Methodenartikel

In vitro kweektechniek voor het bestuderen van cellulaire dynamica in zebravisschubben

DOI:

10.3791/66619

⸱

10 januari 2025

 , 
1Department of Biology, Mount Saint Vincent University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een methode om cellulaire dynamica te bestuderen met behulp van een eenvoudige in vitro kweektechniek. Het biedt zebravisonderzoekers en -opvoeders de mogelijkheid om cellulaire processen te bestuderen, zoals die gerelateerd aan bothomeostase en basale celbiologie, door fluorescerende kernen en apoptotische cellen binnen de schalen te visualiseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebravisschubben bieden een verscheidenheid aan voordelen voor gebruik in standaard laboratoria voor onderwijs- en onderzoeksdoeleinden. Schubben kunnen gemakkelijk worden verzameld zonder dat euthanasie nodig is, regenereren binnen een paar weken en zijn doorschijnend en klein, waardoor ze met een standaardmicroscoop kunnen worden bekeken. Zebravisschubben zijn vooral nuttig in educatieve omgevingen, omdat ze studenten een unieke kans bieden om praktijkgerichte leerervaringen op te doen, met name in het begrijpen van cellulaire dynamiek en in-vitrokweekmethoden . Het hoofddoel van dit protocol is het beschrijven van een methode voor het verzamelen en onderhouden van zebravisschubben in cultuur voor gebruik in een verscheidenheid aan biologische studies met behulp van basislaboratoriumapparatuur. Bovendien beschrijft het protocol het gebruik ervan bij het begrijpen van bothomeostase door de activiteit van botcellen te onderzoeken die betrokken zijn bij botresorptie en -afzetting. Het bevat ook aanvullende protocollen voor algemene technieken, zoals de visualisatie van kernen en apoptotische cellen. Het in-vitrokweekprotocol levert betrouwbare resultaten op met een minimum aan reagentia en apparatuur. Dit artikel bespreekt de voordelen van het gebruik van in vitro culturen van zebravisschubben om wetenschappelijk onderzoek te bevorderen en schetst de middelen die nodig zijn om hun integratie in educatieve omgevingen te ondersteunen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren zijn zebravissen (Danio rerio) naar voren gekomen als een waardevol modelorganisme op verschillende wetenschappelijke gebieden, waaronder genetica, ontwikkelingsbiologie en toxicologie 1,2,3. Zebravissen zijn kleine tropische zoetwatervissen die inheems zijn in de rivieren van Zuidoost-Azië4. Ze zijn een populair modelorganisme in de biologie geworden vanwege hun gemakkelijke onderhoud, kleine formaat, snelle voortplantingscyclus en doorschijnende embryo's1. Dit maakt het mogelijk om hun interne ontwikkeling gemakkelijk te observeren, waardoor ze ideaal zijn voor het bestuderen van verschillende biologische processen in de ontwikkelingsbiologie. Zebravissen delen genetische overeenkomsten met mensen; Ongeveer 70% van de menselijke genen heeft ten minste één tegenhanger van zebravissen, waardoor ze een uitstekend model zijn voor het bestuderen van genetische aandoeningen en ziekten bij mensen 5,6. Door specifieke genen in zebravissen te manipuleren, kunnen onderzoekers waardevolle inzichten krijgen in de functie en het gedrag van genen, die vervolgens kunnen worden toegepast op onderzoek naar de menselijke gezondheid6, genbewerking en het creëren van transgene lijnen 7,8.

Zebravisschubben regenereren na verwijdering 9,10 en kunnen gedurende één tot drie dagen worden gekweekt met een eenvoudige (niet-CO2 ) incubator terwijl ze worden gebruikt voor experimenten11. Het gebruik van zebravisschubben is voordelig in basislaboratoria omdat ze uit verdoofde vissen kunnen worden verwijderd zonder dat euthanasie nodig is. Zebravisschubben zijn een onderdeel van het huidskelet en bestaan voornamelijk uit twee lagen: de interne laag, die dik is en bestaat uit gedeeltelijk gemineraliseerd weefsel gevormd door lagen collageenfibrillen, en de externe laag, die sterk gemineraliseerd is en een netwerk van verweven collageenfibrillen bevat 12,13 (Figuur 1A-C). Deze morfologische en cellulaire kenmerken van de schaal kunnen gemakkelijk worden waargenomen onder een standaard samengestelde microscoop. Deze eigenschappen maken zebravisschubben een goed model voor het bestuderen van cellulair en moleculair. Zebravisschubben zijn bijvoorbeeld gebruikt om bothomeostase te bestuderen, inclusief botcelactiviteit11,12. Ze zijn ook gebruikt om weefselregeneratie 9,14,15, genroutes en signalering14,16, metabolisme17, microbiota-onderzoeken18, enz. te begrijpen. Zebravissen zijn, net als andere teleosten, ook zeer gevoelig voor omgevingsfactoren zoals verontreinigende stoffen en gifstoffen 19,20,21,22. Als zodanig worden visschubben gebruikt om blootstelling aan gifstoffen in vispopulaties te bestuderen. Deze kenmerken maken weegschalen tot een uitstekend model om studenten te leren over de effecten van omgevingsfactoren op levende organismen. Bovendien kunnen schubben van transgene zebravislijnen, zoals Tg (osterix: mCherry) en Tg (runx2a: GFP), een extra niveau van complexiteit toevoegen aan studentenexperimenten.

