Methodenartikel

Real-time in-vitromigratietest voor primaire muizen CD8+ T-cellen

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66580

⸱

24 mei 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester, 2David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt een methode voor primaire muizen T-celisolatie en time-lapse-microscopie van T-celmigratie onder specifieke omgevingsomstandigheden met kwantitatieve analyse.

Samenvatting

De adaptieve immuunrespons is afhankelijk van het vermogen van een T-cel om door bloed, lymfe en weefsel te migreren als reactie op ziekteverwekkers en vreemde lichamen. T-celmigratie is een complex proces dat de coördinatie vereist van veel signaalinvoer uit de omgeving en lokale immuuncellen, waaronder chemokines, chemokinereceptoren en adhesiemoleculen. Bovendien wordt de beweeglijkheid van T-cellen beïnvloed door dynamische omgevingssignalen, die de activeringstoestand, het transcriptionele landschap, de expressie van adhesiemoleculen en meer kunnen veranderen. In vivo maakt de complexiteit van deze schijnbaar met elkaar verweven factoren het moeilijk om individuele signalen te onderscheiden die bijdragen aan T-celmigratie. Dit protocol biedt een reeks methoden, van T-celisolatie tot computerondersteunde analyse om T-celmigratie in realtime te beoordelen onder zeer specifieke omgevingsomstandigheden. Deze omstandigheden kunnen helpen bij het ophelderen van mechanismen die migratie reguleren, het verbeteren van ons begrip van de kinetiek van T-cellen en het leveren van sterk mechanistisch bewijs dat moeilijk te bereiken is door middel van dierproeven. Een beter begrip van de moleculaire interacties die van invloed zijn op celmigratie is belangrijk om verbeterde therapieën te ontwikkelen.

Inleiding

T-cellen zijn de belangrijkste effectoren van de adaptieve, antigeenspecifieke immuunrespons. Op populatieniveau zijn T-cellen heterogeen, bestaande uit cellulaire subsets met verschillende gespecialiseerde functies. Belangrijk is dat CD8+ T-cellen de belangrijkste cytolytische effectoren van het immuunsysteem zijn, die geïnfecteerde of disfunctionelecellen direct elimineren.

Rijpe CD8+ T-cellen bevinden zich in weefsel en circuleren door bloed en lymfevaten op zoek naar antigenen. Tijdens infectie worden T-cellen gepresenteerd met antigenen in bloed of weefsel en worden ze snel afgevoerd naar de milt of de dichtstbijzijnde drainerende lymfeklier om een productieve immuunrespons te starten. In beide gevallen worden T-cellen geactiveerd, ondergaan ze klonale expansie en verlaten ze het lymfestelsel om in het bloed te komen, als dat nog niet het geval is. Tijdens dit proces zorgt intracellulaire signalering voor de neerwaartse regulatie van lymfatische homing-receptoren en de opregulatie van talrijke integrine- en chemokinereceptoren die essentieel zijn voor weefselspecifieke migratie2. Uiteindelijk wordt de gerichte migratie van T-cellen naar infectieplaatsen aangedreven door convergerende omgevingssignalen, waaronder integrine- en chemokine-signalering.

Chemokines kunnen grofweg worden onderverdeeld in twee hoofdklassen: (1) homeostatische signalen, die essentieel zijn voor differentiatie, overleving en basale functie, en (2) ontstekingssignalen, zoals CXCL9, CXCL10 en CCL3, die nodig zijn voor chemotaxis. Over het algemeen creëren chemokines een signaalgradiënt die directionele migratie stimuleert, bekend als chemotaxis, naast het activeren van integrine-expressie1. Chemotaxis is fijn gereguleerd en zeer gevoelig, met T-cellen die in staat zijn om te reageren op kleine veranderingen in gradiënt die hen naar een specifieke richting of locatie kunnen leiden.

Naast deze T-cel-gerelateerde factoren wordt migratie ook beïnvloed door de samenstelling en dichtheid van de extracellulaire matrix (ECM). De ECM bestaat uit een dicht netwerk van eiwitten, waaronder collageen en proteoglycanen, die de steiger vormen voor adhesieve integrinereceptoren op T-cellen. Integrinen zijn een diverse familie van transmembraaneiwitten, elk met zeer gespecialiseerde bindingsdomeinen en stroomafwaartse signaaleffecten. Dynamische expressie van integrinereceptoren op het oppervlak van een T-cel maakt een snelle aanpassing aan hun veranderende omgeving mogelijk3. Belangrijk is dat integrinen de ECM- en intracellulaire cytoskeletale actinenetwerken verbinden die samenwerken om de voortstuwingskracht te genereren die nodig is voor de beweging van T-cellen.

