Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Voorbereiding en analyse van histologische objectglaasjes van de oogbollen van ratten en muizen om het netvlies te evalueren

4.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66663

⸱

23 augustus 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chair and Department of Experimental and Clinical Physiology, Laboratory of Centre for Preclinical Research, Medical University of Warsaw, 2Department of Pathology, Medical University of Warsaw

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript presenteert een protocol voor de histologische voorbereiding van dia's van oogbollen van knaagdieren. Met de voorgestelde methode kan het binnenste netvlies eenvoudig worden gevisualiseerd en beoordeeld onder een lichtmicroscoop. De procedure wordt gepresenteerd voor de oogbollen van muizen en ratten.

Samenvatting

Een oogbol van een knaagdier is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van de pathomechanismen van veel oogziekten, zoals glaucoom, hypertensieve retinopathie en nog veel meer. Preklinische experimenten stellen onderzoekers in staat om de werkzaamheid van nieuwe geneesmiddelen te onderzoeken, nieuwe behandelingsmethoden te ontwikkelen of nieuwe pathomechanismen te zoeken die betrokken zijn bij het ontstaan of de progressie van de ziekte. Een histologisch onderzoek levert veel informatie op die nodig is om de effecten van de uitgevoerde experimenten te beoordelen en kan degeneratie, weefselremodellering, infiltratie en vele andere pathologieën aan het licht brengen. In klinisch onderzoek is er zelden een kans om oogweefsel te verkrijgen dat geschikt is voor een histologisch onderzoek, daarom moeten onderzoekers gebruik maken van de mogelijkheid die wordt geboden door het onderzoek van oogbollen van knaagdieren. Dit manuscript presenteert een protocol voor de histologische preparatie van secties van knaagdieroogbollen. De procedure wordt gepresenteerd voor de oogbollen van muizen en ratten en omvat de volgende stappen: (i) het oogsten van de oogbol, (ii) het bewaren van de oogbol voor verdere analyse, (iii) het verwerken van het weefsel in paraffine, (iv) het voorbereiden van objectglaasjes, (v) kleuring met hematoxyline en eosine, (vi) het beoordelen van het weefsel onder een lichtmicroscoop. Met de voorgestelde methode kan het netvlies eenvoudig in beeld worden gebracht en in detail worden beoordeeld.

Inleiding

De oogbol is een bolvormige structuur die het gezichtsorgaan vormt. De binnenkant van de oogbol kan worden onderverdeeld in twee segmenten: het voorste segment, dat het hoornvlies, de iris, het ciliaire lichaam, de lens, de voorste kamer en de achterste kamer omvat, en het achterste segment, dat het glasvocht, het netvlies, het vaatvlies, de sclera en de oogzenuwkop omvat. De voorste oogkamer bevindt zich tussen het hoornvlies en de iris 1,2. De iris is een cirkelvormige structuur met een opening in het midden die de pupil wordt genoemd. Op de kruising van het hoornvlies en de iris is er de afvoerhoek, waar een gespecialiseerd systeem van trabeculae het kamerwater van de oogbol naar het veneuze systeem afvoert. De achterste kamer wordt begrensd door de iris, het ciliaire lichaam en de lens, evenals de opschortende ligamenten die de lens op zijn plaats houden. Achter de lens bevindt zich het glasvochtlichaam, de grootste structuur van de oogbol. Het glasvocht hecht zich aan het netvlies en stabiliseert zijn positie. Het netvlies is omgeven door het vaatvlies en de sclera1. De anatomie van de oogbol is samengevat in Figuur 1.

De oogbolwand bestaat uit drie lagen. De buitenste laag is de sclera, die de oogbol beschermt tegen letsel en zijn vorm behoudt. Aan de voorste pool van de oogbol verandert de sclera in een transparant hoornvlies. Onder de sclera bevindt zich een vasculaire structuur, de uvea genaamd, waarvan de primaire functie is om de structuren van het oog te voeden. De uvea vormt het vaatvlies en binnen de voorpool het corpus ciliare en de iris1. De binnenste laag is het netvlies, een zeer gespecialiseerde structuur van het oog, bestaande uit neuronen, gliacellen en pigmentepitheelcellen. De retinale neuronen omvatten de fotoreceptorcellen (staafjes en kegeltjes), horizontale cellen, bipolaire cellen, amacriene cellen en retinale ganglioncellen (RGC's). Deze cellen zijn georganiseerd in complexe lagen en hun rol is het ontvangen en verwerken van lichtprikkels 2,3. De gliacellen van het netvlies bestaan uit de Müller-cellen, astrocyten en microglia, die in alle lagen van het netvlies aanwezig zijn. De vele functies van gliacellen omvatten de voeding van neuronen, ondersteuning van de bloed-netvliesbarrière, structurele ondersteuning van neuronen om de gelaagde structuur van het netvlies te behouden, regulatie van het metabolisme van neuronen, secretie van biologisch actieve eiwitten die het functioneren, de groei en overleving van neuronen reguleren, en het reguleren van de immunologische processen in het netvlies4. De pigmentepitheelcellen vormen de buitenste laag van het netvlies en fungeren als een barrière tussen het vaatvlies en de fotoreceptoren. Deze cellen reguleren het bidirectionele transport van afvalproducten en voedingsstoffen en beschermen ook het netvlies tegen overmatige door licht veroorzaakte schade door lichtenergie te absorberen en door licht gegenereerde reactieve zuurstofsoorten te neutraliseren5.