Samenvattend, door zebravisschubben te gebruiken, kunnen onderzoekers experimenten ontwerpen en uitvoeren om verschillende aspecten van de biologie te bestuderen, van cellulaire mechanismen tot veranderingen in het milieu. Zebravissen zijn ook een waardevolle hulpbron in het hoger onderwijs, omdat ze praktische ervaringen kunnen bieden op het gebied van experimenteel ontwerp, gegevensverzameling en analyse. Zebravissen kunnen ook worden gebruikt in geavanceerde cursussen en onderzoeksgerichte programma's om specifieke interessegebieden te verkennen. Dit artikel beschrijft een protocol voor het gebruik van zebravisschubben in onderzoeks- en klassikale leeromgevingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hier beschreven protocollen volgen de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care en werden jaarlijks goedgekeurd door de Saint Mary's University/Mount Saint Vincent University Animal Care committee onder protocolnummers 20-14 en 21-12. Alvorens dit protocol uit te voeren, moeten gebruikers ervoor zorgen dat de federale en provinciale richtlijnen voor het gebruik van dieren in onderzoek of onderwijs worden gevolgd23. De details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Bereiding van reagentia voor schaalcultuur

  1. Bereid DMEM medium met HEPES (10 g DMEM-poeder, 5,95 g HEPES, in 1 l gedestilleerd water of dH2O, pH: 6,91), aliquot en bewaar bij 4 °C.
  2. Bereid het kweekmedium - werkoplossing voor (88% DMEM-medium met HEPES, 10% foetaal runderserum en 2% penicilline-streptomycine [5000 eenheden penicilline en 5 mg streptomycine per ml] aangepast aan het volume dat nodig is op de dag dat het experiment wordt uitgevoerd.
    NOTITIE: De werkoplossing moet dagelijks vers worden bereid en kan niet worden bewaard. Het kweekmedium moet koud worden bewaard (bij 4 °C of op ijs) totdat het wordt gebruikt.
  3. Aliquot de werkoplossing van het kweekmedium in de containers waarin het experiment zal worden uitgevoerd. In dit geval werden buisjes van 0,2 ml of een plaat met 96 putjes gebruikt. Bewaar deze aliquots op het ijs totdat ze nodig zijn.
    NOTITIE: Deze oplossing moet vers worden bereid en kan niet langer dan 1 dag worden bewaard. Raadpleeg Tabel 1 voor alle reagentia.

