Methodenartikel

Voorbereiding van retinale organoïdemonsters voor transmissie-elektronenmicroscopie

DOI:

10.3791/66590

⸱

7 juni 2024

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een geoptimaliseerde en uitgebreide voorbereidingsprocedure voor retinale organoïdemonsters voor transmissie-elektronenmicroscopie. Het is geschikt voor toepassingen waarbij synapsen in volwassen retinale organoïden worden geanalyseerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinale organoïden (RO's) zijn een driedimensionaal kweeksysteem dat menselijke retinale kenmerken nabootst die zich onder specifieke omstandigheden hebben onderscheiden van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). De ontwikkeling en rijping van synapsen in RO's zijn immunocytochemisch en functioneel bestudeerd. Het directe bewijs van de synaptische contactultrastructuur is echter beperkt en bevat zowel speciale lintsynapsen als conventionele chemische synapsen. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) wordt gekenmerkt door een hoge resolutie en een respectabele geschiedenis die de ontwikkeling van het netvlies en de rijping van synapsen bij mensen en verschillende soorten opheldert. Het is een krachtig hulpmiddel om de synaptische structuur in RO's te verkennen en wordt veel gebruikt in het onderzoeksveld van RO's. Daarom, om de structuur van RO-synaptische contacten op nanoschaal beter te onderzoeken en microscopisch bewijs van hoge kwaliteit te verkrijgen, hebben we een eenvoudige en herhaalbare methode voor de voorbereiding van RO TEM-monsters ontwikkeld. Dit document beschrijft het protocol, de gebruikte reagentia en gedetailleerde stappen, waaronder RO-fixatievoorbereiding, postfixatie, inbedding en visualisatie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het netvlies, een vitaal visueel sensorisch orgaan bij mensen en zoogdieren, vertoont een duidelijke gelamineerde structuur die wordt gekenmerkt door drie nucleaire lagen met neuron somas en twee plexiforme lagen gevormd door synaptische verbindingen1, waaronder conventionele synapsen en de gespecialiseerde lintsynaps 2,3. De lintsynaps speelt een cruciale rol bij het gradueel overbrengen van blaasjesimpulsen 2,3. Het visieproces omvat elektro-optische signaaloverdracht over verschillende niveaus van neuronen en synapsen, die uiteindelijk de visuele cortex bereiken 4,5.

Retinale organoïden (RO's) vertegenwoordigen een driedimensionaal (3D) kweeksysteem dat is afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), dat de fysiologische toestanden van netvliesweefsel in vitro nabootst 1,6,7. Deze benadering is veelbelovend voor het bestuderen van netvliesaandoeningen8, medicamenteuze screening9 en dient als een mogelijke therapie voor onomkeerbare retinale degeneratieve aandoeningen zoals retinitis pigmentosa10 en glaucoom11. Als een krachtig in vitro optisch geleidingssysteem is de synaps in RO's een cruciale structuur die effectieve signaaltransformatie en -overdracht mogelijkmaakt 5.

De ontwikkeling van RO kan grofweg in drie fasen worden verdeeld, afhankelijk van hun morfologische kenmerken en moleculaire expressieprofielen 6,12. RO's in stadium 1 (rond D21-D60) omvatten neurale voorlopercellen van het netvlies, veel retinale ganglioncellen (RGC's) en enkele starburst-amacriene cellen (SAC's), die overeenkomen met het eerste tijdperk van de ontwikkeling van de menselijke foetus. In stadium 2 (rond D50-D150) brengen RO's enkele fotoreceptorvoorlopers, interneuronen en synaptogenese-gerelateerde genen tot expressie, wat een overgangsfase vertegenwoordigt. Fotoreceptoren ontwikkelen rijpheid in stadium 3 RO's (ongeveer na D100-D150), wat overeenkomt met de derde fase van de menselijke foetale ontwikkeling 6,12,13. Met name in vergelijking met RO's in fase 1 en fase 2 hebben RO's in fase 3 een duidelijke lamellaire structuur waarvan de synapsen zijn gerijpt12, inclusief de aanwezigheid van lintsynapsen14. Bovendien heeft een recente studie bevestigd dat de volwassen synapsen bestaan de overdracht van lichtsignalen, wat aangeeft dat ze functioneel zijn13. Daarom worden RO's in fase 3 vaak geselecteerd om de synaptische structuur te onderzoeken.

