Methodenartikel

Voorspelling en validatie van eiwitdoelen van een verbinding met kleine moleculen

3.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66564

⸱

23 februari 2024

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Het experiment dat hier wordt gebruikt, toont een methode van moleculaire docking in combinatie met cellulaire thermische verschuivingstest om de interactie tussen kleine moleculen en eiwitdoelen te voorspellen en te valideren.

Samenvatting

Eiwitten zijn van fundamenteel belang voor de menselijke fysiologie, waarbij hun doelwitten cruciaal zijn in onderzoek en de ontwikkeling van geneesmiddelen. De identificatie en validatie van cruciale eiwitdoelen is een integraal onderdeel geworden van de ontwikkeling van geneesmiddelen. Moleculaire docking is een computationeel hulpmiddel dat veel wordt gebruikt om eiwit-ligandbinding te onderzoeken, vooral in de context van geneesmiddel- en eiwitdoelinteracties. Voor de experimentele verificatie van de binding en om rechtstreeks toegang te krijgen tot de binding van het geneesmiddel en zijn doelwit, wordt de cellulaire thermische verschuivingstest (CETSA) -methode gebruikt. Deze studie had tot doel moleculaire docking te integreren met CETSA om interacties tussen geneesmiddelen en vitale eiwitdoelen te voorspellen en te valideren. In het bijzonder hebben we de interactie tussen xanthatine en Keap1-eiwit voorspeld, evenals de bindingsmodus door middel van moleculaire docking-analyse, gevolgd door verificatie van de interactie met behulp van de CETSA-test. Onze resultaten toonden aan dat xanthatine waterstofbruggen kon aangaan met specifieke aminozuurresiduen van het Keap1-eiwit en de thermostabiliteit van het Keap1-eiwit kon verminderen, wat aangeeft dat xanthatine direct zou kunnen interageren met het Keap1-eiwit.

Inleiding

Eiwitten zijn zeer belangrijke macromoleculen in levende organismen en bezitten een breed scala aan unieke functies in cellen, zoals membraansamenstelling, vorming van cytoskeletten, enzymactiviteit, transport, celsignalering en betrokkenheid bij zowel intracellulaire als extracellulaire mechanismen 1,2,3. Eiwitten manifesteren hun biologische functies voornamelijk door specifieke interacties met een verscheidenheid aan moleculen, waaronder andere eiwitten, nucleïnezuren, liganden van kleine moleculen en metaalionen 1,4. Liganden zijn kleine moleculaire verbindingen die specifiek binden aan eiwitten in een organisme. De interactie tussen eiwitten en liganden vindt plaats op specifieke plaatsen op het eiwit, de bindingsplaatsen genoemd, ook wel bekend als de bindingspockets5. In medicinaal-chemisch onderzoek ligt de focus op het identificeren van sleuteleiwitten die duidelijk geassocieerd zijn met ziekten, die dienen als doelwit voor geneesmiddelen6. Daarom is het verkrijgen van een diepgaand begrip van de bindingsplaatsen tussen eiwitten en liganden van het grootste belang bij het bevorderen van de ontdekking, het ontwerp en het onderzoek van geneesmiddelen 7,8.

Moleculaire docking is een veelgebruikt computationeel hulpmiddel voor het bestuderen van eiwit-ligandbinding, waarbij de driedimensionale structuren van eiwitten en liganden worden gebruikt om hun primaire bindingsmodi en affiniteiten te verkennen bij het vormen van stabiele complexen 9,10,11. De toepassing van moleculaire dockingtechnologie is ontstaan in de jaren 1970. Op basis van het principe van slot- en sleutelkoppeling en met behulp van de algoritmen van moleculaire dockingsoftware, kan men de interactie tussen verbindingen en moleculaire doelen bepalen door dockingresultaten te analyseren. Deze aanpak maakt het mogelijk om actieve bindingsplaatsen te voorspellen voor zowel de verbinding als het doelmolecuul. Bijgevolg vergemakkelijkt het de identificatie van een optimale bindingsconformatie (hier het bindingsmodel genoemd) voor ligand-receptorinteracties, wat cruciaal is voor het begrijpen van de mechanica van deze moleculaire engagementen 12,13,14,15. Hoewel moleculaire docking waardevolle computergebaseerde voorspellingen van ligand-receptorinteracties oplevert, is het belangrijk op te merken dat dit voorlopige bevindingen zijn. Bijgevolg is verdere experimentele verificatie essentieel om deze interacties te bevestigen.

