Ervaringsafhankelijke hermodellering van juveniele reukbare sensorische neuronen Synaptische connectiviteit van de hersenen in een kritieke periode in het vroege leven

Samenvatting

We beschrijven hier methoden voor het induceren en analyseren van olfactorische ervaring-afhankelijke remodellering van synaptische glomeruli van de antennekwab in de juveniele hersenen van Drosophila .

Samenvatting

Olfactorische sensorische ervaring in het vroege leven induceert dramatische synaptische glomeruli-remodellering in de juveniele hersenen van Drosophila , die ervaringsdosisafhankelijk, tijdelijk beperkt en alleen tijdelijk omkeerbaar is in een korte, goed gedefinieerde kritieke periode. De directionaliteit van de remodellering van de synaptische connectiviteit van het hersencircuit wordt bepaald door de specifieke geurstof die inwerkt op de respondentreceptorklasse van olfactorische sensorische neuronen. Over het algemeen brengt elke neuronklasse slechts één geurreceptor tot expressie en innerveert een enkele olfactorische synaptische glomerulus. In het genetische model van Drosophila is het volledige scala aan olfactorische glomeruli nauwkeurig in kaart gebracht op basis van de respons op geurstoffen en gedragsoutput. Ethylbutyraat (EB) geurstof activeert Or42a-receptorneuronen die de VM7-glomerulus innerveren. Tijdens de kritieke periode in het vroege leven stimuleert EB-ervaring dosisafhankelijke synapseliminatie in de Or42a olfactorische sensorische neuronen. Getimede perioden van gedoseerde blootstelling aan EB-geurant maken onderzoek mogelijk naar ervaringsafhankelijk snoeien van circuitconnectiviteit in juveniele hersenen. Confocale microscopiebeeldvorming van synaptische glomeruli van de antennekwab wordt gedaan met Or42a-receptorgestuurde transgene markers die kwantificering van het synapsaantal en het innervatievolume bieden. De geavanceerde genetische toolkit van Drosophila maakt de systematische ontleding mogelijk van de cellulaire en moleculaire mechanismen die de hermodellering van het hersencircuit mediëren.

Inleiding

De hermodellering van juveniele hersencircuits tijdens het vroege leven vertegenwoordigt de laatste kans voor grootschalige synaptische connectiviteitsveranderingen om overeen te komen met de zeer variabele, onvoorspelbare omgeving waarin een dier wordt geboren. Als de meest voorkomende groep dieren delen insecten dit evolutionair geconserveerde, fundamentele mechanisme voor het hermodelleren van kritieke perioden¹. Kritieke perioden beginnen met het begin van sensorische input, vertonen omkeerbare circuitveranderingen om de connectiviteit te optimaliseren en sluiten vervolgens wanneer stabilisatiekrachten zich verzetten tegen verdere hermodellering². Insecten zijn vooral afhankelijk van olfactorische sensorische informatie en vertonen een goed gedefinieerde olfactorische kritieke periode. Drosophila biedt een uitstekend genetisch model om deze ervaringsafhankelijke kritieke periode in het juveniele brein te onderzoeken. Geurervaring gedurende de eerste paar dagen na de eclosie zorgt voor opvallende veranderingen in de circuitconnectiviteit in individueel geïdentificeerde synaptische glomeruli ^3,4. De richting van de verbouwing is afhankelijk van de specifieke input geurbeleving. Sommige geurstoffen veroorzaken een toename van het synaptische glomerulusvolume gedurende een paar dagen na eclosie (dpe)3,5,6,7, terwijl andere geurstoffen een snelle eliminatie van synapsen veroorzaken tijdens de kritieke periode van 0-2 dpe, wat resulteert in een verminderd innervatievolume ^8,9,10. In het bijzonder stimuleert de ervaring met ethylbutyraat (EB) geurstof dosisafhankelijke synaptische snoei van de Or42a-olfactorische receptorneuronen alleen tijdens deze kritieke periode in het vroege leven⁸. De eliminatie van de synaps is volledig omkeerbaar door de input van EB-geurstoffen binnen de kritieke periode te moduleren, maar wordt permanent na het sluiten van de kritieke periode. Deze olfactorische ervaringsafhankelijke synaptische snoei biedt een waardevol experimenteel systeem om de tijdelijk beperkte mechanismen op te helderen die ten grondslag liggen aan de hermodellering van het juveniele hersencircuit.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat wordt gebruikt om EB-ervaringsafhankelijk synaptisch snoeien van Or42a-receptor olfactorische sensorische neuronen tijdens de kritieke periode in het vroege leven te induceren en te analyseren. We laten zien dat Or42a synaptische terminals in de antennekwab VM7 glomerulus specifiek kunnen worden gelabeld door transgeen een membraan-tethered mCD8::GFP-marker aan te sturen, ofwel direct gefuseerd met de Or42a-promotor (Or42a-mCD8::GFP)¹¹ of met behulp van het Gal4/UAS binaire expressiesysteem (Or42a-Gal4 die UAS-mCD8::GFP aanstuurt)¹². Individuele Or42a-neuronsynapsen kunnen op dezelfde manier worden gelabeld met behulp van gerichte transgene expressie van presynaptische actieve zonemarkers die zijn gefuseerd met een reeks fluorescerende tags (bijv. Bruchpilot::RFP)⁸ of een elektronendicht signaal voor ultrastructurele synapsanalyses (bijv. miniSOG-mCherry)⁸. Or42a synaptische terminals kunnen worden afgebeeld met een combinatie van laserscanning confocale microscopie en transmissie-elektronenmicroscopie. We laten zien dat Or42a synaptisch glomeruli snoeien EB-dosisafhankelijk is, schaalbaar naar de concentratie van de getimede geurervaring. Het percentage EB-odorant opgelost in minerale olie dat als vehikel wordt gebruikt, kan worden gevarieerd, evenals de getimede duur van de blootstelling aan geurstof bij dieren in een ontwikkelingsfase. Ten slotte tonen we de methoden die worden gebruikt om de mate van synaptische glomeruli-snoei te analyseren door de intensiteit en het volume van de VM7-innervatiefluorescentie te meten. Het aantal synapsen kan ook worden gekwantificeerd door gelabelde synaptische puncta te tellen en door synaptische ultrastructuurparameters te meten met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie⁸. Over het algemeen is het hier getoonde protocol een krachtige benadering die de systematische dissectie mogelijk maakt van zowel cellulaire als moleculaire mechanismen die het trimmen van de synaptische connectiviteit van het olfactorische circuit van Drosophila mediëren tijdens een juveniele kritieke periode. De algemene opstelling voor blootstelling aan geur die in deze studie wordt beschreven, is in eerdere onderzoeken gebruikt met behulp van andere geuren en het testen van andere glomeruli ^3,7.

