De rol van CD4 T-cel bij relapsing-remitting experimentele auto-immuun encefalomyelitis

Samenvatting

Een experimenteel auto-immuun encefalomyelitis (EAE) model bij muizen werd gebruikt om de rol van CD4 T-cellen in de initiatie en terugval van EAE te onderzoeken vanuit het perspectief van de activeringsfase en de immuuneffectfunctie.

Samenvatting

Multiple sclerose (MS) is een auto-immuunziekte die wordt gekenmerkt door de infiltratie van immuuncellen en demyelinisatie in het centrale zenuwstelsel (CZS). Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) dient als een prototypisch diermodel voor het bestuderen van MS. In deze studie wilden we de rol van CD4 T-cellen bij het ontstaan en terugvallen van EAE onderzoeken, met de nadruk op de activeringsfase en de immuunrespons. Om het EAE-muizenmodel te creëren, werden vrouwelijke muizen geïmmuniseerd met myeline-oligodendrocytglycoproteïne (MOG)35-55 geëmulgeerd met volledig Freund-adjuvans (CFA). Klinische scores werden dagelijks beoordeeld en de resultaten toonden aan dat muizen in de EAE-groep een klassiek relapsing-remitting-patroon vertoonden. Hematoxyline-eosine (H&E) en luxol fast blue (LFB) kleuringsanalyse onthulde significante infiltratie van ontstekingscellen in het CZS en demyelinisatie bij EAE-muizen. Wat de activeringsfase betreft, kunnen zowel CD4⁺CD69⁺ effector T (Teff) cellen als CD4⁺CD44⁺CD62L-effector memory T (Tem) cellen bijdragen aan de initiatie van EAE, maar de terugvalfase werd waarschijnlijk gedomineerd door CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem cellen. Bovendien zijn helper T (Th)1-cellen, in termen van immuunfunctie, voornamelijk betrokken bij het initiëren van de EAE. Zowel Th1- als Th17-cellen dragen echter bij aan de terugvalfase en de immunosuppressieve functie van regulerende T (Treg)-cellen werd geremd tijdens het EAE-pathologische proces.

Inleiding

Multiple sclerose (MS) is een auto-immuunziekte die wordt gekenmerkt door de infiltratie van het centrale zenuwstelsel (CZS) met immuuncellen en demyelinisatie ^1,2. Een recente studie heeft aangetoond dat het de meest voorkomende invaliderende ziekte is die jongeren treft, en dat de incidentie wereldwijd voortdurend toeneemt³. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een prototypisch diermodel voor MS dat vele aspecten van de ontstekingsfase van de menselijke MS⁴ simuleert. Vanuit het perspectief van immuunfuncties worden de initiële CD4 T-cellen die nog geen antigenen zijn tegengekomen, helper T(Th) 0-cellen genoemd. Deze cellen ondergaan rijpings- en activeringsprocessen om verschillende functies te vertonen. CD4 T-cellen kunnen worden gecategoriseerd in verschillende subsets op basis van hun specifieke functies, waaronder Th1, Th2, regulerende T (Treg), folliculaire helper T (Tfh), Th17, Th9 en Th22 cellen⁵. Het is een algemene consensus dat Th1- en Th17-celsubtypes cruciale pathogenesefactoren van EAE⁶ zijn. Th1-cellen kunnen interferon-γ (IFN-γ) afscheiden, en Th17-cellen scheiden interleukine (IL)-17 en andere ontstekingsfactoren af, die andere immuuncellen zoals microgliacellen en astrocyten kunnen activeren. Deze cellen produceren inflammatoire cytokines⁷, zoals IL-18, IL-12, IL-23 en IL-1β, die de immuunrespons van Th1/Th17-cellen verder kunnen induceren, wat resulteert in progressieve demyelinisatie en axonale schade. Vanuit het perspectief van de activeringsfase hebben CD4 T-cellen een vooraf bepaalde bestemming om zich te ontwikkelen tot afzonderlijke celsubsets en gedifferentieerde toestanden, waaronder naïeve, effector- en geheugen-T-cellen⁸. De initiële CD4 T-cellen prolifereren en differentiëren tot een verscheidenheid aan effectorsubsets met verschillende functies in verschillende omgevingen⁹. De meeste effectorcellen hebben een korte levensduur, waarbij een kleine populatie T-cellen zich ontwikkelt tot geheugen-T-cellen die snelle effectorfuncties vertonen wanneer ze dezelfde antigenen opnieuw tegenkomen en de gastheer zeer krachtige en langdurige bescherming bieden^10,11.

Hoewel huidig onderzoek suggereert dat CD4 T-cellen een belangrijke rol spelen bij de ontwikkeling van EAE, is het nog steeds onduidelijk hoe verschillende CD4 T-celsubsets, geclassificeerd op basis van hun activeringsfase en immuuneffectfunctie, bijdragen aan het ontstaan en terugvallen van EAE. In de huidige studie hebben we het EAE-model vastgesteld in C57BL6/J-muizen door myeline-oligodendrocytglycoproteïne (MOG)35-55-peptide te immuniseren en de initiatie en terugval van EAE te onderzoeken, met de nadruk op de activeringsfase en immuunfunctie van CD4 T-cellen.