Samenvattend variëren migratiepatronen op basis van het fenotype van de immuuncel of omgevingssignalen. Deze complexe biologische processen worden strak gereguleerd door de expressie van cytokines, chemokinen en integrinen op het oppervlak van de T-cel, de omliggende cellen en het lokale, geïnfecteerde weefsel. In vivo kunnen deze migratiemechanismen complex zijn en het gevolg zijn van verschillende additieve signalen4. Vanwege deze complexiteit kan het onmogelijk zijn om een causaal verband vast te stellen tussen schijnbaar in elkaar grijpende variabelen. Om dit te verhelpen, zijn er verschillende in vitro benaderingen om specifieke aspecten van T-celmigratie te bestuderen, zoals de respons op specifieke chemokine-signalen en de interactie tussen T-celintegrinen en ECM-bindende eiwitten. Dit protocol behandelt methoden om muizen CD8+ T-cellen te isoleren en te activeren, met in vitro migratietests in de tweedimensionale ruimte en computationele analysetools voor het analyseren van gespecificeerde T-celmigratie. Deze methoden zijn voordelig voor de gebruiker omdat ze geen geavanceerde materialen of apparaten vereisen, zoals bij sommige andere celmigratietests die in de literatuur worden beschreven. Celmigratiegegevens die met deze methoden worden gegenereerd, kunnen op een simplistische manier bewijs leveren van immuunresponsen die verder, geïnformeerd onderzoek in vivo mogelijk maken.

Protocol

De dierprotocollen werden goedgekeurd door het University Committee on Animal Resources van de Universiteit van Rochester. De muizen in deze studie werden gehouden in de pathogeenvrije ruimte van de dierenfaciliteit van de Universiteit van Rochester. Mannelijke/vrouwelijke C57BL/6-muizen in de leeftijd van 6-12 weken (15-30 g) werden gebruikt voor de huidige studie. Isolatie van muizenweefsel kan worden uitgevoerd op een werkblad met handschoenen om de handen te bedekken en een gezichtsmasker om de neus en mond te bedekken, of in een bioveiligheidskast. Alle celkweek en plaatbereiding moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast. De reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. CD8+ T-celzuivering en -activering