Protocol

1. Blootstelling aan geurstoffen

1. Sorteer met een fijn penseel 40-50 dieren in een ontwikkelingsfase als donkere poppen van faraat (90+ uur na de verpopping bij 25 °C) in flesjes van 25 mm x 95 mm polystyreen Drosophila met standaard maïsmeelmelassevoer (Figuur 1A).
2. Plaats fijn roestvrijstalen gaas over het uiteinde van de Drosophila-flesjes om de vliegen in bedwang te houden en tegelijkertijd een goede luchtstroom mogelijk te maken. Bevestig de gaasdoppen met geplakte transparante film aan de zijkant van de Drosophila-injectieflacons .
3. Plaats 1 ml 1 ml 100% minerale olie in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml (voertuigbesturing) of los het ethylbutyraat (EB) odorant op in minerale olie in een ander buisje om de gewenste concentratie te verkrijgen (bijv. 15% (150 μL) of 25% (250 μL)).
4. Plaats de voertuigcontrole- of odorant-microcentrifugebuisjes rechtop in een luchtdichte Glasslock-container van 3700 ml. Veranker de buisjes met tape stevig in het midden van de geurkamers samen met de Drosophila-injectieflacons (Figuur 1B).
5. Plaats de verzegelde voertuigcontrole- en EB-geurkamers met de gefaseerde Drosophila pharate-poppenflesjes in een bevochtigde (70%), temperatuurgecontroleerde (25 °C) incubator op een licht/donkercyclus van 12 uur/12 uur.
6. Verwijder de nieuw gesloten vliegen na 4 uur blootstelling aan de geurkamer en breng snel 20-25 vliegen over in verse Drosophila-injectieflacons in kamers met vers gemaakte geurstof (Figuur 1A,B). Gooi de niet-gesloten poppen weg.
7. Houd de vliegen in totaal 24 uur in hun afgesloten geurkamers in de couveuses. Voor een langere dosering van geurstof, brengt u vliegen elke 24 uur snel over naar nieuwe Drosophila-injectieflacons in vers gemaakte geurkamers.
8. Verdoof de vliegen in een ontwikkelingsfase door ze gedurende 1 minuut onder te dompelen in een schaal met 70% ethanol ter voorbereiding op onmiddellijke hersendissectie en verwerking van immunocytochemie.

2. Ontleding van de hersenen

1. Markeer flacons als voertuigcontrole (alleen 100% minerale olie) of EB blootgesteld (% EB) door ze te labelen en deze aanduidingen te behouden voor de gehele duur van hersendissectie en daaropvolgende verwerking. Verwerk 10-20 dieren voor elk genotype/geurstofaandoening.
2. Breng met een tang een enkele verdoofde vlieg over in een schaaltje met vers gemaakte fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)¹³. Dompel de vlieg onder in PBS en ga door met volledige hersendissectie met de vlieg volledig ondergedompeld.
3. Plaats met een fijne (#5) geslepen tang in beide handen de vlieg met de buikzijde naar boven en pak met de ene pincet de bovenste thorax vast en met de andere pincet de kop onder de slurf. Zorg ervoor dat u niet in de hersenen doordringt.
4. Verwijder het hoofd van de rest van het lichaam door met beide handen voorzichtig in tegengestelde richting te trekken. Het hoofd moet gemakkelijk loskomen van de thorax; laat de geïsoleerde kop over voor dissectie (Figuur 1C).
5. Schuif de pincet die eerder werd gebruikt om de thorax vast te pakken onder de andere kant van de proboscis. Begin de cuticula van het exoskelet voorzichtig in tegengestelde richtingen te trekken, zodat deze tussen de ogen scheurt om de hersenen te onthullen.
6. Bij het trekken kunnen de optische kwabben van de hersenen samen met het exoskelet loskomen. Om dit te voorkomen, trekt u langzaam en gestaag met de twee tangen terwijl u de cuticula van het exoskelet verwijdert (Figuur 1C, midden).
7. Ga door met het verwijderen van de nagelriem van het exoskelet van het hoofd. Zorg ervoor dat alle onderdelen van het exoskelet zijn verwijderd. Verwijder alle weefsels die aan de hersenen zijn bevestigd, inclusief het vetlichaam en eventuele uitstekende luchtpijp.
8. Om plakken te voorkomen, spoelt u een P20 pipetpunt af met PBS + 0,2% Triton-X 100 (PBST). Breng onmiddellijk na de dissectie de hersenen over in de fixeeroplossing (4% paraformaldehyde (PFA) + 4% sucrose) in een afgesloten buisje (Figuur 1C,D).

