Methodenartikel

In situ nucleosoomassemblage voor correlatieve kracht van één molecuul en fluorescentiemicroscopie

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66579

⸱

6 september 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Nanoscale Biophysics and Biochemistry, The Rockefeller University, 2Tri-Institutional PhD Program in Chemical Biology

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel presenteert een gedetailleerde experimentele procedure voor het reconstrueren van nucleosoombevattende DNA-kettingen voor correlatieve kracht en fluorescentiemicroscopie van één molecuul. Het beschrijft verder verschillende stroomafwaartse experimenten die kunnen worden uitgevoerd om het bindingsgedrag van chromatine-interagerende eiwitten te visualiseren en veranderingen in de fysische eigenschappen van nucleosomen te analyseren.

Samenvatting

Nucleosomen vormen de primaire eenheid van eukaryotisch chromatine en zijn het onderwerp geweest van tal van informatieve onderzoeken met één molecuul naar hun biofysische eigenschappen en interacties met chromatinebindende eiwitten. Nucleosoomreconstitutie op DNA voor deze onderzoeken omvat meestal een zoutdialyseprocedure die nauwkeurige controle biedt over de plaatsing en het aantal nucleosomen dat langs een DNA-ketting wordt gevormd. Dit protocol is echter tijdrovend en vereist een aanzienlijke hoeveelheid DNA en histonoctameren als invoer. Om een alternatieve strategie te bieden, wordt een in situ nucleosoomreconstitutiemethode voor enkelvoudige molecuulkracht en fluorescentiemicroscopie beschreven die gebruik maakt van de histon-chaperonne Nap1. Deze methode stelt gebruikers in staat om nucleosomen op elk DNA-sjabloon te assembleren zonder dat er sterke nucleosoompositioneringssequenties nodig zijn, de nucleosoomdichtheid op verzoek aan te passen en minder reagentia te gebruiken. In situ nucleosoomvorming vindt plaats binnen enkele seconden, wat een eenvoudigere experimentele workflow biedt en een gemakkelijke overgang naar metingen met één molecuul. Voorbeelden van twee stroomafwaartse assays voor het onderzoeken van nucleosoommechanica en het visualiseren van het gedrag van individuele eiwitten op chromatine worden verder beschreven.

Inleiding

De primaire verpakkingseenheid van eukaryotisch chromatine is het nucleosoom, waarin ~147 basenparen (bps) DNA zijn gewikkeld rond een octameer van kernhistoneneiwitten 1,2. Naast de verpakking van het genoom, dient de nucleosoomarchitectuur als een andere rijke laag van biofysische regulatie die kan worden benut door chromatinebindende eiwitten bij het uitvoeren van hun verschillende functies 3,4. Het experimenteel benaderen en meten van de fysieke kenmerken van nucleosomen is technisch uitdagend geweest, aangezien deze eenheden op minuscule schalen presteren (bijv. nanometerlengtes, piconewtonkrachten), en dus vereist hun sonderen voldoende gevoeligheid en precisie om de functie zinvol te informeren. Bovendien verbinden chromatinebindende eiwitten zich vaak tijdelijk met hun substraten, en de meeste ensemblebenaderingen missen de juiste temporele resolutie om de kinetiek van deze interacties te informeren5. Gelukkig heeft de komst van technieken met één molecuul het mogelijk gemaakt om individuele eiwitten en hun interacties in realtime te visualiseren en te manipuleren, waardoor mechanistische informatie wordt onthuld over deze moleculaire gebeurtenissen die zich op nanoschaal voordoen6. In het bijzonder maakt single-molecule correlatieve kracht en fluorescentiemicroscopie (smCFFM) gebruik van zowel fluorescentiedetectie met hoge resolutie als krachtmanipulatie-instrumenten om tegelijkertijd de mechanica, samenstelling en coördinatie van chromatine en chromatine-eiwitcomplexen op te lossen 7,8.

In smCFFM dat specifiek gebruik maakt van "optische pincetten" als krachtmanipulatiemethode, wordt een strak gefocusseerde laser gebruikt om een diëlektrisch object, meestal een plastic kraal ter grootte van een micron, in drie dimensies te vangen9. Een biopolymeer zoals een stukje DNA kan aan de kraal worden geconjugeerd (via bijv. streptavidin-biotine, digoxigenine-anti-digoxigenine-antilichaamkoppeling), en de gebruiker kan zowel een gekalibreerde kracht uitoefenen als de kracht/verplaatsing meten die door het systeemwordt gegenereerd 10. De toegevoegde fluorescentiemodule maakt gelijktijdige meerkleurige fluorescentiebeeldvorming mogelijk om de eiwitsamenstelling en het gedrag te volgen.

De reguliere methode voor het reconstrueren van nucleosoomsjablonen voor smCFFM omvat het assembleren van nucleosomen op aangepaste DNA-sjablonen door middel van zoutdialyse 11,12,13. In deze procedure worden gezuiverde histon-octameren geïncubeerd met DNA-sjablonen in een buffer met een hoog zoutgehalte (~1 M natriumchloride), en terwijl het zout langzaam wordt weggedialyseerd, assembleren nucleosomen zich spontaan op het DNA op een sequentie-afhankelijke positionele manier14,15. Als zodanig is het gebruikelijk dat sterke nucleosoompositioneringssequenties (bijv. Widom 60116, X. laevis 5S rDNA17) worden opgenomen in de DNA-sjablonen om aangepaste nucleosoomreeksen te genereren. Hoewel deze beproefde methode nauwkeurige controle biedt over de plaatsing en het aantal nucleosomen in het DNA, heeft het verschillende nadelen: (1) de incorporatie van sterke nucleosoompositionerings-DNA-sequenties kan kunstmatig stabiele nucleosomen genereren die de activiteit van chromatine-bindende eiwitten beïnvloeden, (2) het proces van zoutdialyse voor nucleosoomvorming vereist grote hoeveelheden DNA en octameren, en (3) de procedure vergt één tot enkele dagen werk en een aanzienlijke inspanning om de juiste DNA-octameerverhouding te titreren voor een optimale nucleosoom-array-dichtheid.