Protocol

In totaal werden 18 vrouwelijke C57BL/6J-muizen in de leeftijd van zes tot acht weken willekeurig verdeeld in een controlegroep (n = 6) en een EAE-groep (n = 12) voor deze studie. Muizen werden gekocht van het proefdierencentrum van de Ningxia Medical University. Muizen werden gehuisvest in een ruimte met temperatuur- en vochtigheidsregeling met een licht/donker-cyclus van 12 uur en vrije toegang tot vers water en voedsel. Ethische goedkeuring werd verkregen van de Experimental Animal Ethics Committee van de Ningxia Medical University voordat de studie begon.

1. Ontwikkeling van relapsing remitting EAE in C57BL/6 muizen

1. Ontbinding van reagens
   1. Los 5,4 mg MOG35-55 (materiaaltabel) op in 1,8 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Weeg 12,6 mg Mycobacterium tuberculosis H37RA af (Materiaaltabel) en voeg dit toe aan 1,8 ml complete Freund's adjuvansoplossing (CFA) (Materiaaltabel). Los 360 μL kinkhoesttoxine (PTX; Tabel van materialen) in 7,2 ml PBS met behulp van een pipet (Materiaaltabel).
2. Bereiding van de emulsie van MOG35-55 en CFA
   1. Pipetteer MOG35-55-oplossing en CFA-oplossing met behulp van twee spuiten van 5 ml die in stap 1.1 zijn voorbereid en sluit ze aan met een T-stukklep. Meng continu op ijs gedurende 1 uur tot een melkachtige water-in-olie-emulsie is verkregen.
      OPMERKING: De emulsie wordt met succes bereid wanneer deze op het wateroppervlak drijft zonder zich te verspreiden nadat deze in het water is gevallen.
3. Verdoving bij muizen
   1. Schroef de vuldop aan de voorkant van de verdamper van het anesthesieapparaat los. Giet langzaam 20 ml isofluraan langs de afdichtschroef in het midden en vergrendel de vuldop. Schakel de schakelaar van de T-knop om ervoor te zorgen dat de luchtstroom van de verdamper van de anesthesiemachine wordt gecommuniceerd met de anesthesie-inductiebox (Materiaaltabel).
   2. Sluit de voeding van de luchtpomp aan, zet de luchtpompschakelaar aan en draai en stel de luchtbronklep aan de voorkant van de zuurstofstroommeter af zodat de uitgaande gasstroom 400 ml/min is. Open de verdamper, stel de inductieconcentratie in op 3% en wacht tot de verdoving de inductiebox vult.
   3. Plaats de muizen ongeveer 1 minuut later in de inductiebox, sluit vervolgens de inductiebox en wacht tot de muizen in diepe slaap, spierontspanning en gestage ademhaling zijn; dan kunnen de muizen worden bepaald als de ideale staat van anesthesie (Materiaaltabel).
      NOTITIE: Schakel de schakelaar van het T-slagventiel om ervoor te zorgen dat de luchtstroom van de verdamper van het anesthesieapparaat wordt gecommuniceerd met het anesthesiemasker totdat de muizen volledig verdoofd zijn.
4. Immunisatie van muizen
   1. Injecteer subcutaan 200 μl emulsie bereid in stap 1.2 met behulp van een spuit van 1 ml met de naald op vier plaatsen op de rug van de muis, ongeveer 0,5 cm aan beide zijden van de wervelkolom in de oksel en liesvlak¹² bij muizen van de EAE-groep. Gebruik 50 μL emulsie op elke plaats (Materiaaltabel).
5. PTX-injectie
   1. Haal de muizen uit de kooi door de staart te vangen en plaats deze op de kooidraad. Houd de staart van muizen vast met de 4e en 5e vinger en trek deze voorzichtig omhoog om de trend van het lichaam en de ledematen naar voren te behouden. Pak de kop van de muizen vast en vang de huid op de rug van de muizen vast met de middel- en ringvinger.
   2. Injecteer 0 uur en 48 uur na immunisatie in stap 1.4 200 μL PTX intraperitoneaal op een positie van 0,5 cm langs weerszijden van de middenbuiklijn met een penetratiediepte van 1-2 cm met behulp van een spuit van 1 ml met naald (Materiaaltabel).
      OPMERKING: Alvorens PTX 48 uur na immunisatie van MOG35-55 te injecteren, is het noodzakelijk om muizen te verdoven met behulp van de procedures beschreven in stap 1.3. De muizen moeten worden verzorgd totdat ze weer voldoende bewustzijn hebben om sternale lighouding te behouden.
   3. Voor de muizen in de controlegroep: behandel met zoutoplossing volgens dezelfde methode en beoordeel de klinische score dagelijks.
      OPMERKING: Muizen werden beoordeeld op tekenen van EAE volgens de volgende schaal¹³: 0 = geen ziektesymptomen, 1 = volledige verlamming van de staart, 2 = gedeeltelijke achterverlamming/zwakte, 3 = volledige verlamming van de achterpoten, 4 = verlamming van de voor- en achterpoten en 5 = stervende toestand.