3. Immunocytochemie van de hersenen

1. Fixeer de hersenen gedurende 30 minuten op kamertemperatuur (RT) met end-over-end rotatie. Terwijl u de hersenen in de buis houdt, pipet u het gevaarlijke fixeermiddel af en voert u het op de juiste manier weg. Was de vaste hersenen snel 3x met PBS (Figuur 1D).
2. Hersenen zitten vaak vast in de dop van de buisjes na rotatie. Om onbedoeld verlies van hersenen te voorkomen, wat een constant gevaar is bij alle transfers, gebruikt u een dissectiemicroscoop tijdens het pipetteren van vloeistoffen.
3. Ter voorbereiding op de etikettering van antilichamen, blokkeert u de vaste hersenen gedurende 1 uur bij RT in PBST + 1% runderserumalbumine (BSA) + 0,5% normaal geitenserum (NGS) met constante end-over-end-rotatie (Figuur 1D).
4. Verwijder de blokkade en incubeer de hersenen met het geselecteerde primaire antilichaam op de juiste manier verdund in PBST + 0,2% BSA + 0,1% NGS. Incubeer de hersenen 's nachts (14-16 uur) bij 4 °C met constante rotatie.
   OPMERKING: Voorbeeld van gebruikte antilichamen: anti-CadN van ratten (verdunning 1:50)¹⁴ om synaptische glomeruli te labelen en anti-GFP van kip (1:1000)⁸ om Or42a-mCD8::GFP te labelen (Figuur 1D).
5. Pipette het primaire antilichaam af. Was de hersenen 3x gedurende 20 minuten met PBST. Incubeer hersenen met secundaire antilichamen verdund in PBST met 0,2% BSA + 0,1% NGS gedurende 2 uur bij RT met constante rotatie.
   OPMERKING: U kunt de hersenen ook 's nachts (14-16 uur) bij 4 °C incuberen. Verdunde antilichamen in PBST met 0,2% BSA + 0,1% NGS; Secundaire antilichamen die hier worden gebruikt: 488 Goat Anti-Chicken (1:250) en 546 Goat Anti-Rat (1:250).
6. Pipette de secundaire antilichamen af. Was de hersenen 3x gedurende 20 minuten met PBST. Eindig door de hersenen 20 minuten te wassen met PBS (Figuur 1D).
7. Bereid glazen objectglaasjes (75 mm x 25 mm) voor door twee dunne stroken dubbelzijdig plakband op het objectglaasje ~25 mm uit elkaar te plaatsen. Dit biedt een afstandhouder om te voorkomen dat de hersenen worden verpletterd.
8. Pipetteer ~10-15 μL montagemedium tussen de twee stroken tape om de hersenen te monteren. Met een P20-pipetpunt die is voorgespoeld met PBST, brengt u de gelabelde hersenen over op het microscoopglaasje (Figuur 1E).
9. Zodra de hersenen zijn overgebracht, gebruik je een fijn penseel om ze uit te lijnen, waarbij je ervoor zorgt dat de antennelobben naar boven wijzen. Zoek naar de kant met de gebogen bult, die de antennelobben zal bevatten.
10. Zodra de hersenen goed georiënteerd zijn, bedek je ze met een glazen dekglaasje (nr. 1.5H) en zorg je ervoor dat het dekglaasje stevig op de tape zit. Vul vervolgens de zijkanten van het dekglaasje in met extra montagemedium (Figuur 1E).
11. Verzegel de randen van het dekglaasje met doorzichtige nagellak. Laat het objectglaasje goed drogen en bewaar het vervolgens in de koelkast voor latere beeldvorming.