Het netvlies kan worden onderverdeeld in tien lagen: (i) het retinale pigmentepitheel, (ii) de fotoreceptorsegmentlaag (staafjes en kegeltjes), (iii) extern beperkend membraan (ELM), (iv) buitenste nucleaire laag (ONL), (v) buitenste plexiforme laag (OPL), (vi) binnenste kernlaag (INL), (vii) binnenste plexiforme laag (IPL), (viii) ganglioncellaag (GCL), (ix) retinale zenuwvezellaag (RNFL), en (x) intern beperkend membraan (ILM)2. De genucleeerde lagen van het netvlies omvatten de ONL, INL en GCL, terwijl de lagen met synaptische verbindingen tussen cellen de OPL en IPL6 omvatten. De kernen van staafjes en kegeltjes vormen de ONL, en hun axonen strekken zich uit tot in de OPL, waar ze zich verbinden met de dendrieten van bipolaire en horizontale cellen. Binnen de INL bevinden zich de horizontale, bipolaire en amacriene celkernen. Binnen de IPL synapseren axonuiteinden van bipolaire en amacriene cellen met dendrieten van RGC's. Binnen de GCL vormen de RGC's het grootste deel van de cellichamen, maar ook enkele ontwrichte amacriene cellen zijn er te vinden. De axonen van RGC's vormen de RNFL en verder de oogzenuw 7,8,9.

Veel oogheelkundige aandoeningen, zoals neurodegeneratieve aandoeningen van het netvlies, leiden tot onomkeerbare en ongeneeslijke blindheid10. Visie wordt beschouwd als een van de belangrijkste zintuigen11, en permanente blindheid vermindert de kwaliteit van leven van de patiënt aanzienlijk. Om de pathomechanismen van veel ziekten beter te begrijpen, wordt preklinisch onderzoek met behulp van celculturen of diermodellen op grote schaal uitgevoerd. Preklinische studies met proefdieren bieden de mogelijkheid om de pathomechanismen die ten grondslag liggen aan oogziekten te beoordelen en nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen. Oogziekten kunnen worden gemodelleerd bij zowel grote dieren (apen, koeien, honden en katten) als kleine dieren (konijnen, ratten, muizen en zebravissen). Het gebruik van grotere dieren zorgt door zijn grootte voor een betere toegang tot het oog. Experimenten met knaagdieren daarentegen maken vanwege hun relatief snelle voortplanting het mogelijk om ingeteelde stammen te fokken die worden gekenmerkt door vatbaarheid voor bepaalde ziekten12,13.

In diermodellen is enucleatie mogelijk, wat het mogelijk maakt om een gedetailleerd histopathologisch onderzoek van de oogbol uit te voeren, met de beoordeling van kleine pathologieën die tijdens de ontwikkeling van de ziekte in bepaalde structuren van het oog verschijnen - een onderzoek dat zeer zelden bij mensen kan worden uitgevoerd. Histopathologische beoordeling is een uiterst waardevol hulpmiddel bij het onderzoeken van de pathomechanismen van oogaandoeningen. In de gepubliceerde literatuur zijn de beschrijvingen van de methodologie voor histologisch onderzoek van oogbollen zeer beperkt en ontbreken stapsgewijze handleidingen, wat het voor beginners moeilijk maakt om te recreëren. Deze studie heeft tot doel een eenvoudige en beknopte methode te bieden voor het voorbereiden van histologische objectglaasjes en het beoordelen van het netvlies van ratten en muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de instelling. De oogbollen die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn verkregen van dieren die zijn opgenomen in een experiment dat is uitgevoerd op basis van het studiegoedkeuringsnummer WAW2/122/2020, uitgegeven door de2e lokale ethische commissie van de Warsaw University of Life Sciences in Warschau, Polen. Ons protocol is ontwikkeld door muizen van 11 en 44 weken en ratten van 6, 12 en 16 weken te onderzoeken.

