Methodenartikel

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66631

⸱

8 maart 2024

 ,  , 
1Department of Anatomy, Keio University School of Medicine, 2Department of Molecular Neurobiology, Institute for Developmental Research, Aichi Developmental Disability Center

In dit artikel

Samenvatting

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Samenvatting

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Dit proces is cruciaal voor een goede hersenfunctie en de ontregeling ervan kan na de geboorte leiden tot neurologische ontwikkelings- en psychiatrische stoornissen. In feite zijn veel genen die verantwoordelijk zijn voor deze ziekten betrokken gebleken bij dit proces, en daarom is het belangrijk om te onthullen hoe deze mutaties de cellulaire dynamiek beïnvloeden om de pathogenese van deze ziekten te begrijpen. Dit protocol introduceert een techniek voor time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in hersenplakjes verkregen uit muizenembryo's. Cellen worden gelabeld met fluorescerende eiwitten met behulp van in utero-elektroporatie , waarbij individuele cellen worden gevisualiseerd die migreren uit de ventriculaire zone met een hoge signaal-ruisverhouding. Bovendien stelt dit in vivo genoverdrachtssysteem ons in staat om gemakkelijk gain-of-function- of loss-of-function-experimenten uit te voeren op de gegeven genen door co-elektroporatie van hun expressie of knockdown/knock-out vectoren. Met behulp van dit protocol kan het migratiegedrag en de migratiesnelheid van individuele cellen, informatie die nooit uit vaste hersenen wordt verkregen, worden geanalyseerd.

Inleiding

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors produceren (apicale) radiale glia in de palliale ventriculaire zone (VZ) die de laterale ventrikel bekleedt, eerst neuronen en vervolgens gliale voorlopercellen met enige overlappende periode1. Neuronen worden ook gegenereerd uit intermediaire voorlopercellen of basale radiale glia in de subventriculaire zone (SVZ) grenzend aan de VZ, die beide afkomstig zijn van de (apicale) radiale glia 2,3. Bij muizen produceren radiale gliacellen alleen neuronen op embryonale dag (E) 12-14, zowel neuronen als glia-voorlopercellen op E15-16 en glia-voorlopercellen vanaf E174. De belangrijkste populatie glia-voorlopercellen die tijdens deze embryonale stadia worden gegenereerd, differentieert bij voorkeur tot astrocyten, hoewel sommige cellen ook differentiëren tot oligodendrocyten5. Neuronen en voorlopercellen van astrocyten die in deze stadia worden gegenereerd, migreren naar het hersenoppervlak en komen de corticale plaat binnen (toekomstige corticale grijze stof). Neuronale migratie van de VZ naar de corticale plaat vindt plaats in meerdere fasen. Neuronen nemen eerst een multipolaire morfologie aan net boven de multipolaire celaccumulatiezone (MAZ), overlappend met de SVZ of tussenliggende zone, waar ze meerdere dunne processen krachtig uitbreiden en intrekken en langzaam migreren (multipolaire migratie)6,7. Na ongeveer 24 uur transformeren neuronen in een bipolaire morfologie, waarbij een dik leidend proces zich uitbreidt naar het hersenoppervlak en een dun achterblijvend proces naar achteren, en lineair naar het hersenoppervlak migreren met behulp van een radiaal proces dat zich uitstrekt van de radiale glia naar het piale oppervlak als een steiger, die voortbewegingsmodus 2,8 wordt genoemd. Omdat neuronen in de voortbewegingsmodus altijd het buitenste oppervlak van de corticale plaat bereiken en door hun voorgangers net onder de marginale zone gaan, worden neuronen op een geboortedatum-afhankelijke inside-out manier uitgelijnd in de corticale plaat 9,10,11.

Daarentegen migreren voorlopercellen van astrocyten snel naar de tussenliggende zone en de corticale plaat, met frequente richtingsveranderingen. Dit migratiegedrag is totaal anders dan neuronale migratie en wordt grillige migratie genoemd5. Voorlopers van astrocyten migreren ook langs bloedvaten in een proces dat bloedvatgeleide migratie wordt genoemd. Voorlopers van astrocyten schakelen tussen deze migratiemodi en bereiken de corticale plaat 5,12. Hoewel de positionering van astrocyten niet strikt wordt bepaald door hun productiedatum, is er een milde neiging waargenomen bij vroeggeboren astrocyten om zich te nestelen in het oppervlakkige deel van de corticale plaat5. Interessant is dat astrocyten die zich in de corticale plaat nestelen, in embryonale stadia worden gegenereerd en uiteindelijk differentiëren tot protoplasmatische astrocyten, terwijl postnataal gegenereerde astrocyten niet actief migreren, in de witte stof blijven en differentiëren tot vezelachtigeastrocyten. Hoe deze fase-afhankelijke specificatie van astrocytische subtypes optreedt, blijft onduidelijk.

