Method Article

Op CRISPR gebaseerde modulaire assemblage voor high-throughput constructie van een UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek

DOI:

10.3791/66581

⸱

May 17th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 2Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een protocol voor CRISPR-gebaseerde modulaire assemblage (CRISPRmass), een methode voor high-throughput constructie van UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek in Drosophila met behulp van openbaar beschikbare cDNA/ORF-bronnen. CRISPRmass kan worden toegepast op het bewerken van verschillende plasmidebibliotheken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Functionele genomics-screening biedt een krachtige benadering van de functie van sonde-gen en is gebaseerd op de constructie van genoombrede plasmidebibliotheken. Conventionele benaderingen voor de bouw van plasmidebibliotheken zijn tijdrovend en arbeidsintensief. Daarom hebben we onlangs een eenvoudige en efficiënte methode ontwikkeld, CRISPR-gebaseerde modulaire assemblage (CRISPRmass), voor high-throughput constructie van een genoombrede stroomopwaartse activerende sequentie-complementaire DNA/open leesframe (UAS-cDNA/ORF) plasmidebibliotheek. Hier presenteren we een protocol voor CRISPRmass, met als voorbeeld de constructie van een op GAL4/UAS gebaseerde UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek. Het protocol omvat massaal parallelle reageerbuisreacties in twee stappen, gevolgd door bacteriële transformatie. De eerste stap is het lineariseren van de bestaande complementaire DNA (cDNA) of open leesframe (ORF) cDNA- of ORF-bibliotheekplasmiden door de gedeelde stroomopwaartse vectorsequenties naast het 5'-uiteinde van cDNA's of ORF's te knippen met behulp van CRISPR/Cas9 samen met single guide RNA (sgRNA), en de tweede stap is om een UAS-module in de gelineariseerde cDNA- of ORF-plasmiden in te voegen met behulp van een eenstapsreactie. CRISPRmass maakt de eenvoudige, snelle, efficiënte en kosteneffectieve constructie van verschillende plasmidebibliotheken mogelijk. De UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek kan worden gebruikt voor gain-of-function-screening in gekweekte cellen en voor het construeren van een genoombrede transgene UAS-cDNA/ORF-bibliotheek in Drosophila.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onbevooroordeelde genetische screening van het hele genoom is een krachtige benadering voor het identificeren van genen die betrokken zijn bij een bepaald biologisch proces en het ophelderen van het mechanisme ervan. Daarom wordt het veel gebruikt op verschillende gebieden van biologisch onderzoek. Ongeveer 60% van de Drosophila-genen is geconserveerd bij mensen 1,2, en ~75% van de menselijke ziektegenen heeft homologen in Drosophila3. Genetische screening is voornamelijk onderverdeeld in twee soorten: functieverlies (LOF) en functiewinst (GOF). LOF genetische screenings in Drosophila hebben een cruciale rol gespeeld bij het ophelderen van mechanismen die bijna elk aspect van de biologie beheersen. De meerderheid van de Drosophila-genen heeft echter geen duidelijke LOF-fenotypes4, en daarom is GOF-screening een belangrijke methode om de functie van die genen te bestuderen 4,5.

Het binaire GAL4/UAS-systeem wordt vaak gebruikt voor weefselspecifieke genexpressie in Drosophila6. In dit systeem brengt het weefsel specifiek gisttranscriptieactivator GAL4 tot expressie die bindt aan het GAL4-responsieve element (UAS) en daardoor de transcriptie van de stroomafwaartse genetische componenten (bijv. cDNA en ORF) activeert6. Om genoombrede GOF-screenings in Drosophila uit te voeren, moeten we een genoombrede UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek construeren en vervolgens een transgene UAS-cDNA/ORF-bibliotheek in Drosophila.