Immunohistochemie wordt veel toegepast bij de studie van de expressie van verschillende moleculaire eiwitten. De beperking van optische microscopie ligt echter in het vermogen om slechts een beperkt aantal specifieke cellen en moleculen tegelijk waar te nemen, wat resulteert in een gebrek aan uitgebreide analyse van de relaties tussen cellen en hun omgeving. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) wordt gekenmerkt door een hoge resolutie, met een beperkte resolutie van 0,1-0,2 nm, die de lichtmicroscoop met ~10-20 keer15 overtreft. Het compenseert de defecten van optische microscopie en wordt gebruikt om de ontwikkeling van het netvlies en de rijping van synapsen bij mensen op te helderen16,17 en verschillende soorten 18,19,20,21. TEM maakt het directe onderscheid tussen presynaptische en postsynaptische componentenmogelijk 18,20, en maakt zelfs uitgebreide observatie mogelijk van subcellulaire structuren zoals linten 2,3, blaasjes22 en mitochondriën23. Daarom is TEM een essentieel hulpmiddel voor het identificeren van soorten synapsen en het verkennen van de ultrastructuur van synaptische contacten in RO's op nanoschaal.

Het is van cruciaal belang op te merken dat monstervoorbereiding van groot belang is voor het verkrijgen van hoogwaardige elektronenmicrofoto's. Hoewel sommige studies EM hebben uitgevoerd op RO's 12,13,24, zijn de gedetailleerde procedures onduidelijk. Aangezien de kwaliteit van het elektronenmicroscopiebeeld in grote mate afhangt van het effect van RO-fixatie en reagenspermeatie, moet bij de voorbereiding met verschillende belangrijke factoren rekening worden gehouden. Om synaptische contacten in RO's beter te onderzoeken, presenteren we daarom een methode met een goede reproduceerbaarheid die de werkingspunten van RO-fixatie, inbedding en de identificatie van observatieplaatsen aantoont.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. RO's verkrijgen van iPSC's25

OPMERKING: RO's zijn afgeleid van iPSC's door de eerder gerapporteerde procedure te wijzigen.

  1. Dissocieer iPSC's bij ~90% confluentie met behulp van een bacterieel protease (zie Tabel met materialen). Hak de kolonies in stukken en schraap ze weg met een celheffer.
  2. Resuspendeer na het verzamelen de clusters van cellen in 0,25 ml ijskoude Matrigel. Na 20 minuten incubatie bij 37 °C strooit u de gestolde gel uit met het DMEM/F12-medium (0,5% N2-supplement, 1% B27-supplement, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 0,2 mM L-glutaminevervanger, 100 E/ml penicilline en 100 mg/ml streptomycine). Definieer deze tijd als dag 0 van differentiatie.
  3. Na 5 dagen drijvende cultuur groeperen cellen zich om celcysten te vormen. Breng deze celcysten over in een petrischaal van 100 mm waar ze zich nu zullen hechten en groeien.
  4. Gebruik op dag 15 bacterieprotease om de aanhangende cellen te dissociëren en kweek ze in DMEM/F12-medium (2% B27-supplement, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren).
  5. Vervang op dag 21 het medium door 20 ml serumbevattend medium (DMEM/F12-medium, 8% FBS, 2% B27-supplement, 100 mM Taurine en 2 mM L-glutaminevervanger) en vervang het medium elke week.

