Methodenartikel

Evaluatie van de afbraak van de bloed-hersenbarrière in een muismodel van licht traumatisch hersenletsel

DOI:

10.3791/66653

⸱

18 oktober 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, National Defense Medical College, 2Department of Pharmacology, National Defense Medical College, 3Department of Biochemistry, National Defense Medical College

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is een methode ontwikkeld om kleurstofextravasatie als gevolg van afbraak van de bloed-hersenbarrière (BBB) te visualiseren door twee fluorescerende kleurstoffen op verschillende tijdstippen aan muizen toe te dienen. Het gebruik van glycerol als cryoprotectant vergemakkelijkte immunohistochemie op hetzelfde monster.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescerende kleurstoffen worden gebruikt om de mate van kleurstofextravasatie te bepalen die optreedt als gevolg van afbraak van de bloed-hersenbarrière (BBB). Labelen met deze kleurstoffen is een complex proces dat wordt beïnvloed door verschillende factoren, zoals de concentratie van kleurstoffen in het bloed, de doorlaatbaarheid van hersenvaten, de duur van de extravasatie van de kleurstof en de vermindering van de kleurstofconcentratie in het weefsel als gevolg van afbraak en diffusie. In een model voor licht traumatisch hersenletsel veroorzaakt blootstelling aan door ontploffing veroorzaakte schokgolven (BSW's) BBB-afbraak binnen een beperkt tijdsbestek. Om de precieze volgorde van BBB-afbraak te bepalen, werden Evans-blauw en fluoresceïne-isothiocyanaat-dextran intravasculair en intracardiaal geïnjecteerd in muizen op verschillende tijdstippen ten opzichte van BSW-blootstelling. De verdeling van kleurstoffluorescentie in hersenplakjes werd vervolgens geregistreerd. Verschillen in de verdeling en intensiteit tussen de twee kleurstoffen onthulden de spatiotemporele sequentie van BBB-afbraak. Immunokleuring van de hersenplakjes toonde aan dat astrocytaire en microgliale responsen correleerden met de plaatsen van BBB-afbraak. Dit protocol heeft een breed potentieel voor toepassing in studies met verschillende BBB-afbraakmodellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Afbraak en disfunctie van de bloed-hersenbarrière (BBB) worden veroorzaakt door systemische ontstekingen, infecties, auto-immuunziekten, verwondingen en neurodegeneratieve ziekten1. Bij licht traumatisch hersenletsel (mTBI) als gevolg van blootstelling aan door ontploffing geïnduceerde schokgolven (BSW's), is een significante correlatie waargenomen tussen de intensiteit van BSW's en de hoeveelheid lekkage van fluorescerende kleurstof als gevolg van BBB-afbraak 2,3,4. Een opmerkelijk kenmerk van BBB-afbraak bij mTBI is dat het onmiddellijk of binnen een paar uur na blootstelling aan BSW's begint en meestal een voorbijgaand proces is dat ongeveer een week duurt voordat vertraagde, chronische neurologische aandoeningen optreden 3,5,6,7. Hoewel de details onduidelijk blijven, maakt BBB-afbraak deel uit van de langdurige pathologische cascade en kan het ook dienen als een prognostische factor bij mTBI6. Daarom is het belangrijk om de ruimtelijke en temporele verdelingen van BBB-afbraak in de hersenen te begrijpen.

Fluorescerende kleurstoffen worden gebruikt om de mate van BBB-afbraak 3,8 te bepalen. Omdat de bloedconcentratie van de kleurstoffen en de omvang en omvang van de BBB-afbraak in de loop van de tijd veranderen, is voorzichtigheid geboden bij het interpreteren van afbeeldingen van kleurstofextravasatie. De afwezigheid van extravasatie van kleurstoffen betekent bijvoorbeeld niet noodzakelijkerwijs de afwezigheid van BBB-afbraak. Er kan geen BBB-afbraak worden gedetecteerd voor of na een verhoging van de bloedconcentratie van de kleurstof. Zelfs als de kleurstof zich met succes heeft opgehoopt waar BBB-afbraak optrad, kan deze in de loop van de tijd verloren zijn gegaan nadat de afbraak was gestopt. Over het algemeen worden in water oplosbare en biologisch inerte stoffen snel uitgescheiden in de urine9. Om te bepalen of BBB-afbraak op een bepaald tijdstip optreedt, worden daarom de meest betrouwbare resultaten verkregen wanneer een fluorescerende kleurstof gedurende een korte periode onmiddellijk vóór het fixeren van het dier in de bloedbaan wordt toegediend. In de handel verkrijgbaar fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran met een specifiek molecuulgewicht moet op deze manier worden gebruikt.