Het opbouwen van een genoombrede UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek met conventionele methoden uit openbaar beschikbare cDNA/ORF-klonen is tijdrovend en arbeidsintensief, aangezien elk gen geïndividualiseerde ontwerpen vereist, waaronder primerontwerp en -synthese, polymerasekettingreactie (PCR) en gelzuivering, sequencing, restrictievergisting, enzovoort 7,8. Daarom is de constructie van zo'n plasmidebibliotheek een snelheidsbeperkende stap in het creëren van een genoombrede transgene UAS-cDNA/ORF-bibliotheek in Drosophila. Onlangs hebben we dit probleem met succes opgelost door een nieuwe methode te ontwikkelen, CRISPR-gebaseerde modulaire assemblage (CRISPRmass)9. De kern van CRISPRmass is het manipuleren van de gedeelde vectorsequenties van een plasmidebibliotheek door een combinatie van genbewerkingstechnologie en naadloze kloontechnologie.

Hier presenteren we een protocol voor CRISPRmass, dat massaal parallelle tweestaps reageerbuisreacties omvat, gevolgd door bacteriële transformatie. CRISPRmass is een eenvoudige, snelle, efficiënte en kosteneffectieve methode die in principe kan worden gebruikt voor high-throughput constructie van verschillende plasmidebibliotheken.

CRISPRmass-strategie
De procedure van CRISPRmass begint met parallelle reageerbuisreacties in twee stappen voorafgaand aan de transformatie van Escherichia coli (E. coli) (Figuur 1). Stap 1 is de splitsing van de identieke vectorruggengraat van de cDNA/ORF-plasmiden door Cas9/sgRNA. Een ideale splijtingsplaats grenst aan het 5′ uiteinde van cDNA/ORF. De decolletéproducten hoeven niet gezuiverd te worden. Stap 2 is het invoegen van een vectorspecifieke UAS-module in de Cas9/sgRNA gelineariseerde cDNA/ORF-plasmiden door Gibson-assemblage (hierna eenstapsreactie genoemd), wat resulteert in UAS-cDNA/ORF-plasmiden. De 5′ en 3′ terminale sequenties van een UAS-module overlappen met die van de gelineariseerde cDNA/ORF-plasmiden, waardoor de eenstapsreactie mogelijk is.

De eenstapsreactieproducten worden direct onderworpen aan E. coli-transformatie . Theoretisch kunnen alleen de gewenste UAS-cDNA/ORF-kolonies groeien op Luria-Bertani (LB)-platen die selectieantibiotica bevatten die overeenkomen met het antibioticaresistentiegen van de UAS-module. De UAS-module bestaat uit een UAS-kernmodule, een antibioticaresistentiegen dat verschilt van dat van cDNA- of ORF-plasmiden, en de 5′ en 3′ terminale sequenties. Een kern-UAS-module bestaat uit 10 kopieën van UAS, een Hsp70 minimale promotor, een attB-sequentie voor phiC31-gemedieerde genomische integratie en een mini-witte transformatiemarker voor Drosophila7.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bepaling van de optimale Cas9/sgRNA-splitsingsplaats stroomopwaarts van cDNA/ORF