2. Anterieure fixatie van RO's

  1. Verplaats een van de gekweekte RO's (~D180, een grootte van ongeveer 1~2 mm in diameter is optimaal) voorzichtig van de petrischaal naar 1,5 ml microcentrifugebuisjes met een pipet en markeer de relevante informatie over de RO's.
    OPMERKING: Snijd de RO's doormidden of snijd het slecht gestructureerde weefsel af met een scheermes onder de microscoop in de schaal met fixeermiddel als de RO's te groot zijn.
  2. Verwijder het kweekmedium met een pipet uit de microcentrifugebuisjes van 1,5 ml. Voeg 1,5 ml 2% paraformaldehyde-2% glutaaraldehydefixeermiddel verdund in 0,1 M fosfaatbuffer (PB), pH 7,4, toe en fixeer gedurende 4 uur bij kamertemperatuur (RT). Bewaar de microcentrifugebuisjes een nacht bij 4 °C.
    OPMERKING: Deze stap kan 1 week worden gepauzeerd, maar het wordt aanbevolen om zo vroeg mogelijk opnieuw te beginnen. Als RO's langer worden gelaten, kan dit autolyse van cellen veroorzaken, wat leidt tot vernietiging van de ultrastructuur van RO's. Vermijd vanwege de kwetsbaarheid van de RO's roteren, oscilleren, spiegelen of zware bewerkingen.

3. Postfixatie van RO's

  1. Verwijder het 2% paraformaldehyde-2% glutaaraldehyde fixeermiddel en was met 1 ml 0,01 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij pH 7,4 gedurende 3 x 10 min. Hang de RO's tijdens het wasproces voorzichtig op in de microcentrifugebuisjes van 1,5 ml om ze volledig te spoelen. Verhoog voor elke extra dag fixatie het aantal wasbeurten met twee om het resterende fixeermiddel zoveel mogelijk te verwijderen.
  2. Verwijder eventuele resterende PBS met behulp van een pipet en vervang deze door ~150 μL 1% osminezuur (OsO4) totdat de weefselblokkades zijn ondergedompeld. Plaats de microcentrifugebuisjes in een donkere doos om ze te beschermen tegen licht en infiltreer gedurende 1 uur bij RT.
    OPMERKING: OsO4 is een sterk oxidatiemiddel en moet worden behandeld in een zuurkast.

4. Vlekken en uitdroging

NOTITIE: De luchtontvochtiger moet zijn ingeschakeld om de omgeving van deze stap te drogen.

  1. Verwijder OsO4 met een pipet, was met 0.01 M PBS (pH 7.4) 3 x 10 minuten en was vervolgens 3 x 10 minuten met gedeïoniseerd water.
    NOTITIE: Om een volledige spoeling van RO's te garanderen, raden we aan om de RO's op te schorten. Zuig OsO4 op in een speciale wegwerpfles.
  2. Verwijder het laatste gedeïoniseerde water, was het en vervang het door ~150 μL per buis (zorg voor volledige infiltratie van weefselblokken) uraniumacetaat en vlek gedurende 1-2 uur bij RT. Bescherm de microcentrifugebuisjes tegen licht.
  3. Verwijder het uraniumacetaat en vervang het door 1 ml 50% aceton in de zuurkast, laat 10 minuten drogen. Gebruik vervolgens achtereenvolgens 70%, 80%, 90%, 100% en 100% aceton voor gradiëntuitdroging van de RO's. Elke uitdroging duurt 10 minuten.
    NOTITIE: Laat wat vloeistof over om de RO's voor elke uitwisseling te laten weken om blootstelling aan lucht en vocht te voorkomen. Werk bovendien zo snel mogelijk snel, want aceton is vluchtig. Zuig uraniumacetaat op in een speciale wegwerpfles.

5. Infiltratie

  1. Gooi de aceton weg en voeg ~150 μL van het mengsel bestaande uit aceton en Epon-812-hars toe in een verhouding van 1:1. Zet het 1 uur in een oven van 37 °C.
  2. Verwijder het bovenstaande mengsel en vervang het door een mengsel bestaande uit aceton en Epon-812 hars in een verhouding van 1:4. Zet het een nacht in een oven van 37 °C.
  3. Breng de RO's voorzichtig over in de nieuwe buizen met ~500 μL pure epoxyhars en plaats ze 1 uur in een oven van 45 °C.