4. Confocale beeldvorming

1. Blind alle hersenglaasjes voor zowel genotype- als ervaringsomstandigheden voorafgaand aan beeldvorming door het glaasje te markeren met een gecodeerd label voor latere decodering.
2. Gebruik een confocale laserscanmicroscoop met een 63x olie-immersieobjectief. We gebruiken een Zeiss 510 META-microscoop in alle hier getoonde afbeeldingen (Figuur 1F).
3. Gebruik geschikte laserlijnen voor de gebruikte fluoroforen. Gebruik hier een Argon 488- en HeNe 543-laser voor de synaptische glomeruli van de antennekwab en Or42a olfactorische sensorische neuronbeeldvorming (Figuur 2).
4. Bepaal de optimale versterking en offset voor beide kanalen, waarbij u idealiter de versterking voor beide kanalen <750 en offset ≈0 houdt. Dit wordt gedaan om ervoor te zorgen dat de signaal-ruisverhouding optimaal is en tegelijkertijd de achtergrond wordt beperkt.
5. Plaats beeldvorming in het midden van de hersenen. Bij beeldvorming bevinden de VM7-glomeruli zich proximaal van het gat in het midden van de hersenen na verwijdering van de slokdarm tijdens dissectie (Figuur 2A).
   OPMERKING: De VM7-glomeruli zullen zich altijd dicht bij de opening van de slokdarm bevinden. De exacte locatie en grootte variëren echter enigszins, afhankelijk van hersendissectie en toenemende verschillen, dus houd hier rekening mee bij het maken van beeldvorming.
6. Selecteer de beeldresolutie en de dikte van de optische plak. Hier wordt een resolutie van 1024 x 1024 gebruikt met een Z-stack plakdikte van 0,37 μm.
7. Neem een volledige confocale Z-stack-projectie door de antennekwab, zodat de volledige Or42a-neuroninnervatie van de VM7-glomeruli wordt vastgelegd.

5. Synaptische metingen

1. Laad de afbeelding met genotype/aandoening in Fiji (1.54f). Splits de laserlijnkanalen door te klikken op Afbeelding > Kleur > Kanalen splitsen.
2. Bepaal in het or42a olfactorische sensorische kanaal welke plakjes de Or42a-innervatie bevatten door door het geheel van de Z-stack te scrollen en te identificeren waar de fluorescentie begint en eindigt.
3. Maak een projectie van somsegmenten met alleen segmenten die Or42a-neuroninnervatie bevatten door op Afbeelding > stapels te klikken > Z Project > Sum Slices en het gewenste bereik in te voeren.
4. Klik in Fiji op de Lasso-tool op de bovenste balk om de omtrek van de Or42a-neuroninnervatie in de VM7-glomerulus te traceren, waarbij elke glomerulus aan de hersenzijde onafhankelijk wordt behandeld (Figuur 3).
5. Vermenigvuldig de omtrek met het aantal plakjes van de Z-stapel en de dikte van elke plak om het VM7 synaptische glomerulus-innervatievolume te verkrijgen. Om het synapsgetal te kwantificeren, kan de tool voor het vinden van maxima worden gebruikt samen met de macro voor het vinden van maxima stapels om synapspuncta te tellen in het geschetste gebied ^8,15.

Resultaten

Figuur 1 toont de workflow voor de olfactorische ervaringsafhankelijke kritieke periode, blootstelling aan geurstoffen en beeldvormingsmethoden van de hersenen. Het protocol begint met het matchen van de leeftijd van donkere pharaaatpoppen direct voor de eclosie (Figuur 1A). De poppen worden gedurende 4 uur in geurkamers geplaatst en vervolgens worden pas gesloten volwassenen in verse flesjes gedraaid in de voertuigbesturing of in de gedoseerde EB-geurkamers (Figuur 1B). We stellen de geur meestal 24 uur bloot, hoewel elke duur mogelijk is. Na blootstelling aan geurstof begint de hersendissectie met het verwijderen van het hoofd van de thorax en vervolgens het verwijderen van het nagelriem-exoskelet met een fijne pincet (Figuur 1C). De geïsoleerde hersenen worden ontdaan van alle geassocieerde weefsels die de beeldvorming zouden kunnen verstoren en vervolgens onmiddellijk gefixeerd in 4% paraformaldehyde en 4% sucrose in PBS. Een korte fixatie van 30 minuten is voldoende voor een goede integriteit van het hersenweefsel. Het immunocytochemische protocol begint met een blok van 1 uur (bijv. BSA, NGS), nachtelijke incubatie in primaire antilichamen (bijv. anti-GFP, -CadN) en vervolgens een korte incubatie van 2 uur in secundaire antilichamen (Figuur 1D). De gelabelde hersenen zijn gemonteerd op glasplaatjes onder verzegelde dekglaasjes met het dorsale oppervlak van de hersenen naar boven voor de beste beeldvorming van de antennelobben (Figuur 1E). Merk op dat alle monsters blind zijn voor zowel genotype- als ervaringsomstandigheden door het objectglaasje te markeren met een gecodeerde aanduiding voor latere decodering. Een confocale laserscanmicroscoop met een 63x olie-immersieobjectief wordt gebruikt om de antennelobben van de centrale hersenen af te beelden (Figuur 1F). Laserlijnen die optimaal zijn voor de gebruikte fluoroforen worden geselecteerd (bijv. Argon 488 en HeNe 543) om de Or42a olfactorische sensorische neuroninnervatie van VM7 in beeld te brengen in de context van de omliggende glomeruli.

