Er is een methode ontwikkeld om kleurstofextravasatie als gevolg van afbraak van de bloed-hersenbarrière (BBB) te visualiseren door twee fluorescerende kleurstoffen op verschillende tijdstippen aan muizen toe te dienen. Het gebruik van glycerol als cryoprotectant vergemakkelijkte immunohistochemie op hetzelfde monster.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Evaluatie van de afbraak van de bloed-hersenbarrière in een muismodel van licht traumatisch hersenletsel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fluorescerende kleurstoffen worden gebruikt om de mate van kleurstofextravasatie te bepalen die optreedt als gevolg van afbraak van de bloed-hersenbarrière (BBB). Labelen met deze kleurstoffen is een complex proces dat wordt beïnvloed door verschillende factoren, zoals de concentratie van kleurstoffen in het bloed, de doorlaatbaarheid van hersenvaten, de duur van de extravasatie van de kleurstof en de vermindering van de kleurstofconcentratie in het weefsel als gevolg van afbraak en diffusie. In een model voor licht traumatisch hersenletsel veroorzaakt blootstelling aan door ontploffing veroorzaakte schokgolven (BSW's) BBB-afbraak binnen een beperkt tijdsbestek. Om de precieze volgorde van BBB-afbraak te bepalen, werden Evans-blauw en fluoresceïne-isothiocyanaat-dextran intravasculair en intracardiaal geïnjecteerd in muizen op verschillende tijdstippen ten opzichte van BSW-blootstelling. De verdeling van kleurstoffluorescentie in hersenplakjes werd vervolgens geregistreerd. Verschillen in de verdeling en intensiteit tussen de twee kleurstoffen onthulden de spatiotemporele sequentie van BBB-afbraak. Immunokleuring van de hersenplakjes toonde aan dat astrocytaire en microgliale responsen correleerden met de plaatsen van BBB-afbraak. Dit protocol heeft een breed potentieel voor toepassing in studies met verschillende BBB-afbraakmodellen.
Inleiding
Afbraak en disfunctie van de bloed-hersenbarrière (BBB) worden veroorzaakt door systemische ontstekingen, infecties, auto-immuunziekten, verwondingen en neurodegeneratieve ziekten1. Bij licht traumatisch hersenletsel (mTBI) als gevolg van blootstelling aan door ontploffing geïnduceerde schokgolven (BSW's), is een significante correlatie waargenomen tussen de intensiteit van BSW's en de hoeveelheid lekkage van fluorescerende kleurstof als gevolg van BBB-afbraak 2,3,4. Een opmerkelijk kenmerk van BBB-afbraak bij mTBI is dat het onmiddellijk of binnen een paar uur na blootstelling aan BSW's begint en meestal een voorbijgaand proces is dat ongeveer een week duurt voordat vertraagde, chronische neurologische aandoeningen optreden 3,5,6,7. Hoewel de details onduidelijk blijven, maakt BBB-afbraak deel uit van de langdurige pathologische cascade en kan het ook dienen als een prognostische factor bij mTBI6. Daarom is het belangrijk om de ruimtelijke en temporele verdelingen van BBB-afbraak in de hersenen te begrijpen.
Fluorescerende kleurstoffen worden gebruikt om de mate van BBB-afbraak 3,8 te bepalen. Omdat de bloedconcentratie van de kleurstoffen en de omvang en omvang van de BBB-afbraak in de loop van de tijd veranderen, is voorzichtigheid geboden bij het interpreteren van afbeeldingen van kleurstofextravasatie. De afwezigheid van extravasatie van kleurstoffen betekent bijvoorbeeld niet noodzakelijkerwijs de afwezigheid van BBB-afbraak. Er kan geen BBB-afbraak worden gedetecteerd voor of na een verhoging van de bloedconcentratie van de kleurstof. Zelfs als de kleurstof zich met succes heeft opgehoopt waar BBB-afbraak optrad, kan deze in de loop van de tijd verloren zijn gegaan nadat de afbraak was gestopt. Over het algemeen worden in water oplosbare en biologisch inerte stoffen snel uitgescheiden in de urine9. Om te bepalen of BBB-afbraak op een bepaald tijdstip optreedt, worden daarom de meest betrouwbare resultaten verkregen wanneer een fluorescerende kleurstof gedurende een korte periode onmiddellijk vóór het fixeren van het dier in de bloedbaan wordt toegediend. In de handel verkrijgbaar fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran met een specifiek molecuulgewicht moet op deze manier worden gebruikt.