Evans blue is een algemeen erkende blauwe azokleurstof met een sterke affiniteit voor serumalbumine. De kleurstof vertoont rode fluorescentie wanneer deze wordt opgewekt door groen licht in biologische systemen2. Vanwege zijn inerte aard blijft het Evans blue-serum albuminecomplex tot 2 uur in het bloed, waardoor het een nuttige 69 kDa-tracer is voor het labelen van regio's met een gecompromitteerde BBB voor ten minste deze duur10,11. Daarom is het belangrijk om rekening te houden met mogelijke onzekerheden rond de farmacokinetiek en toxiciteit van Evans blue9. Een recente studie toonde echter aan dat Evans-blauw zich blijft ophopen in gebieden waar de BBB afwezig of verstoord is7. Deze functie stelde Evans Blue in staat om de geschiedenis van de BBB-storing vast te leggen, terwijl FITC-dextran werd gebruikt om de BBB-storing op een specifiek tijdstip na de BSW-blootstelling op te nemen. Hoewel Evans blue intraveneus of intraperitoneaal kan worden toegediend10, heeft intraveneuze toediening de voorkeur voor tijdgevoelige experimenten. Deze studie had tot doel het gebruik van Evans blue en FITC-dextran aan te tonen om de spatiotemporele verdeling van BBB-afbraak na blootstelling aan BSW te detecteren.

Ten tweede presenteerde de studie een techniek voor het bevriezen van hersenplakjes na het observeren van de fluorescentie van BBB-afbraak en het bereiden van dunnere plakjes die geschikt zijn voor immunohistochemische procedures. Het gebruik van glycerol als montagemedium en cryoprotectant vereenvoudigt het immunohistochemieproces. Door beelden van BBB-afbraak te vergelijken met die uit de immunohistochemie, kan de spatiotemporele verdeling van BBB-afbraak worden gecorreleerd met de weefselrespons van hetzelfde monster.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische richtlijnen voor dierproeven die zijn opgesteld door het National Defense Medical College (Tokorozawa, Japan). Het onderzoeksprotocol werd goedgekeurd door het Comité voor Dieronderzoek van het National Defense Medical College (goedkeuring nr. 23011-1). Mannelijke C57BL/6J-muizen van 8 weken oud en met een gewicht van 19-23 g werden in dit onderzoek gebruikt. Zoals geïllustreerd in figuur 1, werden een enkele Evans blue-injectie en FITC-dextran-perfusie uitgevoerd op verschillende tijdstippen in relatie tot een enkele BSW-blootstelling. Details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Anesthesie

OPMERKING: Dit is een aangepast protocol dat de hoeveelheid medetomidine met 2,5 keer verhoogt in vergelijking met het oorspronkelijke protocol12. De doseringen voor medetomidinehydrochloride, midazolam en butorfanol waren respectievelijk 0,75 mg/kg, 4 mg/kg en 5 mg/kg.

  1. Bereid een mengsel van medetomidinehydrochloride (75 μg/ml), midazolam (400 μg/ml) en butorfanol (500 μg/ml) in fysiologische zoutoplossing.
  2. Dien het mengsel intraperitoneaal toe om de muis te verdoven (10 μL/g)13.
  3. Controleer na ongeveer 5-10 minuten of er voldoende anesthesie is door het ontbreken van staartknijp- en pedaalterugtrekkingsreflexen te observeren.
  4. Houd de muis warm totdat hij herstelt van de effecten van anesthesie.

2. Blootstelling aan BSW

OPMERKING: In dit onderzoek is een interne schokdemper gebruikt14.