In dit manuscript beschrijven we een alternatieve methode om nucleosomen te vormen langs DNA in situ binnen een correlatieve kracht- en fluorescentiemicroscoop met één molecuul met behulp van recombinant histonchaperonne Nap1, die lijkt op de fysiologische route van nucleosoomvorming in vivo 18,19,20,21,22. Deze methode stelt gebruikers in staat om nucleosomen op niet-specifieke DNA-sequenties te assembleren, de nucleosoomdichtheid eenvoudig aan te passen en aanzienlijk minder hoeveelheden reagentia te gebruiken, allemaal binnen enkele minuten. Bovendien maakt de vorming van nucleosomale DNA-kettingen ter plaatse een eenvoudigere experimentele workflow mogelijk en het gemak van ingebouwde visualisatie en manipulatie van één molecuul. Dus wanneer uniforme en specifieke nucleosoompositionering geen noodzaak is, biedt dit protocol een nuttige optie voor het onderzoek naar nucleosoommechanica of eiwitgedrag op chromatine, waarvoor we ook voorbeeldassays beschrijven.

Protocol

De details van de reagentia en de apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Bereiding van gebiotinyleerd DNA

  1. Bereid een volumereactie van 120 μL voor met 20 μg λ-DNA, 33 μM biotine-dCTP, 33 μM biotine-dUTP, 33 μM biotine-dATP, 33 μM dGTP, 10 eenheden Klenow-enzym en 1x NEB-buffer 2.
    OPMERKING: Deze procedure maakt specifiek gebruik van lineair dubbelstrengs (ds) methylatievrij bacteriofaag λ genomisch DNA (48.502 bps), dat 12-nucleotide (nt) 5' enkelstrengs (ss) DNA-overhang23 bevat. Het protocol kan echter worden aangepast om gebruik te maken van elke lengte of sequentie van lineair dsDNA, op voorwaarde dat het ten minste enkele nts van ss 5'-overhangen bevat, waarbij de lengte en nt-sequentie het aantal gebiotinyleerde nts dicteren dat aan elk uiteinde is geïnstalleerd voor stroomafwaartse tethering tussen optische vallen. Bovendien kan de reactie worden verkleind. Zo kan bijvoorbeeld 5 μg DNA worden gebruikt in een volumereactie van 30 μL. Bovendien zijn de op deze manier gegenereerde DNA-substraten niet torsioneel beperkt. Voor protocollen om torsioneel beperkt DNA te creëren, verwijzen wij u naar de eerder gepubliceerde rapporten 24,25.
  2. Incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  3. Voeg 10 mM EDTA toe en incubeer bij 75 °C gedurende 20 min.
  4. Voer ethanolprecipitatie uit om het gebiotinyleerde DNA-product te verkrijgen.
    1. Voeg 0,1x volume 3 M natriumacetaat en 3x volume ijskoude 100% ethanol toe. Houd bij -20 °C gedurende ten minste 1 uur tot een nacht. Centrifugeer bij 13.500 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    2. Verwijder het supernatans voorzichtig zonder de pellet te verstoren en voeg 1 ml 75% ethanol toe. Centrifugeer bij 13.500 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C.
    3. Herhaal de stappen voor het verwijderen van het bovendrijvende middel, de toevoeging van ethanol en het centrifugeren.
    4. Verwijder voorzichtig al het supernatans en laat de pellet 10 minuten aan de lucht drogen. Los de pellet op in 100-200 μL TE-buffer of ddH2O (kan incuberen bij 37 °C om het oplossen te vergemakkelijken). Meet de concentratie met behulp van een Nanodrop-spectrofotometer.

2. Voorbereiding van kanalen in een flowcel

OPMERKING: Deze procedure is gebaseerd op een in de handel verkrijgbare microfluïdische chip (zie Materiaaltabel), maar kan worden aangepast aan elk smCFFM-instrument met een meerkanaals flowcel.

  1. Passiveer kanalen (hfdst.) 4 en 5 ( of een kanaal dat eiwitten bevat) (zie schema van kanalen in figuur 1A). Voeg 500 μL 0,1% BSA toe aan elk kanaal en debiet met 0,8 bar (~0,45 μL/s voor slangen met een binnendiameter van 0,010 inch) gedurende 8 min. Verwijder de oplossing.
  2. Voeg 500 μL 0,05% Pluronic-F127 toe aan elk kanaal en stroom met 0,8 bar gedurende 8 minuten. Verwijder de oplossing en spoel de spuiten uit met 1x PBS. Voeg 2 ml 1x PBS toe aan elk kanaal en stroom met 0,8 bar gedurende 27 minuten.
  3. Draai de stockoplossing van met streptavidine beklede kralen (deze procedure gebruikt korrels van 3,13 μm) en voeg 2,15 μL van de pareloplossing toe aan 1 ml 1x PBS. Toevoegen aan hfdst. 1.
    OPMERKING: De grootte en concentratie van de met streptavidine beklede kralen kunnen worden aangepast aan de voorkeur van de gebruiker.
  4. Voeg 30-80 ng gebiotinyleerd λ-DNA toe aan 1 ml 1x PBS. Toevoegen aan hfdst. 2.
    OPMERKING: De concentratie van gebiotinyleerd DNA kan worden aangepast aan de voorkeur van de gebruiker. Grotere hoeveelheden DNA zullen de frequentie van het vormen van DNA-kettingen verhogen, maar ook de frequentie van het vastbinden van meerdere DNA-moleculen tegelijk, wat de moeilijkheidsgraad van het experiment kan vergroten.