1. Voorbereiding van de oogbollen van muizen

OPMERKING: Dit protocol presenteert de methode voor het voorbereiden van secties van muisoogbollen en is ontwikkeld met behulp van oogbollen geoogst van: vrouwelijke C57Bl/6-muizen van 11 weken oud (gemiddeld gewicht 21 g), vrouwelijke C57Bl/6-muizen van 44 weken oud (gemiddeld gewicht 25 g), vrouwelijke DBA/2-muizen van 11 weken oud (gemiddeld gewicht 21,5 g) en vrouwelijke DBA/2-muizen van 44 weken met glaucoom (gemiddeld gewicht 25 g).

  1. Enucleatie
    1. Gebruik een kleine tang om de oogleden te openen. Druk op de oogleden om de oogbol te laten verzakken.
    2. Ontleed de oogbol van de oogkas door het weefsel achter de oogbol af te knippen met een kleine, scherpe schaar. Zodra de oogbol uit de baan is verwijderd, snijdt u het uitstekende bindweefsel en de perioculaire spieren af.
      1. Markeer de oogbollen voor een betere oriëntatie, bijvoorbeeld door een kleine hechting op de stomp van de pees van de laterale rectusspier van de oogbol te binden om de temporale zijde van de oogbol te markeren.
  2. Fixatie van weefsels
    1. Plaats de ontkernde oogbol in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en laat deze 24 uur rusten in een 4 % oplossing van paraformaldehyde (PFA) opgelost in fosfaatbufferzoutoplossing (PBS).
    2. Behandel vervolgens de oogbol gedurende 24 uur in een 10% oplossing van sucrose, verwijder deze vervolgens en plaats deze gedurende 24 uur in een 20% oplossing van sucrose, en verwijder ten slotte en plaats deze gedurende 24 uur in een 30% oplossing van sucrose.
      OPMERKING: Houd de oogbol tijdens het hele proces op een lage temperatuur van 4 °C. Naaldpuncties voor sucrose-infiltratie moeten worden vermeden om het risico op oogbolbeschadiging te minimaliseren.
  3. Weefsel invriezen en bewaren
    1. Verwijder de oogbol van de sucrose-oplossing en droog deze af door deze lichtjes te deppen met keukenpapier.
    2. Plaats de oogbol in een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml en vries in bij -80 °C voor toekomstige verwerking.
      OPMERKING: Indien bewaard bij - 80 °C, kan een oogbol tot 12 maanden levensvatbaar blijven tot toekomstige verwerking.
  4. Voorbereiding van de dia's
    1. Ontdooi de oogbol op kamertemperatuur. Verplaats het van de microcentrifugebuis in een cassette en spoel het 20 minuten onder stromend water om de sucrose weg te spoelen.
    2. Dehydrateer de oogbol door deze in de volgende oplossingen onder een zuurkast te plaatsen en deze vervolgens uit de volgende oplossingen te verwijderen: 70% oplossing van ethylalcohol (EtOH) gedurende 10 min, 80% oplossing van EtOH gedurende 10 min, 96% oplossing van EtOH gedurende 10 min, 99,9% oplossing van EtOH gedurende 10 minuten en aceton gedurende 5 min.
    3. Maak de oogbol vrij door deze 5 minuten in xyleen onder een zuurkast te plaatsen.
    4. Smelt de paraffine door wat vaste paraffine in een bekerglas te doen en in een laboratoriumincubator te doen die is ingesteld op een temperatuur die hoger is dan de door de paraffinefabrikant opgegeven smelttemperatuur (de smelttemperatuur van paraffine ligt tussen 46 °C en 68 °C). Nadat de paraffine volledig is gesmolten (de tijd is afhankelijk van de hoeveelheid gebruikte paraffine), beweegt u de oogbol in het bekerglas met paraffine en houdt u deze 1 uur warm in de broedmachine. Tijdens 1 uur paraffine-infiltratie in het weefsel, roer de paraffine elke 10 - 15 min.
      OPMERKING: Voor deze stap kan een weefselverwerker worden gebruikt die paraffine-infiltratie mogelijk maakt tijdens het roeren van de oplossing.
    5. Steek de oogbol in een paraffineblok zoals hieronder beschreven.
      1. Open de cassette en verwijder de bovenklep. Kies een metalen vorm en giet een kleine hoeveelheid paraffine om de bodem van de vorm te bedekken. Haal de oogbol met een tang uit de cassette en plaats deze op de paraffine in de vorm. Plaats de oogbol op zijn kant om ervoor te zorgen dat u in het sagittale vlak snijdt.