  1. Voorbereiding van materialen
    1. Voor de negatieve selectie van CD8+ T-cellen: Bereid een negatief selectiemedium voor uit het supernatans van hybridomacellijnen GK1.5 en M5/114-antilichamen, die respectievelijk anti-CD4 en anti-MHCII produceren. Meng het supernatans in een verhouding van 1:1, filtreer het en bewaar het bij 4 °C voor toekomstig gebruik (>0,5 μg van elk antilichaam/miljoen totale cellen). Als alternatief zijn er commerciële CD8+ T-celisolatiekits beschikbaar.
    2. Voor activering van T-cellen: Voeg 500 μL CD3 (10 μg/ml) en CD28 (16 μg/ml) antilichamen in 1x DPBS (zonder calcium en magnesium) toe aan een niet met weefselcultuur (TC) behandelde plaat met 24 putjes en bewaar deze 's nachts bij 4 °C om plaatbinding te garanderen.
      OPMERKING: Antilichamen en eiwitten bedekken niet-TC-behandelde kweekplaten/schaaltjes beter dan reguliere TC-behandelde platen, dus niet-TC-behandelde kweekplaten worden gebruikt voor het genereren van T-cellen.
  2. Bereid een kweekschaaltje van 10 cm (of gelijkwaardig) voor door een celzeef van 70 μm in het schaaltje te plaatsen en doe 2 ml R9-medium in het filter (R9-medium: RPMI 1640x aangevuld met 10% FBS, 1% antibioticum-antimycoticum, 20 mM HEPES-buffer, 1% MEM niet-essentiële aminozuren, 50 μM β-mercaptoethanol).
  3. Zorg voor een muis met de juiste genetische achtergrond, geslacht, leeftijd en gewicht zoals bepaald door het experimentele ontwerp.
  4. Euthanaseer de muis met behulp van CO2 gevolgd door cervicale dislocatie, of geschikte euthanasiestrategieën zoals gedefinieerd door lokale protocollen voor dierenverzorging en -gebruik en goedgekeurd door de instelling.
  5. Plaats de muis in rugligging, strek alle vier de ledematen loodrecht op het lichaam en speld de voetzolen op een dissectiebord met behulp van muisdissectie-T-pinnen of iets dergelijks. Maak een oppervlakkige, centrale incisie door de huidlaag op de ventrale onderbuik met een chirurgische dissectieschaar van een muis en knip recht omhoog tot aan de kin (~8 cm). Scheid de huid van het buikvlies om de lymfeklieren bloot te leggen. Rek de huid loodrecht weg van de romp en speld deze vast5.
    1. Snijd de cervicale, axiale, brachiale en liesachtige lymfeklieren voorzichtig bilateraal weg met behulp van een stompe pincet (of het voorkeurstype uit een standaard chirurgische dissectieset voor muizen). Breng over naar de celzeef die in stap 1.2 is voorbereid.
    2. Open het buikvlies en verwijder de milt. Breng over naar de celzeef die in stap 1.2 is voorbereid.
    3. Gooi het muizenkarkas weg in de daarvoor bestemde opvangbak voor biologisch gevaar.
  6. Bereid een eencellige suspensie van de secundaire lymfoïde weefsels voor door mechanische disruptie over de celzeef van 70 μm met 2 ml R9-medium uit stap 1.2 door het weefseldisruptiegereedschap herhaaldelijk een halve slag met de klok mee en tegen de klok in te draaien.
    OPMERKING: Het zuigeruiteinde van een luer-lock-spuit, 3 ml of 10 ml, werkt goed om het weefsel te vermalen en te homogeniseren. Alternatieve materialen kunnen naar goeddunken van de gebruiker worden gebruikt.
  7. Was de cellen, het uiteinde van de spuit, de zeef en het kweekschaaltje met 7 ml medium en zorg ervoor dat de zeef rechtop blijft staan om de overdracht van grotere stukken weefsel of cellulaire aggregaten die aanwezig kunnen zijn in de eencellige suspensie te voorkomen.
  8. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml.
  9. Pelleteer de cellen bij 270 x g bij kamertemperatuur (20 °C) gedurende 5 minuten en decanteer de supernatant.
  10. Voeg 500 μL lyseerbuffer toe gedurende 1 minuut om rode bloedcellen te verwijderen. Verdun met 9,5 ml R9 medium en draai gedurende 5 minuten op 270 x g (20 °C). Decanteer het bovenliggende.
  11. Resuspendeer de pellet in 10 ml van het eerder bereide negatieve selectiemedium dat anti-MHCII en anti-CD4 bevat (stap 1.1.1). Gesteente bij kamertemperatuur (20 °C) gedurende 30 min.
  12. Pelleteer de cellen op 270 x g gedurende 5 minuten en decanteer de supernatant. 3x wassen met 10 ml R9 medium.
  13. Was tegelijkertijd in een conische buis van 15 ml 200 μl IgG-korrels tegen ratten voor schapen in 7 ml medium. Plaats de tube op een magneet, verwijder het medium en herhaal de wasstap twee keer. Resuspendeer de korrels in 7 ml R9 medium.
  14. Pelleteer de cellen bij 270 x g (20 °C) gedurende 5 minuten, decanteer de supernatant en resuspendeer de pellet vervolgens in 7 ml kralensuspensie uit stap 1.13. Gesteente bij kamertemperatuur (20 °C) gedurende 45 min.
  15. Verrijk CD8+ T-cellen door magnetische pareluitputting. Plaats de conische buis gedurende 3 minuten direct op de magneet zonder deksel om antilichaam-/hielgebonden cellen te verwijderen. CD8+- cellen moeten worden behouden. Terwijl het buisje nog in de magneet zit, verzamelt u de celsuspensie met behulp van een serologische pipet of iets dergelijks en brengt u het over in een nieuw buisje van 15 ml. Centrifugeer op 270 x g (20 °C) gedurende 5 minuten en was 3x op medium.
  16. Was de voorgecoate activeringsplaat (stap 1.1.2) twee keer met 1x DPBS zonder direct op de onderkant van de plaat te pipetteren.
  17. Optioneel: Voer een scheiding van levende/dode lymfocyten uit om dode cellen te verwijderen.
    1. Breng de cellen over naar een conische buis van 15 ml. Voeg voorzichtig 2 ml lymfocytscheidingsmedia toe aan de bodem van de celsuspensie. Centrifugeer bij 900 x g gedurende 10 minuten (bij kamertemperatuur) bij lage acceleratie en vertraging.
      OPMERKING: Levende cellen zullen scheiden op het grensvlak van medium en scheidingsmedia (middelste witte laag). Dode cellen zullen zich op de bodem van de buis ophopen en aan het einde worden weggegooid.
    2. Breng de middelste laag met levende lymfocyten over in een nieuwe buis en centrifugeer bij 270 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Decanteer het bovenliggende.
  18. Resuspendeer de pellet in 12 ml medium met 10 E/ml recombinant muis IL-2. Plaat 1 ml per putje in een niet met TC behandelde plaat met 24 putjes en overbrengen naar 37 °C 's nachts.