2. Histologische kleuringsanalyse

1. De inzameling van hersenen
   1. Verdoof de muizen volgens stap 1.3. Euthanaseer de muizen door cervicale dislocatie en open de borstkas om het hart volledig bloot te leggen. Snijd de oorschelp door en perfuseer langzaam met een voorgekoelde zoutoplossing met behulp van een spuit van 20 ml met naald bij de linkerventrikel totdat de lever grijs en wit wordt.
   2. Doordrenk langzaam met 4% paraformaldehyde totdat de staartpunt omhoog draait, het lichaam stijf wordt en de lever taai wordt. Onthoofd het hoofd, snijd de schedel, verzamel de hersenen met een pincet en fixeer het gedurende 24 uur in een 4% paraformaldehyde-oplossing (Materiaaltabel).
2. Bereiding van paraffinesecties
   1. Gradiënt dehydratatie: Dompel het hersenweefsel uit stap 2.1 achtereenvolgens onder in 70% ethanol gedurende 1 uur, 80% ethanol gedurende 1 uur, 95% ethanol gedurende 1 uur, watervrije ethanol gedurende 1 uur, vervang door verse watervrije ethanol, blijf onderdompelen gedurende 1 uur (Materiaaltabel).
   2. Transparantie: Dompel het hersenweefsel uit stap 2.2.1 gedurende 30 minuten onder in xyleen, vervang het door vers xyleen en blijf onderdompelen totdat de weefsels transparant zijn (Materiaaltabel).
   3. Inbedding: Veranker het hersenweefsel uit stap 2.2.2 gedurende 1 uur in paraffine, vervang door verse paraffine, blijf 1 uur inbedden, snijd in plakjes van 6 μm na het loskomen van de vorm, plaats het glaasje in heet water, droog af bij 37 °C, bewaar bij kamertemperatuur (Materiaaltabel).
   4. Ontwaxen: Dompel hersenweefsel uit stap 2.2.3 20 minuten onder in xyleen, vervang door vers xyleen, blijf 20 minuten onderdompelen, plaats 5 minuten in watervrije ethanol, vervang door verse watervrije ethanol, dompel 5 minuten onder, 75% ethanol gedurende 5 minuten, spoel af met kraanwater (Materiaalopgave).
   5. Hematoxyline-eosine (H&E) kleuring: Kleur weefsels uit stap 2.2.4 3-5 minuten met hematoxylineoplossing en spoel vervolgens af met kraanwater. Behandel de weefsels met een hematoxylinedifferentiatieoplossing, kort en spoel grondig af met kraanwater. Behandel de weefsels met hematoxyline Scott kraanblauwoplossing en spoel af met kraanwater. Dompel 5 minuten onder in 85% ethanol en 5 minuten in 95% ethanol en kleur stappen 5 minuten met eosinekleurstof (Materiaaltabel).
   6. Drogen: Dompel de weefsels uit stap 2.2.5 achtereenvolgens 5 minuten onder in watervrije ethanol, vervang door verse watervrije ethanol, blijf 5 minuten onderdompelen, vervang door verse watervrije ethanol, dompel 5 minuten onder, xyleen gedurende 5 min, vervang door vers xyleen, dompel 5 minuten onder, sluit af met neutrale gom (Materiaaltabel).
   7. Observeer met een microscoop de hersenweefsels en voer beeldacquisitie en -analyse uit (Materiaaltabel).

3. Analyse van LFB-kleuring

1. Verzameling myelineschede: Snijd de ruggengraat van de muis af van het hoofduiteinde 2 segmenten omhoog naar het staartuiteinde 2 segmenten naar beneden, blaas het ruggenmerg uit tot aan het staartuiteinde en fixeer het ruggenmerg gedurende 4% 24 uur in een paraformaldehyde-oplossing van 4%.
   OPMERKING: De myelineschede is in stap 2.1 van dezelfde muizen geoogst en de stappen voor hartperfusie zijn hetzelfde als in 2.1.
2. Deparaffinisatie en rehydratatie van paraffinesecties: Plaats de dia's uit stap 3.1 achtereenvolgens 20 minuten in xyleen, vervang ze door vers xyleen, blijf 20 minuten onderdompelen, watervrije ethanol gedurende 5 minuten, vervang door verse watervrije ethanol, dompel deze 5 minuten onder, 75% alcohol gedurende 5 min, was met kraanwater.
3. Snelle blauwe kleuring: Plaats luxol fast blue staining solution A in een oven van 60 °C en verwarm 30 minuten voor. Leg de glaasjes uit stap 3.2 in oplossing A en bedek ze 1 uur met een plastic membraan om te voorkomen dat de plakjes uitdrogen, haal vervolgens de glaasjes eruit en was ze snel met kraanwater.
4. Achtergronddifferentiatie: Plaats de objectglaasjes uit stap 3.3 2 s in luxol snelle blauwe kleuringsoplossing B (terwijl de kleurstof heet is) en dompel ze direct onder in luxol snelle blauwe kleuringsoplossing C voor differentiatie gedurende 15 s, was met water totdat de myelineschede blauw is en de achtergrond bijna kleurloos is.
5. Eosin tegenkleuring: Zet de dia's uit stap 3.4 in de oven op 65 °C om te drogen. Als je klaar bent, haal je ze uit de oven en laat je ze afkoelen. Zet de glaasjes gedurende 1 minuut in 95% ethanol en eosine tegenkleuring.
6. Drogen en afdichten: Plaats de dia's uit stap 3.5 achtereenvolgens in watervrije ethanol 5 min, vervang door verse watervrije ethanol, blijf 5 minuten onderdompelen, vervang opnieuw door verse watervrije ethanol, blijf 5 minuten onderdompelen, xyleen 5 min, vervang door vers xyleen, dompel 5 minuten onder. Was en droog de monsters en sluit ze af met neutrale gom.
7. Microscooponderzoek: Verzamel en analyseer afbeeldingen met behulp van een rechtopstaande optische microscoop (Materiaaltabel).