De cellulaire thermische verschuivingstest (CETSA), oorspronkelijk voorgesteld door het onderzoeksteam van Pär Nordlund in 2013, dient als een methode voor het valideren van geneesmiddel-doelwit-eiwitinteracties. Deze techniek test specifiek de thermische stabiliteit van doeleiwitten die worden geïnduceerd door geneesmiddelbinding, en biedt een praktische benadering voor het bevestigen van moleculaire interacties 16,17,18. Deze benadering is gebaseerd op het fundamentele principe dat ligandbinding een thermische verschuiving binnen doeleiwitten initieert en is van toepassing op een breed scala aan biologische monsters, waaronder cellysaten, intacte levende cellen en weefsels19,20. CETSA ondersteunt directe doelbetrokkenheid van kleine moleculen in intacte cellen door thermodynamische stabilisatie van eiwitten als gevolg van ligandbinding te detecteren en de waargenomen fenotypische respons te koppelen aan de doelverbinding21,22. Van de verschillende methodologieën die van CETSA zijn afgeleid, wordt Western Blot-CETSA (WB-CETSA) beschouwd als een klassieke benadering. Na monstervoorbereiding met behulp van de CETSA-methode wordt western blot-analyse gebruikt om veranderingen in de thermische stabiliteit van het doeleiwit te detecteren. Dit maakt de nauwkeurige bepaling van geneesmiddel-eiwitinteracties binnen cellulaire systemen mogelijk17,23.

Xanthatin is een bioactieve stof geïsoleerd uit de plant Xanthium L. met eigenschappen zoals ontstekingsremmend, die in de traditionele Chinese geneeskunde wordt gebruikt om ziekten zoals neusbijholteontsteking en artritis te behandelen24,25. Het kelch-achtige ECH-geassocieerde eiwit 1 (Keap1) is een onderdeel van het op Cullin3 gebaseerde Cullin-RING E3 ubiquitineligase multi-subunit eiwitcomplex en een belangrijke regulator van intracellulaire redoxhomeostase, die de intensiteit en duur van de ontstekingsreactie beïnvloedt door de intracellulaire redoxtoestand te moduleren26. In deze studie gebruikten we eerst moleculaire docking om de interactie tussen xanthatine (klein molecuul) en Keap1-eiwit te onderzoeken, met als doel hun bindingsmodus te voorspellen. Vervolgens hebben we de CETSA-methode gebruikt om deze interactie te valideren door de impact van xanthatine op de thermische stabiliteit van het Keap1-eiwit te beoordelen.

Protocol

1. De structuren van xanthatin en Keap1 downloaden

  1. Open de PubChem-database (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), voer xanthatin (klein molecuul) in, druk vervolgens op Zoeken en klik op Het eerste resultaat. Klik op Downloaden en klik op Opslaan onder 2D-structuur om de verbinding in .sdf-formaat op te slaan.
  2. Download de kristalstructuur van het eiwit.
    1. Open de UniProt-database (https://www.uniprot.org/), voer Keap1 in en klik op Zoeken. Klik in de linkerkolom op Mens onder populaire organismen en klik vervolgens in de rechterkolom op De eerste vermelding met de naam Q14145 .
    2. Klik op Structuur onder de functie in de linkerkolom, zoek de structuur met PDB ID: 2FLU, en klik op RCSB-PDB. Klik op Bestanden downloaden en selecteer PDB-formaat om de kristalstructuur van het Keap1-eiwit te downloaden.