3. Nap1-gemedieerde in situ nucleosoomvorming

  1. Voeg 500 μL eiwitvrije beeldbuffer toe aan hoofdstuk 3.
    OPMERKING: De buffersamenstelling in hoofdstuk 3 is flexibel en moet geschikt zijn voor zowel nucleosomen als het (de) specifieke eiwit(en) van belang. Optioneel kunnen gebruikers ervoor kiezen om zuurstofopvangsystemen toe te voegen voor verminderde fotobleking van fluoroforen en/of DNA van concurrenten om histon-octameren te verwijderen die niet goed in nucleosomen zijn verpakt.
  2. Voeg 2 nM S. cerevisiae Nap1 en 2-5 nM LD655-gelabeld H4-histonoctameer (HO) toe aan 500 μL1x HR-buffer 18. Toevoegen aan hfdst. 4.
    OPMERKING: Histon-octameren en Nap1 kunnen in de handel worden gekocht of in eigen huis worden bereid (zie Materiaaltabel). Het aantal nucleosomen dat langs elk gebonden DNA moet worden gevormd, hangt af van de octameerconcentratie en de tijd die in dit kanaal wordt doorgebracht. De door de gebruiker gewenste en geschatte nucleosoomdichtheid langs elk DNA-molecuul kan worden gemoduleerd door een of beide van deze parameters aan te passen. Bovendien kan de gebruiker ervoor kiezen om histon-octameren te labelen met hun favoriete fluorofoor.
  3. Optioneel: Voeg chromatinebindend eiwit of een ander interessant eiwit toe aan hoofdstuk 5 in een geschikte buffer.
  4. Laat alle kanalen stromen met 1,0 bar (~0,55 μL/s in de huidige experimentele opstelling) gedurende 30 s om de stroomcelkanalen met monsters te spoelen.
  5. Stel het debiet in op 0,2 bar (~0,16 μL/s in de huidige experimentele opstelling). Verplaats de optische vallen (OT's) naar hoofdstuk 1 en vang een geschikt paar met streptavidine beklede kralen.
  6. Verplaats de OT's naar hoofdstuk 3, voer een krachtkalibratie uit voor het kralenpaar, zet de rode confocale laser (of een andere laserlijn naar keuze) aan en kalibreer het beeldvormingsgebied.
  7. Stel de stroom in op 0,2 bar en verplaats OT's naar hoofdstuk 2. Vang gebiotinyleerd DNA.
  8. Verplaats de OT's naar hoofdstuk 3 en stop de stroom. Vergroot de afstand tussen de OT's om het DNA uit te rekken en controleer de bijbehorende kracht-afstandscurve (FD) om de aanwezigheid van een enkele DNA-ketting te bevestigen (in tegenstelling tot meerdere kettingen). De curve moet het wormachtige-ketenmodel voor dsDNA volgen bij de gegeven contourlengte26.
  9. Pas de afstand tussen de OT's zo aan dat de DNA-spanning ongeveer 1 pN aangeeft.
    OPMERKING: 1 pN spanning is laag genoeg om nucleosomen door DNA27 te laten omwikkelen, maar is hoog genoeg om het hele DNA-molecuul binnen de beeldvormingsas van de lijnscanning te plaatsen.
  10. Schakel lijnscannen in om te beginnen met het verzamelen van een kymograaf met de rode laser ingeschakeld.
    OPMERKING: Kymografen of 2D-scans van vastgebonden DNA kunnen worden verkregen, afhankelijk van de voorkeur van de gebruiker.
  11. Verplaats de OT's naar hfdst. 4 met de stroom uit. Gefaciliteerd door Nap1 worden HO's op DNA geladen en verpakt om in realtime nucleosomen te vormen. Nucleosoombelasting wordt gevisualiseerd als fluorescerende banen die op het DNA in kymografen verschijnen. Tegelijkertijd kan de vorming van nucleosoomen op het DNA worden gevolgd door de krachttoename naarmate er meer HO's worden belast wanneer de posities van OT's constant worden gehouden.
    OPMERKING: De fluorescentie-excitatielaser kan worden uitgeschakeld tijdens de nucleosoomvormingsstappen om fotobleking van fluoroforen te voorkomen. Bovendien zou met dit protocol niet-specifieke binding van histonoctameren aan DNA kunnen optreden, waarbij de octameren niet in nucleosomen zijn verpakt. Deze bindingsgebeurtenissen zullen geen "scheur" genereren wanneer het DNA wordt uitgerekt, zoals beschreven in het Unwrapping Nucleosomes (stap 4) protocol hieronder, en kunnen soms worden weggespoeld door een zachte bufferstroom, vooral als de buffer vrij DNA van een concurrent bevat.
  12. Wanneer het geschatte gewenste aantal nucleosomen is gevormd, begint u met het verzamelen van gegevens.