Er is een groeiend aantal genen geïdentificeerd die betrokken zijn bij neuronale migratie, waaronder genen die betrokken zijn bij neurologische ontwikkelingsstoornissen en psychiatrische stoornissen13,14. Daarom is het cruciaal om de effecten van mutaties in deze genen op het gedrag van migrerende neuronen op te helderen. Zoals eerder vermeld, vindt neuronale migratie plaats in meerdere fasen. Time-lapse-waarnemingen kunnen direct de fase bepalen die het meest wordt beïnvloed (uitgang van de celcyclus, multipolaire-bipolaire overgang, migratiesnelheid van voortbeweging, enz.). De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de specificatie, migratie en positionering van astrocyten blijven echter grotendeels onbekend. Aangezien astrocyten een cruciale rol spelen bij synaptogenese15 en de vorming van bloed-hersenbarrières tijdens de ontwikkeling van de hersenen16, kunnen ontwikkelingsstoornissen bij astrocyten leiden tot neurologische ontwikkelingsstoornissen. Time-lapse-studies naar voorlopercellen van astrocyten kunnen deze moleculaire mechanismen en hun relatie met psychische aandoeningen verduidelijken.

Dit protocol biedt een methode voor time-lapse-observatie van corticale VZ-afgeleide cellen. Een soortgelijk videoprotocol voor de observatie van neuronale migratie is al gepubliceerd17. Hier beschrijven we de methode voor zowel migrerende neuronen als astrocytenvoorlopercellen. Om deze cellen te labelen met fluorescerende eiwitten, zoals groene en rode fluorescerende eiwitten (GFP en RFP), worden plasmidemengsels met de juiste componenten in de corticale VZ geïntroduceerd door in utero elektroporatie in de juiste stadia 18,19,20,21. De gemanipuleerde embryo's worden in de gewenste stadia verwijderd en de hersenen worden in plakjes gesneden en gebruikt voor time-lapse-observaties met behulp van een laserscanmicroscoop. De migratiesnelheid, richting en ander gedrag, dat nooit wordt aangepakt met behulp van vaste hersenmonsters, kan met deze methode worden onderzocht. Door gebruik te maken van in utero elektroporatie, expressie en knockdown/knock-out vectoren kunnen ze gemakkelijk gelijktijdig worden overgedragen met fluorescerende eiwitvectoren, waardoor we gain-of-function-en verlies-of-function-studies van specifieke genen kunnen uitvoeren.

Protocol

De huidige studie werd uitgevoerd met goedkeuring van en volgens de richtlijnen van de Animal Care and Use Committee van het Institute for Developmental Research, Aichi Developmental Disability Center (#2019-013) en Keio University (A2021-030). Getimede zwangere ICR (wild-type) muizen werden commercieel verkregen (zie Materiaaltabel). Om de relatie tussen migrerende cellen en bloedvaten te observeren, werden Flt1-DsRed-muizen gebruikt, waarbij de endotheelcellen DsRed22 tot expressie brengen. Mannelijke Flt1-DsRed-muizen werden gekruist met vrouwelijke ICR-muizen (beide muizen waren 8-24 weken oud). Alle dieren werden gehuisvest en gemanipuleerd onder specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden tot aan de bemonstering. De reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Elektroporatie in utero