2. Schubben van levende vissen verwijderen

  1. Zet een bak of aquarium klaar voor de zebravissen met een watervolume van ongeveer 2 L voor 4-5 volwassen vissen.
    OPMERKING: De typische parameters van het water die geschikt zijn voor zebravissen zijn pH 7.5, temperatuur 28.5 °C, geleidbaarheid 640-781 μS en een donker-lichtcyclus van 12-12 uur. Zorg ervoor dat de temperatuur in de tank constant op peil blijft.
  2. Gebruik een visnet om 4-5 volwassen zebravissen te vangen en plaats ze in de hierboven voorbereide zebravistank.
  3. Zet een bak met minimaal 60 ml water klaar waar de vissen worden verdoofd.
    OPMERKING: De vissen moeten in de container kunnen bewegen en diep genoeg zijn om te voorkomen dat ze eruit springen. Deze container moet gebufferd 0,01% tricaïne methaansulfonaat (MS222) bevatten, dat moet bestaan uit zebraviswater (verdun 0,1% MS222, dat wordt bereid met 0,3 g MS222, 615 μL 1 M NaOH in 300 ml zebraviswatersysteem, tien keer).
    LET OP: Personen die deze experimenten uitvoeren, moeten de goedkeuring van de institutionele ethische commissie voor dieren hebben om zebravissen te vangen, te verdoven en te hanteren. Evenzo is het gebruikte verdovingsmiddel een lage concentratie tricaïne methaansulfonaat (MS222), een chemische stof die veel wordt gebruikt in de visbiologie, maar die op de juiste manier moet worden gehanteerd, zoals geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder nitrilhandschoenen voor eenmalig gebruik, veiligheidsbril/spatbril en laboratoriumjas (raadpleeg het veiligheidsinformatieblad van MS222 voor meer informatie).
  4. Bereid een herstelcontainer voor met dezelfde specificaties als eerder gebruikt in stap 1 (minimaal 2 L water) waar de vissen na het verwijderen van de kalk zullen worden geplaatst. Deze container moet voldoende ruimte en de juiste waterparameters hebben, zoals hierboven vermeld.
  5. Breng met behulp van een net voorzichtig een enkele volwassen zebravis over naar de container met 0,01% MS222. Wacht tot de vis volledig onbeweeglijk is en minimale operculaire beweging heeft (dit duurt meestal minder dan 10 minuten).
    OPMERKING: Deze hele stap wordt één vis tegelijk uitgevoerd. Verdoof de volgende vis pas als de schubben met succes zijn verwijderd van de vis die wordt gehanteerd en totdat die vis is overgebracht naar de herstelcontainer.
  6. Leg de volwassen zebravis afzonderlijk op een omgekeerde petrischaal bekleed met een natte papieren handdoek.
  7. Verwijder onder een ontleedende stereomicroscoop en met een fijne pincet maximaal 10-12 schubben van een individuele vis. De schubben worden verwijderd uit het laterale gebied van de vis, waar de schubben groter zijn en een constantere grootte hebben in vergelijking met de andere delen van het lichaam (Figuur 2). Beide kanten van de vis kunnen worden gebruikt.
    1. Verwijder de schubben één voor één door voorzichtig in de natuurlijke richting van de schub te trekken (d.w.z. in de richting van vooraan naar achter). Dit moet zo snel mogelijk gebeuren.
  8. Plaats elke afzonderlijke weegschaal in een aparte buis van 0,2 ml met de in stap 1.1 bereide oplossing voor de schaalcultuur (bereid in stap 1.1) om te voorkomen dat de schubben degraderen. Als alternatief kan een plaat met 96 putjes worden gebruikt.
    OPMERKING: Isolatie van individuele schubben in afzonderlijke buizen of putjes voorkomt dat de schubben aan elkaar plakken en maakt het mogelijk om individuele schubben te volgen die nodig kunnen zijn voor meerdere experimenten.
  9. Als het specifieke experiment een schaalbehandeling vereist, past u deze in deze stap toe. Zie stap 4 en 5 voor voorbeelden van enkele protocollen.
  10. Plaats de buisjes met de weegschaal in een incubator bij 28 °C. Het kweekmedium moet elke 24 uur worden vervangen (met de oplossing voor het bewerken van het kweekmedium). Voor de hier beschreven experimenten werd een niet-CO2 -incubator gebruikt.
  11. Breng de zebravis na het verwijderen van de schubben voorzichtig terug naar de hersteltank en houd ze in de gaten totdat de beweging wordt hervat. Een pipet of beluchtingssteen wordt gebruikt om lucht in de tank te brengen om het herstel te versnellen.
  12. Zodra de beweging is hersteld, zet u de zebravissen terug in een gewone kweekbak. Vergeet niet om de vissen die zijn gebruikt apart van andere vissen te bewaren, zodat ze apart kunnen herstellen en om bij te houden welke vissen hun schubben actief regenereren.
  13. Wacht ~2 weken voordat u het verwijderen van schubben van dezelfde vissen herhaalt. Dit geeft ze de tijd om hun schubben op natuurlijke wijze te regenereren.