        OPMERKING: Door de oogbol op zijn kant te plaatsen (met de voorste pool naar de ene kant en de achterste pool naar de andere) kan in het sagittale vlak worden gesneden. Op deze manier worden doorsneden door het hoornvlies, de iris, het ciliaire lichaam, de pupil, het perifere en het centrale netvlies verkregen.
      2. Koel de vorm kort af op een koelplaat die is ingesteld op - 15 °C zodat de paraffine licht kan stollen om het weefsel op zijn plaats te verankeren. Bedek de tissue voorzichtig met paraffine en de cassettebodem tot een blok. Leg het blok op een koelplaat om volledig te stollen. Haal vervolgens het blok uit de metalen mal en plaats de paraffineblokken terug op de koelplaat om minimaal 15 minuten af te koelen voordat u ze aansnijdt.
    6. Zet een paraffineblok vast in de microtoom. Stel de microtoom in om de overtollige paraffine van het blok te verwijderen (we stellen het in om 15 μm te snijden) en knip bij tot het midden van de oogbol. Wijzig de microtoominstellingen om dunnere secties te snijden (we hebben het ingesteld op 3.5 μm) en plaats de sectie op een dia. Als u een microtoom gebruikt met een aangrenzend waterbad, verwijder dan het overtollige water van de dia met een vochtige tissue.
      OPMERKING: Het doel is om minimaal 3 doorsneden door de pupil te verkrijgen. Hoe minder ervaren de onderzoeker, hoe meer doorsneden er moeten worden verkregen om doorsnede op het niveau van de leerling te garanderen. Plaats een paar secties op één dia. Snijd voor minder ervaren onderzoekers het weefsel ook dikker, bijvoorbeeld in secties van 4 μm of 5 μm dik. Het gebruik van een microtoom met een aangrenzend waterbad maakt het proces van het overbrengen van weefselsecties op objectglaasjes veel gemakkelijker in vergelijking met het gebruik van microtomen zonder waterbaden. Een ander punt dat het vermelden waard is, is dat de lens moeilijk door te snijden kan zijn. Om het risico op weefselbeschadiging door de broze lens te minimaliseren, gebruikt u alleen scherpe microtoommesjes die zijn bedoeld om door harde weefsels te snijden. Overweeg om één mes te gebruiken voor het trimmen en een ander voor het snijden van secties om het bot worden van het mes te minimaliseren.
    7. Plaats het glaasje in een laboratoriumincubator die gedurende 30 minuten op 56 °C is ingesteld.
    8. Verwijder het objectglaasje uit de couveuse en begin het handmatig te kleuren met hematoxyline en eosine (H&E) door het objectglaasje achtereenvolgens van en naar de volgende oplossingen te plaatsen en te verwijderen. Begin met 7 minuten xyleen, 5 minuten xyleen (nog een bekerglas met een schone oplossing) en 5 minuten xyleen (nog een bekerglas met een schone oplossing). Volg dit met 2 min 96% EtOH, 1 min 96% EtOH (nog een bekerglas met een schone oplossing), 1 min 96% EtOH (nog een bekerglas met een schone oplossing).
    9. Spoel in 5 minuten stromend water, dan 2 minuten Mayer's hematoxyline, 2 minuten Mayer's hematoxyline (nog een bekerglas met een schone oplossing), 5 minuten stromend water, 5 minuten stromend water (nog een schoon bekerglas).
    10. Voeg 1% eosine toe gedurende 2 min, gevolgd door 1 min 96% EtOH, 30 s 96% EtOH (nog een bekerglas met een schone oplossing), 30 s 96% EtOH (een ander bekerglas met een schone oplossing), 2 min xyleen, 1 min xyleen (een ander bekerglas met een schone oplossing), 2 min xyleen (een ander bekerglas met een schone oplossing).
      OPMERKING: U kunt ook een geautomatiseerde dia-kleurer gebruiken.
    11. Sluit de schuif af met behulp van een geautomatiseerde slide sealer. Het geprepareerde objectglaasje is klaar voor opslag en beoordeling onder een lichtmicroscoop.
      OPMERKING: U kunt ook de diaafdichting handmatig uitvoeren door een dunne laag polystyreendekmiddel op het bevlekte weefsel te plaatsen en dit af te dekken met een glazen dekglaasje.
      LET OP: Stappen die PFA, EtOH, aceton en xyleen bevatten, moeten worden uitgevoerd onder een zuurkast voor laboratoria.