  1. Verdoof de muis zoals beschreven in stap 1.
  2. Plaats de muis op 5 cm afstand van het uitgangsuiteinde van de schokdemper en zorg ervoor dat de lichaamsas evenwijdig is aan, maar niet uitgelijnd met de as van de buis.
  3. Lever een enkele BSW-belichting met een piekoverdruk van 25 kPa aan het hoofd.
    NOTITIE: Houd de muis warm totdat hij herstelt van de effecten van anesthesie. Controleer regelmatig de toestand van de behandelde muis. Als tekenen van angst, zoals moeite met eten of drinken, voorovergebogen of langdurig abnormaal uiterlijk zonder tekenen van herstel, worden waargenomen, euthanaseer de muis en beëindig het experiment voortijdig. Vermijd het toedienen van pijnstillers, omdat deze mogelijk de gliarespons kunnen beïnvloeden.

3. Evans blauwe injectie in de staartader

OPMERKING: Evans blue solution moet intraveneus worden toegediend zonder verdoving. In aanwezigheid van anesthesie dringt de kleurstof vaak niet voldoende door in het lichaam, waarschijnlijk als gevolg van een verlaagde bloeddruk en lichaamstemperatuur13. Evans blue werd toegediend in een dosis van 100 mg/kg.

  1. Bereid de Evans blauwe oplossing (4% w/v in zoutoplossing) in een microbuisje, draai het vervolgens en bewaar het in het donker voor gebruik.
  2. Injecteer de oplossing in de staartader (2,5 μL/g)13.

4. Transcardiale perfusie met FITC-dextran oplossing en fixatie

  1. Voeg heparine toe aan fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om een concentratie van 1 E/ml te verkrijgen en voeg vervolgens FITC-dextran toe aan de gehepariniseerde PBS om een concentratie van 3 mg/ml te bereiken.
  2. Los het FITC-dextran poeder volledig op voor gebruik. Om dit te doen, schudt u de oplossing voorzichtig gedurende 30 minuten of langer. Controleer voor gebruik zorgvuldig op onopgelost FITC-dextran poeder. Als er iets achterblijft, blijf dan schudden totdat het volledig is opgelost.
  3. Verdoof de muis zoals beschreven in stap 1.
  4. Ga verder met het standaard perfusiefixatieprotocol met behulp van een peristaltische pomp15,16. Eerst perfuseren met gehepariniseerde PBS die FITC-dextran bevat gedurende 2 minuten met een snelheid van 4,0 ml/min. Verfuseer vervolgens met 10% formalineneutrale bufferoplossing of 4% paraformaldehyde-PBS gedurende 2 minuten met een snelheid van 4,0 ml/min, gevolgd door 8 minuten met een snelheid van 3,5 ml/min.
  5. Verwijder de hersenen voorzichtig met een chirurgische schaar en een pincet 15,16. Na dissectie fixeren de hersenen een nacht in hetzelfde fixeermiddel (d.w.z. 10% formalineneutrale bufferoplossing of 4% paraformaldehyde-PBS) bij 4 °C.
  6. Vervang de volgende dag het fixeermiddel door PBS.

5. Verwerking van hersenweefsel

OPMERKING: Zelfs als de perfusiefixatie is voltooid, kunnen Evans blue en FITC-dextran zich in de buffer verspreiden. Daarom moeten de procedures die leiden tot stap 6.8 binnen een week na perfusiefixatie worden voltooid. Stel het monster bovendien niet bloot aan licht.

  1. Bereid een plaat met 24 putjes voor met 500 μL 20% glycerol in fosfaatbuffer (PB; pH 7,4) in elk putje.
  2. Snijd met behulp van een hersensnijder de hersenen coronaal in 12 plakjes van elk 1 mm dik.
  3. Breng elk plakje over in het overeenkomstige kuiltje van de plaat met 24 putjes en bewaar het gedurende ten minste 2 uur bij 4 °C.
  4. Vervang de oplossing door 50% glycerol-PB en bewaar deze minimaal 2 uur bij 4 °C.
  5. Vervang ten slotte de oplossing door 100% glycerol. Voor onmiddellijke microscopische waarneming laat u de plakjes minstens 2 uur bij kamertemperatuur staan of bewaart u ze bij 4 °C. De plakjes zijn nu doorschijnend en klaar voor microscopische observatie.

6. Fluorescentiemeting van kleurstofextravasatie

OPMERKING: De efficiëntie van fluorescentielabels varieert van muis tot muis. Daarom moet de fluorescentie-intensiteit worden genormaliseerd. Fluorescentiewaarden worden uitgedrukt ten opzichte van die in de gigantocellulaire reticulaire kern (GRN) omdat dit gebied minimaal wordt beïnvloed door BSW-behandeling.