  1. Bereid HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS) voor door een gelijk volume geautoclaveerd water toe te voegen aan in de handel verkrijgbare 2x HBS.
  2. Er zijn twee opties voor anesthetica; isofluraan (inhalatie) en MMB (injectie). In het geval van het gebruik van MMB, bereid het dan als volgt voor. Voeg 0,75 ml medetomidine (1 mg/ml), 2 ml midazolam (5 mg/ml) en 2,5 ml butorfanol (5 mg/ml) toe aan 19,75 ml geautoclaveerd water23.
    LET OP: Deze verdovingsoplossing wordt binnen 2 maanden minder actief. Bewaren bij 4 °C met lichtschild.
  3. Bereid atipamezol-oplossing voor. Verdun 0,75 ml atipamezol (5 mg/ml) met 24,25 ml geautoclaveerd water.
  4. Bereid 0,2% (m/v) Fast Green-oplossing in geautoclaveerd water. Steriliseer met een filter (poriegrootte 0,22 μm).
  5. Bereid plasmide voor met behulp van een conventionele plasmidezuiveringsset op basis van alkalische lysis en kolomzuivering23 volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Los het gezuiverde plasmide op uit de bacteriecultuur van 100 ml in 30-50 μl HBS om de plasmidevoorraad (3-5 μg/μl) te bereiden (aanvullend bestand 1).
    1. Meng en verdun de plasmidevoorraden met HBS en voeg 1/10 volume van 0,2% Fast Green toe om de injectant te kleuren. De componenten en de uiteindelijke concentraties van de plasmiden worden bepaald op basis van hun doel (tabel 1).
  6. Maak de micropipetten door met een pipettrekker aan de glazen haarvaten te trekken.
    OPMERKING: De punt van de pipet wordt schuin gesneden met een fijne pincet. De buitendiameter van de punt is ongeveer 70 μm. Markeer de micropipetten met tussenpozen van 2 μL door 2 μL water op te zuigen.
  7. Injecteer MMB-verdoving in een dosis van 10 μl/g lichaamsgewicht intraperitoneaal in een zwangere muis in een geschikt stadium (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
    OPMERKING: De te manipuleren embryonale stadia moeten worden bepaald op basis van het doel. Om toekomstige II/III piramidale neuronen te labelen, is E14.5 geschikt. Om glia-voorlopercellen te labelen, moet elektroporatie worden uitgevoerd op E15-16. Als alternatief kunnen de muizen worden verdoofd door inhalatie van isofluraan (1%-2%).
  8. Nadat de muis diep verdoofd is, legt u deze op een warm bord bij 38 °C.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de muis niet reageert op het knijpen van de staart.
  9. Na het verwijderen van de vacht rond de operatieplaats met ontharingscrème, desinfecteert u het operatiegebied meerdere keren in een cirkelvormige beweging met zowel een scrub op jodiumbasis als 70% alcohol. Maak een 2 cm lange incisie in de huid langs de middellijn vanaf het niveau van het2e meest achterste paar tepels anterieur, gevolgd door een incisie van 2 cm in de buikwand langs de linea alba (Figuur 1A).
    OPMERKING: Tijdens de incisie in de buikwand tilt u deze iets op met een fijne pincet om de inwendige organen niet te snijden.
  10. Leg een steriel plastic vel op de huid en een stuk steriel tissuepapier erop (Figuur 1A). Maak een gat in het midden om het operatiegebied bloot te leggen.
    OPMERKING: Het steriele plastic vel en het steriele tissuepapier worden na het maken van de incisie geplaatst, omdat er een breed gezichtsveld nodig is om de incisie te positioneren die verwijst naar de positie van de tepels.
  11. Maak het papier nat met steriel PBS, observeer zorgvuldig de baarmoederhoorns vanaf de incisie en trek de baarmoederhoorn door de gaten van het plastic vel en papier naar buiten.
  12. Injecteer met behulp van een micropipet die aan een aspiratorbuisje is bevestigd 1 μl van het plasmidemengsel in het linker of rechter laterale ventrikel door de baarmoederwand door middel van expiratoire druk (Figuur 1A).
    OPMERKING: Als alternatief kan plasmide worden geïnjecteerd met behulp van een microinjector.
  13. Knijp in de kop van het embryo met een pincet-achtige elektrode en breng elektronische pulsen aan met behulp van een elektroporator (35 V voor E14-16, 50 V voor E17, 50 ms vierkante pulsen met intervallen van 450 ms, 5 keer) (Figuur 1A).
    OPMERKING: Knijp niet te hard in de kop van de embryo's, dit zal de embryo's beschadigen. De werkelijke stroom moet 40-70 mA zijn.
  14. Plaats de baarmoederhoorn terug in de buikholte.
  15. Hecht de buikwand met een 5-0 zijden draad.
  16. Breng atipamezol oplossing aan in een dosis van 10 μl/g lichaamsgewicht intraperitoneaal.
  17. Hecht de huid met een 5-0 zijden draad.
    OPMERKING: De skin kan worden gesloten met behulp van een autoclip.
  18. Bewaar de gemanipuleerde muizen minimaal 30 minuten op een warm bord. De muizen gaan bewegen in de kooi.
    OPMERKING: De procedure van in utero elektroporatie (van stap 1.7 tot 1.16) moet binnen 30 minuten worden uitgevoerd. De typische bedrijfstijd is 20 minuten.

2. Bereiding van plakjes

OPMERKING: De versheid van de plakjes is de sleutel tot het succes van dit experiment. De plakjes moeten binnen 2 uur worden bereid (uit stap 2.5-2.12).