2. Moleculair docken

  1. Maak een nieuwe map met de naam moleculaire docking op het bureaublad en sla de gedownloade xanthatin (klein molecuul) en Keap1 (eiwit) structuren op in deze map.
    OPMERKING: De mapnaam en het pad moeten in het Engels zijn.
  2. Open de Maestro-software, klik op Bestand, selecteer Werkmap wijzigen, klik op Bureaublad, dubbelklik om de nieuw gemaakte moleculaire dockingmap te selecteren en klik op Opties kiezen.
  3. Verwerking van kleine moleculen
    1. Klik op Opties voor bestand en importstructuren, klik op Bureaublad, dubbelklik op de moleculaire dockingmap, klik op xanthatin Structuurbestand en klik vervolgens op Openen om een klein molecuulbestand te importeren.
    2. Klik op Taken in de rechterbovenhoek van de software en selecteer de optie LigPrep . Gebruik structuren uit de werkruimte; de rest van de parameters zijn de standaardparameters en klik op Uitvoeren om de verwerking van kleine moleculen uit te voeren.
  4. Verwerking van de eiwitstructuur
    1. Klik op de opties Bestand en Importstructuren , klik op Bureaublad en dubbelklik op de map Molecular Docking . Klik op het bestand Keap1 Protein Structure en klik vervolgens op Openen om het eiwitstructuurbestand te importeren.
    2. Klik op Taken in de rechterbovenhoek van de software en selecteer de optie Wizard Eiwitbereiding . Vink het vakje aan voordat u water boven 5 Å uit De groepen verwijdert en voer een pH van 7,4+/-0,0 in. Klik op Voorverwerken, klik op Verfijnen en klik vervolgens op Optimaliseren > Water verwijderen > Minimaliseren.
    3. Klik op de volgende taak wanneer de vorige taak is voltooid. Klik op Taken en selecteer de optie Sitemap , gebruik de standaardinstellingen voor alle parameters en klik op Uitvoeren.
    4. Klik op de opties Bestand en Importstructuren , klik op Bureaublad, dubbelklik op de moleculaire dockingmap en open de map met de naam sitemap_1. Klik op het eerste bestand met de naam Sitemap_1_out.maegz en klik vervolgens op Openen.
    5. Dubbelklik op de stip om sitemap_1_protein in de werkruimte te selecteren en klik vervolgens op Sitemap_1_site_1 om deze te selecteren. Klik op Taken en selecteer de optie Receptor Grid Generation .
      OPMERKING: De eiwitsites die door de sitemap worden voorspeld, worden gerangschikt op basis van de score, met de hoogst scorende site op de eerste plaats.
    6. Selecteer de optie Invoer onder receptor, waarbij de overige parameters ongewijzigd blijven. Klik op de kleine witte bal in de eiwitstructuur om een dockingbox van standaardgrootte te genereren en wijzig de taaknaam in glijdende grid_2FLU. Klik op Uitvoeren.
  5. Moleculair docken
    1. Klik op Taken en selecteer de optie Ligand Docking . Selecteer het Receptorraster As in het bestand en klik op Bladeren. Klik op Bureaublad, dubbelklik op de moleculaire dockingmap, dubbelklik op het bestand dat grid_2FLU glijden, klik op Glide-grid_2FLU.zip bestand en klik vervolgens op Openen.
    2. Klik op Liganden uit bestanden gebruiken > blader > bureaublad. Dubbelklik op de moleculaire dockingmap, dubbelklik op het ligprep_1-bestand, klik op Ligprep_1-out.maegz-bestand en klik vervolgens op Openen.
    3. Klik op Instellingen en selecteer de optie Precisie als XP (extra precisie), wijzig de taaknaam in glijdend dock_XP_2FLU en klik op Uitvoeren.
  6. Dockingresultaten weergeven
    1. Klik op de opties Bestand en Importstructuren , klik op Bureaublad en dubbelklik op de map Molecular Docking . Dubbelklik op het glide-dock_XP_2FLU-bestand , klik op het glide-dock_XP_1_pv.maegz-bestand en klik vervolgens op Openen.
    2. Dubbelklik op de stip om ligand in de werkruimte te selecteren en klik vervolgens om sitemap_1_protein te selecteren. Klik op Tabel, schuif helemaal naar rechts en bekijk de partituur onder dockingscore.
  7. Visualisatie van 2D-resultaten
    1. Dubbelklik op de stip om ligand in de werkruimte te selecteren en klik vervolgens om ook sitemap_1_protein te selecteren. Klik op Ligand Interaction > View en vink het vakje voor de LID-legenda aan.
    2. Klik op Bestand, kies Screenshot opslaan, voer 6000 in de breedte in, verwijder het vinkje uit het vakje voor Transparante achtergrond en klik op OK. Klik op Bureaublad, noem het bestand als 2D-xanthatin-2FLU en sla de afbeelding op.
  8. Visualisatie van 3D-resultaten
    1. Dubbelklik op de stip om ligand in de werkruimte te selecteren en klik vervolgens om ook sitemap_1_protein te selecteren.
    2. Klik op L in Snelle selectie om kleine moleculen te selecteren en klik vervolgens op Stijl. Klik op de tweede regel in de stijl om de grootte van de kleine molecuulbinding te wijzigen en klik op de kleuratomen om de kleur van de kleine molecuul te wijzigen.
    3. Selecteer het kleine molecuul in de figuur, klik met de rechtermuisknop, selecteer Selectie uitvouwen en kies 4 Å. Klik op Labels in stijl toepassen om de labels weer te geven.
    4. Klik op de tweede regel in de stijl om de grootte van aminozuurbindingen te wijzigen en klik op de kleuratomen om de aminozuurkleur te wijzigen.
    5. Klik op Volgende > Omkeren, houd de Control-toets ingedrukt en klik op de eerste oogpositie onder stijl om alleen de aminozuren met labels weer te geven.
    6. Klik op Linten > stijl om het eiwit als lintstijl weer te geven en klik op Lint bewerken onder linten om de kleur van het lint te wijzigen.
    7. Klik op Interacties Toggle in de rechterbenedenhoek van het scherm, klik met de rechtermuisknop en schakel contacten/clashes uit.
    8. Zoek naar meten in taken, selecteer Afstand en klik op de twee atomen die zijn verbonden door de gele stippellijn (waterstofbrug) in het scherm om de lengtes van waterstofbruggen te meten.
    9. Houd het muiswiel ingedrukt om het eiwit te draaien, pas het eiwit aan naar het midden van het scherm en zorg ervoor dat elk aminozuurlabel zichtbaar is.
    10. Klik op Werkruimte > Afbeelding opslaan als en klik op het bureaublad. Sla de afbeelding standaard op als 600 dpi, noem het bestand als 3D-xanthatin-2FLU, kies het bestandstype als tiff-formaat en sla de afbeelding op.