Het is belangrijk om de optimale versterking, offset, beeldresolutie en optische plakdikte te selecteren om de volledige Z-stack-projectie van de Or42a-neuroninnervatie in de VM7-glomeruli vast te leggen. Alle genotypen en ervaringsomstandigheden die moeten worden vergeleken, worden afgebeeld met identieke microscoopinstellingen. De Z-stacks worden verwerkt met behulp van ImageJ-software met ervaringsafhankelijke veranderingen die voornamelijk worden beoordeeld op innervatievolume ^7,14. Er zijn twee manieren waarop volumetrische metingen zijn berekend. Men berekent het innervatiegebied plak voor plak met behulp van de ImageJ-lassofunctie en vermenigvuldigt vervolgens elke waarde met de dikte van elke plak (μm)^8,9. De andere maakt gebruik van som plak Z-projecties en vermenigvuldigt het aantal Z-stack plakjes met plakdikte om het gemiddelde volume te bepalen. Beide methoden geven consistente resultaten. Naast volumemetingen kan ook de fluorescentie-intensiteit worden beoordeeld met een maximale intensiteitsprojectie van VM7 glomeruli¹⁶. De gewogen som van alle pixels wordt beoordeeld via ImageJ sum slice max-projectie, waarbij het pixelaantal op elk intensiteitsniveau wordt opgeteld om de totale intensiteit ^8,9 te berekenen. De achtergrond kan worden afgetrokken door een extra-glomerulair gebied van identieke grootte te kwantificeren. Deze aftrekmethode is tijdrovender, maar nauwkeuriger, omdat het rekening houdt met verschillende niveaus van achtergrondantilichaamlabeling in elk hersenmonster om een meer representatieve kwantificering van de innervatiefluorescentie-intensiteitswaarden te produceren. Intensiteitsmetingen worden uitgevoerd in een typisch bereik van 18-30 optische plakjes (0,37 μm/plak) binnen een Z-stapel, gemiddeld voor elk brein¹⁶. In bijna alle gevallen geven de intensiteits- en volumemetingen van de innervatiefluorescentie consistente resultaten.

Over alle meetmodaliteiten heen blijven de representatieve resultaten onwrikbaar; ervaring met EB-geurstoffen in het vroege leven resulteert in een aanzienlijk verlies van Or42a-neuroninnervatie. De VM7-glomerulus kan betrouwbaar worden geïdentificeerd aan de hand van grootte, vorm en locatie, naast andere nauwkeurig in kaart gebrachte olfactorische glomeruli van de antennekwab (Figuur 2A) en door gerichte expressie van het Or42a-mCD8::GFP-membraanlabel gekoppeld aan glomerulaire labeling met anti-neurale cadherine (CadN; Figuur 2B). Getimede blootstelling aan de geur voertuigcontrole (minerale olie) resulteert in Or42a-neuroninnervatie die niet te onderscheiden is van een onbehandeld, normaal dier. Toch veroorzaakt de ervaring met EB-geurstof in de eerste paar dagen na de eclosie (dpe) synaptische glomeruli-snoei (Figuur 2C). Dit snoeimechanisme is volledig beperkt tot de korte kritieke periode in het vroege leven ^8,10. We gebruiken nu meestal 24 uur blootstelling aan geurstoffen om VM7 glomeruli synaptisch snoeien en de daaruit voortvloeiende afname van het innervatievolume in de juveniele Drosophila-hersenen te beoordelen. Een blootstelling van 24 uur (0-1 dpe) aan de odorant voertuigcontrole (minerale olie) handhaaft de normale, dichte Or42a-mCD8::GFP-innervatie (groen) in de VM7 synaptische glomeruli (witte stippelcirkels) in de antennelobben van beide hersenhelften (Figuur 2D, links). In schril contrast hiermee leidt 24 uur blootstelling (0-1 dpe) aan 25% EB-odorant opgelost in de minerale olie tot sterke snoei van Or42a-mCD8::GFP-innervatie (groen) en een verlies van het synaptische glomerulaire volume (Figuur 2D, rechts). Deze resultaten zijn zowel visueel duidelijk als consistent duidelijk. Een van de grootste kenmerken van dit protocol voor geurbeleving is de helderheid van de resultaten van de hersenbeeldvorming, die ook uiterst vatbaar zijn voor eenvoudige innervatiefluorescentie-intensiteits- en volumekwantificeringen.

Het grote voordeel van dit protocol voor geurbeleving is de mogelijkheid om het te gebruiken voor de studie van temporele beperking en dosisafhankelijke mechanismen van geurstof tijdens synaptisch snoeien in de kritieke periode. Voor EB-gestuurde Or42a-neuronsynapse-eliminatie in de VM7-glomerulus is het remodelleringsmechanisme voornamelijk beperkt tot de vroege juveniel (0-2 dpe), zonder detecteerbare ervaringsafhankelijke synaptische snoei op volwassen leeftijd (7-9 dpe) behalve kleine modulatie bij de hoogste EB-blootstellingsniveaus⁸. Een dergelijke beperking in de tijd definieert een kritieke periode, en het begrijpen van dit timingmechanisme is een belangrijk doel. Een ander kenmerk van dit protocol is dat ervaringsafhankelijk synaptisch snoeien EB-dosisafhankelijk is (Figuur 3). Getimede blootstelling aan de odorant voertuigcontrole (minerale olie) met 0% EB-odorant resulteert in normale Or42a-neuroninnervatie van de VM7-synaptische glomerulus, die niet te onderscheiden is van een onbehandeld dier. Berekening van het 3-dimensionale volume van de Or42a-neuroninnervatie toont een grootte die typisch is voor een normaal juveniel brein (2260 μm³; Figuur 3A, links). Representatieve resultaten tonen aan dat het verhogen van de EB-geurconcentratie een steeds grotere synaptische glomeruli-snoei veroorzaakt. Bijvoorbeeld, een blootstelling van 24 uur (0-1 dpe) aan 15% EB-geurstof resulteert in helder en consistent innervatieverlies (Figuur 3A, midden). Kwantificering van het 3D-innervatievolume laat een opvallende vermindering zien in vergelijking met voertuigcontroles (760 μm³ vs. 2260 μm³). Een blootstelling van 24 uur (0-1 dpe) aan 25% EB-geurstof veroorzaakt nog meer innervatieverlies (281 μm³; Figuur 3A, rechts). Representatieve kwantificeringen voor dit bereik van EB-geurstofconcentraties laten consistente resultaten zien voor fluorescentie-intensiteit (Figuur 3B) en innervatievolume (Figuur 3C). Deze dosisafhankelijkheid maakt het mogelijk om de middelen te bestuderen om synaptisch snoeien te voorkomen en om het snoeien te verbeteren met een lagere blootstelling aan geurstoffen om een verhoogde synaptische glomeruli-remodellering aan te tonen. Sommige eerdere studies hebben het tegenovergestelde effect aangetoond van een verhoogd glomerulair volume bij gebruik van andere geurstoffen met dit protocol¹⁰. Blootstelling aan EB-geuren in de kritieke periode resulteert altijd in opvallende en gemakkelijk detecteerbare synaptische glomeruli-snoei.