2. Heffen van de geactiveerde CD8+ T-cellen

  1. Visualiseer cellen met behulp van een standaard tafelmodel lichtmicroscoop, met behulp van het 4x of 10x objectief.
    OPMERKING: Geactiveerde T-cellen zullen er groter en rond of langwerpig uitzien in vergelijking met geïnactiveerde T-cellen en moeten dichte clusters van cellen door de hele put hebben.
  2. Om de geactiveerde cellen op te tillen, verstoort u de cellen met een pipet van 1 ml en zorgt u ervoor dat u goed mengt aan de randen van de plaat. Breng de cellen over naar een nieuwe conische buis van 15 ml.
    OPMERKING: Geactiveerde cellen zijn plakkeriger en vereisen krachtiger pipetteren.
  3. Was de putjes met 1 ml R9-medium om eventuele resterende cellen te verwijderen. Herhaal indien nodig nog een keer. Centrifugeer de cellen bij 270 x g (20 °C) gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg.
  4. Voer een scheiding van levende/dode lymfocyten uit om dode cellen te verwijderen zoals in stap 1.17-1.18.
  5. Onderhoud T-cellen door levende/dode cellen elke 3-4 dagen te verwijderen in R9-medium met IL-2 in een niet-TC 6-puts plaat.
    OPMERKING: T-cellen vermenigvuldigen zich beter in putten van kleine afmetingen tijdens vroege activering, mogelijk als gevolg van T-cel-T-celcontacten of van T-cellen afgeleide oplosbare factoren die hun activering bevorderen. Snelle proliferatie van T-cellen zorgt ervoor dat het kweekmedium binnen 24-48 uur na de kweek geel wordt. Til nu de cellen op en breng ze over naar een grotere put (ongecoate, niet-TC 6-wells plaat) met voldoende vers kweekmedium om de cellen te voeden (meestal 5 ml per putje). Vervang verarmd medium door vers wanneer dit wordt aangegeven door een kleurverandering van geel medium, of elke 3-4 dagen.

3. Bereiding van de glazen schaal

  1. Bereid de migratiekamers of -platen van glascellen voor door ze een nacht bij 4 °C te coaten met 300 μl/cm2 eiwit A (0,1 mg/ml), was tweemaal met 1x DPBS door ze op de schaal te doseren en te decanteren voordat u naar de volgende stap gaat.
  2. Smeer de migratiekamer of -plaat in met 300 μl/cm2 recombinante muis ICAM-1 of VCAM-1 Fc chimaera (0,1-2,75 mg/ml) samen met een recombinant muizenchemokine (0,1-10 μg/ml) gedurende 2-3 uur bij kamertemperatuur. Andere integrineliganden zoals fibronectine, muizencollageen IV en E-cadherine van muizen worden 's nachts bij 4 °C direct in de kamer gedompeld in een temperatuur van 2,5-10 μg/ml.
    1. Was de kamers twee keer met 1x DPBS door ze op de schaal te doseren en onmiddellijk daarna te decanteren voordat u cellen toevoegt.
      OPMERKING: T-cellen kunnen anders migreren in verschillende concentraties van integrineliganden en chemokines, afhankelijk van de status van activering, differentiatie, sensibilisatie en priming. Het wordt sterk aanbevolen om celmigratie in meerdere verschillende concentraties te testen.
  3. Plaats de aanhangende cellen 24 uur voor aanvang van de beeldvorming op met glas beklede platen als T-cellen samen met andere cellen, zoals kankercellen, worden gekweekt om het doden van T-cellen van kankercellen in realtime te meten.

4. Bereiding van cellen

  1. Optioneel: Kleuring T-cellen en aanhangende cellen met celtrackerkleurstof naar keuze bij 1 μg/ml per 1 x 107 cellen in 1x DPBS gedurende 15 min bij 37 °C, of volgens het protocol van de fabrikant.
  2. Tel cellen met behulp van een hemocytometer of iets dergelijks.
  3. Plaat 1 x 105 CD8+ T-cellen (of gewenste hoeveelheid) in Leibovitz's L-15 medium aangevuld met 1-5 g/L glucose in een kamer van 37 °C.
    OPMERKING: L-15 medium is geformuleerd voor gebruik zonder een CO2 -natriumbicarbonaat systeem. Het wordt gebufferd met vrije basische aminozuren, fosfaatbuffers en galactose om de pH-waarde op peil te houden.
  4. Optioneel: Integrineblokkering uitvoeren.
    1. Pre-incubeer T-cellen met een blokkerend antilichaam tegen een integrine (1-10 μg/ml, anti-muis CD11a (M17/4), anti-muis CD18 (M18/2), anti-muis VLA-4 (9C10) gedurende 10 minuten en laat kruipen in aanwezigheid van hetzelfde antilichaam.

5. Time-lapse microscopie

  1. Voer videomicroscopie uit.
  2. Voor T-cellen verkrijgt u elke 10-60 s gedurende 10-60 minuten helderveld- en fluorescentiebeelden, of de gewenste acquisitie-instellingen.
    OPMERKING: T-celmigratie is temperatuurgevoelig en de optimale temperatuur voor T-celmigratie van muizen is 37 °C. Het temperatuurregelsysteem dat in dit protocol wordt gebruikt, bestaat uit een gesloten en geïsoleerd microscoopdek met een aangesloten verwarmingssysteem. De beeldvormingskamer bevindt zich op het beeldvormingsdek. De omtrek van deze kamer heeft een put gevuld met gedestilleerd water die een consistente warmte en vochtigheid mogelijk maakt tijdens de beeldvorming. De microtiwell bevindt zich in het midden van de beeldkamer.