  1. Bereiding van cDNA- of ORF-plasmiden met identieke vectorruggengraat
    1. Koop cDNA/ORF-klonen die beschikbaar zijn in openbare bronnen, zoals het Drosophila genome resource center (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection10,11, de muizen zoogdier genencollectie (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) en de menselijke CCSB-brede lentivirale expressiebibliotheek12. In dit protocol nemen we als voorbeeld de pOT2-vectorgebaseerde cDNA/ORF-klonen, die beschikbaar zijn in de DGRC Gold Collection.
    2. Extraheer plasmide-DNA met behulp van een plasmide mini-prep-kit. Meet de concentratie plasmiden met een spectrofotometer.
  2. Ontwerp van sgRNA's
    1. Bezoek de website van CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Klik op de knop Doel plakken en voer vervolgens de gewenste DNA-sequentie in. De sequentie van belang is een gebied van 20-100 bp in de pOT2-vectorruggengraat stroomopwaarts van het cDNA/ORF 5'-uiteinde.
    2. Kies dan voor de soort Drosophila melanogaster. Klik op de knop Doelsites zoeken. Kies sgRNA-kandidaten met een voorspelde efficiëntie van meer dan 80%.
  3. Bereiding van sgRNA's
    1. Bestel PAGE-gezuiverde oligo's, een voorwaartse primer (5′ -TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTA
      GAAATAG-3′) waarbij (N)20 de doelsequentie is van een sgRNA, en een sgRNA-scaffold reverse primer sgRNA-REV (5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′).
      OPMERKING: Beveel het gebruik van PAGE-gezuiverde oligonucleotiden van hoge kwaliteit aan.
    2. Bereid een DNA-sjabloon voor door PCR voor in vitro transcriptie (IVT) van sgRNA. Zet een PCR-reactie van 100 μL als volgt op: 5 μL sjabloon pX330 (Addgene plasmide 42230, een geschenk van Feng Zhang; 0,1 ng/μL), 5 μL voorwaartse primer (10 μM), 5 μL sgRNA-REV (10 μM), 50 μL 2x High fidelity PCR-mastermix en 35 μL diethylpyrocarbonaat (DEPC)-behandeld water in een PCR-buis.
    3. Voer PCR uit met behulp van de volgende thermocyclische omstandigheden: 1 cyclus van 98 °C gedurende 30 s; 5 cycli van 98 °C gedurende 10 s, 51 °C gedurende 10 s, 72 °C gedurende 5 s; 30 cycli van 98 °C gedurende 10 s, 72 °C gedurende 15 s; 1 cyclus van 72 °C gedurende 2 min. Incubeer reacties in een thermische cycler.
    4. Scheid PCR-producten door 0,8% agarosegelelektroforese. Een DNA-fragment van ~120 bp moet zichtbaar zijn op de gel onder UV. Zuiver het ~120-bp DNA-fragment met behulp van een gelextractieset. Het gezuiverde DNA-fragment dient als sjabloon voor IVT van sgRNA.
    5. Zet een IVT-reactie van 5 μL als volgt op: 165 ng ~120-bp gezuiverd gel-DNA-fragment, 1.65 μL NTP-buffermix, 0.33 μL T7 RNA-polymerasemix en DEPC-behandeld water. Incubeerreacties bij 37 °C gedurende 4 uur. Volg de instructies in de handleiding van een in-vitrotranscriptieset .
    6. Voeg 45 μL DEPC-behandeld water toe aan het IVT-reactieproduct. Behandel de IVT-reactieproducten als RNA en gebruik DEPC-behandeld water als blanco controle. Meet de concentratie van sgRNA met een spectrofotometer. De concentratie verdund sgRNA ligt rond de 870 ng/μL.
    7. Verdun het IVT-reactieproduct tot 20 ng/μL met DEPC-behandeld water. Aliquot en sla sgRNA direct op bij -80 °C.
      OPMERKING: Na de IVT-reactie is verwijdering van de DNA-sjabloon door DNase-digestie niet nodig voor het meten van de precieze concentratie van sgRNA, aangezien de hoeveelheid van de DNA-sjabloon minder is dan 0,4% van die van sgRNA en de DNA-sjabloon geen invloed heeft op de daaropvolgende CRISPRmassa-reactie. Daarom is sgRNA-zuivering niet nodig.
  4. Evaluatie van sgRNA's
    1. Verteer een cDNA/ORF-plasmidedragende pOT2-vectorruggengraat met een restrictie-enzym. Scheid de resulterende DNA-fragmenten door 0,8% agarosegelelektroforese. Zuiver het DNA-substraat met een gelextractieset.
      OPMERKING: Een resulterend DNA-fragment dat de sgRNA-targetingssequenties van de pOT2-vectorbackbone bevat, dient als het DNA-substraat van Cas9/sgRNA's. De splitsingsplaatsen van Cas9/sgRNA's bevinden zich asymmetrisch in het DNA-substraat, en daardoor levert splitsing van het DNA-substraat door Cas9/sgRNA's twee DNA-fragmenten van verschillende grootte op, waardoor ze gemakkelijker te onderscheiden zijn van het niet-afgedankte DNA-substraat in de verteringsreactie.
    2. Zet een Cas9-splitsingsreactie van 5 μL als volgt op: 0,2 μL van 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 0,5 μL 20 ng/μL sgRNA, 0,015 pmol DNA-substraat, 0,5 μL 10x Cas9 Buffer en DEPC-behandeld water. Incubeerreacties bij 37 °C gedurende 1 uur.
    3. Scheid de splitsingsproducten door 0,8% agarosegelelektroforese. Laad het intacte DNA-substraat als negatieve controle voor het verteerde DNA-substraat.
      OPMERKING: Hier verwijst intact DNA-substraat naar DNA-substraat dat niet wordt onderworpen aan verteringsreacties door Cas9/sgRNA's. Splitsing van het DNA-substraat door Cas9/sgRNA's levert twee DNA-fragmenten van verschillende grootte op, waardoor ze gemakkelijker te onderscheiden zijn van het afgedankte DNA-substraat in de verteringsreactie.
    4. Analyseer splijtingspatronen met behulp van een digitaal beeldvormingssysteem (Figuur 2). Selecteer het meest efficiënte sgRNA voor volgende CRISPRmass-experimenten. Figuur 2 laat zien dat alle vier de sgRNA's een hoge splitsingsefficiëntie vertonen en kunnen worden gebruikt voor CRISPRmass. Selecteer het onderstreepte sgRNA voor volgende experimenten.
      OPMERKING: Hoe minder het verwijderde DNA-substraat is, hoe efficiënter het sgRNA is voor Cas9/sgRNA-vertering van DNA-substraat.