  1. Bereid de uitgebalanceerde zoutoplossing van de Hanks voor met Ca2+ en Mg2+; HBSS(+). Voeg 5 ml CaCl2 (14 g/l, geautoclaafd) en 5 ml MgSO 4,7H2O (20 g/l, geautoclaafd) toe aan 500 ml HBSS(-). Bewaren bij 4 °C. Laat de oplossing voor gebruik 5 minuten op ijs bubbelen met 95% O2 + 5% CO2 gas.
  2. Bereid het kweekmedium voor. Er is minimaal 2,5 ml/schaaltje nodig. Voeg 2 ml foetaal runderserum, 25 μl L-glutamine (200 mM), 200 μl B27 (50x), 50 μl penicilline + streptomycine (10 K eenheden/ml en 10 mg/ml) toe aan 8 ml Neurobasal medium.
  3. Bereid 3% agarosegel met een lage smelttemperatuur. Porie 50 ml HBSS(+), voeg vervolgens 1,5 mg agarose met lage smelttemperatuur toe en autoclaaf het. Smelt de agarose in een magnetron en bewaar deze voor gebruik op 50 °C in een waterbadcouveuse.
  4. Voeg 1,9 ml kweekmedium toe aan een glazen schaaltje. Plaats er voorzichtig een celcultuurinzetstuk op om te voorkomen dat luchtbollen onder het filter terechtkomen en voeg vervolgens 500 μL kweekmedium toe aan het filter (Figuur 1B). Leg het op ijs.
  5. Na het verdoven van de gemanipuleerde muizen door inademing van 5% isofluraan, offert u ze op door cervicale dislocatie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) in de juiste stadia die moeten worden geobserveerd.
    NOTITIE: Twee dagen (48 uur) en 3 dagen na elektroporatie bij E14.5 zijn geschikt voor het observeren van respectievelijk de multipolaire-bipolaire overgang en de voortbewegingsmodus.
  6. Haal de embryo's eruit en plaats ze in een petrischaaltje met koude PBS.
  7. Selecteer de embryo's door de expressie van GFP of andere fluorescerende eiwitten onder een microscoop.
  8. Na de onthoofding van de embryo's ontleedt u de hersenen6 onder een ontleedmicroscoop en bewaart u ze in koude HBSS(+).
  9. Giet de gesmolten agarosegel met een lage smelttemperatuur van 3% in een cryomal (zie Tabel met materialen), doe de hersenen erin en rol ze meerdere keren. Zet het op kamertemperatuur tot de agarose volledig stolt en leg het dan op ijs.
  10. Snijd de hersenen coronaal in plakjes met een dikte van 350 μm met behulp van een vibrerende microtoom (zie Tabel met materialen).
  11. Schik de plakjes op het filter (maximaal 6 plakjes per filter).
  12. Trek het kweekmedium uit de binnen- en buitenkant van de filterbeker (600 μL in totaal). In deze stap worden de plakjes geperst en op een filter gefixeerd. Voeg na 5 minuten 100 μL kweekmedium toe aan de binnenkant van het celcultuurinzetstuk.

3. Time-lapse beeldvorming

  1. Houd de kweekkamer gemonteerd op de tafel van een omgekeerde laserscanmicroscoop bij 37 °C met behulp van de verwarming van de kamer of een kap die de microscoop omsluit ten minste 30 minuten voordat u de beeldvorming maakt om Z-drift te voorkomen. Lever bevochtigd 5% CO2 + 40% O2 gas aan de kweekkamer.
  2. Zet de kweekschaal met de hierboven bereide plakjes in de kweekkamer.
  3. Gebruik een 20x-lens met een lange werkafstand (NA = 0,45) om de 15-30 minuten gedurende 24 uur ongeveer 10 Z-stack-beelden met stappen van 5 μm.
    OPMERKING: Het gebruik van een gemotoriseerde XY-tafel wordt ten zeerste aanbevolen. Dit stelt ons in staat om beelden uit meerdere objectiefvelden te verkrijgen. Doorgaans verkrijgen we 10-20 beelden van verschillende objectiefvelden in één time-lapse-experiment.

4. Beeldvormende analyse

  1. Converteer XYZT-afbeeldingen naar XYT door de maximale projectie van de Z-as met behulp van ImageJ of andere software.
    OPMERKING: Als de plakjes tijdens de observatie zijn verschoven, pas dan de positie van de cellen in de afbeeldingen aan met behulp van StackRed, een ImageJ-plug-in, met zijn functie van Rigid Body-transformatie (zie Tabel met materialen).
  2. Traceer het traject van GFP- of andere fluorescerende eiwitpositieve cellen handmatig of automatisch. Handmatige en automatische tracering kunnen worden uitgevoerd met respectievelijk MTrackJ24 en TrackMate 25,26 (ImageJ-plug-ins). Automatische tracering met behulp van TrackMate is efficiënt voor het analyseren van veel cellen op een onbevooroordeelde manier. Handmatige tracering met behulp van MTrackJ blijft echter nuttig voor het nauwkeurig volgen van individuele cellen.