6. Software-ondersteunde analyse van T-celmigratie

  1. Gebruik de Volocity-software om de migratie van T-cellen te beoordelen.
    1. Open Volocity en maak een nieuwe afbeeldingsreeks.
    2. Selecteer en verplaats alle time-lapse-videomicroscopiefilms naar het blauwe gebied in Volocity.
    3. Pas de helderheid en het contrast aan met behulp van de tool voor contrastverbetering naar de gewenste instellingen van de onderzoeker.
    4. Controleer de afbeeldingsformaten: 0,325 μm voor 20x, 0,65 μm voor 10x.
    5. Volgorde: stel tijdstippen in (bijvoorbeeld: 81 foto's als je elke 15 s een foto maakt gedurende 20 minuten, 4 per minuut).
    6. Schakel alle tijdstippen uit op het tabblad Meting.
    7. Zoek objecten met behulp van intensiteit: verschuif de balk zodat deze precies rechts van de piek is.
    8. Sluit objecten uit op grootte: alle cellen die kleiner zijn dan 10 μm diameter en groter dan 100 μm om celresten of niet-cellulaire deeltjes uit te sluiten. Sluit T-cellen uit die minder dan 20% van de opnametijd migreren (dit kan variëren afhankelijk van de definitie door elke onderzoeker).
    9. Statische objecten negeren (selectievakje).
    10. Breekbare traktaten automatisch samenvoegen (selectievakje aanvinken).
    11. Stel de kortste weg in op niet meer dan 20 μm.
    12. Het spoor van een celmigratie is de lijn die de locatie van dezelfde cel in de loop van de tijd verbindt. Zorg ervoor dat het trackingalgoritme wordt bijgehouden door te detecteren waar individuele objecten worden gedetecteerd door segmentatie in elk frame en de objecten worden afgestemd op verschillende frames.
    13. Sla een nieuw protocol op door Metingen > Protocol opslaan te kiezen > Nieuw protocol een naam te geven.
    14. Klik op alle tijdstippen meten in het tabblad meting.
    15. Sorteer tracks op tijdspanne, van hoog naar laag.
    16. Noteer track-ID-nummers voor alle cellen met goede tracks zoals gedefinieerd door de onderzoeker. Na automatische celtracering is handmatige evaluatie van elke celtrack nodig om ten onrechte geïdentificeerde of kapotte tracks uit te sluiten. Sluit cellen met slechte sporen uit.
    17. Exporteer het bestand als door komma's gescheiden tekst en breng de gegevens over naar de gewenste analysesoftware.
      OPMERKING: Basisparameters: Snelheid (μm/min), verplaatsing (netto beweging, μm), spoorlengte (totale weglengte, μm) en meanderende index (MI; netto verplaatsing/spoorlengte. MI = 1 geeft een volledig recht lineair spoor aan).
  2. Handmatige tracking uitvoeren met behulp van afbeelding J.
    1. Open plug-ins en selecteer tracking en handmatige tracking. Stel de parameters in - tijdsintervallen, x/y-kalibratie (pixelgrootte) en z-kalibratie (in handmatige volgmodus). Begin met het volgen van individuele cellen door op track toevoegen te klikken, één cel op het eerste tijdstip te selecteren en door te gaan op alle tijdstippen. Klik vervolgens op Track beëindigen. Herhaal dit voor alle cellen die van belang zijn.
      OPMERKING: Trackmate, een andere tool voor het volgen van mobiele cellen, is een automatische trackingsoftware die beschikbaar is via de ImageJ-plug-in.

Resultaten

Bevestiging van T-celactivering kan worden bereikt door flowcytometrie, op zoek naar verhoogde expressie van CD69 en CD44, die canonieke markers van activering zijn in Muizen T-cellen6. Bovendien kan de zuiverheid van de T-celpopulatie worden bepaald door flowcytometrie voor CD3+ CD8+ T-cellen. Deze methode levert >90 % CD8+ T-celpopulatie op.