  1. Voeg 500 μL glycerol toe aan de bodem van een schaaltje met glazen bodem van 35 mm.
  2. Breng het plakje over naar de glyceroloplossing en bedek het oppervlak met een dekglas.
  3. Verwijder overtollige glycerol van de rand van het dekglas.
  4. Meet de fluorescentie-intensiteit van de plak onder een fluorescentiemicroscoop.
  5. Na microscopische meting plaatst u het plakje terug in het putje.
  6. Herhaal de meting voor alle 12 plakjes.
  7. Voeg 500 μL PB toe aan elk putje en bewaar de plaat met 24 putjes een nacht bij 4 °C; de volgende dag zijn de plakjes verzadigd met 50% glycerol-PB.
  8. Vervang de oplossing door 30% glycerol-PB en bewaar deze minimaal 2 uur bij 4 °C.
  9. Voer de procedures in stap 7 binnen enkele weken uit.

7. Cryosectie en immunohistochemie

  1. Bereid een plaat met 24 putjes voor door 1000 μL van een mengsel van gelijke volumes tissuevriesmedium en 30% glycerol-PB toe te voegen aan putje 1. Voeg vervolgens 1000 μL tissuevriesmedium toe aan put 2.
  2. Breng de plak over naar kuil 1 en schud de plaat gedurende 1 uur op 4 °C.
  3. Breng de plak over naar kuil 2 en schud de plaat gedurende 1 uur op 4 °C.
  4. Vries de plak snel in met isopentaan met behulp van droogijs en zorg ervoor dat u de plak niet buigt. Bewaar de plakjes bij -80 °C tot cryosectie.
  5. Cryosectie de plak tot een dikte van 6 μm. Bewaar de secties na droging op het microscoopglaasje bij -80 °C.
  6. Dompel voor het ophalen van antigeen17 de secties onder in 10 mM natriumcitraat (pH 6,0), verwarm eenmaal tot 100 °C en houd ze vervolgens gedurende 1 uur op 98 °C.
  7. Was de secties uitgebreid in gedestilleerd water. De coupes zijn nu klaar voor immunohistochemische kleuring.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1A toont het tijdsverloop van de kleurstofinjectie in relatie tot het begin van BSW, met een piekoverdruk van 25 kPa. In het 'Post'-protocol werd Evans blauwe oplossing intravasculair toegediend 2 uur vóór FITC-dextranperfusie, die 6 uur, 1 dag, 3 dagen en 7 dagen na blootstelling aan BSW werd uitgevoerd. In het 'Pre'-protocol werd Evans blauwe oplossing onmiddellijk voor blootstelling aan BSW geïnjecteerd. In het 'Post'-protocol wordt verwacht dat de concentratie van Evans-blauw ongeveer 2 uur vóór perfusiefixatie zijn maximum zal bereiken, terwijl in het 'Pre'-protocol wordt verwacht dat deze zijn maximum zal bereiken rond de tijd van blootstelling aan BSW (Figuur 1B). De concentratie van FITC-dextran in de hersenbloedvaten werd tijdens de perfusie gedurende 2 minuten constant gehouden.

Evans blauwe etikettering toonde aan dat de BBB-afbraak binnen 6 uur begon en doorging tot 7 dagen na blootstelling aan BSW (Figuur 2A). Met name BBB-afbraak trad niet onmiddellijk na blootstelling aan BSW op, aangezien er geen Evans-extravasatie van blauwe kleurstof was na 3 uur in het 'Pre'-protocol (Figuur 2B). Verrassend genoeg gaf langdurige etikettering met Evans-blauw het cumulatieve karakter ervan aan in het 'Pre'-protocol (Figuur 2B)7.

Het gebruik van twee verschillende kleurstoffen, elk geïntroduceerd met tussenpozen van 2 uur of meer, maakte het mogelijk om temporele veranderingen in de BBB-integriteit te onderzoeken door hun verdeling te vergelijken. Figuur 3 toont fluorescentiebeelden van de plakjes die een significant verschil vertoonden in de verdeling van Evans-blauw en FITC-dextran.