2. Voorbereiding van de sectie van de rattenoogbollen en de montage van de dia

OPMERKING: Dit protocol presenteert de methode voor het prepareren van secties van de oogbollen van ratten en is ontwikkeld met behulp van de oogbollen die zijn geoogst van: mannelijke SHR-ratten van 6 weken (gemiddeld gewicht 115,5 g), mannelijke SHR-ratten van 12 weken met arteriële hypertensie (gemiddeld gewicht 262,5 g), mannelijke WKY-ratten van 6 weken (gemiddeld gewicht 143,5 g), mannelijke WKY-ratten van 12 weken (gemiddeld gewicht 265 g), mannelijke Lewis-ratten van 12 weken oud (gemiddeld gewicht 310 g) en mannelijke Lewis-ratten van 16 weken met geïnduceerde diabetes mellitus (gemiddeld gewicht 259 g).

  1. Enucleatie
    1. Gebruik een kleine tang om de oogleden te openen. Druk op de oogleden om de oogbol te verzakken.
    2. Ontleed de oogbol van de oogkas door het weefsel achter de oogbol af te knippen met een kleine, scherpe schaar.
      OPMERKING: Markeer de oogbollen voor een betere oriëntatie, bijvoorbeeld door een kleine hechting op de stomp van de pees van de laterale rectusspier van de oogbol te binden om de temporale zijde van de oogbol te markeren.
  2. Fixatie van weefsels
    1. Plaats de ontkernde oogbol in een microcentrifugebuis van 1.5 ml en laat deze 24 uur rusten in een 4% -oplossing van paraformaldehyde (PFA) opgelost in fosfaatbufferzoutoplossing (PBS).
    2. Behandel vervolgens de oogbol gedurende 24 uur in een 10% -oplossing van sucrose, verwijder deze vervolgens en plaats deze gedurende 24 uur in een 20%-oplossing van sucrose, verwijder deze ten slotte en plaats deze gedurende 24 uur in een 30%-oplossing van sucrose.
      OPMERKING: Houd de oogbol tijdens het hele proces op een lage temperatuur van 4 °C. Naaldpuncties voor sucrose-infiltratie moeten worden vermeden om het risico op oogbolbeschadiging te minimaliseren.
  3. Weefsel invriezen en bewaren
    1. Verwijder de oogbol van de sucrose-oplossing en droog deze af door deze lichtjes te deppen met keukenpapier.
    2. Plaats de oogbol in een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml en vries deze in bij -80 °C voor toekomstige verwerking.
      OPMERKING: Indien bewaard bij -80 °C, kan de oogbol tot 12 maanden levensvatbaar blijven tot toekomstige verwerking.
  4. Voorbereiding van de dia's
    1. Haal de oogbol uit de vriezer en uit de microcentrifugebuis. Snijd de oogbol langs het sagittale vlak doormidden met een scherp scalpel. Verwijder de lens en gooi deze weg.
      OPMERKING: Deze stap is het gemakkelijkst uit te voeren op een bevroren oogbol, vers uit de vriezer gehaald. Tijdens het snijden in de oogbol kan de lens het omliggende weefsel beschadigen. Gebruik een zeer scherp scalpel om het risico op schade te minimaliseren en blijf voorzichtig.
    2. Ontdooi de oogbol op kamertemperatuur. Verplaats de twee helften in een cassette en spoel ze 20 minuten onder stromend water om de sucrose eruit te spoelen.
    3. Dehydrateer de oogbol door deze in de volgende oplossingen onder een zuurkast te plaatsen en deze vervolgens uit deze te verwijderen: 70% oplossing van ethylalcohol (EtOH) gedurende 15 min, 80% oplossing van EtOH gedurende 15 min, 96% oplossing van EtOH gedurende 15 min, 99,9% oplossing van EtOH gedurende 15 minuten en aceton gedurende 7 min.
    4. Maak de oogbol vrij door deze 7 minuten in xyleen onder een zuurkast te plaatsen.
    5. Smelt de paraffine door wat vaste paraffine in een bekerglas te doen en in een laboratoriumincubator te doen die is ingesteld op een temperatuur die hoger is dan de door de paraffinefabrikant opgegeven smelttemperatuur (de smelttemperatuur van paraffine ligt tussen 46 °C en 68 °C). Nadat de paraffine volledig is gesmolten (de tijd is afhankelijk van de hoeveelheid paraffine die wordt gebruikt), beweegt u de oogbol in het bekerglas met paraffine en houdt u deze 1 uur warm in de broedmachine. Tijdens 1 uur paraffine-infiltratie in het weefsel, roer de paraffine elke 10 - 15 min.
