Formvar-carbon gecoate 200 mesh grid	TAAB Laboratories Equipment	F077/025
Gas evacuatieapparaat	RWD	R546W
Glycerol	Fisher BioReagents	10021083
Geiten polyklonaal anti-kip antilichaam, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11039
Hamilton naald 30G, Small Hub RN Naald, 25 mm, PST3	Hamilton	7803-07
Hamilton spuit (10 µL)	Hamilton	7653-01
HEK293T	American Type Culture Collection	CRL-11268
HiTrap Heparine HP 1 x 5 mL	Cytiva	17040701	Voorgepakte heparine kolom
HiTrap Heparine HP 5 x 1 mL	Cytiva	17040601	Voorgepakte heparine kolom
Immobilon-P PVDF Membraan	Merck Millipore	IPVH00010
Isofluraan	Braun	469860
Ketamine	Dechra Pharmaceuticals	N/A	Nimatek
Microcentrifugebuisjes met lage retentie (2 mL)	Fisher Scientific	11906965
Lunatic & Stunner Client software	Unchained Labs	N/A	Client analyse software versie 8.0.1.235. Software voor de opeenvolgende ultraviolet-zichtbare lichtabsorptie, statische lichtverstrooiing en dynamische lichtverstrooiing analyse van rAAV-monsters
Methanol	Fisher Chemical	M/4000/FP21
Muis monoklonaal anti-AAV, VP1, VP2 antilichaam (A69)	American Research Products	03-61057
Muis monoklonaal anti-AAV, VP1, VP2, VP3 antilichaam (B1)	American Research Products	03-61058
Neuro2a	American Type Culture Collection	CCL-131
Normaal geitenserum	Gibco	16210064
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	12738422
NZYColour Protein Marker II	NZYtech	MB09002
pAAV-CMV-scGFP	Addgene	32396	Addgene plasmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396
pAAV-CMV-ssGFP	Addgene	105530	Addgene plasmid # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530
pAAV2/9n	Addgene	112865	Addgene plasmid # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865
Paraformaldehyde	Acros Organics	10342243
PBS	Fisher BioReagents	BP2438
Penicilline-streptomycine	Gibco	15140-122
Pluronic F-68 Niet-ionogene oppervlakteactieve stof (100x)	Gibco	24040032
Polyethyleeniminee MAX, MW 40.000	Polysciences Europe	24765
R500 Series Compact Kleine Dieren Anesthesie Apparaat - Isofluraan	RWD	N/A
Sample Inlet Valve V9-IS	Cytiva	29027746
Sample pump P9-S	Cytiva	29027745
Natriumazied	Sigma-Aldrich	S