3. Fixatie van schubben

  1. Was de weegschaal driemaal met 200 μL 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bereid uit 10x PBS (voeg voor 1 L 80 g NaCl, 2 g KCl en 11,2 g Na2HPO4 toe, voeg dH2O toe tot 1 L).
  2. Verwijder de 1x PBS en voeg 200 μL 4% paraformaldehyde (PFA) toe 's nachts bij 4 °C. Voeg voor 100 ml PFA 4 g paraformaldehyde en 0,1 g NaOH toe en voeg vervolgens 1x PBS toe tot 100 ml. Meng op een hete plaat op laag vuur en roer tot de oplossing helder is, laat de oplossing dan afkoelen en stabiliseer de pH tot 7,4. Bewaren bij -20 °C. Zie voor nadere bijzonderheden Aanvullend Dossier 1 (Tabel 1).
  3. Was de weegschaal na fixatie drie keer met 200 μL 1x PBS. Bewaar de weegschaal bij 4 °C.
    LET OP: PFA is schadelijk. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad voor meer informatie. Al deze processen vereisen een juiste behandeling, zoals de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder nitrilhandschoenen voor eenmalig gebruik, een veiligheidsbril/spatbril en een laboratoriumjas.

4. Homeostase van het bot

OPMERKING: Hieronder worden twee procedures voor bothomeostase beschreven. Tartraatresistente zure fosfatase (TRAP) en alkalisch fosfaat (AP) kleuring worden meestal gebruikt om respectievelijk actieve osteoclasten en osteoblasten te identificeren. Osteoclasten resorberen de botmatrix, terwijl osteoblasten de botmatrix afzetten. AP is het belangrijkste enzym dat door osteoblasten wordt afgegeven tijdens de botvorming, terwijl TRAP door osteoclasten wordt uitgescheiden in de zure ruimte tussen de osteoclast en de botmatrix, wat helpt bij botafbraak en resorptie 24,25,26. Dit protocol is ook beschikbaar op The Zebrafish Information Network27en is eerder gepubliceerd28. Alkalische fosfatase is een enzym dat door meerdere celtypen wordt geproduceerd als onderdeel van het stofwisselingsproces. Dit proces is niet volledig specifiek voor osteoblasten, maar in botweefsel wordt het gebruikt als een marker voor de functie van osteoblasten.

  1. Tartraat-resistente zure fosfatase (TRAP) kleuring
    1. Plaats elke vaste weegschaal in een buisje van 0,2 ml of een plaat met 96 putjes met 200 μL dH2O. Was de weegschaal door ongeveer 150 μLdH 2O toe te voegen en te verwijderen gedurende drie minuten gedurende 15 minuten. Zie voor nadere bijzonderheden aanvullend dossier 1 (tabel 2).
    2. Verwijder de schaaltjes uit de tube of het putje van 0,2 ml en plaats ze in een nieuw buisje dat 200 μl tartraatbuffer van 50 mM bevat. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
      1. Zet voor 100 mM tartraatbuffer een glazen recipiënt klaar, voeg 2,3 g wijnsteenzuur toe en meng dit met 0,2 M acetaatbuffer (pH 5,5) tot 100 ml oplossing. Roer goed door en bewaar bij 4 °C. Om 50 mM tartraatbuffer te bereiden, voegt u gelijke volumes dH2O en 100 mM tartraatbuffer toe. Zie voor nadere bijzonderheden Aanvullend Dossier 1 (Tabel 3 en Tabel 4).
    3. Verwijder de tartraatbuffer uit de tube en voeg 200 μL TRAP-substraatoplossing toe. Incubeer de monsters gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat monsters in het donker blijven.