      OPMERKING: Voor deze stap kan een weefselverwerker worden gebruikt die paraffine-infiltratie mogelijk maakt tijdens het roeren van de oplossing.
    6. Steek de oogbol in een paraffineblok zoals hieronder beschreven.
      1. Open de cassette en verwijder de bovenklep. Kies een metalen vorm en giet een kleine hoeveelheid paraffine om de bodem van de vorm te bedekken. Haal de oogbol met een tang uit de cassette en plaats deze op de paraffine in de vorm. Plaats de ene oogbolhelft met de onderkant van de cup naar boven en de andere - naar beneden.
        OPMERKING: Door de oogbolhelften te plaatsen met de ene helft met de onderkant van de cup naar boven en de andere - naar beneden, kan weefsel in het sagittale vlak worden gesneden. Op deze manier worden doorsneden door het hoornvlies, de iris, het ciliaire lichaam, de pupil, het perifere en het centrale netvlies verkregen.
      2. Koel de vorm kort af op een koelplaat die is ingesteld op - 15 °C zodat de paraffine licht kan stollen en de oogbol op zijn plaats verankert. Bedek de oogbol voorzichtig met paraffine en de onderkant van de cassette tot een blok. Leg het blok op een koelplaat om volledig te stollen. Haal vervolgens het blok uit de metalen mal en plaats de paraffineblokken terug op de koelplaat om minimaal 15 minuten af te koelen voordat u ze aansnijdt.
    7. Zet een paraffineblok vast in de microtoom. Stel de microtoom in om de overtollige paraffine van het blok te verwijderen (we stellen het in om 15 μm te snijden) en knip bij totdat u het midden van de oogbol bereikt. Wijzig de microtoominstellingen om dunnere secties te snijden (we hebben het ingesteld op 3.5 μm) en plaats de sectie op een dia. Als u een microtoom gebruikt met een aangrenzend waterbad, verwijder dan het overtollige water van de glijbaan met een vochtige tissue.
      OPMERKING: Het doel is om minimaal 3 doorsneden door de pupil te verkrijgen. Hoe minder ervaren de onderzoeker, hoe meer doorsneden er moeten worden verkregen om doorsnede op het niveau van de leerling te garanderen. Plaats een paar secties op één dia. Snijd voor minder ervaren onderzoekers het weefsel ook dikker, bijvoorbeeld in secties van 4 μm of 5 μm dik. Het gebruik van een microtoom met een aangrenzend waterbad maakt het proces van het overbrengen van weefselsecties op objectglaasjes veel gemakkelijker in vergelijking met het gebruik van microtomen zonder waterbaden.
    8. Verwijder het objectglaasje en begin handmatig met hematoxyline en eosine (H&E) te kleuren door het objectglaasje achtereenvolgens van en naar de volgende oplossingen te brengen en te verwijderen. Begin met 7 minuten xyleen, 5 minuten xyleen (nog een bekerglas met een schone oplossing) en 5 minuten xyleen (nog een bekerglas met een schone oplossing). Volg dit met 2 min 96% EtOH, 1 min 96% EtOH (nog een bekerglas met een schone oplossing), 1 min 96% EtOH (nog een bekerglas met een schone oplossing).
    9. Spoel in 5 minuten stromend water, dan 2 minuten Mayer's hematoxyline, 2 minuten Mayer's hematoxyline (nog een bekerglas met een schone oplossing), 5 minuten stromend water, 5 minuten stromend water (nog een schoon bekerglas).
    10. Voeg 1% eosine toe gedurende 2 min, gevolgd door 1 min 96% EtOH, 30 s 96% EtOH (nog een bekerglas met een schone oplossing), 30 s 96% EtOH (een ander bekerglas met een schone oplossing), 2 min xyleen, 1 min xyleen (een ander bekerglas met een schone oplossing), 2 min xyleen (een ander bekerglas met een schone oplossing).
      OPMERKING: U kunt ook een geautomatiseerde dia-kleurer gebruiken.
    11. Sluit de schuif af met behulp van een geautomatiseerde slide sealer. De geprepareerde objectglaasjes zijn klaar om te worden bewaard en beoordeeld onder een lichtmicroscoop.
      NOTITIE: U kunt ook de diaafdichting handmatig uitvoeren door een dunne laag polystyreenmontant op het bevlekte weefsel te plaatsen en af te dekken met een glazen dekglaasje.
      LET OP: Stappen die PFA, EtOH, aceton en xyleen bevatten, moeten worden uitgevoerd onder een zuurkast voor laboratoria.