Resultaten

Radiale gliacellen in de palliale VZ produceren alleen neuronen tot E14, en zowel neuronen als gliacellen op E15 en E16. Om het migratiegedrag van neuronen en gliacellen tegelijkertijd te observeren, hebben we ze gelabeld met respectievelijk verbeterde GFP (EGFP) en RFP met behulp van een neuronspecifieke promotor, Tα1-promotor27, en humaan gliafibrillair zuur eiwit (hGFAP) promotor28, die bij voorkeur wordt geactiveerd in astrocyten. Voorlopers van astrocyten herhalen celdelingen tijdens de migratie, wat leidt tot de verdunning van plasmide in de cellen. Om dit te voorkomen, werd een transposonvectorsysteem gebruikt dat bestaat uit een donorplasmide (pPB) en een transposase-expressievector (pCAG-hyPBase) 29,30. Het hier gebruikte donorplasmide (pPB-CAG-LNL-RFP) heeft een loxP-neo-loxP (LNL) cassette en drukt RFP uit afhankelijk van Cre-recombinase. ICR-muizen (wildtype; WT) werden geëlektropoleerd met de aangegeven plasmiden in figuur 2A bij E15, en de plakjes werden 3 dagen later bereid. Gedurende deze periode bereikte het eerste cohort EGFP+-neuronen het oppervlak van de corticale plaat (Figuur 2B), maar veel EGFP+-neuronen migreerden nog steeds. Time-lapse-observatie werd gedurende 24 uur uitgevoerd. Tijdens deze observatie migreerden neuronen met een dik leidend proces lineair naar het hersenoppervlak met een relatief constante snelheid in de corticale plaat (19,54 ± 6,21 μm/h, gemiddelde ± standaarddeviatie, 70 cellen). De migratietrajecten werden automatisch getraceerd met behulp van TrackMate-software (magenta lijnen in figuur 2B). In hetzelfde objectiefveld werden voorlopercellen van astrocyten gevisualiseerd met RFP (Figuur 2C). Omdat de hGFAP-promotor ook actief is in radiale gliacellen in late embryonale stadia, brengen sommige neuronen die van die radiale glia zijn afgeleid ook RFP tot expressie (blauwe pijlen in figuur 2B,C). Deze neuronen worden bijna altijd getransfecteerd met een EGFP-expressievector. Daarom werden voorlopercellen van astrocyten geïdentificeerd als RFP single-positieve cellen.

In tegenstelling tot neuronen migreren voorlopercellen van astrocyten snel en willekeurig met frequente richtingsveranderingen binnen de tussenzone en de corticale plaat (grillige migratie)5. De migratie van astrocytenvoorlopercellen werd handmatig getraceerd door MTrackJ-software (magenta lijnen in figuur 2C), die hun hoge beweeglijkheid onthulde (88,37 ± 33,61 μm/h, 5 cellen). Om de relatie tussen astrocytenvoorlopercellen en bloedvaten te observeren, werden Flt1-DsRed-muizen gebruikt, die DsRed, een RFP, in endotheelcellen tot expressie brengen. In dit experiment werden de voorlopercellen van astrocyten verondersteld alleen te worden geïdentificeerd door EGFP. Hiertoe werd het rDIO-systeem5 ontwikkeld, waarin EGFP-expressie afhankelijk van hGFAP-Cre in neuronen kan worden geëlimineerd door gebruik te maken van een Dcx-promotor (een vroege neuronspecifieke promotor)31-afhankelijke activering van een andere set DNA-recombinase en de herkenningssequentie ervan (Dre-rox) (Figuur 2D, de sequentie van pPB-CAG-rDIO-EGFP is opgenomen in aanvullend bestand 1)32, 33. okt. Het rDIO-systeem werd geïntroduceerd in de Flt1-DsRed-muis bij E15 door elektroporatie in utero en plakjes werden 24 uur later bereid. Als gevolg hiervan werd waargenomen dat de EGFP-positieve astrocyt-voorlopercellen actief langs bloedvaten migreerden (bloedvatgeleide migratie)5 (Figuur 2E).