T-celmigratie kan worden beoordeeld met software-ondersteunde celvolgprogramma's die zowel reproduceerbaar zijn als afstembaar om aan de behoeften van de onderzoeker te voldoen. Enkele basisparameters die worden gebruikt om experimentele effecten te bepalen, zijn onder meer cellulaire snelheid (migratielengte per een bepaalde tijd om te bepalen hoe snel een cel beweegt), verplaatsing (migratieafstand, een rechte lijn van het startpunt naar het eindpunt, om te bepalen hoe ver een cel migreert), spoorlengte (migratieafstand, de totale lengte van het migratiepad, om te bepalen hoe ver een cel migreert), en meanderende index (MI ligt tussen 0 en 1 om de rechtheid van de migratie te bepalen, 1 = recht). Deze parameters worden gebruikt om migratieverschillen te evalueren in naïeve en geactiveerde CD8+ T-cellen die langs ICAM-1 gecoat glas kruipen met CXCL12 (Figuur 1). Verhoogde gemiddelde snelheid, verplaatsing en meanderende index werden waargenomen in geactiveerde CD8+ T-cellen in vergelijking met naïeve, wat aangeeft dat geactiveerde T-cellen een verhoogd migratievermogen hebben. Evenzo kan de impact van verschillende chemokines op cellulaire migratiepatronen met deze methoden worden opgehelderd. Geactiveerde CD8+ T-cellen vertonen bijvoorbeeld een verhoogde migratie in aanwezigheid van CXCL12, maar niet van CCL2 of CCL22, en de migratie neemt op een dosisafhankelijke manier toe tot een verzadigingsconcentratie (Figuur 2). Bovendien maakt software-ondersteunde celtracking de karakterisering van individuele celmigratie mogelijk, waardoor inzicht kan worden verkregen in de effecten van individuele liganden op het gedrag van T-cellen. Representatieve celsporen zijn te zien in figuur 3.

Alles bij elkaar ondersteunen deze gegevens de werkzaamheid van de huidige methoden door te bevestigen dat we (1) celmigratie op individuele celbasis kunnen volgen, en (2) verschillen in migratie van CD8+ T-cellen kunnen onderscheiden op basis van activeringsstatus en in de aanwezigheid van verschillende chemokines en adhesiemoleculen. Deze test is een cruciale stap in het ontleden van complexe signaleringsmechanismen en het informeren van gerichte in vivo experimenten die de biologische bijdragen van specifieke signalen op een celtype-specifieke manier verder kunnen aanpakken.

figure-results-1
Figuur 1: In vitro testen voor naïeve en geactiveerde CD8+ T-celmigratie. Naïeve of CD3/CD28-geactiveerde muis CD8+ T-cellen mochten gedurende 10 minuten migreren op ICAM-1 plus CXCL12. Snelheid, verplaatsing en meanderende index van de celmigratie werden geanalyseerd met behulp van time-lapse-microscopie en volocity. Elke groep heeft 36 individuele T-cellen (gemiddelde ± SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: In vitro assays voor chemokine-afhankelijke migratie van geactiveerde CD8+ T-cellen. CD3/CD28-geactiveerde muis CD8+ T-cellen mochten migreren op ICAM-1 plus een geïndiceerde chemokine. De verhoudingen van het aantal cellen dat gedurende 20 minuten meer dan 50 μm kruipt (percentage van het totaal) werden bepaald in een gezichtsveld. Een enkele test geanalyseerd >10 cellen (n = 3 tests per groep gemiddelde ± SEM). Ongepaarde t-toets, *p< 0,05 vergeleken met controlegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Migratiesporen van geactiveerde CD8+ T-cellen op ICAM-1 plus CXCL12 gedurende 20 minuten. Elke gekleurde lijn geeft het migratiespoor van elke T-cel aan in een richting van het punt van de cel naar het tegenovergestelde. In deze specifieke test migreerden 24 van de 38 cellen in een significante lengte (ten minste de afstand van hun celbreedte volgens onze definitie). T-cellen migreerden in verschillende lengtes van afstanden, wat aangeeft dat elke cel zich in een andere status van activering of priming bevond. Alle migrerende cellen bewogen in verschillende richtingen op voorwaarde dat het oppervlak gelijkmatig gecoat was. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het begrijpen van de biologische impact van convergerende signalen in vivo is een uitdaging en niet gemakkelijk te interpreteren. De hierin gepresenteerde protocollen bieden een redelijke methode om T-celmigratie te begrijpen in zeer gedefinieerde en biologisch relevante omstandigheden. Deze voorwaarden kunnen worden gespecificeerd op basis van het oordeel van de onderzoeker, en de protocollen kunnen worden aangepast om te voldoen aan de behoeften van verschillende T-celpopulaties, activeringsstatus en celfenotype. Bovendien kunnen veel liganden en receptoren worden ondervraagd via deze gedefinieerde antilichaamblokkerende 7,8- en ligand-gecoate glasprocedures 8,9,10. Deze techniek is ook een cruciaal platform geweest om gemanipuleerde immuuncellen te ontwikkelen11,12.