Evans blue is een algemeen erkende blauwe azokleurstof met een sterke affiniteit voor serumalbumine. De kleurstof vertoont rode fluorescentie wanneer deze wordt opgewekt door groen licht in biologische systemen2. Vanwege zijn inerte aard blijft het Evans blue-serum albuminecomplex tot 2 uur in het bloed, waardoor het een nuttige 69 kDa-tracer is voor het labelen van regio's met een gecompromitteerde BBB voor ten minste deze duur10,11. Daarom is het belangrijk om rekening te houden met mogelijke onzekerheden rond de farmacokinetiek en toxiciteit van Evans blue9. Een recente studie toonde echter aan dat Evans-blauw zich blijft ophopen in gebieden waar de BBB afwezig of verstoord is7. Deze functie stelde Evans Blue in staat om de geschiedenis van de BBB-storing vast te leggen, terwijl FITC-dextran werd gebruikt om de BBB-storing op een specifiek tijdstip na de BSW-blootstelling op te nemen. Hoewel Evans blue intraveneus of intraperitoneaal kan worden toegediend10, heeft intraveneuze toediening de voorkeur voor tijdgevoelige experimenten. Deze studie had tot doel het gebruik van Evans blue en FITC-dextran aan te tonen om de spatiotemporele verdeling van BBB-afbraak na blootstelling aan BSW te detecteren.
Ten tweede presenteerde de studie een techniek voor het bevriezen van hersenplakjes na het observeren van de fluorescentie van BBB-afbraak en het bereiden van dunnere plakjes die geschikt zijn voor immunohistochemische procedures. Het gebruik van glycerol als montagemedium en cryoprotectant vereenvoudigt het immunohistochemieproces. Door beelden van BBB-afbraak te vergelijken met die uit de immunohistochemie, kan de spatiotemporele verdeling van BBB-afbraak worden gecorreleerd met de weefselrespons van hetzelfde monster.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische richtlijnen voor dierproeven die zijn opgesteld door het National Defense Medical College (Tokorozawa, Japan). Het onderzoeksprotocol werd goedgekeurd door het Comité voor Dieronderzoek van het National Defense Medical College (goedkeuring nr. 23011-1). Mannelijke C57BL/6J-muizen van 8 weken oud en met een gewicht van 19-23 g werden in dit onderzoek gebruikt. Zoals geïllustreerd in figuur 1, werden een enkele Evans blue-injectie en FITC-dextran-perfusie uitgevoerd op verschillende tijdstippen in relatie tot een enkele BSW-blootstelling. Details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Anesthesie
OPMERKING: Dit is een aangepast protocol dat de hoeveelheid medetomidine met 2,5 keer verhoogt in vergelijking met het oorspronkelijke protocol12. De doseringen voor medetomidinehydrochloride, midazolam en butorfanol waren respectievelijk 0,75 mg/kg, 4 mg/kg en 5 mg/kg.
- Bereid een mengsel van medetomidinehydrochloride (75 μg/ml), midazolam (400 μg/ml) en butorfanol (500 μg/ml) in fysiologische zoutoplossing.
- Dien het mengsel intraperitoneaal toe om de muis te verdoven (10 μL/g)13.
- Controleer na ongeveer 5-10 minuten of er voldoende anesthesie is door het ontbreken van staartknijp- en pedaalterugtrekkingsreflexen te observeren.
- Houd de muis warm totdat hij herstelt van de effecten van anesthesie.
2. Blootstelling aan BSW
OPMERKING: In dit onderzoek is een interne schokdemper gebruikt14.
- Verdoof de muis zoals beschreven in stap 1.