4. Analyse van flowcytometrie

1. Open de buikholte van muizen. Extraheer de milten met een pincet en hak ze met een schaar in kleine stukjes van 1,5-2,5 cm in PBS op ijs. Maal de milt in 10 ml RPMI-1640 met 2% foetaal runderserum (FBS) met behulp van een spuitzuiger van 2,5 ml en duw deze door een celzeef van 70 μm om eencellige suspensie te verkrijgen (Materiaaltabel).
   OPMERKING: De milten zijn geoogst van dezelfde muizen in stap 2.1.
2. Breng de in stap 4.1 verkregen suspensie over in buisjes van 15 ml en lyseer deze gedurende 10 minuten met behulp van 5 ml lysisbuffer van rode bloedcellen op ijs. Wassen met RPMI-1640 met 2% FBS, centrifugeren op 350 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en suspendeer cellen met RPMI-1640 met 2% FBS.
3. Tel de cellen met een automatische cellenteller (Materiaaltabel) en pas de concentratie aan op 1 x 10⁶ cellen/ml.
4. Pipetteer 100 μL celsuspensie in buisjes van 1,5 ml en incubeer met 1 μL anti-muis CD16/32 antilichaam¹⁴ (0,5 mg/ml) gedurende 30 minuten om niet-specifieke kleuring te blokkeren. Wassen met RPMI-1640 en centrifugeren op 350 x g gedurende 5 min, gooi het bovenstaande weg. Resuspendeer de cellen in 100 μl RPMI-1640 met 2% FBS.
5. Kleuring met antilichamen specifiek voor CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC) en CD69 (BV674) voor Teff-cellen¹⁵ gedurende 30 minuten, 2 μL voor elk antilichaam. Kleuring met antilichamen specifiek voor CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC), CD44 (BV421) en CD62L (PE) voor Tem-cellen¹⁶ gedurende 30 minuten, 2 μL voor elk antilichaam. Wassen met RPMI-1640 en centrifugeren op 350 x g gedurende 5 minuten, gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen opnieuw in 350 μL PBS. Analyseer de celverhouding met behulp van een flowcytometer en de bijbehorende software (Materiaaltabel).