      1. Zet een donkere glazen recipiënt klaar en voeg 30 ml 100 mM tartraatbuffer, 1 ml hexazotized PRS (pararosanilinehydrochloride-oplossing) en 2 ml enzymsubstraatoplossing toe. Roer goed door.
        OPMERKING: Deze oplossing kan niet worden opgeslagen; Bewaar het tijdens gebruik in het donker op kamertemperatuur. Voor de oplossingen die nodig zijn om de TRAP-substraatoplossing te bereiden, zie aanvullend bestand 1 (tabellen 5-9).
    4. Verwijder de TRAP-substraatoplossing en was de weegschalen door ongeveer 150 μL dH2O toe te voegen en te verwijderen gedurende 15 minuten, drie keer.
    5. Haal de schaaltjes uit de tube en plaats ze in een nieuwe tube of put met 200 μL 80% glycerol (meng voor 100 ml 80 ml glycerol met 20 ml dH2O) verpakt in aluminiumfolie om vervaging te voorkomen en bewaar ze bij 4 °C.
    6. Om de schubben onder de microscoop te visualiseren, gebruikt u een depressie of een concaaf objectglaasje.
  2. Alkalisch fosfaat (AP) kleuring
    1. Plaats elke vaste weegschaal in een tube van 0,2 ml of een plaat met 96 putjes met 200 μL dH2O en was ze door ongeveer 150 μL dH2O toe te voegen en te verwijderen gedurende 15 minuten, drie keer. Zie voor nadere bijzonderheden aanvullend dossier 1 (tabel 2).
    2. Verwijder de schubben van de buisjes of putjes van 0,2 ml en plaats ze in een nieuw buisje met 200 μl tris-maleaatbuffer en incubeer het gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
      1. Maak voor deze buffer een glazen container klaar en voeg 0,605 g tris-buffer en 0,55 g maleïnezuur toe. Voeg dH2O toe tot 25 ml en roer goed door. Stabiliseren tot pH 8,3. Bewaren bij 4 °C. Zie voor nadere bijzonderheden Aanvullend Dossier 1 (Tabel 10).
    3. Verwijder de tris-maleaatbuffer uit de buis en voeg 200 μL AP-substraatoplossing toe. Incubeer het gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat monsters in het donker blijven.
      1. Bereid voor deze oplossing een donkere glazen container voor, voeg 8 mg diazoniumzout toe en meng dit met 0,1 ml napthol-AS-TR-fosfaat in N,N-dimethylformamide en 10 ml tris-maleaatbuffer (pH 8,3), roer goed. Bereid deze oplossing vers voor. Zie voor nadere bijzonderheden Aanvullend Dossier 1 (Tabel 11).
    4. Verwijder de AP-substraatoplossing en was de weegschalen door driemaal 200 μL dH2O gedurende 15 minuten toe te voegen en te verwijderen.
    5. Haal de schubben uit de tube en plaats ze in een nieuwe tube of put met 200 μL 80% glycerol verpakt in aluminiumfolie om vervaging te voorkomen. Bewaren bij 4 °C.
    6. Om de schubben met een microscoop te visualiseren, plaatst u de schubben op een holle of depressieve dia.
      LET OP: De meeste reagentia die in de TRAP- en AP-kleuring worden gebruikt, kunnen schadelijk zijn. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad voor elke chemische stof. Al deze procedures vereisen de juiste behandeling, zoals de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder nitrilhandschoenen voor eenmalig gebruik, een veiligheidsbril/spatbril en een laboratoriumjas.