figure-results-1
Figuur 1: Stroom van time-lapse-waarnemingen van cellen die zijn gelabeld door in utero-elektroporatie. (A) Een zwangere muis in een geschikt stadium wordt verdoofd en de buikholte wordt opengesneden. Het operatiegebied is bedekt met steriel plastic en steriele papieren vellen. De baarmoederhoorns worden blootgelegd en embryo's worden geïnjecteerd met 1 μL plasmidemengsel en toegepaste elektronische pulsen. De buikwand en huid worden gehecht en de gemanipuleerde muizen worden terug in de huiskooi geplaatst. (B) Plakjes bereid uit geëlektropoleerde hersenen worden op het filter van het celcultuurinzetstuk (maximaal 6 plakjes) in een glazen schaaltje gelegd. De glazen schaaltjes met plakjes zijn gemonteerd in een kweekkamer. Dit time-lapse systeem heeft een acrylkap die de hele microscoop bedekt om de temperatuur op 37 °C te houden. De kweekkamer, waarin bevochtigd menggas wordt geleverd, is uitgerust met een microscooptafel in de kap. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Time-lapse waarnemingen van neuronen en voorlopercellen van astrocyten. (A) Methode voor differentiële labeling van neuronen (EGFP, groen) en voorlopercellen van astrocyten (RFP, rood), en een representatief beeld van een plak die 2 dagen na de elektroporatie is voorbereid op 2 uur vanaf het begin van de time-lapse beeldvorming (rechts). (B,C) Time-lapse-beelden van EGFP+ (B) en RFP+ cellen (C) op hetzelfde objectiefveld weergegeven in (A) - rechts van 2 uur tot 21 uur observatie. (B) Trajecten van EGFP+ migrerende cellen die automatisch door TrackMate-software werden gedetecteerd, werden in magenta weergegeven. (C) Trajecten van RFP+- cellen werden handmatig getraceerd met behulp van MTrackJ-software. EGFP/RFP dubbele positieve cellen, waarvan wordt gedacht dat het neuronen zijn, worden aangegeven met blauwe pijlen. (D) Etiketteringsstrategie van astrocytenvoorlopercellen met behulp van het rDIO-systeem in Flt1-DsRed muizenembryo's. (E) Representatief resultaat van bloedvatgeleide migratie. Een cel (pijl) stak een leidende processus (pijlpunt) uit en migreerde langs het DsRed-expressieve bloedvat (magenta) naar het piale oppervlak. CP; corticale plaat. IZ; tussenliggende zone. VZ; ventriculaire zone. Schaal balken: 200 μm (A-C), 50 μm (E). Deze figuur is een bewerking van Tabata H. et al.5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Neuronen (lagen II/III)Voorlopers van astrocytenrDIO-systeem
(astrocyt-specifieke etikettering)
pCAG-EGFP0,5 μg/μlpPB-CAG-LNL-EGFP0,5 μg/μlpPB-CAG-rDIO-EGFP0,5 μg/μl
of Ta1-EGFP (specifieker voor neuronen)0,5 μg/μlhGFAP-CRE0,75 μg/μlhGFAP-CRE0,75 μg/μl
pCAG-hyPBase0,5 μg/μlpDcx-Dre0,5 μg/μl
pCAG-hyPBase0,5 μg/μl

Tabel 1: Representatieve componenten van de plasmidemix voor elk doelwit. EGFP-vectoren kunnen worden vervangen door equivalente RFP of andere fluorescerende eiwitexpressievectoren. Om voorlopers van astrocyten te labelen, wordt een transposon-vectorsysteem gebruikt. pPB-vectoren zijn PiggyBac-transposonvectoren voor genoomintegratie. pCAG-hyPBase is een PiggyBac transposase expressievector. LNL is een loxP-neo-loxP cassette voor Cre-afhankelijke expressie. rDIO-EGFP is Cre-loxP en Dre-roxP afhankelijk van/uit cassette van EGFP-expressie. Om het gain-of-function- of loss-of-function-fenotype van gewenste genen te observeren, kunnen expressievectoren of knockdown-vectoren worden toegevoegd bij 1 μg/μL. De concentratie van deze vectoren moet in elk geval worden aangepast.

Aanvullend bestand 1: Plasmide-sequenties. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit protocol introduceerde een methode voor de time-lapse observatie van cellen afkomstig van de palliale (corticale) VZ. Om de migrerende cellen van de VZ te labelen, gebruikten we in utero-elektroporatie, waarbij individuele cellen duidelijk werden gelabeld met een hogere signaal-ruisverhouding dan in virale vector-gemedieerde labeling. Met behulp van in utero-elektroporatie kan elk type vector in elke combinatie gemakkelijk in de radiale gliacellen (neurale stamcellen) in levende embryo's worden ingebracht. Neuronen en glia-voorlopercellen kunnen selectief worden gelabeld met behulp van verschillende promotors. Aangezien het aantal kopieën van plasmiden dat door in utero-elektroporatie wordt geïntroduceerd hoog is, kunnen gain-of-function- en loss-of-function-studies gemakkelijk worden uitgevoerd door co-elektroporatie van GFP-expressievectoren en verschillende vectoren die verband houden met de genen van belang, zoals expressievectoren en knockdown/knock-outvectoren. Bovendien kan elektroporatie in utero worden gebruikt om plasmidevectoren te introduceren in de VZ van verschillende hersengebieden anders dan de corticale VZ, waardoor we de migratie van andere celtypen kunnen observeren, zoals remmende neuronen, oligodendrocytvoorlopers van ganglionische eminenties 34,35,36 en hippocampale piramidale neuronen37.

In time-lapse-studies kunnen de effecten van gain-of-function- en loss-of-function-experimenten op celgedrag worden geëvalueerd met behulp van de TrackMate- en MTrackJ-software. Veel genen, waaronder genen die verantwoordelijk zijn voor neurologische ontwikkelingsstoornissen en verstandelijke handicaps, zijn betrokken bij neuronale migratie. Time-lapse-studies kunnen direct onthullen hoe deze genen het gedrag van cellen reguleren. Vergeleken met neuronale migratie zijn de moleculaire mechanismen van gliacelmigratie niet goed begrepen. Deze methode kan niet alleen de normale ontwikkeling van gliacellen onthullen, maar ook de genetische en omgevingsfactoren die de ontwikkeling van gliacellen en de relatie met psychische aandoeningen kunnen beïnvloeden.