- Plaats de muis op 5 cm afstand van het uitgangsuiteinde van de schokdemper en zorg ervoor dat de lichaamsas evenwijdig is aan, maar niet uitgelijnd met de as van de buis.
- Lever een enkele BSW-belichting met een piekoverdruk van 25 kPa aan het hoofd.
NOTITIE: Houd de muis warm totdat hij herstelt van de effecten van anesthesie. Controleer regelmatig de toestand van de behandelde muis. Als tekenen van angst, zoals moeite met eten of drinken, voorovergebogen of langdurig abnormaal uiterlijk zonder tekenen van herstel, worden waargenomen, euthanaseer de muis en beëindig het experiment voortijdig. Vermijd het toedienen van pijnstillers, omdat deze mogelijk de gliarespons kunnen beïnvloeden.
3. Evans blauwe injectie in de staartader
OPMERKING: Evans blue solution moet intraveneus worden toegediend zonder verdoving. In aanwezigheid van anesthesie dringt de kleurstof vaak niet voldoende door in het lichaam, waarschijnlijk als gevolg van een verlaagde bloeddruk en lichaamstemperatuur13. Evans blue werd toegediend in een dosis van 100 mg/kg.
- Bereid de Evans blauwe oplossing (4% w/v in zoutoplossing) in een microbuisje, draai het vervolgens en bewaar het in het donker voor gebruik.
- Injecteer de oplossing in de staartader (2,5 μL/g)13.
4. Transcardiale perfusie met FITC-dextran oplossing en fixatie
- Voeg heparine toe aan fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om een concentratie van 1 E/ml te verkrijgen en voeg vervolgens FITC-dextran toe aan de gehepariniseerde PBS om een concentratie van 3 mg/ml te bereiken.
- Los het FITC-dextran poeder volledig op voor gebruik. Om dit te doen, schudt u de oplossing voorzichtig gedurende 30 minuten of langer. Controleer voor gebruik zorgvuldig op onopgelost FITC-dextran poeder. Als er iets achterblijft, blijf dan schudden totdat het volledig is opgelost.
- Verdoof de muis zoals beschreven in stap 1.
- Ga verder met het standaard perfusiefixatieprotocol met behulp van een peristaltische pomp15,16. Eerst perfuseren met gehepariniseerde PBS die FITC-dextran bevat gedurende 2 minuten met een snelheid van 4,0 ml/min. Verfuseer vervolgens met 10% formalineneutrale bufferoplossing of 4% paraformaldehyde-PBS gedurende 2 minuten met een snelheid van 4,0 ml/min, gevolgd door 8 minuten met een snelheid van 3,5 ml/min.
- Verwijder de hersenen voorzichtig met een chirurgische schaar en een pincet 15,16. Na dissectie fixeren de hersenen een nacht in hetzelfde fixeermiddel (d.w.z. 10% formalineneutrale bufferoplossing of 4% paraformaldehyde-PBS) bij 4 °C.
- Vervang de volgende dag het fixeermiddel door PBS.
5. Verwerking van hersenweefsel
OPMERKING: Zelfs als de perfusiefixatie is voltooid, kunnen Evans blue en FITC-dextran zich in de buffer verspreiden. Daarom moeten de procedures die leiden tot stap 6.8 binnen een week na perfusiefixatie worden voltooid. Stel het monster bovendien niet bloot aan licht.
- Bereid een plaat met 24 putjes voor met 500 μL 20% glycerol in fosfaatbuffer (PB; pH 7,4) in elk putje.
- Snijd met behulp van een hersensnijder de hersenen coronaal in 12 plakjes van elk 1 mm dik.
- Breng elk plakje over in het overeenkomstige kuiltje van de plaat met 24 putjes en bewaar het gedurende ten minste 2 uur bij 4 °C.
- Vervang de oplossing door 50% glycerol-PB en bewaar deze minimaal 2 uur bij 4 °C.
- Vervang ten slotte de oplossing door 100% glycerol. Voor onmiddellijke microscopische waarneming laat u de plakjes minstens 2 uur bij kamertemperatuur staan of bewaart u ze bij 4 °C. De plakjes zijn nu doorschijnend en klaar voor microscopische observatie.