3. Celkweek en CETSA-monstervoorbereiding

  1. Celcultuur
    1. Voeg 5 x 106 RAW264,7 cellen/ml toe aan een kweekschaal van 100 mm en incubeer met 6 ml DMEM-medium met 10% FBS en 1% antibioticum-antimycotische oplossing bij 37 °C, 95% vochtigheid en 5% CO2. Bereid drie gerechten voor en voer het experiment uit wanneer de cellen 80% samenvloeiing bereiken.
  2. Voorbereiding van CETSA-monsters
    1. Zuig het oude medium op, voeg 2 ml tot kamertemperatuur opgewarmde fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) toe aan elk gerecht en was 2x.
    2. Voeg 2 ml PBS toe aan elk schaaltje cellen, meng de cellen en verzamel de cellen in twee microcentrifugebuisjes van 1,5 ml. Centrifugeer op 377 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen met 2 ml PBS met 1% breedspectrum proteaseremmermengsels. Verdeel in afzonderlijke microcentrifugebuisjes met elk 1 ml celsuspensie.
    4. Vries de microcentrifugebuisjes in vloeibare stikstof in tot ze wit zijn, ontdooi ze onmiddellijk in een waterbad van 37 °C en herhaal 3x. Centrifugeer bij 12.000 x g bij 4 °C gedurende 10 min.
    5. Neem twee microcentrifugebuisjes, één met 100 μM xanthhinine en één met een gelijk volume DMSO, en voeg 450 μl gecentrifugeerd supernatans toe aan elk buisje, incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten.
    6. Voeg het supernatans uit de twee microcentrifugebuisjes toe aan 14 PCR-buisjes met een volume van 60 μl/buisje en verhit de buisjes tegelijkertijd bij wisselende temperaturen (45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C en 63 °C) gedurende 3 minuten, met twee PCR-buisjes bij elke temperatuur, voor de DMSO- en xanthinegroep; respectievelijk.
    7. Neem voor de onverwarmde groep supernatans uit elk van de twee microcentrifugebuisjes en voeg het toe aan 14 PCR-buisjes, 7 voor de DMSO-groep en 7 voor de xanthinegroep, in een volume van elk 60 μl. Verwarm de monsters hier niet.
    8. Koel de buizen af op kamertemperatuur voor de verwarmde groep. Centrifugeer alle buisjes (verwarmd en onverwarmd) bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en neem 48 μl supernatans uit elk buisje in een nieuw microcentrifugebuisje van 1,5 ml. Voeg 12 μL SDS-PAGE-eiwitlaadbuffer toe aan elke buis, draai om goed te mengen en verwarm in een waterbad bij 100 °C gedurende 5 minuten.
      OPMERKING: Bereide CETSA-monsters moeten worden bewaard bij -80 °C en binnen 1 week worden getest met western blot.