5. Visualisatie van celdynamica in zebravisschubben

OPMERKING: Een reeks kleuringsmethoden kan worden gebruikt om verschillen tussen schalen te visualiseren en om cellen binnen de schaal te labelen (Figuur 3B). Methoden om kernen en lysosomen in de cellen van de schaal te kleuren, worden bijvoorbeeld hieronder beschreven.

  1. DAPI-kleuring voor visualisatie van celkernen
    OPMERKING: DAPI wordt gebruikt om de kernen van alle cellen te markeren door het DNA te labelen. DAPI is een fluorescerende marker die sterk bindt aan regio's die verrijkt zijn voor adenine en thymine in DNA-sequenties.
    1. Voordat u DAPI gebruikt, moet u ervoor zorgen dat de weegschaal is gefixeerd in 4% paraformaldehyde (stap 3). Was de weegschaal met 200 μL 1x PBS gedurende 5 minuten na fixatie.
    2. Bereid een DAPI-werkoplossing in een verdunning van 1:10 als volgt. Meng 1 μL DAPI met 9 μL 1x PBS om een totaal volume van 10 μL te maken.
    3. Gebruik na het bereiden van de DAPI-oplossing een tang of een plastic pipet om de weegschaal op een hol objectglaasje te plaatsen, verwijder overtollig PBS en voeg ongeveer 10 μL van de bereide DAPI-oplossing toe.
      OPMERKING: DAPI zal de schaal onmiddellijk kleuren, zodat deze kan worden gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop met een excitatiegolflengte van 352-402 nm en een emissiegolflengte van 417-477 nm. DAPI kleurt alle celkernen een helderblauwe kleur. Om de hele schaal in het gezichtsveld te zien, is het 4x objectief gebruikt. Enkelvoudig gekleurde kernen zijn zichtbaar met behulp van het 20x-objectief.
    4. Tel het aantal DAPI-gekleurde kernen om het aantal cellen in de schaal te bepalen.
  2. Apoptotische kleuring voor visualisatie van celdood in levende monsters
    OPMERKING: Fluorescerende vlekken kunnen worden gebruikt om apoptotische cellen te labelen. Het fluorescentiemarkerprotocol dat hier wordt gebruikt, is bijvoorbeeld voor zure omgevingen en kan worden gebruikt voor het labelen en traceren van zure organellen zoals lysosomen. Een toename van het aantal van deze organellen is gecorreleerd met een verhoogde celdood. Deze vlek moet worden aangebracht op niet-gefixeerde schubben die vers zijn getrokken of maximaal 2 dagen zijn gekweekt.
    1. Bereid een oplossing van de fluorescerende kleuring voor apoptose-tracking volgens de instructies van de fabrikant door het kweekmedium als verdunningsmiddel te gebruiken.
      OPMERKING: De concentratie van de fluorescerende vlek kan drastisch veranderen, afhankelijk van de gebruikte apoptosemethode. Raadpleeg het commerciële protocol voor de vlek van keuze voor specifieke details over aanbevolen concentraties.
    2. Verwijder voorzichtig het kweekmedium uit elke buis van 0,2 ml of putje van een plaat met 96 putjes als de schubben eerder zijn gekweekt.
    3. Voeg voldoende fluorescerende kleuringsoplossing toe om de hele schaal te bedekken (ongeveer 50 μL).
    4. Dek alle buizen af met aluminiumfolie om vervaging te voorkomen en laat 30 minuten staan.
    5. Verwijder de fluorescerende kleuringsoplossing uit de buizen of putjes.
    6. Was monsters door 200 μL 1x PBS toe te voegen aan de buizen of putjes gedurende 5 minuten.
    7. Verwijder de PBS en voeg 200 μL 4% PFA toe aan de buizen of putjes om de monsters gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te fixeren.
    8. Was monsters door 200 μL 1x PBS toe te voegen aan de buizen of putjes gedurende 5 minuten.
    9. Breng de weegschaal over in een nieuwe buis of put van 0,2 ml en voeg 200 μL verse 1x PBS toe. Dek deze buizen/putjes af met aluminiumfolie om vervaging te voorkomen. Bewaren bij 4 °C.
    10. Om de schubben met een fluorescentiemicroscoop te visualiseren, gebruikt u een concaaf of depressief objectglaasje en het juiste filter. Het hier gebruikte fluorescerende signaal heeft een excitatie- en emissiemaximum van 577-590 nm. De fluorescerende kleuring toont apoptotische cellen die lysosomen in rood bevatten.
    11. Tel het aantal gekleurde cellen om het aantal cellen te bepalen dat apoptose ondergaat.
      NOTITIE: Aluminiumfolie wordt gebruikt tijdens het kleuren en bewaren om vervaging te voorkomen. Monsters kunnen een paar uur of zelfs dagen in het donker worden bewaard, afhankelijk van welke fluorescerende kleuring wordt gebruikt. Om fluorescerende monsters voor langere tijd te bewaren, gebruikt u een fixatie- en montageprotocol dat compatibel is met de fluorescerende vlek. Alle fluorescerende kleuringen werden gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop met een vergroting van ten minste 20x. Het gebruikte filter was als volgt: voor DAPI 417-477 nm; voor apoptose tracking 577-590 nm.