Figuur 1: Stroomdiagram van studies naar blootstelling aan geurstoffen in de juveniele hersenen van Drosophila . (A) Pharate donkere poppen (90+ uur na de verpopping bij 25 °C) worden verzameld en in geurkamers geplaatst. Onder geurende omstandigheden wordt 4 uur toegestaan voor eclosie en vervolgens worden jonge vliegen overgebracht naar een verse fles. (B) Vliegen op basis van hun leeftijd worden onderverdeeld in de ervaringsomstandigheden voor voertuigbeheersing (100% minerale olie) of ethylbutyraat (EB; % v/v in minerale olie). Een fijn gaas (inzet) zorgt voor toegang tot geurstof. Vliegen worden doorgaans nog 20 uur blootgesteld voor een totaal van 24 uur blootstelling, 0-1 dag na eclosie (dpe). (C) Vliegen worden ontleed door eerst het hoofd te verwijderen, en vervolgens wordt een fijne pincet gebruikt om het cuticula-exoskelet voorzichtig te verwijderen en de juveniele hersenen te isoleren. De geïsoleerde hersenen worden ontdaan van alle omliggende weefsels en uitstekende luchtpijp. (D) Geïsoleerde hersenen worden gefixeerd, geblokkeerd en vervolgens achtereenvolgens geïncubeerd in primaire en secundaire antilichamen. Het scala aan antilichamen dat wordt gebruikt, omvat doorgaans een algemene membraansonde om de synaptische glomeruli van de antennekwab te onthullen en een specifieke membraansonde voor de Or42a olfactorische sensorische neuronen. (E) Gelabelde hersenen worden in een montagemedium op een glazen microscoopglaasje geplaatst met tape-afstandhouders onder een verzegeld dekglaasje. Een correcte oriëntatie van de hersenen (dorsaal oppervlak naar boven) is van cruciaal belang voor een optimale beeldvorming van de antennelobben. (F) De hersenen worden in beeld gebracht met behulp van een confocale fluorescentiemicroscoop met laserscanning. Alle monsters zijn blind voor genotype en ervaren omstandigheden voorafgaand aan beeldvorming en daaropvolgende gekwantificeerde analyses. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Geurstofervaringsafhankelijke synaptische glomeruli snoei in de kritieke periode. (A) De olfactorische glomeruli van de antennekwab (AL) zijn nauwkeurig in kaart gebracht. Er worden enkele representatieve synaptische glomeruli getoond. De klasse van Or42a-receptor olfactorische sensorische neuron (OSN) innerveert specifiek de VM7-glomeruli. (B) Or42a-mCD8::GFP gelabelde neuronen (groen) innerveren de gepaarde VM7-glomeruli aan de linker- (L) en rechterkant (R) van de hersenen dicht, met N-Cadherin (CadN) antilichaamlabeling van alle AL-synaptische glomeruli (magenta). De vlieglijn is w¹¹¹⁸; Or42a-mCD8::GFP/+. (C) Schematische grafische weergave van de Or42a OSN-innervatie van de VM7 synaptische glomeruli in de mediumcontroletoestand (100% minerale olie; links) en blootstelling aan ethylbutyraat (% EB v/v in minerale olie; rechts) tijdens de juveniele kritieke periode. Ervaringsafhankelijk innervatiesnoei vindt alleen plaats bij blootstelling aan EB in het vroege leven, waarbij synapsen worden geëlimineerd en axonen verloren gaan, wat resulteert in een verminderd innervatievolume. (D) Representatieve confocale beelden van Or42a OSN-innervatie van de gepaarde VM7 synaptische glomeruli (gestippelde witte omtrekcirkels; Or42a-mCD8::GFP, groen) na controle van het olievoertuig (links) en 25% EB-blootstelling (rechts) gedurende 24 uur (0-1 dpe). De EB-geurervaring stimuleert synaptisch snoeien en het verlies van innervatievolume. Dit ervaringsafhankelijke mechanisme is tijdelijk beperkt en alleen tijdelijk omkeerbaar binnen een welbepaalde olfactorische kritieke periode in de eerste paar dagen na de eclosie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Kwantificering van EB dosisafhankelijke synaptische glomeruli-innervatiefluorescentie-intensiteit en -volume. (A) Or42a-mCD8::GFP-gelabelde innervatie in een VM7 synaptische glomerulus (groen) blootgesteld van 0-1 dpe aan de controle van minerale olie van het geurvoertuig (0% EB, links), 15% EB (midden) of 25% EB (rechts). Onder: Dezelfde afbeeldingen met glomerulaire innervatie omlijnd (witte cirkels) en het berekende 3-dimensionale innervatievolume. De voertuigbesturing heeft VM7 synaptische glomerulus-innervatie door Or42a-neuronen die niet te onderscheiden is van de onbehandelde dieren. Kritische periode-ervaring met 15% blootstelling aan EB-geurstof resulteert in duidelijke synaptische glomerulussnoei, met in dit geval een afname van 66% in het 3-dimensionale innervatievolume. Blootstelling aan het hogere niveau van 25% EB resulteert in meer snoeien, met in dit geval een verlies van bijna 90% van het synaptische glomerulusvolume. Zo kan men zich dosisafhankelijk snoeien voorstellen naarmate de geurbeleving toeneemt. (B) Representatieve resultaten van de Or42a-mCD8::GFP-gelabelde fluorescentie-intensiteit binnen VM7 synaptische glomeruli blootgesteld van 0-1 dpe aan de odorant voertuigcontrole (olie, groen), 15% EB (midden, oranje) of 25% EB (rechts, zwart). (C) Representatieve resultaten van de 3-dimensionale innervatievolumes van VM7 glomeruli onder dezelfde blootstellingsomstandigheden aan geurstoffen in dezelfde kritieke periode. De spreidingsdiagrammen tonen alle individuele gegevenspunten met het gemiddelde ± SEM. De significantie wordt aangeduid als p≤0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***) en p ≤ 0,0001 (****). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het hier gepresenteerde protocol voor blootstelling aan geurstof en beeldvorming van de hersenen kan worden gebruikt om ervaringsafhankelijke olfactorische sensorische neuron synaptische glomeruli-snoei tijdens een kritieke periode in het vroege leven op betrouwbare wijze te induceren en te kwantificeren. Eerdere studies die dit behandelingsparadigma gebruikten om de remodellering van het olfactorische circuit te onderzoeken, begonnen met blootstelling aan geurstof op de^2e dag na eclosie ^3,4,5. Daarentegen beginnen we met blootstelling aan geurstof in faraatpoppen voorafgaand aan de volwassen eclosie en ontdekken we dat de overgrote meerderheid van de remodellering plaatsvindt binnen de eerste 24 uur na de eclosie ^8,9. Een essentiële stap in dit protocol voor blootstelling aan geurstoffen is dus het plaatsen van gefaseerde donkere poppen in geurkamers voorafgaand aan de ontsluiting (Figuur 1). Dit is niet per se voor blootstelling aan popgeur, maar eerder om blootstelling aan geurstof onmiddellijk na eclosie van volwassenen te garanderen. We selecteerden gesloten juveniele volwassenen 4 uur na de stadiëring om leeftijden te synchroniseren binnen een krap tijdsbestek en om verschillen in blootstellingstijden aan geurstoffen te voorkomen. Dit eerdere ervaringsinterval is in lijn met recente studies die aantonen dat de eB-reukzin al na 2 dagen na de eclosie sluit¹⁰. De gevolgen van verschillen in de timing van blootstelling aan geurstoffen binnen de kritieke periode (bijv. 0-1 vs. 1-2 dagen) zijn echter niet goed gekarakteriseerd. Or42a olfactorische sensorische neuronen innerveren selectief de VM7-glomerulus in de antennekwab, die gemakkelijk kan worden geïdentificeerd op basis van de precieze glomerulaire kaarten en gerichte innervatie-etikettering (bijv. Or42a-mCD8::GFP; Figuur 2). Blootstelling aan EB-geurstof tijdens de kritieke periode verandert niets aan de expressie van de Or42a-promotor of reporterniveaus⁸. Getimede blootstelling aan geurstof veroorzaakt sequentiële synapseliminatie en verlies van axoninnervatie van Or42a-receptorneuronen. Deze snoei is volledig omkeerbaar in de kritieke periode van het vroege leven (0-2 dpe), maar niet bij volwassen volwassenheid (7-9 dpe) wanneer veranderingen in de geuromgeving de innervatie niet langer veranderen. De strakke temporele beperking van dit sensorische, ervaringsafhankelijke mechanisme is een belangrijke openstaande vraag in het veld. Er worden veel pogingen ondernomen om de kritische periode-achtige plasticiteit op volwassen leeftijd te heropenen. Het protocol dat hier wordt gegeven, is een krachtige weg voor onderzoek.