3. Beoordelen van de oogbolsecties

  1. Dia's scannen
    1. Plaats het glaasje in een histopathologische diascanner en scan de secties met behulp van de scanmodus: 40x. Sla de afbeeldingen op als digitale bestanden met een hoge resolutie.
  2. Analyse van dia's
    1. Open het gescande bestand met behulp van software voor het bekijken van afbeeldingen. Zoek dwarsdoorsneden van de pupillen en analyseer drie opeenvolgende secties.
    2. Zoek het dikste deel van het netvlies en vergroot het beeld tot 20x door op het vergrotingsvak in de rechterbovenhoek te drukken en 20x te kiezen. Verplaats de muis naar het niveau van ELM in het dikste deel van het netvlies en druk op de rechterknop op de muis, kies Annoteren en Liniaal.
    3. Beweeg de muis in de richting van de ILM en klik op de linkerknop. Geef de meting een titel RT en vink de vakjes aan voor titel en lengte weergeven. Op deze manier wordt de dikte van het netvlies (RT) gemeten en wordt de meting weergegeven in μm. Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 2 en Figuur 3.
    4. Gebruik de liniaal, meet de dikte van elke netvlieslaag, inclusief de ONL, OPL, INL en IPL, en label ze. Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 4 en Figuur 5.
    5. Om het aantal cellen in de GCL te tellen, stelt u een vooraf bepaalde lengte van het netvlies vast. Gebruik bijvoorbeeld voor het netvlies van de muis één sectie van 500 μm en voor het netvlies van de rat vijf secties van 100 μm.
    6. Meet met de liniaal de gekozen afstand langs de GCL. Druk op de rechterknop op de muis en selecteer Annoteer > Opgeslagen > 1x RBC. Klik op elke cel die wordt geïdentificeerd als een rond, met hematoxyline bevlekt lichaam langs de GCL over de vooraf bepaalde lengte van het netvlies. Tel het aantal omcirkelde cellen. Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 6 en Figuur 7.
    7. Na analyse van drie opeenvolgende secties, tekent u het gemiddelde voor alle metingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van het gepresenteerde protocol kunnen de anatomie en morfologie van specifieke structuren van de oogbol in detail worden beoordeeld. Ons team richt zich op het onderzoeken van de pathomechanismen van neurodegeneratie bij netvliesaandoeningen, zoals glaucoom, diabetische retinopathie en hypertensieve retinopathie. Om de kenmerken van neurodegeneratie in het netvlies te beoordelen, evalueerden we de RT (muisoogbol -Figuur 2, rattenoogbol -

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een histologisch onderzoek van de oogbol van de muis en de rat is een krachtig hulpmiddel op het gebied van experimentele oogheelkunde. Het kan nieuwe informatie opleveren met betrekking tot veranderingen in de oogstructuren in de loop van oogaandoeningen, die anders niet zouden worden waargenomen in klinische omgevingen. De beschreven protocollen presenteren een eenvoudige methode voor het uitvoeren van een histologische analyse van het netvlies. De subtiliteiten van de procedure die no...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