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onlangs werd dit schaalkweekprotocol gebruikt om bothomeostase11 te bestuderen. Schubben kunnen minstens 2 dagen overleven in het kweekmedium. Het aantal apoptotische cellen werd op elke dag van de kweek geanalyseerd, tot een maximum van drie dagen, door de gelabelde cellen te tellen. Deze resultaten toonden aan dat apoptotische cellen significant toenamen op de derde dag van de kweek, wat aangeeft dat de kweektijd beperkt moet worden tot twee dagen met behulp van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebravisschubben zijn een gemakkelijk toegankelijk in vitro model om een verscheidenheid aan verschillende biologische processen te bestuderen die tot 2 dagen kunnen worden volgehouden met behulp van een kweekmethode en een incubator om hun natuurlijke omgeving te simuleren11. Schalen hebben een regelmatige en proportionele verdeling van de aanwezige cellen, waardoor onderzoekers cellen kunnen bekijken, tellen en labelen en eenvoudige celbiologische exper...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken de medewerkers van de Mount Saint Vincent University Aquatic Facility en alle leden van het Franz-Odendaal Bone Development Lab voor het leveren van de nodige viszorg. Specifieke dank aan Alisha McNeil, Keely A. MacLellan en Shirine Jeradi voor hun hulp bij het optimaliseren van sommige protocollen. Dit onderzoek werd ondersteund door financiering van de Canadian Space Agency (CSA) [19HLSRM01] en de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 mL buisjesn/an/a
37% HCl EMDHX0603-4Voor pH stabilisatie en bereiding van PRS
Concave schuifn/an/a
DAPIVectashieldH-1200Voor visualisatie van celkernen
Diazoniumzout (Fast Blue B)SigmaD9805Voor AP substraatoplossing
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) poeder Sigma D5523Voor schaal kweekmedia 
Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat (MS222) Sigma E10521Voor bereiding van 0,1% MS222
Fetaal bovien serum Sigma F4135Voor schaal kweekmedia 
Fluorescerende microscoopn/an/a
Glacial azijnzuur Fisher A38 212Voor acetaatbuffer
GlycerolVWRBDH1172-4LPVoor 80% glycerol - opslag schalen
HEPES ThermoFisher 15630106Voor schaal kweekmedia 
Hot platen/an/a
KCl SigmaP217-10Voor bereiding van PBS
LysotrackerThermoFisherL7528Voor lysosoomvisualisatie 
MaleïnezuurSigmaM0375Voor Tris-Maleaat buffer 
Micropipetn/an/a
N,N-dimethylformamideSigma319937Voor AP substraatoplossing
N,N-dimethylformamide Sigma319937Voor Enzym Substraat Oplossing
Na2HPO4 EMDSX0720-1Voor bereiding van PBS
NaCl Sigma S9888Voor bereiding van PBS
NaNO2SigmaS-2252Voor 4% NaNO2
NaOH SigmaS5881Voor bereiding van 4% PFA
NaOH Sigma S5881Voor schaal fixatie en pH stabilisatie
Napthol-AS-TR-fosfaatSigmaN6125Voor AP substraatoplossing
Napthol-AS-TR-fosfaat SigmaN6125Voor Enzym Substraat Oplossing
Pararosanilline hydrochloride SigmaP3750Voor PRS
Penicilline-streptomycine 5000 eenheden penicilline en 5 mg streptomycine/mlThermoFisher 15140122Voor schaal kweekmedia 
Persoonlijk beschermingsmateriaal (PBM): wegwerpbare nitril handschoenen, veiligheidsbril/spatbril en laboratoriumjas.n/an/a
PFA Sigma P6148Voor schaal fixatie
Natriumacetaat Sigma S2889Voor acetaatbuffer
Standaard samengestelde microscoopn/an/a
Roerplaatn/an/a
WijnsteenzuurSigmaT6521Voor Tartrate buffer
Tris baseRoche03 118 142 001Voor Tris-Maleaat buffer 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. New York. (2002).
  2. Linney, E., Upchurch, L., Donerly, S. Zebrafish as a neurotoxicological model. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 709-718 (2004).
  3. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Drug Safety Eval: Met Prot. , 271-279 (2011).
  4. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).
  5. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  6. Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods Cell Biol. 105, 309-337 (2011).
  7. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Anim Res. 37, 1-29 (2021).
  8. Brito, R. S., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Sci Total Environ. 848, 157665(2022).
  9. Bergen, D. J. M., et al. Regenerating zebrafish scales express a subset of evolutionary conserved genes involved in human skeletal disease. BMC Biol. 20 (1), 1-25 (2022).
  10. Sire, J., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (Cyprinidae), using scale regeneration. J Exp Zool. 286 (3), 297-304 (2000).
  11. Carvajal-Agudelo, J. D., McNeil, A., Franz-Odendaal, T. A. Effects of simulated microgravity and vibration on osteoblast and osteoclast activity in cultured zebrafish scales. Life Sci Space Res. 38, 39-45 (2023).
  12. Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. Osteoblast and osteoclast behavior in zebrafish cultured scales. Cell Tissue Res. 350, 69-75 (2012).
  13. Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. The zebrafish scale as model to study the bone mineralization process. J Mol Histol. 43, 589-595 (2012).