2. Bouw van een UAS-module

OPMERKING: Een UAS-module bestaat uit een kern-UAS en ongeveer 20-40 bp van de 5′ en 3′ terminale sequenties die overlappen met respectievelijk 5′ en 3′ uiteinden van de backbone-splitsingsplaats (Figuur 1). De 5′ en 3′ terminale sequenties van de UAS-module worden bepaald door de ruggengraatsplitsingsplaats van de pOT2-vector.

  1. Kloon de pOT2-vectorspecifieke UAS-module naar de EcoRI-site van de pCR8GW-vector, wat resulteert in pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70-plasmide (aanvullend bestand 1). Laat de pOT2-vectorspecifieke UAS-module vrij door vergisting van pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70-plasmide met EcoRI bij 37 °C gedurende 1 uur.
  2. Scheid de splitsingsproducten door 0,7% agarosegelelektroforese. Zuiver de 6178-bp UAS-module met een gelextractieset. Verdun de UAS-module tot 23 ng/μL voor volgende experimenten. Dit 6178-bp-fragment dient als een UAS-module voor de constructie van UAS-cDNA/ORF-plasmiden uit pOT2-vectorgebaseerde cDNA/ORF-klonen.

3. Grootschalige constructie van UAS-cDNA/ORF plasmiden door CRISPRmass

OPMERKING: CRISPRmass is gestandaardiseerd als massaal parallelle tweestaps reageerbuisreacties voorafgaand aan E. coli-transformatie (Figuur 1).