4. Nucleosomen uitpakken

  1. Voltooi stap 2 en stap 3.
  2. Na het vormen van een DNA-ketting die nucleosomen bevat, verplaats je de OT's naar hoofdstuk 3.
  3. Bereid je voor op experimenten met het uitpakken van nucleosoomen door de afstand tussen OT's te verkleinen tot de kracht ongeveer nul is. Zet de kracht op nul.
  4. Begin de OT 1 weg te bewegen van de OT 2 met een constante snelheid van 0.1 μm/s. Op een kymograaf zal de kraal in OT 1 visueel verder van de kraal in OT 2 bewegen. Op de FD-curve zal de kracht toenemen naarmate de afstand groter wordt. Naarmate nucleosomen zich uitpakken, zullen er "scheuren" of overgangen in de kracht (~8-37 pN) verschijnen die het ontrafelen van de binnenste omhulsel van individuele nucleosomen 27,28,29 betekenen.
    OPMERKING: De kracht waarmee het uitpakken plaatsvindt, is afhankelijk van de treksnelheid, die wordt verwacht bij niet-evenwichtsprocessen. Soms wikkelen meerdere nucleosomen tegelijk uit, waardoor een grotere afstandsverandering ontstaat in de overgang op de FD-curve. Bovendien is het ontrafelen van de buitenste omhulsel van het nucleosoom niet direct zichtbaar in deze experimentele setting (zie de sectie Discussie).

5. Visualisatie van eiwitbinding aan chromatine

  1. Voltooi stap 2 en stap 3.
  2. Voeg 10 nM Cy3-gelabelde linkerhiston H1.4 toe aan 500 μL beeldbuffer in hoofdstuk 5.
    OPMERKING: Elk eiwit dat van belang is, kan worden toegevoegd aan ch. 5 in een concentratie naar keuze (meestal minder dan 100 nM voor visualisatie van één molecuul).
  3. Nadat u een DNA-ketting met nucleosomen hebt gevormd, zet u naast de rode laser ook de groene laser aan en verplaatst u OT's naar ch. 5 voor real-time beeldvorming van H1-binding aan chromatine.
  4. Ga door met het verzamelen van kymografen of scans totdat er voldoende statistieken zijn verkregen (ten minste ~10-20 kymografen, afhankelijk van de frequentie van de gebeurtenissen en de experimentele moeilijkheidsgraad).

Resultaten

Met behulp van de opstelling beschreven in stap 3 (Figuur 1A) werd de vorming van nucleosoomen langs de DNA-ketting gevisualiseerd als het verschijnen van rode fluorescerende brandpunten op een 2D-scan (Figuur 1B, links) of trajecten in de tijd op een kymograaf (Figuur 1B, rechts). Goed verpakte nucleosomen leverden fluorescentiebanen op die in de loop van de tijd stationair waren binnen de diffractielimiet van confocale detectie (~300 nm). Met name meerdere nucleosomen die onder de diffractielimiet dicht bij elkaar worden gevormd, kunnen niet ruimtelijk worden opgelost en verschijnen als helderdere brandpunten of banen. Desalniettemin werden de fotobleekstappen van individuele nucleosomale trajecten geanalyseerd en vertoonden ze vaak 1-staps (Figuur 1C) of 2-staps (Figuur 1D) fotobleekgebeurtenissen, wat aangeeft dat foci meestal mononucleosomen bevatten, gezien de ongeveer 70% etiketteringssnelheid van het H4-eiwit in dit monster. Bovendien werd, op basis van het gemiddelde aantal fotonen voor een enkele LD655-fluorofoor in deze experimentele toestand, het aantal gelabelde H4-kopieën in elk nucleosoomtraject geschat en toonde aan dat de nucleosoomloci voornamelijk (>75%) 1 of 2 gelabelde H2A-kopieën bevatten (Figuur 1E), opnieuw in overeenstemming met het idee dat ze voornamelijk werden geladen als ruimtelijk gescheiden mononucleosomen. De andere helderdere brandpunten bevatten meer dan 3 kopieën van gelabeld H4, die waarschijnlijk meerdere nucleosomen binnen de diffractielimiet vertegenwoordigen.

De vorming van nucleosomen werd ook gevolgd door een toename van de spanning langs de ketting wanneer de posities van de OT's constant bleven omdat er meer DNA rond histon-octameren werd gewikkeld (Figuur 1B, onderaan). Bij afwezigheid van Nap1 kunnen histonoctameren nog steeds DNA binden, maar blijven ze grotendeels onuitgepakt, omdat de bijbehorende spanning wanneer de OT-posities werden vastgehouden constant bleef (Figuur 1F). Het is mogelijk dat niet-specifieke binding van histonoctameren aan DNA optreedt, zelfs in aanwezigheid van Nap1. In een ander experiment werd hetzelfde protocol uitgevoerd om nucleosomen te vormen die Cy3-gelabeld H2A bevatten, wat vergelijkbare resultaten opleverde als die uitgevoerd met LD655-gelabeld H4 (Figuur 1G), wat wijst op de assemblage van intacte octameren tot nucleosomen.