Het werk, inclusief ratten, werd gefinancierd als onderdeel van het project TIME 2 MUW - excellentie in onderwijs als een kans voor de ontwikkeling van de Medische Universiteit van Warschau, medegefinancierd door het Europees Sociaal Fonds in het kader van het operationele programma Ontwikkeling van kennisonderwijs voor 2014-2020, het nummer van de medefinancieringsovereenkomst: POWR.03.05.00-00-Z040/18-00. Het werk, inclusief muizen, werd uitgevoerd als onderdeel van een project dat in de jaren 2020 tot 2022 werd uitgevoerd, gefinancierd door een subsidie voor wetenschap verkregen door de Medische Universiteit van Warschau.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Acetone Chempur 111024800
Dumont Tweezers #5, 11cm, 0.05 x 0.01mm TipsWorld Precision Instruments14095small, microsurgical forceps
EosinMar-Four4P.05.2001/LAqueous solution
Ethyl alcohol 96 %Chempur CH.ET.AL.96%CZDA.CH
Ethyl alcohol 99.9 %Chempur CH.ETYL.ALK.99,9%BWUse to prepare 70% and 80% solutions of EtOH
Glacier - 86 °C Ultralow Temperature Freezer NU-9483ENuAire13027D0034Freezing temperature - 80 °C
Glass slidesMar-FourMI.15.01673Ground glass slides with a double-sided matte field for description
Leica CV5030 Fully Automated Glass CoverslipperLeica Biosystems 14,04,78,80,101Automated slide sealer 
Mayer's hematoxylinChempur 124687402
Metal base molds 15 mm  x 15 mmLeica Biosystems 3803081
Microme HM 340 EThermo Scientific90-519-0Microtome
Microtome razor bladesMar-FourHI.N.35Cutting angle 35°
Micro-Twin biopsy cassetteMar-FourLN.13874550
Microwave Hybrid Tissue ProcessorMilestone
Multistainer Leica ST5020Leica Biosystems Automated slide stainer 
NanoZoomer 2.0-HT slide scannerHamamatsuC9600Histopathological slide scanner
NDP.view2 Image viewing softwareHamamatsuU12388-01Image viewing software
Paraffin Pathowax PlusMar-Four4P.PWP.010Melting temperature 56 °C - 58 °C
ParaformaldehydeSigma - Aldrich441244-1KGPrepare a 4% solution in PBS
PBS TabletsMerck Millipore524650-1EAUse to prepare a solution of phosphate buffer saline, per manufacturer's instructions
Pierce Microcentrifuge Tubes, 1.5 mLThermo Scientific69715
Refrigerator-freezer EN14000AWElectrolux925032562-00refrigeration 4 °C
Scalpel bladeSwann-MortonT.OST.SKAL00.024
SucroseChempur 427720906
SuperCut Spring Scissors, 12.5cm, CurvedWorld Precision Instruments501925curved, small microsurgical scissors
Tape for automatic sealersMar-FourKP-3020/SMRH001
XyleneChempur CH.KSYL.5l.METAL.OP 
```

Referenties

  1. Kels, B. D., Grzybowski, A., Grant-Kels, J. M. Human ocular anatomy. Clin Dermatol. 33 (2), 140-146 (2015).
  2. Gupta, M. P., Herzlich, A. A., Sauer, T., Chan, C. C. Retinal anatomy and pathology. Dev Ophthalmol. 55, 7-17 (2016).
  3. Masland, R. H. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
  4. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  5. Boulton, M., Dayhaw-Barker, P. The role of the retinal pigment epithelium: Topographical variation and ageing changes. Eye (Lond). 15 (Pt 3), 384-389 (2001).
  6. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nat Rev Neurosci. 21 (1), 5-20 (2020).
  7. Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Chédotal, A. Development of retinal layers. C R Biol. 337 (3), 153-159 (2014).
  8. Adams, T., Chernoff, E., Wilson, J., Dharmarajan, S. Reactive muller glia as potential retinal progenitors. InTech. , (2013).
  9. Salman, A., Mcclements, M. E., Maclaren, R. E. Insights on the regeneration potential of müller glia in the mammalian retina. Cells. 10 (8), 1957(2021).
  10. Marchesi, N., Fahmideh, F., Boschi, F., Pascale, A., Barbieri, A. Ocular neurodegenerative diseases: Interconnection between retina and cortical areas. Cells. 10 (9), 2394(2021).
  11. Enoch, J., Mcdonald, L., Jones, L., Jones, P. R., Crabb, D. P. Evaluating whether sight is the most valued sense. JAMA Ophthalmol. 137 (11), 1317-1320 (2019).
  12. Struebing, F. L., Geisert, E. E. What animal models can tell us about glaucoma. Prog Mol Biol Transl Sci. 134, 365-380 (2015).
  13. Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P. Animal models of glaucoma. J Biomed Biotechnol. 2012, 692609(2012).
  14. Wilding, L. A., Uchihashi, M., Bergin, I. L., Nowland, M. H. Enucleation for treating rodent ocular disease. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (3), 328-332 (2015).
  15. Lin, C. H., et al. A protocol to inject ocular drug implants into mouse eyes. STAR Protoc. 3 (1), 101143(2022).
  16. Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in sd-oct imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
  17. Castro, G., Navajas, E., Farah, M. E., Maia, M., Rodrigues, E. B. Migration, integration, survival, and differentiation of stem cell-derived neural progenitors in the retina in a pharmacological model of retinal degeneration. ISRN Ophthalmol. 2013, 752161(2013).
  18. Chai, G. R., Liu, S., Yang, H. W., Chen, X. L. Quercetin protects against diabetic retinopathy in rats by inducing heme oxygenase-1 expression. Neural Regen Res. 16 (7), 1344-1350 (2021).
  19. Igarashi, T., et al. Tyrosine triple mutated aav2-bdnf gene therapy in a rat model of transient iop elevation. Mol Vis. 22, 816-826 (2016).
  20. Zhang, W., et al. Therapeutic efficacy of neural stem cells originating from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in diabetic retinopathy. Sci Rep. 7 (1), 408(2017).
  21. Dorfman, D., Aranda, M. L., Rosenstein, R. E. Enriched environment protects the optic nerve from early diabetes-induced damage in adult rats. PLoS One. 10 (8), e0136637(2015).
  22. Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. J Clin Invest. 102 (4), 783-791 (1998).
  23. Steinle, J. J., Kern, T. S., Thomas, S. A., Mcfadyen-Ketchum, L. S., Smith, C. P. Increased basement membrane thickness, pericyte ghosts, and loss of retinal thickness and cells in dopamine beta hydroxylase knockout mice. Exp Eye Res. 88 (6), 1014-1019 (2009).
  24. Polley, E. H., Walsh, C. A technique for flat embedding and en face sectioning of the mammalian retina for autoradiography. J Neurosci Method. 12 (1), 57-64 (1984).
  25. Turner, K. W. Hematoxylin toluidine blue-phloxinate staining of glycol methacrylate sections of retina and other tissues. Stain Technol. 55 (4), 229-233 (1980).
  26. Cheng, J., et al. Correlation of optical coherence tomography and retinal histology in normal and pro23his retinal degeneration pig. Transl Vis Sci Technol. 7 (6), 18(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Evaluatie van het netvliesoogbol van knaagdierennetvliessdiktehematoxyline-eosin kleuringparaffine-inbeddingmicrotoomcoupesganglioncellaagoogziektemodellenlichtmicroscopie
Voorbereiding en analyse van histologische objectglaasjes van de oogbollen van ratten en muizen om het netvlies te evalueren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.