De beperking van deze methode is dat deze onvermijdelijk afhankelijk is van de in vitro plakcultuurmethode. Interessant is dat migrerende neuronen geen richtingsaanwijzingen voor migratie naar het hersenoppervlak verliezen, zelfs niet in plakjes die in vitro worden gekweekt. Onderzoekers moeten echter voorzichtig zijn met artefacten. Cellen in de buurt van het oppervlak zijn aan het filter bevestigd en de randen van de plakjes worden gemakkelijk vervormd. Deze cellen moeten bij de analyse worden uitgesloten. Indien mogelijk moeten controle-experimenten worden overwogen. Het is belangrijk op te merken dat hersenplakjes de normale ontwikkeling binnen ongeveer 24 uur recapituleren. Daarom moet de timing van de plakbereiding van elektroporatie worden bepaald, zodat de te analyseren gebeurtenissen in dit tijdvenster zullen plaatsvinden. Om de multipolaire-bipolaire overgang waar te nemen, moeten plakjes 2 dagen na elektroporatie worden bereid. Om de migratie in de voortbewegingsmodus te analyseren, is 3 dagen later geschikt. De observatie van bloedvatgeleide migratie is een moeilijkere taak dan die van andere experimenten. De endotheelcellen worden gemakkelijk afgebroken in plakjes zonder bloedstroom. Om de afbraak van de bloedvaten tot een minimum te beperken, moeten de plakjes zo snel mogelijk worden bereid en bewaard in een medium dat 20% serum en 40%O2-gas bevat. Andere aanvullende experimenten, zoals histologische analyses van vaste hersenen of in vivo live beeldvorming met behulp van twee-fotonmicroscopie, kunnen de waarnemingen in slice time-lapse-analyses versterken.

Samenvattend is deze methode de enige optie om het gedrag van cellen gedurende 24 uur te observeren. Met de ontwikkeling van nieuwe plasmidevectoren zal het toepassingsgebied van deze methode in de toekomst verder worden uitgebreid.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Tα1 promotor is een geschenk van P. Barker en F.D. Miller. Dcx promotor is een geschenk van Q. Lu. hGFAP-Cre was een geschenk van Albee Messing. Het PiggyBac transposon vector systeem werd geleverd door het Sanger Instituut. Flt1-DsRed-muizen werden geleverd door M. Ema (Shiga University). Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI (subsidienummer JP21K07309 aan H. Tabata, JP20H05688 en JP22K19365 aan K. Nakajima) en Takeda Science Foundation, Keio Gijuku Fukuzawa Memorial Fund for the Advancement of Education and Research, Keio Gijuku Academic Development Funds aan K. Nakajima.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aspirator tube assemblyDrummond2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)MeijiMepatia
AutoclipBecton Dickinson4276309 mm
B27 supplementGibco17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)MeijiVetorphale
Cell culture insertMilliporePICM ORG 50
Confocal microscopeNikonA1RHD25Uitgerust met een lengte met lange werkafstand (S Plan Fluor ELWD 20XC)
CryomoldTissue-Tek4566
Culture chamberTokkenTK-NBCMPOp maat gemaakt
ElectroporatorNEPA GeneNEPA21
Fast GreenSigma-AldrichF7258
Gas mixerTokkenTK-MIGM01-02
Glass base dishIwaki3910-035Diameter van de glazen bodem is 27 mm
Glass capillariesNarishigeGD-1
HBS (2x)Sigma-Aldrich51558
HBSS(-)Wako084-08345
Heater UnitTokkenTK-0003HU20Op maat gemaakt, inclusief kap en verwarming
hGFAP-CreAddgene#40591Een geschenk van Albee Messing
ImageJhttps://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)Gibco25030
Low melting temperature agaroseLonza50100
Medetomidine (1 mg/mL)MeijiMedetomin
MicroinjectorNarishigeIM-300
Midazolam (5 mg/mL)SandozMidazolam
MTrackJhttps://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal mediumGibco21103-049
pCAG-hyPBaseHet hyPBase cDNA van pCMV-hyPBase (een geschenk van het Sanger Institute) werd ingebracht in de downstream van de CAG-promotor van pCAGGS (een geschenk van J. Miyazaki).
pDcx-DreDe Dcx-promotor van Dcx4kbEGFP70 (een geschenk van Q. Lu) werd verwisseld met de CAG-promotor van pCAG-NLS-HA-Dre34 (een geschenk van Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + StreptomycinGibco15140122
Plasmid purification kitInvitrogenPureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFPCAG-LNL-cassette van pCALNL-DsRed (een geschenk van Connie Cepko, Addgene #13769), en TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) werden ingebracht in de klonering-site van pPB-CAG.EBNXN (een geschenk van het Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFPDe sequentie die synthetische rox-plaatsen bevat, synthetische DIO-cassette en EGFP cDNA uit pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in omgekeerde richting  werden ingebracht in de klonering-site van pPB-CAG.EBNXN (een geschenk van het Sanger Institute). De sequentie is te vinden in het aanvullende bestand.
PullerNarishigePN-31
StackRedeen plug-in voor ImageJhttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needleNazmeC-24-521-R No.11/2 cirkel, lengte 14 mm
Suture threadNazmeC-23-B2Zijde, maat 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) miceJapan SLCICR mouse
TrackMatehttps://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrodeBEX of NEPA GeneCUY650P5 
Tα1-EGFPEGFP cDNA van pEGFP-N1 (Clontech, U55762) werd ingebracht in de downstream van de Tα1-promotor in plasmid 253 (een geschenk van P. Barker en F.D.Miller)
Vibrating microtomeLeica of ZeissVibrating blade microtome VT1000S of Hyrax V50.