Met behulp van de opstelling beschreven in stap 4 (Figuur 2A) werd het uitpakken van het nucleosoom in de loop van de tijd gevisualiseerd op een kymograaf naarmate de kettingafstand toenam (Figuur 2B). Eerder werd gemeld dat histon-octameren vaak aan het DNA gebonden blijven nadat ze zijn uitgepakt30,31, en daarom blijven fluorescerende banen vaak bestaan, zelfs bij hoge spanningen. Het uitpakken van nucleosoomen werd ook gecontroleerd op de bijbehorende FD-curve (figuur 2C). Kwantificeerbare kenmerken van de FD-curve zijn onder meer de kracht waarmee nucleosoom(en) zich uitpakken (zie "Overgang F" in figuur 2C-inzet) en de lengte van het DNA dat werd vrijgegeven uit het histonoctameer (zie "ΔL" in figuur 2C-inzet), die bestaat in veelvouden van ~24 nm, consistent met onafhankelijke uitwikkeling van de binnenste windingen van DNA van individuele nucleosomen27, 30. okt. Deze parameters kunnen worden gebruikt om het aantal nucleosomen te schatten dat op elke ketting wordt gevormd of voor aanvullende stroomafwaartse analyse van de nucleosoommechanica. Als zodanig werd het aantal inwendige breuken verkregen uit mechanische trekexperimenten vergeleken met het geschatte aantal gelabelde H4-kopieën bij elk nucleosoomtraject op basis van de monomeerintensiteit, wat aantoonde dat de aantallen grotendeels consistent zijn (voorbeelden weergegeven in figuren 2D-G). Er werd echter opgemerkt dat ze niet perfect overeenkomen vanwege de ~70% gelabelde efficiëntie van het H4-eiwit in het monster en eventuele resterende Nap1-onafhankelijke histonbinding aan DNA, zoals weergegeven in figuur 1F. Ten slotte, zoals verwacht, genereren uitrekkende Nap1-gebonden kale DNA-bindingen (zonder histonen) geen door kracht geïnduceerde overgangen (Figuur 2H), wat aangeeft dat Nap1 alleen het DNA niet significant vervormt.

Met behulp van de opstelling beschreven in stap 5 (Figuur 3A), werd de binding van linkerhiston H1 aan chromatine gevisualiseerd als het verschijnen van groene fluorescerende brandpunten langs de chromatineketting (Figuur 3B). Met name H1-gebonden nucleosomen genereerden tweekleurige banen (zie witte pijlen in figuur 3B) die in de loop van de tijd stationair leken. Daarnaast werden diffuse H1-banen over nucleosoomvrije DNA-gebieden waargenomen (zie groene sterren in figuur 3B).