Er werden talrijke fluorescentie-hotspots van verschillende groottes waargenomen. Hoewel sommige hotspots helder genoeg waren om tot de top 0,1% van de pixels te behoren, waren veel hotspots slechts iets helderder dan de omringende weefsels. De discrepantie tussen de kleurstoffen suggereert dat er binnen dit interval veranderingen zijn opgetreden. Hotspots die alleen Evans blauwe fluorescentie vertoonden, duidden op een voortdurende BBB-afbraak op het moment van Evans blauwe injectie, die later werd gerepareerd door de FITC-dextran injectie. Daarentegen suggereerden hotspots die alleen FITC-dextran-fluorescentie vertoonden dat BBB-verstoring optrad tussen de twee kleurstofinjecties. Ten slotte duidden hotspots die fluorescentie van beide kleurstoffen vertoonden op een continue BBB-afbraak gedurende de gehele injectieperiode.

Figuur 4A toont het aantal hotspots dat positief is voor Evans blue (inclusief zowel Evans blue-only als Evans blue/FITC-dextran dubbel-positieve hotspots), FITC-dextran (inclusief zowel FITC-dextran-only als Evans blue/FITC-dextran dubbel-positieve hotspots) of beide kleurstoffen (alleen Evans blue/FITC-dextran dubbel-positieve hotspots). In het 'Pre'-protocol werden om 3 uur talrijke FITC-dextran-only hotspots waargenomen. Om 6 uur en 1 dag in het 'Post'-protocol werden zowel Evans blue-only als FITC-dextran-only hotspots gedetecteerd. Met 3 dagen en 7 dagen in het 'Post'-protocol waren de hotspots echter overwegend positief voor beide kleurstoffen. Deze bevindingen suggereren dat de BBB-afbraak plaatsvond om 3 uur, na 1 dag werd geremodelleerd en aanhield tot 7 dagen na blootstelling aan BSW (Figuur 4B). Belangrijk is dat de omvang van de BBB-afbraak de neiging had om met 7 dagen af te nemen, zoals eerder vermeld.

Na voltooiing van de experimenten met kleurstofextravasatie werd immunohistochemische kleuring van de plakjes uitgevoerd7. De immunohistochemische beeldscans werden consequent vergeleken met die van de kleurstofextravasaties, wat bevestigde dat het carry-over-effect van de fluorescerende stoffen praktisch verwaarloosbaar was7. Zoals te zien is in figuur 5, waren clusters van reactieve astrocyten nauw verbonden met plaatsen van BBB-afbraak. Verdere waarnemingen toonden aan dat geactiveerde en amoeboïde microglia 3 dagen na blootstelling aan BSW aanwezig waren naast reactieve astrocyten.