Referenties

  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32 (1), 149-184 (2009).
  2. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  3. Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: A major site of neurogenesis. P Natl Acad Sci USA. 101 (9), 3196-3201 (2004).
  4. Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  5. Tabata, H., et al. Erratic and blood vessel-guided migration of astrocyte progenitors in the cerebral cortex. Nat Commun. 13 (1), 6571(2022).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar Migration: The third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
  7. Tabata, H., Kanatani, S., Nakajima, K. Differences of migratory behavior between direct progeny of apical progenitors and basal progenitors in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 (9), 2092-2105 (2009).
  8. Rakic, P. Mode of cell migration to the superficial layers of fetal monkey neocortex. J Comp Neurol. 145 (1), 61-83 (1972).
  9. Sekine, K., Honda, T., Kawauchi, T., Kubo, K., Nakajima, K. The outermost region of the developing cortical plate is crucial for both the switch of the radial migration mode and the Dab1-dependent "inside-out" lamination in the neocortex. J Neurosci. 31 (25), 9426-9439 (2011).
  10. Shin, M., et al. Both excitatory and inhibitory neurons transiently form clusters at the outermost region of the developing mammalian cerebral neocortex. J Comp Neurol. 527 (10), 1577-1597 (2019).
  11. Sekine, K., et al. Reelin controls neuronal positioning by promoting cell-matrix adhesion via inside-out activation of integrin α5β1. Neuron. 76 (2), 353-369 (2012).
  12. Morimoto, K., Tabata, H., Takahashi, R., Nakajima, K. Interactions between neural cells and blood vessels in central nervous system development. BioEssays. 230091, (2023).
  13. Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Med Mol Morphol. 49 (2), 63-75 (2016).
  14. Ishii, K., Kubo, K., Nakajima, K. Reelin and neuropsychiatric disorders. Front Cell Neurosci. 10, 229(2016).
  15. Bosworth, A. P., Allen, N. J. The diverse actions of astrocytes during synaptic development. Curr Opin Neurobiol. 47, 38-43 (2017).
  16. Tabata, H. Crosstalk between blood vessels and glia during the central nervous system development. Life. 12 (11), 1761(2022).
  17. Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation. J Vis Exp. (125), e55886(2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient Gene Transfer into the Embryonic Mouse Brain Using in Vivo Electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Fukuchi-Shimogori, T. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  22. Matsumoto, K., et al. Study of normal and pathological blood vessel morphogenesis in Flt1-tdsRed BAC Tg mice. Genesis. 50 (7), 561-571 (2012).
  23. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  24. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  25. Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nat Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  26. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Gloster, A., et al. The T alpha 1 alpha-tubulin promoter specifies gene expression as a function of neuronal growth and regeneration in transgenic mice. J Neurosci. 14 (12), 7319-7330 (1994).
  28. Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
  29. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. P Natl Acad Sci USA. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  30. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Meth. 207 (2), 172-180 (2012).
  31. Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J Neurosci Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
  32. Sauer, B. DNA recombination with a heterospecific Cre homolog identified from comparison of the pac-c1 regions of P1-related phages. Nucleic Acids Res. 32 (20), 6086-6095 (2004).
  33. Hermann, M., et al. Binary recombinase systems for high-resolution conditional mutagenesis. Nucleic Acids Res. 42 (6), 3894-3907 (2014).
  34. Kanatani, S., et al. The COUP-TFII/Neuropilin-2 is a molecular switch steering diencephalon-derived GABAergic neurons in the developing mouse brain. P Natl Acad Sci USA. 112 (36), E4985-E4994 (2015).
  35. Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
  36. Kanatani, S., Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. COUP-TFII is preferentially expressed in the caudal ganglionic eminence and is involved in the caudal migratory stream. J Neurosci. 28 (50), 13582-13591 (2008).
  37. Kitazawa, A., et al. Hippocampal pyramidal neurons switch from a multipolar migration mode to a novel "climbing" migration mode during development. J Neurosci. 34 (4), 1115-1126 (2014).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

In utero elektroporatiefluorescent eiwitlabelinghersenplakcultuurneuronale migratieastrocytenprogenitorengene knockdown

Gerelateerde artikelen