5. Analyse van cytokinen door cytometrische bead array

1. Gebruik de cytometrische kralenreeks (materiaaltabel) om IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, tumornecrosefactor (TNF)-α en IFN-γ in muizenhersenen te meten, methoden zoals hieronder beschreven.
2. Verzamel muizenhersenen zoals beschreven in stap 2.1.
3. Extractie van totaal eiwit: Snijd en weeg 50 mg hersenweefsel (drie hersenen in de controlegroep, EAE-groep in de piekfase en RR-fase). Plaats de hersenen in buisjes van 1,5 ml en voeg 500 μL lysisbuffer toe die PMSF, proteaseremmer en fosfataseremmers bevat.
4. Snijd de hersenen in kleine stukjes rond 1 mm³, extraheer ze met een ultrasone homogenisator bij 400 W, 5 s AAN en 5 s UIT; Herhaal dit 5x. Plaats de buis 10 minuten op ijs, centrifugeer gedurende 5 minuten op 12000 x g en verzamel het bovenstaande (materiaaltabel).
5. Bereid de Th1/Th2/Th17-cytokinestandaarden van muizen voor zoals hieronder beschreven.
   1. Open een flesje met gevriesdroogde muis Th1/Th2/Th17-standaarden. Breng de standaarden over in een conische polypropyleen buis van 15 ml. Label de bovenkant van de tube als standaard.
   2. Reconstitueer de standaarden in 2,0 ml analyseverdunningsmiddel. Laat de gereconstitueerde standaard 15 minuten bij kamertemperatuur in evenwicht blijven. Meng het gereconstitueerde eiwit voorzichtig door te pipetteren.
   3. Etiketteer de buisjes van 12 mm x 75 mm en rangschik ze in de volgende volgorde van verdunning: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 en 1:256. Pipetteer 300 μL analyseverdunningsmiddel in elke gelabelde buis.
   4. Seriële verdunningen uitvoeren: Breng 300 μl van de bovenste standaard over in de 1:2 verdunningsbuis en meng grondig door te pipetteren. Ga door met seriële verdunningen door 300 μL over te brengen van de 1:2 buis naar de 1:4 buis en zo verder tot de 1:256 buis. Bereid een buis van 12 x 75 mm voor die alleen het analyseverdunningsmiddel bevat om als negatieve controle van 0 pg/ml te dienen.
      OPMERKING: Meng grondig door te pipetteren. Draaikolken niet om te voorkomen dat de antilichaamkoppeling op de microbeads eraf valt.
   5. Om de Th1/Th2/Th17 cytokine-afvangkralen van de muis te mengen, bereidt u 19 buisjes voor, inclusief standaarden met 3 monsters in elke groep (controlegroep, EAE-groep in piekstadium en RR-stadium) voor het experiment. Draai de vangparelsuspensie krachtig gedurende 5 s voordat u deze mengt. Voeg 190 μL van elke vangparel toe aan een enkele buis en label deze als gemengde opvangkorrels. Draai het kralenmengsel grondig.
      OPMERKING: De antilichaam-geconjugeerde kralen zullen na verloop van tijd uit de suspensie bezinken. Het is noodzakelijk om de injectieflacon te vortexen voordat u een aliquot met kralenophanging neemt.
   6. Om de test uit te voeren, vortex de mix vangkralen. Voeg 50 μL kralen toe aan alle analysebuisjes. Voeg 50 μl Th1/Th2/Th17 cytokinestandaardverdunningen van muizen toe aan de controlebuisjes zoals in tabel 1.
   7. Voeg 50 μL van het Th1/Th2/Th17 PE-detectiereagens van de muis toe aan alle analysebuisjes. Incubeer de analysebuisjes gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en bescherm ze tegen licht. Voeg 1 ml wasbuffer toe aan elke analysebuis en centrifugeer gedurende 5 minuten op 200 x g . Zuig het bovenstaande uit elke analysebuis op en gooi het voorzichtig weg.
   8. Voeg 300 μL wasbuffer toe aan elke analysebuis om de parelkorrel opnieuw te suspenderen. Analyseer de cytokinegegevens van muis Th1/Th2/Th17 met behulp van FCAP Array-software (Table of Materials).

  

Resultaten

Beoordeling van klinische scores
Zoals te zien is in figuur 1, vertoonden de muizen in de controlegroep geen klinische symptomen. De muizen in de EAE-groep, die waren geïmmuniseerd met MOG35-55, vertoonden ongeveer 12 dagen na immunisatie staartverlamming. Op dag 16 bereikten de symptomen volledige verlamming van de achterpoten (gedefinieerd als piekstadium, piek). Daarna werden de symptomen geleidelijk weggenomen. De klinische symptomen van muizen verergerden rond dag 25 en bereikten volledige verlamming van de achterpoten op ongeveer dag 30 (gedefinieerd als een recidiverend stadium, RR). De symptomen duurden met name langer dan de vorige keer, waardoor een klassieke relapsing-remitting-functie werd ontwikkeld. De belangrijkste manifestatie van relapsing-remitting EAE-muizen ervaren verschillende stadia van uitbraak, remissie en terugval tijdens de progressie van de ziekte, die een bepaalde periodiciteit en fluctuatie hebben.

Histologische analyse
De muizen van de controlegroep vertoonden een intacte hersenweefselstructuur met gelijkmatig verdeelde en duidelijk gedefinieerde bloedvaten, zonder enige infiltratie van ontstekingscellen. (Figuur 2A). In het piekstadium van de muizen van de EAE-groep werd een significante infiltratie van ontstekingscellen in de hersenen waargenomen (Figuur 2B), waarbij manchetachtige veranderingen rond bloedvaten werden gevormd (aangegeven door een rode pijl). Evenzo was er bij muizen uit de EAE-groep in het RR-stadium duidelijke infiltratie van ontstekingscellen (Figuur 2C), met een overheersende aggregatie rond bloedvaten (aangegeven door rode pijl).

Analyse van LFB-kleuring
In de controlegroep leek de myelineschede van de spinale witte stof blauw, wat aangeeft dat de structuur intact en dicht opeengepakt was (Figuur 3A). In het piekstadium van de EAE-groep vertoonde de witte stof van de wervelkolom een lichtblauwe of witte kleur; de structuur leek los en discontinu te zijn, met een significante aanwezigheid van vacuolaire degeneraties aangegeven door een rode pijl (Figuur 3B). In het RR-stadium van de EAE-modelgroep werd een uitgebreid verlies van myeline van witte stof in het ruggenmerg waargenomen. De structuur leek los te zitten en er kon een aanzienlijk aantal vacuolaire degeneraties worden waargenomen (aangegeven door rode pijlen; Figuur 3C).

Flowcytometrie-test
De resultaten weergegeven in figuur 4A,B toonden een significante toename aan van het aandeel CD4⁺CD69⁺ Teff-cellen in EAE-muizen in het piekstadium in vergelijking met de controlegroep (P < 0,0001). Bovendien nam het aandeel van deze cellen ook toe tijdens de RR-fase, hoewel het verschil niet statistisch significant was (P > 0,05). Figuur 4C,D toonde een opmerkelijke toename van het aandeel CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem-cellen in EAE-muizen in zowel het piek- als het ^RR-stadium, in vergelijking met de controlegroep (P < 0,0001).