Het gemak van de hier beschreven blootstelling aan geurstof en beeldvorming van de hersenen zorgt voor een brede toegankelijkheid en een breed aanpassingsvermogen. Het begin, de beëindiging en de duur van de blootstelling aan geurstof zijn allemaal volledig naar goeddunken van de onderzoeker om gerichte studies mogelijk te maken van kritieke periode-eigenschappen, remodellering van reversibiliteit en het heropenen van kritieke periode-achtige plasticiteit. Evenzo kan de sterkte van de geurervaring gemakkelijk worden gemanipuleerd voor de studie van dosisafhankelijke synaptische glomeruli-snoei (Figuur 3). Belangrijk is dat studies die lagere EB-concentraties gebruiken (bijv. 15% EB) kunnen worden gebruikt om manipulaties te testen die de snelheid of omvang van synaptische glomeruli-remodellering kunnen verbeteren. De resultaten kunnen bijvoorbeeld aantonen dat synaptisch snoeien bij lagere EB-niveaus (bijv. 15%) niet te onderscheiden is van hogere EB-niveaus (bijv. 25%). Bij verschillende manipulaties kunnen de resultaten worden vergeleken met consistente innervatie van geurstofvoertuigcontroles en de robuuste synaptische glomeruli-snoei die optreedt bij 25% EB (Figuur 3). Een beperking van deze methode is dat de blootstelling aan geurstof volledig afhankelijk is van de vluchtigheid van de opgeloste geurstof. Variabele factoren zoals temperatuur en relatieve vochtigheid beïnvloeden de effectiviteit van de blootstelling aan geurstoffen⁸. De dichtheid van vliegen in de geurkamers kan mogelijk ook van invloed zijn op de blootstelling aan geurstoffen, bijvoorbeeld door de productie van van vliegen afgeleide geurstoffen. Een dichtheid van niet meer dan 20-25 vliegen per injectieflacon wordt aanbevolen. De geurconcentratie die nodig is om zeer sterke synaptische glomeruli-snoei te induceren, is waarschijnlijk hoger dan wat doorgaans in de natuur wordt ervaren^10,17. Er zouden beeldvormingstechnieken met een veel hogere resolutie nodig zijn om de eliminatie van synapsen bij lagere geurstofconcentraties te testen. Het huidige protocol maakt echter consistente en betrouwbare studies mogelijk voor een reeks manipulaties.