6. Inbedding

  1. Bereid de 30-50 ml pure epoxyhars voor in een centrifugebuis van 50 ml door de reagenskit vooraf te mengen volgens de instructies van de fabrikant. Draai de pure epoxyhars langzaam ondersteboven gedurende 30 minuten om de luchtbellen die door de mixer worden geïntroduceerd te verminderen. Laat het vervolgens 20 minuten in een oven van 37 °C staan. Voeg 2/3 volume pure epoxyhars toe aan de groef van de inbeddingsmal.
  2. Gebruik een tandenstoker om RO's op te pikken in de inbeddingsmal die is uitgerust met pure epoxyhars.
  3. Vul de groef met pure epoxyhars totdat deze iets uitsteekt of uitpuilt.
  4. Pas de positie van RO's aan beide uiteinden van de inbeddingsmal aan voor directionele inbedding. Zet de inbeddingsvorm 1-2 uur in een oven van 45 °C en zet hem vervolgens 48-72 uur in een oven van 65 °C.

7. Semi-dunne positionering

  1. Schuur de overtollige epoxyhars rond het weefsel vanaf de uiteinden van de langere vier zijden van het inbeddingsblok om een trapeziumvormig oppervlak te vormen. Installeer het inbeddingsblok in de monstermontagestandaard en schroef de bout vast met een L-schroevendraaier. Installeer vervolgens glazen messen op de messenstandaard en draai de moer handmatig vast.
  2. Snijd de overtollige hars weg totdat het gewenste gebied zichtbaar is.
  3. Vul de trog van het glasmes met water. Snijd halfdunne plakjes tot een dikte van 1 μm met behulp van een halfdunne microtoom en leg ze met een naald op een microscoopglaasje.
  4. Voeg 50 μL 1% toluïdineblauw toe om halfdunne plakjes te verven en incubeer gedurende 1 minuut bij 95 °C op de verwarmingsplaat. Spoel af met gedestilleerd water gedurende 2 min. Gebruik een 20x gewone optische microscoop om de structuur van de secties te observeren.

8. Ultradunne secties

  1. Installeer de inbeddingsblokken en glasmessen zoals beschreven in stap 7.1. Pas de afstand tussen het mes en het tissueblok, het vloeistofniveau van de gootsteen en de snijsnelheid aan. Snijd de ultradunne secties met een dikte van ~70-100 nm met een ultradunne microtoom en schep de plakjes op het koperen gaas (200 mesh) met de ondersteunende film.
  2. Vlek ultradunne secties met 3% loodcitraat gedurende 15 minuten om het contrast te verbeteren in een dubbele kleuringsprocedure.

9. Beeldvorming van RO's door TEM

  1. Start de software (zie de Tabel met Materialen).
  2. Klik op de knop Geheugenmodus en markeer elk ultradun gedeelte ruwweg.
  3. Zoek naar synaptische structuren.
    1. Onderscheid de gelamineerde structuur van RO's bij lage vergroting.
    2. Lokaliseer de buitenste kernlaag (ONL), die een nucleaire structuur vertoont met een diepere elektronendichtheid. Navigeer vervolgens naar het uiteinde van de fotoreceptor waar zich talloze blaasjes ophopen. Zoek naar de staafklemmen met een enkel synaptisch lint en de conusklemmen met meerdere synaptische linten.
    3. Ga naar de binnenste plexiforme laag (IPL) en zoek een vergelijkbare structuur met een klein lint.
  4. Leg het microscopische beeld vast.
    1. Klik op Start en voer de bijbehorende vergrotingskracht in.
    2. Sla de afbeeldingen op.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De oprichting van 3D RO's door middel van iPSC-differentiatie biedt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van mechanismen voor netvliesaandoeningen en stamcelvervangingstherapie. Hoewel anderen de synaptische verbindingen in RO's functioneel en immunocytochemisch hebben aangetoond, is direct bewijs van conventionele en lintsynapsen zeer beperkt. Hier presenteren we een methode voor het onderzoeken van de ultrastructuur van twee soorten synapsen in RO's door TEM. Na 180 dagen cultuur werden RO's gefixeerd, gekleurd, ingebed en ultradun gesneden. TEM-observatie onthulde lintsynapsen aan de axonale uiteinden van fotoreceptoren (Figuur 1 en Figuur 2), die verdeeld zijn in de OPL. Onder TEM sferen linten van staven rond de synaptische invaginatie en vormen een hoefijzervormig profiel met horizontale cellen (Figuur 1). Staven hebben meestal slechts een enkel lint, maar kegels hebben meerdere linten (Figuur 2). Daarnaast werden klassieke chemische synapsen tussen amacriene cellen in de IPL waargenomen (Figuur 3). Onder TEM bestaat de chemische synaps uit drie delen: het presynaptische, de synaptische spleet en het postsynaptische. De celmembranen die overeenkomen met de presynaptische en postsynaptische delen zijn iets dikker dan de rest van de delen, en de smalle opening tussen de twee membranen wordt de synaptische spleet genoemd. Er zijn veel synaptische blaasjes in het cytoplasma van de presynaptische membraanplaats. Deze studie bevestigt de aanwezigheid van volledige synaptische verbindingen in 3D RO's afgeleid van iPSC. Er moet echter worden opgemerkt dat onvolledig spoelen tussen de stappen zou leiden tot het neerslaan van zwarte deeltjes tijdens het proces van monstervoorbereiding (figuur 4).