6. Fluorescentiemeting van kleurstofextravasatie
OPMERKING: De efficiëntie van fluorescentielabels varieert van muis tot muis. Daarom moet de fluorescentie-intensiteit worden genormaliseerd. Fluorescentiewaarden worden uitgedrukt ten opzichte van die in de gigantocellulaire reticulaire kern (GRN) omdat dit gebied minimaal wordt beïnvloed door BSW-behandeling.
- Voeg 500 μL glycerol toe aan de bodem van een schaaltje met glazen bodem van 35 mm.
- Breng het plakje over naar de glyceroloplossing en bedek het oppervlak met een dekglas.
- Verwijder overtollige glycerol van de rand van het dekglas.
- Meet de fluorescentie-intensiteit van de plak onder een fluorescentiemicroscoop.
- Na microscopische meting plaatst u het plakje terug in het putje.
- Herhaal de meting voor alle 12 plakjes.
- Voeg 500 μL PB toe aan elk putje en bewaar de plaat met 24 putjes een nacht bij 4 °C; de volgende dag zijn de plakjes verzadigd met 50% glycerol-PB.
- Vervang de oplossing door 30% glycerol-PB en bewaar deze minimaal 2 uur bij 4 °C.
- Voer de procedures in stap 7 binnen enkele weken uit.
7. Cryosectie en immunohistochemie
- Bereid een plaat met 24 putjes voor door 1000 μL van een mengsel van gelijke volumes tissuevriesmedium en 30% glycerol-PB toe te voegen aan putje 1. Voeg vervolgens 1000 μL tissuevriesmedium toe aan put 2.
- Breng de plak over naar kuil 1 en schud de plaat gedurende 1 uur op 4 °C.
- Breng de plak over naar kuil 2 en schud de plaat gedurende 1 uur op 4 °C.
- Vries de plak snel in met isopentaan met behulp van droogijs en zorg ervoor dat u de plak niet buigt. Bewaar de plakjes bij -80 °C tot cryosectie.
- Cryosectie de plak tot een dikte van 6 μm. Bewaar de secties na droging op het microscoopglaasje bij -80 °C.
- Dompel voor het ophalen van antigeen17 de secties onder in 10 mM natriumcitraat (pH 6,0), verwarm eenmaal tot 100 °C en houd ze vervolgens gedurende 1 uur op 98 °C.
- Was de secties uitgebreid in gedestilleerd water. De coupes zijn nu klaar voor immunohistochemische kleuring.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1A toont het tijdsverloop van de kleurstofinjectie in relatie tot het begin van BSW, met een piekoverdruk van 25 kPa. In het 'Post'-protocol werd Evans blauwe oplossing intravasculair toegediend 2 uur vóór FITC-dextranperfusie, die 6 uur, 1 dag, 3 dagen en 7 dagen na blootstelling aan BSW werd uitgevoerd. In het 'Pre'-protocol werd Evans blauwe oplossing onmiddellijk voor blootstelling aan BSW geïnjecteerd. In het 'Post'-protocol wordt verwacht dat de...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een nieuwe techniek voor dubbele labeling met behulp van Evans blue en FITC-dextran werd gebruikt om de precieze spatiotemporele verdeling van BBB-afbraak in een enkel brein nauwkeurig te visualiseren. In het BSW-model met lage intensiteit werden merkbare variaties in de mate, locatie en mate van kleurstofextravasatie waargenomen in onderzochte hersenen (Figuur 2 en Figuur 3). Mismatches tussen kleurstoffen toonden aan dat de BB...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken Mayumi Watanabe voor de cryosectietechniek. Dit werk werd ondersteund door een Advanced Research on Military Medicine-subsidie van het Ministerie van Defensie, Japan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10% Formalin Neutral Buffer Solution | FUJIFILM Wako Chemicals | 062-01661 | |
| Anti GFAP, Rabbit | DAKO-Agilent | IR524 | |
| Anti Iba1, Rabbit | FUJIFILM Wako Chemicals | 019-19741 | |
| Chicken anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21200 | |
| Cryo Mount | Muto Pure Chemicals | 33351 | weefselbevriezingsmedium |
| Domitor | Orion Corporation | medetomidine | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| Falcon 24-well Polystyrene Clear Flat Bottom Not Treated Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile, 50/Case | CORNING | 351147 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran gemiddeld mol wt 40.000 | Sigma-Aldrich | FD40S | FITC-dextran |