Belangrijke stappen in het protocol zijn onder meer de isolatie van secundair lymfoïde weefsel, activering van de T-cellen, coating van de glazen beeldvormingsschalen en data-analyse. Voor het onervaren oog kunnen lymfeklieren die in weefsel zijn ingebed, moeilijk te identificeren en te extraheren zijn. Dit kan worden overwonnen met oefening. Zodra T-cellen zijn geïsoleerd en gezuiverd, resulteert de activeringsstap in plakkerige cellen die, als ze niet goed worden opgetild, kunnen resulteren in een lage opbrengst. Dit kan worden voorkomen door de putten royaal en zorgvuldig te wassen. Glazen schalen moeten goed worden bedekt met het ligand van belang en worden gewassen voordat cellen worden toegevoegd. Dit zorgt ervoor dat er een robuuste eiwitlaag beschikbaar is waar cellen zich aan kunnen hechten, terwijl het er ook voor zorgt dat een teveel aan reagens de biologie niet verstoort. Proteïne A-glasbinding en Fc-Proteïne A-binding in de fysiologische pH en zoutconcentratie zijn sterk genoeg om niet te worden weggespoeld bij het voorzichtig gieten en decanteren van de buffer. Eventuele resteiwitten in het medium veroorzaken geen toxiciteit, hoewel ze de celinteractie met gebonden liganden kunnen verstoren als ongebonden liganden in hoge concentraties zijn. We sluiten deze mogelijkheid uit door het gecoate glas een paar keer te spoelen. Ten slotte bestaat er veel gebruiksvriendelijke commerciële en niet-commerciële software waarmee onderzoekers zelfs subtiele verschillen in cellulair gedrag en morfologie kunnen detecteren. Het belang van het handmatig geruststellen van de geanalyseerde resultaten om fouten uit te sluiten die de software zou kunnen maken, kan niet genoeg worden benadrukt.

Methoden voor T-celzuivering en -activering kunnen worden aangepast aan de behoeften van de onderzoeker om de juiste celtoestand en het juiste fenotype te verkrijgen om in vivo observaties te recapituleren. Verschillende celtypen en -toestanden kunnen worden gebruikt om verschillende mechanismen van infectie en immuunrespons aan te pakken 7,8,9,10,11,13, inclusief het aanpakken van naïef en geheugen-T-celgedrag en verschillende aspecten van de geheugenrespons, zoals priming en rekrutering, in weefselspecifieke omstandigheden 14. Deze methode kan worden gebruikt voor co-cultuur met verschillende celtypen om cellulaire interacties verder te begrijpen, waaronder cel-cel contacttijden en -duur 7,9, antigeenpresentatie 9,13 en doelceldoding6. Extra reporters en labels kunnen worden gebruikt om subcellulaire structuren7, granulaat15, apoptose6 en meer te beoordelen.

Het protocol is een uitstekend hulpmiddel om aanvullende in vivo experimenten te begeleiden op basis van waarnemingen in vereenvoudigde en sterk gedefinieerde omstandigheden. Hoewel in vitro beoordeling van de beweeglijkheid van cellen zeer beperkend kan zijn, is het een belangrijke stap in het afbreken van complexe biologische activiteiten. Met de resultaten van deze experimenten kunnen onderzoekers in vivo werk op een meer fysiologisch relevante en gerichte manier benaderen.

De eenvoud van deze methode vertegenwoordigt ook de grote beperking; Hoewel ze representatief zijn voor in vivo activiteiten, kunnen alle resultaten verder worden bevestigd met behulp van bijvoorbeeld intra-vitale multifotonenmicroscopie. De hierin beschreven methode is een van de eenvoudigste die volledig beschikbaar is voor onderzoekslaboratoria met een helderveldmicroscoop en/of epifluorescentiemicroscoop met een digitale camera die in het microscoopsysteem is geïntegreerd of afzonderlijk op het objectief van de scoop is geplaatst. Aan de andere kant zijn er meer opties voor geavanceerde analyse van in vitro immuuncelmigratie. Ten eerste worden immuuncellen vaak aangestuurd door chemokinegradiënten in het biologische systeem. Analyse van het gedrag van immuuncellen onder chemokine-gradiënten kan op verschillende manieren worden bereikt. Een eenvoudige methode is het gebruik van een speciaal ontworpen dia (zie Tabel met materialen). Dit gekanaliseerde putsysteem, wanneer de bodem bedekt is met integrineliganden, maakt analyse van immuuncelmigratie onder statische chemokinegradiënt mogelijk. Andere eenvoudige tests voor chemotaxis van immuuncellen zijn onder meer time-lapse-microscopie van celmigratie naar een micropipetpunt die chemokines16 afgeeft, onder agarose-test17 en Zigmond-kamer18. Voor een meer geavanceerde migratietest onder gecontroleerde chemokine-gradiënten zijn aangepaste objectglaasjes met microfluïdische gradiëntgeneratoren vereist19,20. Ten tweede kunnen immuuncellen migreren in unieke fysieke omstandigheden met behulp van verschillende mechanismen, soms zonder gebruik te maken van integrine-afhankelijke adhesie aan liganden. De in vitro migratietest in één dimensie kan worden uitgevoerd met of zonder integrine-ligandcoating en reproduceert de beweeglijkheid van immuuncellen in capillaire vaten21,22. Een andere optie is een celmigratietest in de driedimensionale ruimte23,24 om mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan interstitiële migratie van cellen25,26. Over het algemeen hebben we eenvoudige, reproduceerbare en betrouwbare methoden geschetst om dynamische cellulaire migratiegebeurtenissen te bestuderen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat al het onderzoek en de voorbereiding van het manuscript zijn uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relaties die zouden kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Dankbetuigingen