figure-results-1
Figuur 1: TEM-beelden van staaflintsynapsen in RO's. (A,B) Staaf- en horizontale cellen vormen een hoefijzervormig profiel. Een enkel lint (pijlpunten) werd waargenomen bij elke staafbol in de OPL van RO's, omgeven door talrijke blaasjes. Schaal balken = 0,2 μm. Afkortingen: ROs = retinale organoïden; HC = horizontale cel; OPL = buitenste plexiforme laag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: TEM-beelden van conuslintsynapsen in RO's. Drie lintsynapsen (pijlpunten) waren duidelijk zichtbaar op een kegelvormige pedikel in de OPL van RO's. Schaal balk = 0,2 μm. Afkortingen: TEM = transmissie elektronenmicroscopie; RO's = retinale organoïden; OPL = buitenste plexiforme laag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: TEM-beeld van chemische synapsen in RO's. Een conventionele chemische synaps werd waargenomen tussen amacriene cellen in de IPL-laag van RO's. De chemische synaps bestaat uit drie delen: het presynaptische, het synaptische spleet en het postsynaptische. Er zijn veel synaptische blaasjes in het cytoplasma van de presynaptische membraanplaats. Een pijl geeft de richting van de synaptische transmissie aan, wat de overdracht van talrijke blaasjes van het ene AC1-proces naar een ander AC2-profiel aangeeft. Schaal balk = 0,2 μm. Afkortingen: TEM = transmissie elektronenmicroscopie; RO's = retinale organoïden; IPL = binnenste plexiforme laag; AC's = amacriene cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Een voorbeeld van een probleem dat zich kan voordoen tijdens het proces van monstervoorbereiding. Er zitten veel zwarte deeltjes (cirkels) in de kegelsteel door onvolledig spoelen tussen de stappen. Pijlen: lint synaps. Schaalbalk = 0,2 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel hebben we een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het observeren van conventionele en lintsynaptische ultrastructuur in RO's door TEM. Dit protocol is gebaseerd op de eerder beschreven bereidingsmethoden van het netvlies met enkele aanpassingen20. Om het slagingspercentage van de monsterbehandeling en de kwaliteit van TEM-microfoto's te verbeteren, moet u rekening houden met de volgende belangrijke punten. Ten eerste is het belangrijk om te erkennen dat RO's zich ontwikkelen uit iPSC's, waarbij een celmassa wordt gevormd zonder vasculatuur 6,26 en gliacellen26. Deze afwezigheid kan leiden tot een minder compacte organisatie in vergelijking met het in vivo netvlies. Het is dus van cruciaal belang om Ros voorzichtig te behandelen om hun structuur en integriteit te behouden. Voeg vloeistoffen toe langs de buiswand om verstoring tot een minimum te beperken.

Belangrijk is dat u zorgt voor een grondige uitdroging van het weefsel in protocolstap 4 en de luchtontvochtiger inschakelt om de luchtvochtigheid in de kamer te verlagen voordat u met de uitdrogingsstap begint. Werk bij het vervangen van aceton snel en laat wat vloeistof achter om het weefsel onder te dompelen, waardoor ernstige vernietiging van de RO-weefselstructuur wordt voorkomen. Niet-uitgedroogd weefsel trekt sterk samen op grote EM-hoogten, en water in het weefsel belemmert de penetratie van het inbeddingsmiddel.