figure-results-1
Figuur 1: Experimenteel ontwerp. (A) Tijdsverloop van het experiment. Evans blauwe oplossing werd intraveneus geïnjecteerd na ('Post'-protocol) of onmiddellijk vóór ('Pre'-protocol) BSW-blootstelling, terwijl FITC-dextran gedurende 2 minuten transcardiaal werd geperfundeerd voordat het werd gefixeerd. (B) Verwachte concentraties van Evans blue en FITC-dextran in de bloedvaten in respectievelijk de 'Post'- en 'Pre'-protocollen. BSW, door ontploffing veroorzaakte schokgolven; FITC, fluoresceïne-isothiocyanaat. Deze figuur is een bewerking van Nishii et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Vergelijking van de fluorescentie-intensiteit in hersenschijfjes. De fluorescentie-intensiteit van de helderste 0,1% van de pixels in de hersenen werd beoordeeld over alle 12 plakjes en vergeleken tussen de 'Post' (A) en 'Pre' (B) omstandigheden. De variabiliteit en significantie van de verschillen worden aangegeven. xxx geeft p < 0,001 aan; xxxx staat voor p < 0,0001 (p-waarden van de F-test). *p < 0,05; p < 0,0001 (analyse van variantie met de post hoc-test van meervoudige vergelijkingen van Dunnett). Deze figuur is een bewerking van Nishii et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: BBB-uitsplitsing waargenomen op verschillende tijdstippen met behulp van dubbele labeling met Evans blue en FITC-dextran. Evans blauw (magenta), FITC-dextran (groen) en samengevoegde afbeeldingen worden getoond. De protocollen voor het injecteren van kleurstoffen worden aan de linkerkant gepresenteerd. Sommige hotspots vertoonden een overheersende fluorescentie van Evans blauw (pijl) of FITC-dextran (pijlpunten). Sterretjes geven de plexus choroid en de bijbehorende bloedvaten aan. BBB, bloed-hersenbarrière; FITC, fluoresceïne-isothiocyanaat; CVO, circumventriculaire organen van het derde ventrikel. Schaal staafje: 1 mm. Deze figuur is een bewerking van Nishii et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Kwantificering van de fluorescentie-hotspots. (A) Nummers van de hotspots die positief zijn voor Evans blauw (magenta), FITC-dextran (groen) en beide kleurstoffen (grijs). Ze werden verzameld op basis van de beelden die om 3 uur werden verkregen in het 'Pre'-protocol en uit de beelden die werden verkregen op 6 uur, 1 dag, 3 dagen en 7 dagen in het 'Post'-protocol. Van 3 uur tot 1 dag vertoonde een aanzienlijk deel van de fluorescentie-hotspots een mismatch tussen kleurstoffen, terwijl van 3 dagen tot 7 dagen een dergelijke mismatch nauwelijks werd waargenomen. (B) Schema dat het tijdsverloop van de BBB-uitsplitsing samenvat. De verticale as geeft conceptueel de intensiteit weer van kleurstoflekkage als gevolg van BBB-afbraak. Het zigzagpatroon van 3 uur tot 1 dag geeft aan dat de locatie en intensiteit van de kleurstoflekkage in deze periode onstabiel zijn. FITC, fluoresceïne-isothiocyanaat; BBB, bloed-hersenbarrière; BSW, door ontploffing veroorzaakte schokgolven. Deze figuur is een bewerking van Nishii et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Expressie van GFAP en Iba1 als markers voor respectievelijk astrocyten en microglia. Elke kolom van de figuur bevat fluorescentiebeelden van kleurstofextravasatie met Evans-blauw of FITC-dextran, samen met GFAP- of Iba1-immunohistochemische beelden. De kleurenbalk geeft de genormaliseerde fluorescentie-intensiteiten van Evans-blauw en FITC-dextran aan met behulp van die binnen GRN. De protocollen voor het injecteren van kleurstoffen worden aan de linkerkant gepresenteerd. De plak van 1 dag in het 'Pre'-protocol toont fluorescentie van zowel Evans-blauw als FITC-dextran, terwijl de plak van 3 dagen in het 'Pre'-protocol alleen fluorescentie van Evans-blauw laat zien (pijlen). De regio's die worden aangeduid met de pijlen in de afbeeldingen van kleurstofextravasatie komen overeen met de immunohistochemische afbeeldingen. Pijlpunten geven clusters van reactieve astrocyten aan. Het polyklonale GFAP-antilichaam gelabelde astrocyten in en rond de witte stof, evenals in zenuwweefsel naast de pia mater. Als gevolg hiervan zijn astrocyten in en dicht bij de dcw in deze figuur gelabeld. De vergrote afbeeldingen die overeenkomen met het kader of de pijl in de Iba1-kolom worden weergegeven in de inzetstukken. Schaalbalken: 1 mm en 200 μm voor respectievelijk de extravasatie van de kleurstof en de immunohistochemische beelden. GFAP, gliaal fibrillair zuur eiwit; Iba1, geïoniseerd calciumbindend adaptermolecuul 1; FITC, fluoresceïne-isothiocyanaat; BSW, door ontploffing veroorzaakte schokgolven; DCW, diepe cerebrale witte stof. Deze figuur is een bewerking van Nishii et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een nieuwe techniek voor dubbele labeling met behulp van Evans blue en FITC-dextran werd gebruikt om de precieze spatiotemporele verdeling van BBB-afbraak in een enkel brein nauwkeurig te visualiseren. In het BSW-model met lage intensiteit werden merkbare variaties in de mate, locatie en mate van kleurstofextravasatie waargenomen in onderzochte hersenen (Figuur 2 en Figuur 3). Mismatches tussen kleurstoffen toonden aan dat de BBB-afbraak ongeveer 3 uur na blootstelling aan BSW begon, met een substantiële remodellering op dag 1 en doorlopend tot en met dag 7 (Figuur 4). In ernstige gevallen werden actieve microglia gerekruteerd naar de plaatsen van BBB-afbraak, en clusters van reactieve astrocyten waren nauw verbonden met deze gebieden (Figuur 5). Door immunohistochemie uit te voeren op dezelfde plakjes die werden gebruikt voor de analyse van kleurstofextravasatie, werd een nauwkeurige correlatie vastgesteld tussen gliareacties en kleurstofextravasatie. Voor meer gedetailleerde gegevens en analyse verwijzen wij u naar Nishii et al.7.