We bedanken eerdere en huidige leden van het Kim Lab die in de loop van de tijd hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van deze protocollen. Representatieve gegevens werden mogelijk gemaakt door P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Verenigde Staten en P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/Verenigde Staten. Deze publicatie is mede mogelijk gemaakt door subsidienummer T32 GM135134 van de Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 cm dishCorning353003of gelijkwaardig
15 mL conische buisThermoFisher339650of gelijkwaardig
1x DPBSGibco14190144zonder calcium en zonder magnesium
6 welplaat niet-TC behandeldCorning3736of gelijkwaardig
70 µm celzeefFisherScientific352350of gelijkwaardig
ACK lyseringsbufferThermoFisherA1049201of gelijkwaardig
Allegra 6KR centrifugeThermoScientificsorvall 16R met tx400 3655 rotor en emmerof gelijkwaardig
Beta mercaptoethanolSigmaM3148of gelijkwaardig
CellTrace VioletThermoFisherC34571of gelijkwaardig
CentrifugeThermoScientificSorvall ST 16Rof gelijkwaardig
Collageen (IV)Corning354233of gelijkwaardig
DeltaT kweekschaal .17 mm dik helder glasBioptechs04200417C
Dynabeads Schapen anti-Rat IgGInvitrogen11035
DynaMag 15 MagneetThermoFisher Scientific12301Dof gelijkwaardig
Easy sep muis T-cel isolatiekitStem Cell19851
FBSSigmaAldrichF2442-500MLof gelijkwaardig
FibronectineSigmaAldrich10838039001of gelijkwaardig
Fijihttp://fiji.sc/weblink
Filter kubussenNikon of Olympus
GK1.5ATCCTIB-207
HEPESThermoFisher15630080of gelijkwaardig
HQ CCD cameraCoolSNAPof gelijkwaardig
ImageJhttp://imagej.nih.gov/ij/hweblink
ImageJ automatisch volg plug inhttp://imagej.net/TrackMateweblink
ImageJ handmatige volg plug inhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.htmlweblink
L-15VerschillendeZie MaterialenMedium Recept: Leibovitz’s L-15 medium zonder fenolrood (Gibco) aangevuld met 1-5 g/L glucose
Liebovitz's L-15 medium, geen fenolroodThermoFisher21083027
Luer Lok wegwerpspuitFisher Scientific14-955-459of gelijkwaardig
Lymfocyten scheidingsmediumCorning25-072-CIof gelijkwaardig
M5/114ATCCTIB-120
MEM Niet-Essentiële AminozurenThermoFisher11140050of gelijkwaardig
Microscoop verwarmingssysteemOkolabokolab.comAangepaste ontwerpen beschikbaar
Millicell EZ slideMilliporeC86024
Mojosort muis CD8+ Naïve T-cel isolatiekitBiolegend480043
Muis E-cadherineR&D systems8875-EC-050of gelijkwaardig
Muis chirurgische dissectiekitFisher Scientific13-820-096of gelijkwaardig
NIS elementenNikonSoftware
niet-TC 24wpCorning353047of gelijkwaardig
Penicilline-streptomycineThermoFisher15140122of gelijkwaardig
Proteïne AThermoFisher Scientificof gelijkwaardig
R9VerschillendeZie MaterialenMedium Recept: RPMI 1640x aangevuld met 10% FBS, 1% antibioticum-antimycoticum (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1% MEM Niet-Essentiële Aminozuren (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
Recombinant muis ICAM-1 Fc chimeraR&D systems796-IC-050of gelijkwaardig
Recombinant Muis IL2Biolegend575410of gelijkwaardig
RPMI 1640xThermoFisher11875093of gelijkwaardig
T pinsFisher ScientificS99385of gelijkwaardig
TE2000-U microscoopNikonof gelijkwaardig
Verschillende recombinante muis chemokineR&D systemsof gelijkwaardig
VCAM-1 Fc chimeraR&D systems643-VM-050of gelijkwaardig
VolocityPerkinElmerSoftware

Referenties

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  2. Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
  3. Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815(2021).
  4. Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
  5. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739(2015).
  6. Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850(2023).
  7. Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
  8. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352(2015).
  9. Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
  10. Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
  11. Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231(2021).
  12. Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
  13. Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
  14. Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
  15. Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239(2013).
  16. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
  17. Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
  18. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), Pt 1 606-616 (1977).
  19. Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
  20. Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
  21. Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
  22. Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379(2014).
  23. Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963(2014).
  24. Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
  25. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  26. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).

Herprints en machtigingen

Tags

T-celmigratieCD8-positieve T-cellentime-lapse microscopielymfocytenisolatiemicrofluïdische apparatenceltrackingintegrineblokkadeveldlichtmicroscopiehandmatige celtracking
Real-time in-vitromigratietest voor primaire muizen CD8+ T-cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.