Aangezien RO's zich presenteren als transparante bollen, moet u zorgen voor de juiste richting bij het snijden van halfdunne plakjes om intacte lamellaire structuren te verkrijgen. Ten slotte worden RO's in fase 3 (ongeveer na D100-D150) als volwassen beschouwd en bezitten ze integrale synapsen12, waardoor het onderzoek naar synaptische contacten, waaronder lintsynapsen en chemische synapsen, wordt aanbevolen om in die RO's uit te voeren.

Hoewel in eerdere studies beperkt ultrastructureel bewijs van RO-synapsen is geleverd, is er geen detail over de volledige procedure van de voorbereiding van RO-monsters en de identificatie van verschillende soorten synaptische structuren 12,13,24. Capowski et al. gebruikten verschillende technieken om de kenmerken van RO's geïnduceerd door verschillende hPSC-lijnen in verschillende stadia te onderzoeken, waaronder elektronenmicrofoto's die het bestaan van met blaasjes beladen lintsynapsen in de kegelsteel aantoonden, waaruit bleek dat RO's in fase 3 geïnduceerd door verschillende hPSC-lijnen volwassen en functioneel zijn12. Met behulp van TEM en beeldvorming met twee fotonen bevestigden Cowan et al. de vorming van functionele lintsynaptische structuren in volwassen RO's13, maar het type synaps was niet geïndiceerd (kegel- of staafsynapsen). Onze verschillende batches microfotoresultaten toonden echter de membraanstructuur van de lintsynapsen met een ideale helderheid en contrast, wat illustreert dat onze methode haalbaar en reproduceerbaar is. Bovendien hebben we verschillende soorten synapsen geïdentificeerd op basis van hun verschillende morfologische kenmerken: kegelsynapsen zijn meestal groter en hebben meerdere linten, terwijl staafsynapsen meestal kleiner zijn en slechts één lint vertonen; In chemische synapsen hopen blaasjes zich op in de presynaptische structuren en wordt de elektronendichtheid van de synaptische spleet verbeterd.

De ultrastructurele integriteit van de synaptische contacten in RO's is van vitaal belang voor hun functie. Het gebruik van TEM om deze contacten te onderzoeken biedt brede en significante voordelen op verschillende gebieden, zoals het bestuderen van de pathogenese van het netvlies in vitro, het uitvoeren van geneesmiddelenscreening bij RO's en het evalueren van differentiatietechnieken van RO's, naast andere toepassingen. Beperkt door 2D TEM-beeldvorming, is slechts een specifiek aspect van de ultrastructuur van de RO's waarneembaar, waardoor het een uitdaging is om de volledige structuur van de synaps stereoscopisch te analyseren. Bovendien draagt de begrensdheid van differentiatie bij aan misplaatste cellen13,26, wat het observatieproces verder bemoeilijkt. Het combineren van volume EM met 3D-reconstructie kan deze tekortkomingen in de toekomst dus verhelpen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het National Key Research and Development Program of China (2022YFA1105503), het State Key Laboratory of Neuroscience (SKLN-202103) en de Zhejiang Natural Science Foundation of China (Y21H120019), de Natural Science Foundation of China (82070981).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 mm Petri schaalCorning430167
AcetonElectron Microscopy Science10000
B27 supplementGibcoA3582801
Cel lifterSanta Cruzsc-395251
KoperroostersBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.AZH400HH
DigitalMicrograph SoftwareGatan, Inc.Software
DispaseStemCell Technologies#07913Bacterieel protease
DMEM/F12 mediumGibco#11320033
InbeddingsmalBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GZ10592
Epon-812 harsElectron Microscopy Science#14900
Fetaal runderserum (FBS)Biological Industries#04-0021A
GlutaraldehydeElectron Microscopy Science16020
hiPSCShownin Biotechnology Co. Ltd.RC01001-A
LoodcitraatBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GZ02618
L-GlutaMaxLife Technologies#35050061L-glutamine substituut
MatrigelCorning356234
MicroscoopglasCITOTEST80312-3161
N2 supplementGibco17502048
Na2HPO4· 12H2OSigma71650Een component van PB/PBS
NaH2PO4· H2OSigma71507Een component van PB/PBS
Niet-essentiële aminozurenSigma#M7145
Optische microscoopLab Binoculaire Biologische MicroscoopXsz-107bnii
OsO4TED PELLA4008-160501
OvenBluepardBPG9040A
ParaformaldehydeElectron Microscopy Science157-8
Penicilline-StreptomycineGibco#15140-122
Semi/ultradunne microtoomReichert-Jung396649
TaurineSigma#T0625
ToluidineblauwSangon BiotechE670105-0100
Transmissie-elektronenmicroscopenHITACHIH-7500
UranylacetaatTED PELLACA96049
β-mercaptoethanolSigma444203