Omdat FITC-dextran onmiddellijk vóór de perfusiefixatie in een constante concentratie gedurende een identieke duur werd geperfundeerd, geven de verdeling en intensiteit van de kleurstof waarschijnlijk nauwkeurig de mate van BBB-afbraak weer op het moment van perfusiefixatie. In een eerder rapport is echter aangetoond dat de fluorescentie van FITC-dextran de neiging heeft zwak te zijn in een BSW-model met lage intensiteit7. Labelen met Evans blauw voor een langere duur was voordelig, omdat het subtielere veranderingen in de BBB-afbraak kon detecteren (Figuur 2). Vanwege de langere duur van de etikettering kan echter voorzichtigheid geboden zijn bij het interpreteren van fluorescerende afbeeldingen van Evans-blauw. De bloedconcentratie van Evans blue was het hoogst onmiddellijk na injectie en nam geleidelijk af gedurende een paar uur (Figuur 1)11. Er wordt gespeculeerd dat de intensiteit van de etikettering zou correleren met de ernst en duur van de BBB-afbraak, evenals de bloedconcentratie van Evans-blauw; het zou echter exponentieel afnemen als het eenmaal is gerepareerd. Al deze factoren variëren van tijd tot tijd en van het ene experiment tot het andere. Daarom mag geen conclusie worden getrokken uit een enkel beeld van extravasatie van kleurstoffen, en statistische overwegingen zijn altijd noodzakelijk.

Afhankelijk van het doel van het experiment kan het interessant zijn om zowel het molecuulgewicht als de combinatie van kleurstoffen te veranderen. In deze studie werd een combinatie van Evans Blue en FITC-dextran gebruikt. Na binding met serumalbumine gedroeg Evans-blauw zich als een 69-kDa-tracer en het 40-kDa FITC-dextran dat in deze studie werd gebruikt, vertoonde een vergelijkbare mate van BBB-afbraak als Evans-blauw. De spatiotemporele verdeling van BBB-afbraak werd systematisch onderzocht met behulp van een combinatie van kleurstoffen die verschillende fluorescentie uitzenden7. In een eerdere studie die een combinatie van Evans-blauw en natriumfluoresceïne (376 Da) gebruikte, kon natriumfluoresceïne, vanwege het kleinere molecuulgewicht, een breder bereik van BBB-afbraakna blootstelling aan BSW 3 labelen. In andere studies werden combinaties van Evans-blauw en FITC-dextran met een hoger moleculair gewicht gebruikt om de mate van BBB-afbraak te vergelijken18,19. Alle voorgaande rapporten dienden Evans blue en FITC-dextran bijna gelijktijdig toe. Het unieke aspect van het hier gepresenteerde protocol is dat de twee kleurstoffen op verschillende tijdstippen werden geïntroduceerd, waardoor de temporele progressie van BBB-afbraak kan worden onderzocht.