  1. Reageerbuisreactie stap 1
    1. Splits de identieke vectorruggengraat van de cDNA/ORF-plasmiden door Cas9/sgRNA. Leg de buisjes van 0,2 ml in een aluminium koelblok op ijs en label de buisjes zorgvuldig. Bereid de mastermix als volgt voor.
      1. Voeg voor een enkele reactie 0,16 μL 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 0,4 μL 20 ng/μL sgRNA, 0,24 μL 10x Cas9-buffer, 1,2 μL DEPC-behandeld water toe. Voeg voor N-reacties (N+1) x 0,16 μL 1,22 μM S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0,4 μL 20 ng/μL sgRNA, (N+1) x 0,24 μL 10x Cas9-buffer, (N+1) x 1,2 μL DEPC-behandeld water toe.
    2. Draai vortex, meng goed en draai naar beneden. Aliquot 2 μL mastermix op elke buis. Voeg 0,4 μL 0,019 μM cDNA/ORF-plasmide toe aan elke buis. Incubeer splijtingsreacties bij 37 °C gedurende 1 uur.
      OPMERKING: Verdun elk plasmide tot 0,019 μM met DEPC-behandeld water. Als de concentratie van een plasmide lager is dan 0,019 μM, voeg dan plasmide-DNA rechtstreeks toe aan de splitsingsreactie. Gebruik RNasevrije tubes en met DEPC behandeld water. Het uitvoeren van deze stappen op grote schaal zal enkele uren in beslag nemen. Tenzij anders aangegeven, bewaar reagentia en reacties op ijs.
  2. Reageerbuisreactie stap 2
    1. Plaats een vectorspecifieke UAS-module uit stap 2 in de Cas9-gelineariseerde cDNA/ORF-plasmiden door middel van een eenstapsreactie. Stel voor elk monster een eenstapsreactie van 1,4 μl in. Leg de buisjes van 0,2 ml in een aluminium koelblok op ijs en label de buisjes zorgvuldig.
      1. Bereid de mastermix als volgt voor. Voeg voor een enkele reactie 0,07 μL 0,006 μM UAS-module en 0,7 μL enkelstaps reactie-assemblagemix toe. Voeg voor N-reacties (N+1) x 0,07 μl 0,006 μM UAS-module en (N+1) x 0,7 μl enkelstapsreactie-assemblagemastermix toe.
    2. Draai vortex, meng goed en draai naar beneden. Aliquot 0,77 μL van het mastermengsel aan elke buis. Voeg 0,7 μL Cas9-gelineariseerd cDNA/ORF-plasmide toe aan elke buis. Incubeer reacties bij 50 °C gedurende 1 uur.
      OPMERKING: Zuivering van eenstaps montagereactieproducten is niet nodig. Het uitvoeren van deze stappen op grote schaal duurt enkele uren. Tenzij anders aangegeven, bewaar reagentia en reacties op ijs.
  3. Transformatie: eenstaps assemblagereactieproducten tot E. coli op grote schaal.
    1. Koel 10 μL tips voor op 4 °C. Koel 1,5 ml buizen in een aluminium koelblok voor op ijs.
    2. Ontdooi competente E. coli-cellen op ijs gedurende 5 minuten. Aliquot 10 μL competente cellen aan elke voorgekoelde buis van 1,5 ml.
      OPMERKING: Gebruik in de handel verkrijgbare competente E. coli-cellen met een transformatie-efficiëntie van ten minste 1 x 108 kve/μg pUC19-DNA.
    3. Voeg 1 μL eenstaps assemblagereactieproduct toe aan 10 μL competente cellen, draai voorzichtig om te mengen en leg 30 minuten op ijs.
    4. Incubeer de buizen gedurende 1 minuut in een waterbad van 42 °C en koel ze vervolgens onmiddellijk 2 minuten af op ijs.
    5. Voeg 100 μL SOC-medium (voorverwarmd tot 37 °C) toe aan elke buis bij kamertemperatuur en incubeer in een schudincubator (250 rpm) bij 37 °C gedurende 1 uur.
    6. Verwarm tot 37 °C de LB-platen die een antibioticum bevatten dat overeenkomt met het antibioticaresistentiegen van de UAS-module. Spreid de cellen uit over de platen en incubeer ze een nacht bij 37 °C.
      OPMERKING: Het uitvoeren van deze stappen op grote schaal duurt enkele uren. Tenzij anders aangegeven, bewaar reagentia en reacties op ijs.
  4. Controleer UAS-cDNA/ORF-plasmiden geconstrueerd door CRISPRmass
    1. Kies een enkele kolonie en inoculeer deze in 4,5 ml LB vloeibaar medium, aangevuld met de juiste selectie van antibiotica die overeenkomen met het antibioticaresistentiegen van de UAS-module. Incubeer een nacht bij 37 °C terwijl je schudt bij 250 tpm.
    2. Extraheer plasmide-DNA met behulp van een plasmide mini-prep kit. Zet als volgt een restrictievergistingsreactie van 20 μl op: 300-500 ng/μl plasmide, geschikt restrictieenzym(en), restrictievergistingsbuffer en ultrapuur water. Incubeerreacties bij 37 °C gedurende 1 uur.
    3. Scheid DNA-fragmenten door middel van 0,8% agarosegelelektroforese en analyseer ze met een digitaal beeldvormingssysteem (Figuur 3).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben CRISPRmass toegepast om een genoombrede UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek te genereren met behulp van 3402 cDNA/ORF-klonen met pOT2-vectorruggengraat uit de DGRC Gold Collection. We analyseerden willekeurig slechts één kolonie voor elk UAS-cDNA/ORF-construct, en de daaropvolgende restrictieanalyse met PstI gaf aan dat 98,6% van de UAS-cDNA/ORF-constructen met succes was gemaakt9. De reden voor het gebruik van PstI voor restrictieanalyse van UAS-cDNA/ORF-constructen met pOT2-vectorruggengraat is als volgt. Er zijn twee PstI-sites in de UAS-module voor de pOT2-vectorgebaseerde cDNA/ORF-klonen, en er is een PstI-site in de pOT2-vectorbackbone. Daarbij levert de vertering van een pOT2-vector-gebaseerde UAS-cDNA/ORF-constructie met PstI een 408 bp UAS-module-specifiek fragment en een 5649 bp UAS-module-vector assemblage-specifiek fragment op. De PstI-fragmenten van 408 bp en 5649 bp geven aan dat UAS-cDNA/ORF-constructen voor pOT2-vectorgebaseerde cDNA/ORF-klonen met succes zijn gemaakt, en de representatieve resultaten worden weergegeven in figuur 3.