  14. De Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporos Int. 25, 567-578 (2014).
  15. Iwasaki, M., Kuroda, J., Kawakami, K., Wada, H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Dev Biol. 437 (2), 105-119 (2018).
  16. Aman, A. J., Fulbright, A. N., Parichy, D. M. Wnt/β-catenin regulates an ancient signaling network during zebrafish scale development. Elife. 7, e37001(2018).
  17. Carnovali, M., Luzi, L., Banfi, G., Mariotti, M. Chronic hyperglycemia affects bone metabolism in adult zebrafish scale model. Endocr. 54, 808-817 (2016).
  18. Burns, A. R., Guillemin, K. The scales of the zebrafish: Host-microbiota interactions from proteins to populations. COMICR. 38, 137-141 (2017).
  19. Vieira, E. F. S., et al. The use of freshwater fish scale of the species Leporinus elongatus as adsorbent for anionic dyes: An isothermal calorimetric study. J Therm Anal Calorim. 109 (3), 1407-1412 (2012).
  20. Ighalo, J. O., Eletta, O. A. A. Recent advances in the biosorption of pollutants by fish scales: A mini-review. Chem Eng Commun. 208 (9), 1301-1312 (2021).
  21. Eletta, O. A. A., Ighalo, J. O. A review of fish scales as a source of biosorbent for the removal of pollutants from industrial effluents. J Res Inf Civ Eng. 16 (1), 2479-2510 (2019).
  22. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol. Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
  23. CCAC Canadian Council of Animal Care (CCAC). , https://ccac.ca/ (2024).
  24. Suzuki, N., Hattori, A. Melatonin suppresses osteoclastic and osteoblastic activities in the scales of goldfish. J. Pineal Res. 33 (4), 253-258 (2002).
  25. Suzuki, N., et al. Effect of vibration on osteoblastic and osteoclastic activities: Analysis of bone metabolism using goldfish scale as a model for bone. ASR. 40 (11), 1711-1721 (2007).
  26. Kawakami, K., et al. z Trap: zebrafish gene trap and enhancer trap database. BMC Dev Biol. 10, 1-10 (2010).
  27. ZFIN The Zebrafish Model Organism Database.. , https://zfin.org/ (2024).
  28. Edsall, S. C., Franz-Odendaal, T. A. A quick whole-mount staining protocol for bone deposition and resorption. Zebrafish. 7 (3), 275-280 (2010).
  29. Howe, D. G., et al. the Zebrafish Model Organism Database: Increased support for mutants and transgenics. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D854-D860 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, Danio rerio: A staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
  31. Barresi, M. J., et al. Zebrafish in the Classroom. Zebrafish. 5 (3), 205-208 (2008).
  32. Ghods, S., et al. On the regeneration of fish scales: Structure and mechanical behavior. J Exp Biol. 223 (10), jeb211144(2020).
  33. Krishnan, S., Sekar, S., Katheem, M. F., Krishnakumar, S., Sastry, T. P. Fish scale collagen-A novel material for corneal tissue engineering. Artif Organs. 36 (9), 829-835 (2012).
  34. Zhao, S., et al. A novel porous nanocomposite of sulfur/carbon obtained from fish scales for lithium-sulfur batteries. J Mater Chem. 1 (10), 3334-3339 (2013).
  35. Kumar, R., et al. A noninvasive technique for rapid extraction of DNA from fish scales. IJEB. 45 (11), 992-999 (2007).
  36. Hutchinson, J. J., Trueman, C. N. Stable isotope analyses of collagen in fish scales: Limitations set by scale architecture. J Fish Biol. 69 (6), 1874-1880 (2006).
  37. Kumari, S., Rath, P. K. Extraction and characterization of chitin and chitosan from (Labeo rohit) fish scales. Procedia Mater Sci. 6, 482-489 (2014).
  38. Stepnowski, P., Ólafsson, G., Helgason, H., Jastorff, B. Preliminary study on chemical and physical principles of astaxanthin sorption to fish scales towards applicability in fisheries waste management. Aquac. 232 (1-4), 293-303 (2004).
  39. Ghods, S., Murcia, S., Ossa, E. A., Arola, D. Designed for resistance to puncture: The dynamic response of fish scales. J Mech Behav Biomed Mater. 90, 451-459 (2019).
  40. Yang, W., et al. Protective role of Arapaima gigas fish scales: Structure and mechanical behavior. Acta Biomater. 10 (8), 3599-3614 (2014).
  41. Zhu, D., Zhang, C., Liu, P., Jawad, L. A. Comparison of the morphology, structures and mechanical properties of teleost fish scales collected from New Zealand. J. Bionic Eng. 16, 328-336 (2019).
  42. Witzmann, F. Morphological and histological changes of dermal scales during the fish-to-tetrapod transition. Acta Zool. 92 (3), 281-302 (2011).
  43. Ibañez, A. L., Cowx, I. G., O'Higgins, P. Geometric morphometric analysis of fish scales for identifying genera, species, and local populations within the Mugilidae. Can J Fish Aquat Sci. 64 (8), 1091-1100 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bothomeostasebotcelactiviteitschubverzamelingbotresorptiebotdepositiedissectiemicroscoopmilieustoring

Gerelateerde artikelen