4. Westelijke vlek

  1. Bereiding van SDS-PAGE gel
    1. Spoel een lange en een korte glasplaat af met ultrapuur water. Plaats de platen in de klemgleuf en vervolgens op een transparant bord. Voeg ultrapuur water toe en controleer de lek gedurende 10 minuten.
    2. Voeg 8 ml onderste geloplossing en 8 ml onderste gelbuffer toe aan een conische kolf en meng door voorzichtig te schudden. Voeg 160 μL stollingspromotor toe aan de geloplossing en meng goed.
      NOTITIE: Het volume van de onderste lijmlaag mag niet groter zijn dan de groene lijn op de clampsleuf.
    3. Giet het ultrapure water van de borden en dep ze droog met filtreerpapier. Voeg de bereide onderste geloplossing toe. Voeg 2 ml isopropylalcohol toe en wacht 20 minuten om te stollen.
    4. Doe 2 ml van de bovenste geloplossing en 2 ml van de bovenste gelbuffer in een conische kolf en meng door de kolf voorzichtig te schudden.
    5. Verwijder de isopropylalcohol van de gellaag en dep de overtollige isopropylalcohol af met filtreerpapier.
    6. Voeg 40 μL stollingspromotor toe aan de gemengde bovenste geloplossing, meng goed, voeg dan toe tussen de lange en korte glasplaten en plaats een kam van 1,5 mm met 15 gaten, wacht 20 minuten.
      NOTITIE: De kam moet loodrecht op de bovenste laag worden ingebracht, zonder luchtbellen tussen de kam en de oplossing.
  2. Elektroforese
    1. Voeg 1 L ultrapuur water toe aan een bekerglas, voeg een zakje SDS-PAGE running buffer poeder toe, roer goed met een glazen staaf en voeg de bereide gel toe aan de elektroforese-eenheid. Plaats het apparaat in de doos en trek de kam eruit.
    2. Ontdooi marker en CETSA-monsters bij kamertemperatuur, vortex en spin down. Voeg 2,5 μl marker toe aan het eerste putje en 20 μl CETSA-monsters aan elk van de resterende putjes volgens de vooraf bepaalde volgorde.
      OPMERKING: CETSA-monsters werden achtereenvolgens toegevoegd volgens de in stap 3.2.6 beschreven temperatuurbehandeling van 45 °C tot 63 °C; eerst de DMSO-groep werd toegevoegd, daarna de xanthatine-groep (Figuur 1).
    3. Voeg de resterende elektroforese-oplossing toe aan de elektroforese-eenheid, sluit het deksel en plaats de elektrode, positieve pool naar positieve pool, negatieve pool naar negatieve pool.
    4. Zet de aan/uit-schakelaar AAN en stel de spanningsschakelaar in op 80 V om elektroforese te starten.
  3. Overbrengen naar membraan
    1. Voeg 850 ml ultrapuur water, 100 ml watervrije ethanol en 50 ml snelle overdrachtsbuffer toe aan een bekerglas en roer goed. Bereid foamboard, plastic messen, pincetten, trays en membraantransferapparaten voor.
    2. Snijd het PVDF-membraan volgens de grootte van de gel, markeer het en week het 30 s in methanol om het te activeren.
    3. Giet de transferoplossing in de bak, plaats en open de transferklemmen en plaats een sponspad en drie lagen transferfilterpapier.
    4. Stop de elektroforese en open vervolgens het deksel van de elektroforesedoos. Neem het elektroforese-apparaat, giet de elektroforese-oplossing eruit en verwijder de plaat. Plaats de plaat op het schuimbord, wrik deze voorzichtig los met een plastic mes en snijd de gel om de eiwitmarker en de doeleiwitten duidelijk te visualiseren.
    5. Houd een kant van de marker vast met een pincet, was deze in een bakje met de transmembraanoplossing en leg deze plat op filtreerpapier. Dompel het geactiveerde PVDF-membraan in de transferoplossing, houd de gelabelde kant vast met een pincet en bedek de gel met de voorkant naar beneden.
      OPMERKING: De met PVDF-membraan gemarkeerde zijde is de voorkant en let erop dat er geen luchtbellen worden gegenereerd tijdens het plaatsingsproces.
    6. Plaats twee lagen transferfilterpapier en een laag sponspad op het PVDF-membraan, bedek en klem de transferclips vast en plaats ze in de transfertank.
      OPMERKING: Zwarte kleur van de transferclip naar zwarte kleur van de transfersleuf.
    7. Voeg de resterende transmembraanoplossing toe aan de transmembraancassette, dek af met het deksel, positief naar positief, negatief naar negatief.
    8. Stel de stroom in op 400 mA, de tijd op 30 minuten en druk vervolgens op Run om te beginnen met het overbrengen van het membraan bij kamertemperatuur.
  4. Blokkeren
    1. Voeg 2 L ultrapuur water toe aan een glazen injectieflacon, voeg een zakje TBS-poeder toe en voeg vervolgens 2 ml Tween toe om TBST-oplossing te maken. Weeg het BSA-poeder om een 5% BSA-oplossing met TBST te bereiden en voeg 6 ml BSA-oplossing toe aan de incubatiedoos.
    2. Stop de membraanoverdracht en open vervolgens de transferclip. Klem de markeringszijde van het PVDF-membraan vast en plaats deze in de incubatiebak. Plaats de incubatiebox op een shaker en laat 1,5 uur op kamertemperatuur staan.
  5. Incubatie van primair antilichaam
    1. Bereid het primaire antilichaam (zie Materiaaltabel voor details) voor met 5% BSA-oplossing op 1:1000, recycle de BSA-oplossing in de incubatordoos en voeg 6 ml primair antilichaam toe aan de incubatiedoos. Plaats de incubatiebox in een schuimdoos met ijspakken en bewaar deze een nacht op een shaker.
  6. Incubatie van secundair antilichaam
    1. Verzamel het primaire antilichaam de volgende dag in de incubatiedoos, voeg vervolgens 6 ml TBST-oplossing toe en plaats deze op een shaker om 5 minuten te wassen.
    2. Giet de gewassen TBST-oplossing af en voeg vers toe voor het wassen; herhaal 5x en bereid het secundaire antilichaam voor met 5% BSA-oplossing op 1:5000.
    3. Giet de TBST-oplossing af en voeg 6 ml secundair antilichaam toe aan de incubatiedoos. Plaats de incubatiebox op een shaker en incubeer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur.
    4. Verzamel het secundaire antilichaam (zie Materiaaltabel voor details), voeg vervolgens 6 ml TBST-oplossing toe en plaats deze op een shaker om gedurende 5 minuten te wassen. Giet de gewassen TBST-oplossing af en voeg vers toe voor het wassen; Herhaal 5x.
  7. Blootleggen van de strips
    1. Bewaar de TBST-oplossing aan het einde van de laatste wasbeurt. Neem gelijke hoeveelheden chemiluminescente reagentia A en B, schud en meng goed. Bescherm de oplossing tegen licht.
    2. Open het gelbeeldvormingssysteem, klik op Monsters, controleer de kalibratie, wacht tot de kalibratie is voltooid en klik vervolgens op Marker, controleer de kalibratie.
    3. Pak de markeringszijde van de strip op met een pincet en dompel deze volledig onder in de chemiluminescente reagensoplossing. Klem een kant van de marker vast om de strip met de voorkant naar beneden in de imager te plaatsen, sluit het deksel van de imager, klik op Belichting en stel de belichtingstijd in op 1 s.
      OPMERKING: De ontwikkelaar moet de strip volledig bedekken en de ontwikkeling moet in een donkere omgeving plaatsvinden.
    4. Klik op Opslaan, geef de afbeelding een naam en sla deze op als een .tif bestand. Analyseer de optische dichtheid van de westelijke vlek. De grijswaarden van elke temperatuur in de DMSO-groep werden vergeleken met de grijswaarden van 45 °C, en de grijswaarden van elke temperatuur in de xanthatine-groep werden vergeleken met de grijze waarden van xanthatine bij 45 °C.