Cytokine gemeten door cytometrische kralenarray
De resultaten weergegeven in figuur 5 tonen aan dat, in vergelijking met de controlegroep, de niveaus van IL-4 (P < 0,0001), IL-6 (P < 0,001), IFN-γ (P < 0,0001) en TNF-α (P < 0,0001) significant verhoogd waren in de EAE-groep in het piekstadium. Hoewel de expressie van IL-17A ook toenam, was het verschil niet statistisch significant (P > 0,05). Bovendien vertoonde het niveau van IL-2 geen verandering tijdens het piekstadium van EAE-muizen (P > 0,05); het nam echter aanzienlijk toe tijdens de RR-fase (P < 0,01). Bovendien waren zowel TNF-α (P < 0,001) als IL-17A (P < 0,01) expressies in de RR-fase significant hoger dan die waargenomen in de controlegroep. Omgekeerd was de expressie van IL-10 in de EAE-groep significant lager dan die in de controlegroep, zowel in de piek- als in de RR-stadia (P < 0,0001).

Figuur 1: Beoordeling van de klinische score. De klinische score werd dagelijks beoordeeld en laat zien dat muizen een klassieke relapsing-remitting EAE ontwikkelden die was geïmmuniseerd door MOG35-55. (A) Het diagram van de symptoomprogressie van de EAE-muizen. (B) De beoordeling van EAE-muizen aan de hand van gemiddelde klinische scores. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, n = 6. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van eenrichtings-ANOVA met post-hoc vergelijkingen om statistisch significante verschillen te beoordelen. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Microscopische kaart van H&E-kleuring in de hersenen. (A) Muizenhersenen in de controlegroep. (B) Hersenen van EAE-muizen in piekstadium. Ontstekingscellen werden in het piekstadium in de hersenen geïnfiltreerd bij muizen uit de EAE-groep en verspreid over bloedvaten om een manchetachtige verandering te vormen (rode pijl). (C) Hersenen van EAE-muizen in RR-stadium. Ontstekingscellen in muizen van de EAE-groep met het RR-stadium geaggregeerd rond bloedvaten (rode pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Microscopische kaart van de LFB-kleuring van de myelineschede. (A) Myelineschede van muizen in de controlegroep. (B) EAE-muizen myelineschede in piekstadium. De witte stof van de wervelkolom was lichtblauw of wit, de structuur was los en discontinu, en er verscheen een groot aantal vacuolaire degeneraties (rode pijl). (C) EAE-muizen myelineschede in RR-stadium. De myeline van de witte stof van het ruggenmerg ging op grote schaal verloren, de structuur zat los en er verscheen een groot aantal vacuolaire degeneraties (rode pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Immunisatie door MOG35-55 induceerde de opregulatie van de verhouding CD4 Teff- en Tem-cellen in zowel het piek- als het RR-stadium bij EAE-muizen. (A) Illustratief stroomdiagram dat de immunokleuring van CD4⁺CD69⁺ -cellen weergeeft. (B) Percentage CD4⁺CD69⁺ Teff-cellen. (C) Illustratief stroomdiagram dat de immunokleuring van CD44⁺CD62L^+- cellen weergeeft (gate op CD4 T-cellen). (D) Percentage CD44⁺CD62L⁺ Tm-cellen. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, n = 5. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van eenrichtings-ANOVA met post-hoc vergelijkingen om statistisch significante verschillen te beoordelen. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Niveau van cytokinen in de hersenen van muizen geanalyseerd door cytometrische kralenarray. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, n = 3. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van eenrichtings-ANOVA met post-hoc vergelijkingen om statistisch significante verschillen te beoordelen. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Buis etiket	Concentratie (pg/ml)	Cytokine Standaard verdunning
1	0 (negatieve controle)	geen standaardverdunning (alleen analyseverdunningsmiddel)
2	20	1:256
3	40	1:128
4	80	1:64
5	156	1:32
6	312.6	1:16
7	625	1:8
8	1250	1:4
9	2500	1:2
10	5000	Topklasse

Tabel 1: Lijst van cytokinestandaardverdunningen aan de controlebuisjes.

Discussie

MS is de meest voorkomende auto-immuundemyeliniserende ziekte van het CZS, die wereldwijd miljoenen mensen treft¹⁷. EAE is het typische diermodel voor het simuleren van de klinisch pathologische kenmerken van MS¹⁸. Studies hebben aangetoond dat personen met MS cognitieve stoornissen en andere handicaps ervaren als gevolg van de degeneratie van axonen en neuronen in het CZS 19,20,21. Op het hoogtepunt en het RR-stadium van het EAE-model vertoonden muizen verlamming in hun staarten en achterpoten. Bovendien werd waargenomen dat ontstekingscellen in het CZS infiltreerden, wat leidde tot verschillende gradaties van verlies van myelineschede. Deze bevindingen wezen op de succesvolle totstandkoming van het EAE-model in dit experiment.