figure-results-1
Figuur 1: Nap1-gemedieerde in situ nucleosoomvorming. (A) Schema van de experimentele opzet beschreven in het Nap1-gemedieerde in situ nucleosoomvormingsprotocol (stap 3). Een paar kralen waren optisch gevangen in hoofdstuk 1 en een enkel λ-DNA-molecuul werd tussen de kralen vastgemaakt via biotine-streptavidine-binding in hoofdstuk 2. De ketting werd vervolgens verplaatst naar ch. 4, met LD655-gelabelde histon-octameren (rood) en Nap1 voor real-time vorming van nucleosomen in het DNA. (B) Representatieve 2D-scan (links) en kymograaf (rechts) van een LD655-H4-gelabelde nucleosoombevattende DNA-ketting. De bijbehorende krachtmeting (onderkant) vertoont een toename van de kracht onmiddellijk wanneer de ketting wordt verplaatst naar ch. 4 wanneer de OT-posities constant worden gehouden, wat wijst op nucleosoomverpakking. Helderdere banen duiden op meerdere aangrenzende nucleosomen die zich binnen de diffractielimiet van ~300 nm bevinden. (C) Voorbeeld van een kymograaf met een 1-staps fotobleekgebeurtenis (witte pijl) van een nucleosoom dat LD655-H4 bevat. (D) Voorbeeld van een kymograaf die een 2-staps fotobleekgebeurtenis (witte pijlen) toont van een nucleosoom dat LD655-H4 bevat. (E) Relatieve frequentie van het aantal LD655-gelabelde H4 per traject, geschat op basis van hun fluorescentie-intensiteit. (F) Representatieve kymografie van een ketting gebonden met histonoctameren bij afwezigheid van Nap1. De bijbehorende krachtmeting (bodem) blijft ongewijzigd, zelfs als histon-octameren het DNA binden. (G) Representatieve kymograaf van een Cy3-H2A-gelabelde nucleosoombevattende DNA-ketting. De bijbehorende krachtmeting (onderkant) vertoont een toename van de kracht onmiddellijk wanneer de ketting wordt verplaatst naar ch. 4 (met octameren en Nap1), aangezien nucleosomen worden gevormd wanneer de OT-posities constant worden gehouden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Nucleosoom uitpaktest. (A) Schema van de experimentele opstelling beschreven in het unwrapping nucleosomen protocol (stap 4). De DNA-ketting met nucleosomen werd verplaatst naar hoofdstuk 3 met een eiwitvrije beeldbuffer waar de afstand tussen de kralen werd vergroot en de nucleosomen werden uitgepakt. (B) Representatieve kymograaf van een nucleosoom-bevattende DNA-ketting die tot hoge krachten wordt getrokken door de afstand tussen de kralen geleidelijk te vergroten. De afname van de fluorescentie-intensiteit in de richting van de onderste kraal was waarschijnlijk te wijten aan het feit dat het DNA iets uit de lijn kantelde om scherp te scannen. (C) De bijbehorende FD-curve die door kracht geïnduceerde overgangen van het uitpakken van de binnenbocht laat zien tussen 8-37 pN. De inzet toont een inzoomweergave van een voorbeeldovergang waarvoor de uitgepakte afstand (ΔL = ~24 nm voor de inwendige draaiing van DNA van individuele nucleosomen) en de overgangskracht (overgang F) kunnen worden geregistreerd en verder kunnen worden geanalyseerd. Voor deze ketting werden 26 nucleosomen uitgepakt en de ketting scheurde bij ~65 pN, zoals aangegeven door de witte stippellijn in de kymograaf. (D,E) Voorbeeld LD655-H4 nucleosoombevattende ketting die tot hoge krachten wordt getrokken, waarbij het aantal H4 per traject wordt geschat via de fluorescentie-intensiteit (aangegeven in de kymograaf, D) en het aantal verpakte nucleosomen wordt geschat via de grootte van de door kracht geïnduceerde afstandsverandering (aangegeven in de bijbehorende kracht-afstandscurve, E). (F,G) Nog een voorbeeld zoals in (D,E). (H) DNA-bindingen (n = 5) die tot hoge krachten worden getrokken nadat ze zijn geïncubeerd in een kanaal dat alleen Nap1 bevat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Visualisatie van de interactie tussen eiwit en chromatine. (A) Schema van de experimentele opzet zoals beschreven in het protocol voor het visualiseren van eiwitbinding aan chromatine (stap 5). De DNA-ketting met nucleosomen werd verplaatst naar ch. 5, met 10 nM Cy3-gelabeld linkerhiston H1 (groen). (B) Representatieve tweekleurige kymograaf van H1-binding aan een nucleosoombevattende DNA-ketting. H1-nucleosoom colokalisatiegebeurtenissen worden aangeduid met witte pijlen. Het ongebonden nucleosoomtraject wordt aangeduid met de magenta pijl. H1-moleculen die op kaal DNA diffunderen, worden aangeduid met groene sterren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het beschreven protocol biedt verschillende voordelen voor nucleosoomreconstitutie, waaronder het minimaliseren van reagentia en tijd, en het mogelijk maken van chaperonne-afhankelijke nucleosoomvorming langs elke (mogelijk inheemse) DNA-sequentie. Bovendien maakt de in situ-methode een eenvoudigere experimentele workflow mogelijk en een gemakkelijke overgang naar enkelvoudige molecuulanalyses van nucleosoommechanica en eiwit-chromatine-interactie. Aan de andere kant omvatten de beperkingen van deze benadering het onvermogen om nucleosoompositionering langs het DNA te sturen (zelfs met de opname van sterke nucleosoompositioneringssequenties) en het aantal gevormde nucleosomen per DNA-ketting nauwkeurig te regelen (hoewel dit empirisch kan worden afgestemd door de experimentele workflow te standaardiseren). In feite ruilen degenen die voor deze methode kiezen in nauwkeurige controle van de positionering en dichtheid van nucleosoomen voor een grotere workflow en een lage behoefte aan reagens, waarvan de keuze afhangt van elk specifiek experiment. Er wordt ook opgemerkt dat de buitenste draaiing van DNA in het huidige protocol niet wordt opgelost vanwege de lange lengte van de ketting (~48,5 kbps) en buffervoorwaarden32. Om informatie te verkrijgen over de buitenste draaiing van DNA en over het stapelen tussen nucleosomen, kan de gebruiker ervoor kiezen om de DNA-lengte te verkorten en een hogere dichtheid van nucleosomen op het DNA te laden en/of de zoutdialysemethode te gebruiken om nucleosomen op sterke positioneringssequenties te plaatsen die worden gescheiden door regelmatige linkerlengtes. Ten slotte is het waarschijnlijk dat niet-specifieke binding van histonoctameren aan DNA zal optreden; Daarom is het belangrijk om bij het interpreteren van de resultaten rekening te houden met zowel fluorescentie- als krachtsignalen.

Een cruciaal aspect van het huidige protocol is ervoor te zorgen dat de gebruiker een hoge fluorescerende labelsnelheid voor histon-octameren heeft bereikt (als visualisatie vereist is), zodat de meeste, zo niet alle, nucleosomen visueel kunnen worden gedetecteerd. Een ander cruciaal aspect is het bevestigen dat de gebruiker een geschikte buffer voor het beeldvormingskanaal heeft gekozen die compatibel is met nucleosomen en andere interessante eiwitten. Gebruikersspecifieke wijzigingen in het protocol kunnen bestaan uit fluorofoorconjugatie naar een ander histon (zie rapporten33,34 voor voorbeelden van het gebruik van deze methode om nucleosomen te vormen met gelabeld H3 of H2B), het kiezen van een alternatieve fluorofoor, het opnemen van DNA-kettingen van verschillende sequenties en lengtes, het toevoegen van een zuurstofwegvangend systeem om de levensduur van fluoroforen te verlengen, het kiezen van een andere korrelgrootte, en met behulp van een alternatief DNA-kraalconjugatiesysteem (bijv. digoxigenine-anti-digoxigenine-antilichaamkoppeling).