Resultaten

Moleculaire docking-analyse voorspelde de interactie tussen xanthatine en Keap1-eiwit. Figuur 2 toont de vorming van waterstofbruggen tussen xanthatine en aminozuurresiduen Gly-367 en Val-606 van het Keap1-eiwit, met een waterstofbruglengte van 2,17 Å voor Gly-367 en 2,13 Å voor Val-606. Bovendien betekent de berekende dockingscore van -5,69 kcal/mol een goede bindingsaffiniteit tussen xanthatine en Keap1-eiwit.

De CETSA-methode toonde aan dat xanthatinebinding de thermische stabiliteit van Keap1-eiwit verschoven, wat de interactie tussen xanthatine en Keap1-eiwit21 bevestigt. Figuur 3 geeft aan dat xanthatine de thermische stabiliteit van het Keap1-eiwit opmerkelijk verschuift binnen het temperatuurbereik van 48 °C tot 57 °C, in vergelijking met de DMSO-groep. Om een gelijke monsterbelasting te garanderen, was ten eerste de dichtheid van de celinoculatie waarin we de experimenten uitvoerden consistent; ten tweede werden de celmonsters van de DMSO-groep en de xanthatinegroep goed gemengd in de celkweekschaaltjes en vervolgens gelijkmatig verdeeld over twee microcentrifugebuisjes, wat zorgde voor een consistente hoeveelheid celmonsters, en het volume supernatans dat aan elke PCR-buis werd toegevoegd was 60 μL, en ten slotte was het volume van elk monster dat in de Western blot werd geüpload 20 μL, wat zorgde voor een gelijkmatige belading van verwarmde monsters. Eiwitafbraak in monsters van ongeveer 51 °C is voornamelijk te wijten aan veranderingen in de eiwitstructuur en versnelde chemische reacties veroorzaakt door hoge temperaturen. De bovenstaande resultaten tonen aan dat xanthatine direct kan binden aan het Keap1-eiwit.

figure-results-1
Figuur 1: Laadvolgorde van western blot. De temperatuur in volgorde van links naar rechts was 45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C en 63 °C.  De eerste rijstrook werd toegevoegd met een markering; Voor elke temperatuur werden twee rijstroken gebruikt; de eerste rijstrook was de DMSO-groep en de tweede rijstrook was de xanthatin-groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Interactie tussen xanthatine en Keap1 (PDB: 2FLU) eiwit. (A) De 2D-weergave van xanthatin binding aan Keap1. (B) De 3D-visualisatie van xanthine en Keap1-eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Effect van xanthatine op de thermische stabiliteit van Keap1 eiwit. (A) De effecten van xanthatine op de thermische stabiliteit van Keap1 werden gedetecteerd door CETSA. (B) De optische dichtheden van Keap1 werden genormaliseerd naar die verkregen bij 45 °C. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Statistische analyse werd uitgevoerd door middel van eenrichtingsvariantieanalyse (eenrichtings-ANOVA). n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01, p < 0,001, p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De identificatie van ziektedoelwitten en de ontdekking en ontwikkeling van geneesmiddelen zijn nauw met elkaar verbonden27. Door zich precies op specifieke doelen te richten, kunnen kandidaat-geneesmiddelen worden ontwikkeld om bepaalde ziekten effectiever te behandelen en tegelijkertijd de bijwerkingen van de geneesmiddelen te minimaliseren28,29. De meest gebruikte targets zijn eiwittargets30. De identificatie van speciale eiwitdoelen vormt echter een enorme uitdaging vanwege de grote diversiteit aan eiwitten in cellen30,31. In dit artikel hebben we gekozen voor een aanpak die moleculaire docking combineert met CETSA om eiwitdoelen te identificeren en te valideren. De resultaten onthulden een directe interactie tussen xanthatine en Keap1-eiwit. De integratie van computertechnologie en biologische experimenten kan ook worden gebruikt bij het onderzoek naar andere geneesmiddelen en eiwitdoelen om de aanwezigheid van een directe interactie tussen het medicijn en het doelwit vast te stellen. Deze aanpak, die voorspelling combineert met verificatie, vermindert effectief zowel het tijdsverbruik als de economische kosten. Bovendien zijn de experimentele instrumenten en materialen gemakkelijk te verkrijgen en is het bedieningsproces niet ingewikkeld. Ten slotte zijn de CETSA-monsters gemakkelijk te bereiden en te testen door middel van de western blot-methode, die de reproduceerbaarheid van de monsters garandeert.