Het emulgingsproces van MOG35-55 en CFA moet op ijs worden uitgevoerd om de degradatie van MOG35-55 te voorkomen die wordt veroorzaakt door warmteontwikkeling tijdens het homogenisatieproces. PTX wordt intraperitoneaal toegediend om de vasculaire permeabiliteit te verbeteren, waardoor T-cellen gemakkelijk de bloed-hersenbarrière kunnen passeren en de myelineschede rond neuronen kunnen bereiken²². Wat speciale aandacht vraagt, is dat in gevallen waarin muizen verlamd raken en niet zelf kunnen eten of drinken, het belangrijk is om voedsel- en waterbakken in hun kooi te voorzien of ze handmatig te voeren om overmatige dorst en honger te voorkomen.

Flowcytometrie werd gebruikt om het aandeel CD4⁺CD69⁺ Teff-cellen en CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem-cellen te analyseren. Het aandeel CD4⁺CD69⁺ Teff-cellen in de milt van EAE-muizen was opmerkelijk hoger gereguleerd in het piekstadium. Bovendien was het hoger dan dat van de controlegroep in de terugvalfase, hoewel dit verschil geen statistische significantie bereikte. Aan de andere kant was het aandeel CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem-cellen significant hoger in de EAE-muizen in vergelijking met de controlegroep in zowel het piek- als het ^RR-stadium. Dit suggereerde dat bij de initiatie van EAE zowel CD4⁺CD69⁺ Teff als CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem-cellen in het piekstadium betrokken zouden kunnen zijn, terwijl het RR-stadium misschien voornamelijk wordt gedomineerd door CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem-cellen. CD69 is het vroegste membraanoppervlaktemolecuul dat tot expressie komt tijdens de activering van lymfocyten. Het speelt een cruciale rol bij het moduleren van de adhesie en migratie van T-cellen, waardoor immuuncellen worden geholpen bij het identificeren en lokaliseren van infectie- of ontstekingsplaatsen in het lichaam²³. T-cellen in rust brengen geen CD69 tot expressie, maar wanneer ze worden gestimuleerd en geactiveerd door anti-CD3/TCR-activatoren kunnen ze inductief tot expressie worden gebracht²⁴. Na de effectorfase ondergaat een aanzienlijk deel van de T-cellen apoptose, omdat ze niet verder kunnen differentiëren. Deze vermindering in aantal wordt voornamelijk veroorzaakt door de afwezigheid van pro-survival cytokines, waaronder IL-2, die worden geproduceerd tijdens antigeenstimulatie. Bovendien draagt de neerwaartse regulatie van receptoren voor deze cytokinen verder bij aan dit klonale contractiefenomeen²⁵. Bovendien leidt klaring van het infectieuze agens door middel van een adaptieve immuunrespons tot klonale contractie van T-cellen, waardoor er uiteindelijk minder langlevende geheugencellen overblijven om immuunrespons te geven aan de gastheer in geval van herinfectie met de ziekteverwekker²⁶. In de huidige studie was het aandeel CD4⁺CD69⁺ T-cellen opmerkelijk verhoogd in het piekstadium, maar nam het af in het RR-stadium, wat aangaf dat CD4 Teff-cellen niet in staat zijn om gedurende een bepaalde periode te overleven en uiteindelijk apoptose ondergaan, slechts een klein deel van de antigeenspecifieke T-cellen ontwikkelt zich tot langlevende geheugen-T-cellen. Tem-cellen hebben een lage expressie van CD62L. Ze zijn echter in staat om enkele chemokinereceptoren en adhesiemoleculen tot expressie te brengen die hun migratie naar ontstoken weefsels vergemakkelijken. Na reactivering van het antigeen is de proliferatiesnelheid relatief traag, maar cytokinen worden snel vrijgegeven om de effectorfunctie te initiëren²⁷. In de huidige studie kunnen de antigenen bij muizen die uit de emulsie vrijkwamen en het immuunsysteem opnieuw aanvielen, Tem-cellen worden gereactiveerd en een groot aantal cytokines afgeven, zoals IL-6 en IFN-γ, wat kan resulteren in de terugval van EAE-muizen.