Het cumulatieve karakter van Evans blue kan nuttig zijn in verschillende BBB-breakdownmodellen. Omdat het de geschiedenis van BBB-afbraak registreert, kan een beter begrip van het begin en de progressie van de ziekte worden vergemakkelijkt. Onderzoekers moeten zich bewust zijn van de positieve en negatieve eigenschappen van kleurstoffen en deze ten volle benutten9. Dit protocol heeft een breed scala aan toepassingen voor verschillende BBB-storingsmodellen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Mayumi Watanabe voor de cryosectietechniek. Dit werk werd ondersteund door een Advanced Research on Military Medicine-subsidie van het Ministerie van Defensie, Japan.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% Formalin Neutral Buffer SolutionFUJIFILM Wako Chemicals062-01661
Anti GFAP, RabbitDAKO-AgilentIR524
Anti Iba1, RabbitFUJIFILM Wako Chemicals019-19741
Chicken anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21200
Cryo MountMuto Pure Chemicals33351weefselbevriezingsmedium
DomitorOrion Corporationmedetomidine
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040
Evans BlueSigma-Aldrich E2129
Falcon 24-well Polystyrene Clear Flat Bottom Not Treated Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile, 50/CaseCORNING351147
Fluorescein isothiocyanate–dextran gemiddeld mol wt 40.000Sigma-Aldrich FD40SFITC-dextran
Glass Base Dish 27mm (No.1 Glass)AGC TECHNO GLASS3910-03535 mm glazen bodemschaal
IX83 Inverted MicroscopeOLYMPUS
MAS Hydrophilic Adhesion Microscope SlidesMatsunami GlassMAS-04
Matsunami Cover Glass (No.1) 18 x 18mmMatsunami GlassC018181
Midazolam Injection 10mg [SANDOZ]Sandoz
Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DACMerck Millipore1.04005.1000
Peristaltic PumpATTOSJ-1211 II-H
RODENT BRAIN MATRIX
Adult Mouse, 30 g, Coronal		ASI INSTRUMENTSRBM-2000Chersenslicer
VetorphaleMeiji Animal HealthVETLI5butorphanol

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: From physiology to disease and back. Physiol Rev. 99 (1), 21-78 (2019).
  2. Kabu, S., et al. Blast-associated shock waves result in increased brain vascular leakage and elevated ros levels in a rat model of traumatic brain injury. PLoS One. 10 (5), e0127971(2015).
  3. Kuriakose, M., Rama Rao, K. V., Younger, D., Chandra, N. Temporal and spatial effects of blast overpressure on blood-brain barrier permeability in traumatic brain injury. Sci Rep. 8 (1), 8681(2018).
  4. Yeoh, S., Bell, E. D., Monson, K. L. Distribution of blood-brain barrier disruption in primary blast injury. Ann Biomed Eng. 41 (10), 2206-2214 (2013).
  5. Readnower, R. D., et al. Increase in blood-brain barrier permeability, oxidative stress, and activated microglia in a rat model of blast-induced traumatic brain injury. J Neurosci Res. 88 (16), 3530-3539 (2010).
  6. Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood-brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Front Cell Neurosci. 8, 232(2014).
  7. Nishii, K., et al. Evans blue and fluorescein isothiocyanate-dextran double labeling reveals the precise sequence of vascular leakage and glial responses after exposure to mild-level blast-associated shock waves. J Neurotrauma. 40 (11-12), 1228-1242 (2023).
  8. Hoffmann, A., et al. High and low molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextrans to assess blood-brain barrier disruption: Technical considerations. Transl Stroke Res. 2 (1), 106-111 (2011).
  9. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Møllgård, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Front Neurosci. 9, 385(2015).
  10. Manaenko, A., Chen, H., Kammer, J., Zhang, J. H., Tang, J. Comparison Evans blue injection routes: Intravenous versus intraperitoneal, for measurement of blood-brain barrier in a mice hemorrhage model. J Neurosci Methods. 195 (2), 206-210 (2011).
  11. Yen, L. F., Wei, V. C., Kuo, E. Y., Lai, T. W. Distinct patterns of cerebral extravasation by Evans blue and sodium fluorescein in rats. PLoS One. 8 (7), e68595(2013).
  12. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  13. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. 67, e2771(2012).
  14. Satoh, Y., et al. Molecular hydrogen prevents social deficits and depression-like behaviors induced by low-intensity blast in mice. J Neuropathol Exp Neurol. 77 (9), 827-836 (2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65, e3564(2012).
  16. Selever, J., Kong, J. Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. 53, e2807(2011).
  17. Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
  18. Nagaraja, T. N., Keenan, K. A., Fenstermacher, J. D., Knight, R. A. Acute leakage patterns of fluorescent plasma flow markers after transient focal cerebral ischemia suggest large openings in blood-brain barrier. Microcirculation. 15 (1), 1-14 (2010).
  19. Xu, Y., et al. Quantifying blood-brain-barrier leakage using a combination of Evans blue and high molecular weight fitc-dextran. J Neurosci Methods. 325, 108349(2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Blast schokgolfmodelEvans Blue labelingFITC dextran injectiefluorescentiemicroscopiepreparatie van hersensectiesimmunohistochemiereactieve astrocytenmicrogli le activatie

Gerelateerde artikelen