Er zijn enorme voordelen aan dit protocol voor blootstelling aan geurstof en beeldvorming van de hersenen. Drosophila is een enorm voordelig diermodel dat is gebaseerd op een uitgebreide en geavanceerde genetische gereedschapskist, die systematisch kan worden benut voor de brede studie van de interacties tussen genen en omgeving bij de hermodellering van het olfactorische circuit in de kritieke periode. Voorbeelden die hier worden getoond, zijn de Or42a-Gal4 transgene driverlijn, UAS-mCD8::GFP-membraanmarker en Or42a-mCD8::GFP directe fusie. Er zijn geen duidelijke verschillen tussen synaptisch glomeruli snoeien met de Or42a directe fusie versus Gal4/UAS indirecte labeling benaderingen ^8,9. De Or42a-Gal4-driver biedt de mogelijkheid om zowel de gerichte olfactorische receptorneuronen te manipuleren als ervaringsafhankelijke veranderingen in VM7-innervatie te visualiseren, terwijl de directe fusielijn het binaire UAS-Gal4-transgene systeem vrijmaakt voor andere celgerichte manipulaties. Veel andere mutante en transgene lijnen uit de uitgebreide Drosophila-toolkit kunnen worden gebruikt om temporele-restrictie- en ervaringsafhankelijke mechanismen te testen, waaronder het identificeren van cellen die synaptisch snoeien mediëren, de intercellulaire signaalroutes die olfactorische ervaringsinformatie doorgeven en de intracellulaire machinerie die nodig is voor gerichte synapseliminatie. Over het algemeen maakt dit protocol de systematische ondervraging mogelijk van vele mechanismen die olfactorische ervaringsafhankelijke hermodellering van het hersencircuit aansturen. Dit protocol voor blootstelling aan geurstoffen en beeldvorming van de hersenen kan ook worden gebruikt om kritieke periodespecifieke olfactorische ervaring, gedragsveranderingen, genetische en farmaceutische manipulaties te onderzoeken die de heropening van kritieke periode-achtige plasticiteit op rijpheid mogelijk kunnen maken, en andere aspecten van de plasticiteit van het olfactorische circuit die verder gaan dan synaptisch glomeruli-snoeien.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Voor geurblootstelling
Drosophila flesjes	Genesee Scientific	32-110
Ethylbutyraat	Sigma Aldrich	E15701
Microcentrifugebuizen	Fisher Scientific	05-408-129
Mineraal olie	Sigma Aldrich	M3516
Geurkamers	Glasslock
Schilderpenselen	Winsor & Newton	Serie 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Gaasdraad	Scienceware	378460000
Hersendissectie
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Verdund tot 70%
Pincetten	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyde	Electron Microscope Sciences	157-8	Verdund tot 4%
Petrischalen	Fisher Scientific	08-757-100B
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Verdund tot 1x
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Electron Microscope Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Hersenimmunocytochemie
488 geit anti-kip	Invitrogen	A11039
546 geit anti-rat	Invitrogen	A11081
Rundserum albumine	Sigma Aldrich	A9647
Kip anti-GFP	Abcam	13970
Dekglasjes	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Dubbelzijdig plakband	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Electron Microscope Sciences	17984-25
Microscoopglaasjes	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Nagellak	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normaal geitenserum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analyse
Elke computer/laptop
Confocal microscoop	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software	Fiji		Versie 2.14.0/1.54f