De primaire pro-inflammatoire CD4 T-celpopulaties geassocieerd met auto-immuunziekten (inclusief MS) zijn Th1-cellen die IL-2-, IL-6-, IFN-γ-, TNF-α- en Th17-cellen afscheiden die IL-17 afscheiden. Het is aangetoond dat Th1-cel-geassocieerde IFN-γ een direct nadelig effect kan hebben op oligodendrocyten, wat resulteert in schade aan de CZS-neuronen van de patiënt²⁸. Th17-cellen spelen ook een belangrijke rol bij verschillende auto-immuunziekten, waaronder MS. Onderzoek heeft verhoogde niveaus van Th17-cellen en IL-17-mRNA waargenomen in hersenlaesies van MS-patiënten in vergelijking met personen zonder de ziekte²⁹. Treg-cellen, die worden gekenmerkt door de productie van IL-10 en^{TGF-β 30}, hebben een immunosuppressief effect en spelen een cruciale rol bij het handhaven van de tolerantie van het immuunsysteem voor zelfcomponenten, waardoor het lichaam de immuunhomeostase kan behouden. Hier zagen we een significante opregulatie van IL-4, IL-6, IFN-γ en TNF-α expressie in de EAE-groep in het piekstadium. Bovendien was de expressie van IL-17A ook verhoogd, hoewel er geen betekenis was. Daarentegen waren de expressieniveaus van TNF-α en IL-17A in de RR-fase significant hoger in vergelijking met de controlegroep. Dit suggereert dat de piekfase van EAE voornamelijk wordt aangedreven door Th1-cellen in plaats van Th17-cellen, terwijl de RR-fase van EAE werd geïnitieerd door zowel de Th1- als de Th17-cellen. Het is vermeldenswaard dat de expressie van IL-10 in de EAE-groep tijdens zowel de piek- als de RR-periode aanzienlijk lager was dan die in de controlegroep, wat suggereert dat de immunosuppressieve functie van Treg-cellen werd belemmerd tijdens de pathologische processie van EAE.

Concluderend suggereren onze studies de succesvolle oprichting van een EAE-model met relapsing-remitting bij muizen door immunisatie met MOG35-55-peptide. Vanuit het perspectief van de actieve fase werd het piekstadium van EAE waarschijnlijk geïnitieerd door CD4⁺CD69⁺ Teff en CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem-cellen, terwijl de terugval van het EAE RR-stadium voornamelijk zou kunnen worden gedomineerd door CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem-cellen. Vanuit het perspectief van de immuuneffectfunctie werd het piekstadium van EAE voornamelijk niet geïnitieerd door Th17-cellen, maar door Th1-cellen. Het RR-stadium van EAE werd echter geïnitieerd door Th1- en Th17-cellen. De immunosuppressieve functie van Treg-cellen werd geremd tijdens het pathologische proces van EAE. Desalniettemin vereisen de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de activering van Th1/Th17-cellen en de onderdrukking van Treg-cellen verder onderzoek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anesthesieapparaat verdamper	Norvap	20-17368
Isofluraan	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.	792632
70 μm celstrainer	XIYAN Co.,Ltd.	15-1070
Alexa Fluor 700 anti-muis CD45 Antilichaam	Biolegend	103128
APC anti-muis CD4 Antilichaam	Biolegend	100616
Automatische celteller	Jiangsu JIMBIO technology Co., LTD	JIMBIO iCyta S2
BD* Cytometric Bead Array (CBA) Muis Th1/Th2/Th17 CBA Kit	BD Biosciences	560485
Biotine anti-muis CD16/32 Antilichaam	Biolegend	101303
Brilliant Violet 510 anti-muis CD69 Antilichaam	Biolegend	104532
BV786 Rat Anti-Muis CD62L(MEL-14)	BD Pharmingen	563109
Column Tissue&Cell Proteïne Extractie Kit	Shanghai Epizyme Biomedical Technology Co., Ltd	PC201Plus
Complete Freund's Adjuvans	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.	SLCH4887
Dehydrator	DIAPATH	Donatello
Wegwerpsiring (1 mL)	Yikang Group	210820
Wegwerpsiring (2,5 mL)	Yikang Group	210820
Wegwerpsiring (5 mL)	Yikang Group	210820
Verfmachine	DIAPATH	Giotto
Inbeddingsmachine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5
Ethanol	SCRC	100092683
Fetaal Rundserum	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	FSP500
FITC Hamster Anti-Muis CD3e(145-2C11)	BD Pharmingen	553062
Flowcytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCelesta
Flowcytometer	Becton,Dickinson and Company	Accuri C6
Flow Jo software	BD Biosciences	10.8.1
Bevroren platform	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5
Glijplaatje	Servicebio	G6004
HE-kleurstofoplossingsset	Servicebio	G1003
Hematoxyline-Eosine oplossing	Servicebio	G1002
Hoge snelheid gekoelde centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Mogafugo8R
Beeldvormingssysteem	Nikon	NIKON DS-U3
Luxol fast blue kleuringskit	Servicebio	G1030
Ms CD44 BV421 IM7	BD Pharmingen	564970
Mycobacterium tuberculosis H37RA	BD Pharmingen	231141
Myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG35-55)	AnaSpec	AS-60130-1
Neutrale gom	SCRC	10004160
Organizer	KEDEE	KD-P
Oven	Labotery	GFL-230
Pathologie slicer	Leica	RM2016
Pertussis Toxine van Bordetella pertussis	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.	P7208
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Servicebio	G4202
Pipet 0,5-10 μL	DLAB Scientific	7010101004
Pipet 100-1000 μL	DLAB Scientific	7010101014
Pipet 20-200 μL	DLAB Scientific	7010101009
RPMI-1640	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	PM150110
Tee klep	Guangdong Kanghua Medical Co., LTD	A06
Weefselverspreider	Zhejiang Kehua Instrument Co.,Ltd	KD-P
Rechtopstaande optische microscoop	Nikon	NIKON ECLIPSE E100
Xyleen	SCRC	10023418