Samenvattend biedt de beschreven methode smCFFM een handige en veelzijdige benadering om nucleosoombevattende tethers te genereren die gemakkelijk kunnen worden gebruikt om een breed scala aan chromatinegerichte vragen in de biologie te bestuderen. Toepasselijke onderzoeksgebieden zijn onder meer chromatinemechanica zoals gereguleerd door histonvarianten en posttranslationele modificaties, biofysische betrokkenheid en kinetiek van chromatinebindende eiwitten, en nucleosoomgerichte assemblageprocessen van hogere orde zoals biomoleculaire condensatie 35,36,37,38.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

Dankbetuigingen

G. N. L. C. erkent de steun van het National Institute of Mental Health van de National Institutes of Health (NIH) onder toekenningsnummer F31MH132306. S. L. wordt ondersteund door de Robertson Foundation, de International Rett Syndrome Foundation en de NIH (toekenningsnummer R01GM149862).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1x HR bufferN/AN/A30 mM tris acetaat pH 7.5, 20 mM magnesiumacetaat, 50 mM kaliumchloride, 0.1 mg/mL BSA 
1x PBS (fosfaat-gebufferd zoutwater)N/AN/A137 mM natriumchloride, 2,7 mM kaliumchloride, 10 mM natriumfosfaat dibasisch, 1,8 mM kaliumfosfaat monobasisch 
Azijnzuur, glazuurMillipore SigmaAX0074-6Gebruik om trisacetaat te maken
Biotin-11-dUTPJena BioscienceNU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATPJena BioscienceNU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTPJena BioscienceNU-956-BIO14-S
Runder Serum AlbumineMillipore SigmaA9418-50GOplossen in H2O en door een 0,22 um filter laten lopen
Cy3 Maleimide Mono-Reactive DyeCytivaPA23031Maleïmide gefunctionaliseerde Cy3 fluorofoor
dGTPNew England BiolabsN0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 RFisher Scientific05-414-051Centrifuge op tafel met koeling
Ethyl alcohol, puurMillipore Sigma459844
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Millipore SigmaE9884Oplossen in H2O tot 0,5 M
Humaan histon octameer (H4, L50C; H2A, K119C) N/AN/ARecombinante histon-eiwitten en die met labelmutaties werden in huis gezuiverd zoals eerder beschreven (zie refs. 33, 34, 35, 36). Kort gezegd, recombinante histonen werden geëxpresseerd in BL21 (De3) pLySS cellen (Promega). Inclusielichamen werden geïsoleerd na sonicatie en histonen werden onder denaturerende omstandigheden geëxtraheerd. Histonen werden gedialyseerd in buffer A (7 M ureum, 10 mM trishydrochloride pH 8,0, 100 mM natriumchloride, 1 mM EDTA en 5 mM 2-mercaptoethanol) en de oplossing werd toegevoegd aan een zwaartekrachtkolom geladen met Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). De doorstroming werd vervolgens toegevoegd aan een zwaartekrachtkolom geladen met SP Sepharose Fast Flow (Cytiva) en de histonen werden van de kolom geëlueerd door buffer A toe te voegen dat was aangevuld met 600 mM natriumchloride. Histonen met labelmutaties (H4, L50C; H2A, K119C) werden gezuiverd en vervolgens geconjugeerd aan de gewenste fluorofoor via maleïmide-gefunctionaliseerde kleurstoffen (Cytiva, Lumidyne) met een molverhouding van 20:1 kleurstof tot eiwit (zie refs. 33, 34). Histon-octaemeren werden samengesteld door een gelijk molair verhouding van elk wild-type of fluorofoor-gelabelde histon toe te voegen onder denaturerende omstandigheden, gedialyseerd in een buffer met hoog zoutgehalte met 2 M natriumchloride en vervolgens gezuiverd door middel van grootte-exclusiechromatografie zoals eerder beschreven (zie refs. 36, 37). Als alternatief kunnen individuele histon-eiwitten en kant-en-klare histon-octaemeren commercieel worden gekocht (bijv. Epicypher). 
AfbeeldingsbufferN/AN/A20 mM trishydrochloride pH 8,0, 100 mM natriumchloride
Klenow-fragment (3' tot 5' exo-)New England BiolabsM0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)Thermo Fisher ScientificSD0021Methyleringsvrij λ DNA
LD655-MALLumidyne Technologies9Maleïmide gefunctionaliseerde LD655 fluorofoor
Linker histon H1.4 (A4C)N/AN/AGezuiverd recombinant eiwit gemaakt in huis (zie ref. 38)
LUMICKS C-Trap DymoLUMICKSN/AConfiguratie met dubbele vangsten; standaardmaterialen voor instrument geleverd door fabrikant
MagnesiumacetaatoplossingMillipore Sigma63052-100MLGebruik om HR-buffer te maken
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SInbegrepen bij Klenow Fragment-kit
Pluronic F-127Millipore SigmaP2443-250GOplossen in H2O en door een 0,22 um filter laten lopen
KaliumchlorideMillipore SigmaP3911Gebruik om PBS en HR-buffer te maken
Kaliumfosfaat monobasischMillipore SigmaP0662Gebruik om PBS te maken
S. cerevisiae Nap1N/AN/ANap1 werd in huis gezuiverd zoals eerder beschreven (zie refs. 33, 34). Als alternatief kan Nap1 commercieel worden gekocht (bijv. Active Motif).
NatriumacetaatMillipore Sigma241245Oplossen in H2O tot 3 M
NatriumchlorideMillipore SigmaS9888Gebruik om PBS en afbeeldingsbuffer te maken
Natriumfosfaat dibasischMillipore SigmaS9763Gebruik om PBS te maken
SPHERO Biotin Gecoate Deeltjes (3,0-3,4 µm)SpherotechTP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c SpectrofotometerFisher ScientificND2000NanoDrop Spectrofotometer
Tris BaseFisher ScientificBP152-500Oplossen in H2O en aanpassen naar geschikte pH; gebruik om afbeeldingsbuffer en trisacetaat te maken