Onze ervaring is dat er verschillende kritische aspecten zijn die speciale aandacht vereisen tijdens experimentele procedures. Ten eerste is het essentieel om de kristalstructuur van het eiwit te selecteren dat is opgelost door röntgenanalyse bij het kiezen van de eiwitstructuur vóór moleculaire docking. Ten tweede zijn de celdichtheid en de vries-/dooitijd cruciale factoren in CETSA-experimenten. Cellen in de logaritmische groeifase moeten worden geselecteerd voor CETSA-experimenten, omdat hun groeitoestand stabiel is en een minimale impact heeft op de experimentele resultaten. Tijdens het herhaaldelijk invriezen en ontdooien van cellen moet de timing goed worden gecontroleerd met vloeibare stikstof die wordt gebruikt voor het invriezen tot een witte vaste vorm, gevolgd door onmiddellijke ontdooiing bij kamertemperatuur voordat de volgende vriescycli volgen. Ten slotte moeten experimenten met western blot onmiddellijk na het bereiden van CETSA-monsters worden voltooid om eiwitafbraak te voorkomen.

Molecular docking en CETSA zijn beide gevestigde technieken die een cruciale rol spelen op het gebied van medicijnontwikkeling. Moleculaire docking is van groot belang bij het voorspellen van interacties op moleculair niveau tussen verbindingen en hun doelen, en biedt waardevolle inzichten in mogelijke bindingsmodi10,11. CETSA daarentegen richt zich op het beoordelen van de impact van geneesmiddelen op de thermische stabiliteit van eiwitten en dient als een hulpmiddel voor het valideren van geneesmiddel-eiwitinteracties17. Hoewel CETSA een relatief eenvoudige verificatiemethode is, is het ook een manier met een lage doorvoer door western blot te gebruiken voor de studie van thermische verschuiving van geneesmiddel-eiwitcomplex, en het zou niet de enige techniek moeten zijn waarop wordt vertrouwd. Bovendien zijn de stappen van CETSA ingewikkeld en kunnen eventuele stapfouten tijdens de operatie een grote impact hebben op de resultaten. Bovendien kan de CETSA-methode de specifieke bindingsplaats en bindingswijze van de verbinding aan het eiwitdoelwit niet bepalen en kan niet aangeven of de binding covalent of niet-covalent is 17,18,23. Naast de thermische verschuivingstest kunnen ook andere soorten energetische tests, zoals pH-afhankelijke eiwitprecipitatie (pHDPP), worden gebruikt voor de studie van ligand-eiwitinteracties32. Bovendien is thermische proteoomprofilering een op energie gebaseerde methode voor het onthullen van ligand-eiwitinteracties, waardoor grootschalige analyse van eiwit-geneesmiddelinteracties met hoge doorvoer mogelijk is door proteomics te combineren met CETSA33.

Bovendien kan gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie (LSPR) verdere kwalitatieve en kwantitatieve analyse bieden 34,35. Het bepaalt niet alleen het bestaan van interacties tussen een geneesmiddel en zijn doelwit, maar meet ook de affiniteitsparameters en kinetische parameters van deze intermoleculaire interacties, waardoor een beter begrip wordt geboden.