figure-results-1
Figuur 1: Stroomdiagram van de UAS-cDNA/ORF-bibliotheekconstructie met behulp van CRISPRmass. De CRISPRmass pipeline voor de bouw van een UAS-cDNA/ORF bibliotheek. (1) De eerste stap reageerbuisreactie. De identieke vectorruggengraat van cDNA/ORF-plasmiden wordt gesplitst door Cas9/sgRNA. De splitsingsplaats bevindt zich in vectorruggengraat grenzend stroomopwaarts van het cDNA/ORF 5′-uiteinde. De splijtingsproducten worden, zonder zuivering, direct onderworpen aan de tweede stap van de reageerbuisreactie. De sgRNA's die bij splitsingsreacties worden gebruikt, worden bereid door middel van in-vitrotranscriptie en kunnen direct zonder zuivering worden gebruikt. Vervolgens wordt 28-40 bp van het 5′ uiteinde van de splijtingsplaats (gele doos) gedefinieerd als 5′ eindoverlap en 28-40 bp van het 3′ uiteinde van de splijtingsplaats (rood vak) wordt gedefinieerd als 3′ eindoverlapping. De vectorruggengraat draagt het antibioticum A-resistentiegen (groene doos). (2) De tweede stap is de reageerbuisreactie. Een vectorspecifieke UAS-module wordt samengevoegd met de Cas9-gelineariseerde cDNA/ORF-plasmiden stroomopwaarts van het cDNA/ORF5′-uiteinde door middel van eenstapsreactieassemblage, wat resulteert in UAS-cDNA/ORF-constructies. Assemblageproducten met een eenstapsreactie worden direct onderworpen aan E. coli-transformatie . Transformanten worden geselecteerd op LB-agarplaten die antibioticum B bevatten dat overeenkomt met het antibiotica B-resistentiegen (bruine doos) van de vectorspecifieke UAS-module. Alleen de gewenste UAS-cDNA/ORF-kolonies kunnen groeien. Een UAS-module bestaat uit 10 kopieën van UAS, een Hsp70 minimale promotor, een attB-sequentie voor phiC31-gemedieerde genomische integratie, een mini-witte transformatiemarker voor Drosophila-transgenese , een selecteerbaar antibioticum B-resistentiegen voor positieve selectie, en de 5′ eindoverlap en 3′ eindoverlap die eenstapsreactieassemblage mogelijk maakt. Eenstapsreactie-assemblage filtert eventuele off-target DNA-splitsingen veroorzaakt door CRISPR/Cas9 uit. Dit cijfer is gewijzigd van9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Evaluatie van sgRNA's gericht op specifieke regio's van de pOT2-vectorruggengraat door middel van in vitro Cas9-splitsingsanalyse. De onderstreepte sgRNA's zijn geselecteerd voor CRISPRmass. M is de DNA-marker. Dit cijfer is gewijzigd van9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Restrictieanalyse van 20 UAS-cDNA/ORF-constructen gegenereerd door CRISPRmass. De constructen werden geanalyseerd door middel van PstI-vertering. De verwachte restrictiepatronen voor alle UAS-cDNA/ORF-constructen werden waargenomen. M is de DNA-marker. Dit cijfer is gewijzigd van9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Constructie van pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 plasmide. De pOT2 vectorspecifieke UAS-module die plasmide pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 bevat, is geconstrueerd op basis van drie plasmiden, pMartini-Amp, pBS-attB-UAS-Hsp70 en pCR8GW-Amp-attB-UAS-Hsp70. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meest kritische stappen van CRISPRmass zijn het ontwerp van sgRNA's en de evaluatie van sgRNA's. Selectie van zeer efficiënte sgRNA's voor Cas9 is de sleutel tot het succes van CRISPRmass. Als er zeer weinig of geen kolonies worden waargenomen op de meeste antibioticabevattende LB-platen na de transformatie van E. coli met assemblageproducten met een eenstapsreactie, controleer dan de plasmidevertering door middel van agarosegelelektroforese. Als plasmiden niet goed worden verteerd, controleer dan de Cas9-activiteit, sgRNA-afbraak en plasmidekwaliteit; als plasmiden goed verteerd zijn, controleer dan de reagentia voor de assemblage van eenstapsreacties en zorg ervoor dat de transformatie-efficiëntie van competente cellen ten minste 1 x 108 kve/μg pUC19-DNA is. Opmerkelijk is dat het gebruik van een aluminium koelblok grootschalige bacteriële transformatie kan vergemakkelijken.