Referenties

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  3. Zhou, K., Gaullier, G., Luger, K. Nucleosome structure and dynamics are coming of age. Nat Struct Mol Biol. 26, 3-13 (2019).
  4. McGinty, R. K., Tan, S. Principles of nucleosome recognition by chromatin factors and enzymes. Curr Opin Struct Biol. 71, 16-26 (2021).
  5. Fierz, B., Poirier, M. G. Biophysics of chromatin dynamics. Annu Rev Biophys. 48, 321-345 (2019).
  6. Single-molecule techniques: A laboratory manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  7. Chua, G. N. L., Liu, S. When force met fluorescence: Single-molecule manipulation and visualization of protein-DNA interactions. Annu Rev Biophys. , (2024).
  8. Hashemi Shabestari, M., Meijering, A. E. C., Roos, W. H., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. Recent Advances in biological single-molecule applications of optical tweezers and fluorescence microscopy. Methods Enzymol. 582, 85-119 (2017).
  9. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Opt Lett. 11, 288(1986).
  10. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  11. Hansen, J. C., van Holde, K. E., Lohr, D. The mechanism of nucleosome assembly onto oligomers of the sea urchin 5 S DNA positioning sequence. J Biol Chem. 266, 4276-4282 (1991).
  12. Salt Peterson, C. L. gradient dialysis reconstitution of nucleosomes. CSH Protoc. 2008, 5113(2008).
  13. Leicher, R., Liu, S. Probing the interaction between chromatin and chromatin-associated complexes with optical tweezers. Methods Mol Biol. 2478, 313-327 (2022).
  14. Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442, 772-778 (2006).
  15. Ioshikhes, I. P., Albert, I., Zanton, S. J., Pugh, B. F. Nucleosome positions predicted through comparative genomics. Nat Genet. 38, 1210-1215 (2006).
  16. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J Mol Biol. 276, 19-42 (1998).
  17. Chipev, C. C., Wolffe, A. P. Chromosomal organization of Xenopus laevis oocyte and somatic 5S rRNA genes in vivo. Mol Cell Biol. 12, 45-55 (1992).
  18. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181, 1380-1394 (2020).
  19. Vlijm, R., et al. Comparing the assembly and handedness dynamics of (H3.3-H4)2 tetrasomes to canonical tetrasomes. PLoS One. 10, e0141267(2015).
  20. Mazurkiewicz, J., Kepert, J. F., Rippe, K. On the mechanism of nucleosome assembly by histone chaperone NAP1. J Biol Chem. 281, 16462-16472 (2006).
  21. Nakagawa, T., Bulger, M., Muramatsu, M., Ito, T. Multistep chromatin assembly on supercoiled plasmid DNA by nucleosome assembly protein-1 and ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor. J Biol Chem. 276, 27384-27391 (2001).
  22. Andrews, A. J., Chen, X., Zevin, A., Stargell, L. A., Luger, K. The histone chaperone Nap1 promotes nucleosome assembly by eliminating nonnucleosomal histone DNA interactions. Mol Cell. 37, 834-842 (2010).
  23. Wu, R., Taylor, E. Nucleotide sequence analysis of DNA. II. Complete nucleotide sequence of the cohesive ends of bacteriophage lambda DNA. J Mol Biol. 57, 491-511 (1971).
  24. King, G. A., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Unravelling the structural plasticity of stretched DNA under torsional constraint. Nat Commun. 7, 11810(2016).
  25. Paik, D. H., Roskens, V. A., Perkins, T. T. Torsionally constrained DNA for single-molecule assays: An efficient, ligation-free method. Nucleic Acids Res. 41, e179(2013).
  26. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).
  27. Diaz-Celis, C., et al. Assignment of structural transitions during mechanical unwrapping of nucleosomes and their disassembly products. Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2206513119(2022).
  28. Leicher, R., et al. Single-molecule and in silico dissection of the interaction between Polycomb repressive complex 2 and chromatin. Proc Natl Acad Sci USA. 117, 30465-30475 (2020).
  29. Chua, G. N. L., et al. Differential dynamics specify MeCP2 function at methylated DNA and nucleosomes. bioRxiv. , (2023).
  30. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1960-1965 (2002).
  31. McCauley, M. J., et al. Human FACT subunits coordinate to catalyze both disassembly and reassembly of nucleosomes. Cell Rep. 41, 111858(2022).
  32. Mihardja, S., Spakowitz, A. J., Zhang, Y., Bustamante, C. Effect of force on mononucleosomal dynamics. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15871-15876 (2006).
  33. Li, S., et al. Nucleosome-directed replication origin licensing independent of a consensus DNA sequence. Nat Commun. 13, 4947(2022).
  34. Li, S., et al. Origin recognition complex harbors an intrinsic nucleosome remodeling activity. Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2211568119(2022).
  35. Harada, B. T., et al. Stepwise nucleosome translocation by RSC remodeling complexes. Elife. 5, e10051(2016).
  36. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution. Methods Mol Biol. 119, 1-16 (1999).
  37. Rogge, R. A., et al. Assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning DNA. J Vis Exp. (79), e50354(2013).
  38. Leicher, R., et al. Single-stranded nucleic acid binding and coacervation by linker histone H1. Nat Struct Mol Biol. 29, 463-471 (2022).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

In situ reconstitutieeenmolecuulmicroscopiekrachtmicroscopiechromatinamechanicahistonchaperonne Nap1DNA tethernucleosoom ontwindingbinding van linkerhistonen
In situ nucleosoomassemblage voor correlatieve kracht van één molecuul en fluorescentiemicroscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.