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions. Cells. 10 (9), 2489(2021).
  2. Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea. Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).
  3. Tom Dieck, S., Brandstätter, J. H. Ribbon synapses of the retina. Cell Tissue Res. 326 (2), 339-346 (2006).
  4. Webvision: The organization of the retina and visual. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. , University of Utah Health Sciences Center, Webvision. Salt Lake City (UT). (1995).
  5. Soto, F., Zhao, L., Kerschensteiner, D. Synapse maintenance and restoration in the retina by ngl2. Elife. 7, e30388(2018).
  6. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  7. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), dev189746 (2020).
  8. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).
  9. Luni, C., Serena, E., Elvassore, N. Human-on-chip for therapy development and fundamental science. Curr Opin Biotechnol. 25, 45-50 (2014).
  10. Chahine Karam, F., et al. Human ipsc-derived retinal organoids and retinal pigment epithelium for novel intronic rpgr variant assessment for therapy suitability. J Pers Med. 12 (3), 502(2022).
  11. Lo, J., et al. Therapeutic strategies for glaucoma and optic neuropathies. Mol Aspects Med. 94, 101219(2023).
  12. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3d human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686(2019).
  13. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), e1634 1623-1640 (2020).
  14. Cora, V., et al. A cleared view on retinal organoids. Cells. 8 (5), 391(2019).
  15. Żak, A. M. Light-induced in situ transmission electron microscopy─development, challenges, and perspectives. Nano Lett. 22 (23), 9219-9226 (2022).
  16. Tschulakow, A. V., Oltrup, T., Bende, T., Schmelzle, S., Schraermeyer, U. The anatomy of the foveola reinvestigated. PeerJ. 6, e4482(2018).
  17. Syrbe, S., et al. Müller glial cells of the primate foveola: An electron microscopical study. Exp Eye Res. 167, 110-117 (2018).
  18. Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
  19. Liu, X., et al. Retinal degeneration in rpgra mutant zebrafish. Front Cell Dev Biol. 11, 1169941(2023).
  20. Yang, Q., et al. Expression of α-synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
  21. Zhang, J., et al. Early degeneration of photoreceptor synapse in ccl2/cx3cr1-deficient mice on crb1(rd8) background. Synapse. 67 (8), 515-531 (2013).
  22. De Robertis, E., Franchi, C. M. Electron microscope observations on synaptic vesicles in synapses of the retinal rods and cones. J Biophys Biochem Cytol. 2 (3), 307-318 (1956).
  23. Frey, T. G., Mannella, C. A. The internal structure of mitochondria. Trends Biochem Sci. 25 (7), 319-324 (2000).
  24. Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
  25. Gao, M. L., et al. Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa. Front Cell Dev Biol. 8, 128(2020).
  26. Afanasyeva, T. aV., et al. A look into retinal organoids: Methods, analytical techniques, and applications. Cell Mol Life Sci. 78 (19-20), 6505-6532 (2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Retinale organo denpreparatie van organo demonstersultrastructuur van synapsenlintsynapsenge nduceerde pluripotente stamcelleninbedding van organo dengradi nt dehydratieinbedding in epoxyharssemidunne microtoom

Gerelateerde artikelen