Naast de thermische verschuivingstest kan pH-afhankelijke eiwitprecipitatie (pHDPP) ook worden gebruikt voor de studie van ligand-eiwitinteracties32. Molecular docking is een op fysicomechanica gebaseerde simulatiemethode voor het voorspellen van interacties tussen kleine moleculen en biomoleculen. Deze methode heeft tot doel binding te bereiken door de conformatie en oriëntatie van kleine moleculen te optimaliseren om de beste complementariteit tussen hen en biomoleculen te produceren. Doelvoorspelling maakt gebruik van kunstmatige-intelligentietechnieken om de bindingsplaatsen tussen kleine moleculen en biomoleculen te voorspellen. De twee benaderingen hebben belangrijke verschillen in de toepassing van de methode en de nauwkeurigheid van de voorspelling. Methode toepassing: moleculaire docking wordt voornamelijk gebruikt voor het ontwerpen en optimaliseren van geneesmiddelen, en biedt een theoretische basis voor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen. Doelvoorspelling, met behulp van meer geavanceerde kunstmatige intelligentie, wordt vaker toegepast op high-throughput screening en snelle ontdekking van loodverbindingen om de efficiëntie van de ontdekking van geneesmiddelen te verbeteren. Voorspellingsnauwkeurigheid: Aangezien moleculaire docking is gebaseerd op fysische simulaties, is de voorspellingsnauwkeurigheid hoger, maar de rekenkosten zijn ook relatief hoog. Hoewel het voorspellen van doelen lagere rekenkosten met zich meebrengt, is de nauwkeurigheid van de voorspelling afhankelijk van de overvloed aan trainingsgegevens en modelselectie.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82004031) en het Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC1303). We spreken onze grote waardering uit voor Jiayi Sun van het Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, voor de hulp bij western blot.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.45 μm Polyvinylideenfluoride membraanMilliporePR05509
Watervrij ethanolChron chemicals64-17-5
RundserumeiwitBioFroxx4240GR100
Breed spectrum protease-remmermengselsBoster Biological Technology Co., LtdAR1193
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
Verbeterd chemiluminescentie reagensBeyotime Biotechnology Co., LtdP0018S
GAPDH-antilichaamProteinTech Group Co., Ltd10494-1-AP
Gel-beeldvormingsinstrumentE-BLOTTouch Imager Pro
Gradiënt PCR-instrumentBiometra TADVANCEDBiometra Tadvanced 96SG
HogesnelheidsvriescentrifugeBeckman CoulterAllegra X-30R
Affiniteit puur geitenantilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidaseProteinTech Group Co., LtdSA00001-2
Isopropylalcohol Chron chemicals67-63-0
Keap1-antilichaamZen BioScience Co., LtdR26935
MetaalbadAnalytik JenaTSC
MethanolChron chemicals67-56-1
Ncmblot snelle overdracht buffer (20×)NCM Biotech Co., LtdWB4600
Omni-Easy OneStep PAGE-gel snelle voorbereiding kieEpizyme Biotech Co., LtdPG212
FosfaatbufferzoutoplossingBoster Biological Technology Co., LtdPYG0021
Voorgekleurde kleur-eiwitmarkerBiosharp BL741A
Eiwit-blotted elektroforesesysteemBio-RadMiniPROTEANÒTetra Cell
RAW264.7-celBeyotime Biotechnology Co., LtdC7505
RAW264.7-celspecifiek mediumProcell Life Science&Technology Co., LtdCM-0597
SDS-PAGE-eiwit-laadbufferBoster Biological Technology Co., LtdAR1112-10
SDS-PAGE-loopbufferpoederServicebioG2018
Tris-gebufferde zoutpoederServicebioG0001
Tween 20BioFroxx1247ML100
WaterbadMemmertWNE10
WaterreinigerMilliporeMilli- IQ 7005
XanthatineChemConst Biotechnology Co., LtdCONST210706

Referenties

  1. Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
  2. Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. Int J Mol Sci. 17 (2), 144(2016).
  3. Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking. Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).
  4. Zhang, F., et al. PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection. Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).
  5. Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network. J Cheminfo. 13 (1), 65(2021).
  6. Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions. Brief Bioinform. 23 (1), 476(2022).
  7. Hatty, C. R., Banati, R. B. Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO). Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).
  8. Chaires, J. B. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).
  9. Huang, S. Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
  10. Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).
  11. Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking. Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).
  12. Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331(2019).
  13. Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications. Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).
  14. Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs. Mar Drugs. 18 (11), 545(2020).
  15. Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin. Carbohydr Polym. 276, 118644(2022).
  16. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  17. Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 116, 154862(2023).
  18. Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
  19. Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects. Eur J Med Chem. 247, 115017(2023).
  20. Jiang, X., et al. Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings. Phytomedicine. 110, 154637(2023).
  21. Mateus, A., et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 16 (3), 9232(2020).
  22. Sanchez, T. W., et al. Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement. ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).
  23. Tolvanen, T. A. Current advances in CETSA. Front Mol Biosci. 9, 866764(2022).
  24. Liu, M., et al. Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases. J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).
  25. Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation. Molecules. 27 (14), 4603(2022).
  26. Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants. Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).
  27. Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery. BMC Biotechnol. 23 (1), 44(2023).
  28. Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
  29. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  30. Chakraborty, C., et al. SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development. Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).
  31. Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).
  32. Zhang, X., et al. Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation. Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).
  33. Zhang, X., et al. A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand. Proteomics. 20, 1900372(2020).
  34. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2022).
  35. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Moleculaire dockingcellulaire thermische verschuivingCETSA assayeiwit ligandbindingKeap1 eiwitvalidatie van kleine moleculenSDS PAGEchemiluminescente detectieinteractie tussen geneesmiddel en target
Voorspelling en validatie van eiwitdoelen van een verbinding met kleine moleculen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.