| Glass Base Dish 27mm (No.1 Glass) | AGC TECHNO GLASS | 3910-035 | 35 mm glazen bodemschaal |
| IX83 Inverted Microscope | OLYMPUS | ||
| MAS Hydrophilic Adhesion Microscope Slides | Matsunami Glass | MAS-04 | |
| Matsunami Cover Glass (No.1) 18 x 18mm | Matsunami Glass | C018181 | |
| Midazolam Injection 10mg [SANDOZ] | Sandoz | ||
| Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DAC | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Peristaltic Pump | ATTO | SJ-1211 II-H | |
| RODENT BRAIN MATRIX Adult Mouse, 30 g, Coronal | ASI INSTRUMENTS | RBM-2000C | hersenslicer |
| Vetorphale | Meiji Animal Health | VETLI5 | butorphanol |
Referenties
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: From physiology to disease and back. Physiol Rev. 99 (1), 21-78 (2019).
- Kabu, S., et al. Blast-associated shock waves result in increased brain vascular leakage and elevated ros levels in a rat model of traumatic brain injury. PLoS One. 10 (5), e0127971(2015).
- Kuriakose, M., Rama Rao, K. V., Younger, D., Chandra, N. Temporal and spatial effects of blast overpressure on blood-brain barrier permeability in traumatic brain injury. Sci Rep. 8 (1), 8681(2018).
- Yeoh, S., Bell, E. D., Monson, K. L. Distribution of blood-brain barrier disruption in primary blast injury. Ann Biomed Eng. 41 (10), 2206-2214 (2013).
- Readnower, R. D., et al. Increase in blood-brain barrier permeability, oxidative stress, and activated microglia in a rat model of blast-induced traumatic brain injury. J Neurosci Res. 88 (16), 3530-3539 (2010).
- Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood-brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Front Cell Neurosci. 8, 232(2014).
- Nishii, K., et al. Evans blue and fluorescein isothiocyanate-dextran double labeling reveals the precise sequence of vascular leakage and glial responses after exposure to mild-level blast-associated shock waves. J Neurotrauma. 40 (11-12), 1228-1242 (2023).
- Hoffmann, A., et al. High and low molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextrans to assess blood-brain barrier disruption: Technical considerations. Transl Stroke Res. 2 (1), 106-111 (2011).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Møllgård, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Front Neurosci. 9, 385(2015).
- Manaenko, A., Chen, H., Kammer, J., Zhang, J. H., Tang, J. Comparison Evans blue injection routes: Intravenous versus intraperitoneal, for measurement of blood-brain barrier in a mice hemorrhage model. J Neurosci Methods. 195 (2), 206-210 (2011).
- Yen, L. F., Wei, V. C., Kuo, E. Y., Lai, T. W. Distinct patterns of cerebral extravasation by Evans blue and sodium fluorescein in rats. PLoS One. 8 (7), e68595(2013).
- Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. 67, e2771(2012).
- Satoh, Y., et al. Molecular hydrogen prevents social deficits and depression-like behaviors induced by low-intensity blast in mice. J Neuropathol Exp Neurol. 77 (9), 827-836 (2018).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65, e3564(2012).
- Selever, J., Kong, J. Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. 53, e2807(2011).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Nagaraja, T. N., Keenan, K. A., Fenstermacher, J. D., Knight, R. A. Acute leakage patterns of fluorescent plasma flow markers after transient focal cerebral ischemia suggest large openings in blood-brain barrier. Microcirculation. 15 (1), 1-14 (2010).
- Xu, Y., et al. Quantifying blood-brain-barrier leakage using a combination of Evans blue and high molecular weight fitc-dextran. J Neurosci Methods. 325, 108349(2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