De beperkingen van CRISPRmass komen voort uit de manipulatie en opname van vector-backbone-sequenties, wat de mogelijkheid beperkt om de cDNA's en ORF's aan het 5'- of 3'-uiteinde te taggen.

In tegenstelling tot alle andere bestaande methoden 7,8, manipuleert en incorporeert CRISPRmass vectorbackbone-sequenties9. Dus, als UAS-modules eenmaal zijn ontworpen en voorbereid, heeft CRISPRmass geen geïndividualiseerd ontwerp of manipulatie nodig voor elk afzonderlijk plasmide, maar massaal parallelle tweestaps reageerbuisreacties voorafgaand aan bacteriële transformatie, waardoor PCR en de bijbehorende manipulaties worden voorkomen. Bovendien hoeven zowel de in vitro getranscribeerde sgRNA's als de assemblageproducten van de eenstapsreactie niet te worden gezuiverd voor de volgende experimenten. Vergeleken met de Gateway-kloontechnologie is CRISPRmass geschikter voor het genereren van UAS-cDNA/ORF-constructies, met name van lange of GC-rijke cDNA's/ORF's, aangezien CRISPRmass de cDNA's of ORF's zelf niet PCR-amplificeert9.

CRISPRmass kan worden gebruikt voor de high-throughput constructie van een UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek en voor het bewerken van verschillende genoombrede plasmidebibliotheken. CRISPRmass kan worden toegepast op de constructie van een expressieplasmidebibliotheek door een CMV-promotor in te voegen in de gedeelde vectorsequenties grenzend aan het 5'-uiteinde van cDNA's of ORF's. CRISPRmass belooft de ontwikkeling van functionele genomics te versnellen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesponsord door de National Natural Science Foundation of China (32071135 en 31471010), het Shanghai Pujiang-programma (14PJ1405900) en de Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Aluminum Cooling BlockAikbbioADMK-0296To perform bacterial transformation
DEPC-Treated WaterInvitrogenAM9906
Gel Extraction KitOmegaD2500To purify DNA from agarose gel
Gel Imaging SystemTanon2500B
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis KitNEBE2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621
Plasmid Mini KitOmegaD6943To isolate plasmid DNA from bacterial cells
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master MixNEBM0494
S. pyogenes Cas9GenScriptZ03386
Shaking IncubatorShanghai Zhichu ZQLY-180V
T series Multi-Block Thermal CyclerLongGeneT20To perform PCR 
Trans10 Chemically Competent CellTranGen BioTechCD101
Ultraviolet spectrophotometerShimadzuBioSpec-nanoTo measure concentration of DNA or RNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).">Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
  2. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).">Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
  3. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).">Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  4. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86 (4), 521-529 (1996).">Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86 (4), 521-529 (1996).
  5. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).">St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).
  6. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).">Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  7. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).">Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
  8. A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila. Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).">Xu, R., et al. A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila. Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).
  9. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).">Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
  10. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).">Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).
  11. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).">Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).
  12. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).">Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Modular AssemblyPlasmid Library ConstructionUAS cDNA ORF LibraryFunctional Genomics ScreeningCRISPR Cas9 EditingHigh Throughput CloningBacterial TransformationSingle Guide RNAGenome Wide LibraryGain Of Function Screening

Related Articles