Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

High-throughput bioprinting-methode voor het modelleren van vasculaire permeabiliteit in standaard zeswellsplaten met maat- en patroonflexibiliteit

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66676

⸱

16 augustus 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Convergence Biosystems Engineering, College of Agriculture and Life Sciences (CALS), Chonnam National University, 2Interdisciplinary Program in IT-Bio Convergence System, Chonnam National University, 3Advanced Bio and Healthcare Materials Research Division, Korea Institute of Materials Science (KIMS), 4Advanced Materials Engineering, Korea National University of Science and Technology (UST)

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een protocol voor high-throughput productie van vasculaire kanalen met flexibele afmetingen en gewenste patronen op een standaard plaat met zes putjes met behulp van 3D-bioprinttechnologie, ook wel vessels-on-a-plate (VOP) genoemd. Dit platform heeft het potentieel om de ontwikkeling van therapieën voor de aandoeningen die verband houden met gecompromitteerd endotheel te bevorderen.

Samenvatting

Vasculaire permeabiliteit is een sleutelfactor bij het ontwikkelen van therapieën voor aandoeningen die verband houden met gecompromitteerd endotheel, zoals endotheeldisfunctie in kransslagaders en verminderde functie van de bloed-hersenbarrière. Bestaande fabricagetechnieken repliceren de geometrische variatie in vasculaire netwerken in het menselijk lichaam, die de ziekteprogressie aanzienlijk beïnvloedt, niet adequaat; Bovendien omvatten deze technieken vaak fabricageprocedures in meerdere stappen die de high-throughput productie belemmeren die nodig is voor farmacologische tests. Dit artikel presenteert een bioprinting-protocol voor het creëren van meerdere vasculaire weefsels met de gewenste patronen en groottes, rechtstreeks op standaard platen met zes putjes, waarmee bestaande resolutie- en productiviteitsuitdagingen in bioprinttechnologie worden overwonnen. Er werd een vereenvoudigde fabricagebenadering ontwikkeld om zes holle, perfuseerbare kanalen in een hydrogel te construeren, die vervolgens werden bekleed met endotheelcellen van de menselijke navelstrengader om een functioneel en volwassen endotheel te vormen. Het computergestuurde karakter van 3D-bioprinten zorgt voor een hoge reproduceerbaarheid en vereist minder handmatige fabricagestappen dan traditionele methoden. Dit benadrukt het potentieel van VOP als een efficiënt high-throughput platform voor het modelleren van vasculaire permeabiliteit en het bevorderen van de ontdekking van geneesmiddelen.

Inleiding

Het vasculaire netwerk door het hele menselijk lichaam functioneert als een cruciale transportbarrière door de uitwisseling van moleculen en cellen tussen het bloed en de omliggende weefsels dynamisch te reguleren. Deze regulatie is essentieel om weefseloedeem te voorkomen en selectieve uitwisseling van voedingsstoffen en cellen mogelijk te maken, waardoor het weefselmetabolisme en de homeostase worden ondersteund1. Veranderde endotheliale permeabiliteit, een factor bij veel gezondheidsproblemen, beïnvloedt zowel de ernst van de ziekte als de werkzaamheid van de behandeling. Vasculaire endotheel werkt als een selectieve barrière en vergemakkelijkt de overdracht tussen bloedvaten, weefsels en organen. Deze regulatie omvat verschillende mechanismen, zoals de basisfiltering van opgeloste stoffen en kleine moleculen, opzettelijke verstoring van de vasculaire barrière en de invloed van moleculen zoals prostaglandinen en groeifactoren op permeabiliteitsniveaus3.

Sleutelfactoren in deze regulatie zijn onder meer endotheelceljuncties, de migratie van leukocyten en de functionaliteit van de bloed-hersenbarrière4. Gezien de complexiteit ervan varieert het proces in verschillende omgevingen, waarbij verschillende soorten bloedvaten betrokken zijn en verschillende anatomische routes worden gebruikt. Het begrijpen van de biologische onderbouwing van vasculaire permeabiliteit is cruciaal voor het bedenken van therapeutische benaderingen voor de behandeling van aandoeningen die verband houden met abnormale vasculaire permeabiliteit. Het behoud van de vasculaire permeabiliteit is cruciaal voor de gezondheid van het vasculaire systeem en de omliggende weefsels; Bijgevolg leidt verslechtering van deze functie tot endotheeldisfunctie, een toestand waarin het endotheel zijn normale functionaliteit verliest.

Endotheeldisfunctie is een voorloper van verschillende veel voorkomende ziekten bij de mens, waaronder hypertensie, coronaire hartziekte, diabetes en kanker 5,6,7. Deze aandoening kan zich op verschillende manieren presenteren, waaronder verminderde vasodilatatie, verhoogde bloedvatdoorlaatbaarheid en een neiging tot een pro-inflammatoire toestand. Deze pathologische toestand is het vroegste stadium van verschillende kritieke cardiovasculaire problemen, zoals coronaire hartziekte, beroerte en perifere slagaderziekte8, die nog steeds de belangrijkste doodsoorzaken zijn in de Verenigde Staten1. Endotheeldisfunctie beïnvloedt zowel de cardiovasculaire gezondheid als de bloed-hersenbarrière (BBB) en speelt een belangrijke rol bij de progressie van verschillende neurologische aandoeningen. Disfunctie kan de BBB-permeabiliteit verhogen, waardoor gifstoffen, ziekteverwekkers en immuuncellen in het centrale zenuwstelsel kunnen infiltreren en bijdragen aan neurologische aandoeningen zoals beroerte, de ziekte van Alzheimer, multiple sclerose enherseninfecties.

Endotheeldisfunctie bij diabetes wordt gekenmerkt door het aangetaste vermogen van het endotheel om de vasculaire tonus te reguleren en vaatverwijdende mediatoren te produceren, zoals stikstofmonoxide, wat leidt tot verminderde vasodilatatie10. Deze aandoening wordt verergerd door door hyperglykemie geïnduceerde routes zoals eiwitkinase C-activering en oxidatieve stress, die aanzienlijk bijdragen aan de progressie van diabetische vaatziekten11. Bovendien is gebleken dat een inflammatoire omgeving de hechting van tumorcellen aan microvasculaire endotheelcellen in de hersenen verbetert, terwijl een lekkend endotheel een belangrijke factor is bij uitzaaiingen van kanker12,13. Het is gebleken dat de geometrie van bloedvaten een directe invloed heeft op de metastase van hersenkanker. Tumorcellen hechten zich bij voorkeur aan gebieden met een grotere bloedvatkromming7. Deze bevinding onderstreept het belang van vasculaire geometrie bij uitzaaiingen van kanker. Wat nog belangrijker is, is dat bij aandoeningen zoals fibrose en kanker een verstoorde endotheliale barrièrefunctie niet alleen een rol speelt bij de ontwikkeling van de ziekte, maar ook de effectiviteit van de behandeling belemmert door een adequate medicijnafgifte te belemmeren14. Onderzoek naar vasculaire permeabiliteit is cruciaal voor het bevorderen van de behandeling van hart- en vaatziekten en biedt inzicht in de behandeling van andere ziekten met een verminderde vasculaire functie.

Gezien de cruciale rol van vasculaire permeabiliteit bij gezondheid en ziekte, is veel onderzoek gericht op het onderzoeken van de selectieve aard van de endotheelbarrière voor therapeutische ontwikkeling door gebruik te maken van diermodellen, naast traditionele 2D en 3D in vitro testplatforms. Diermodellen hebben echter beperkingen vanwege soortspecifieke verschillen en ethische kwesties, evenals hoge kosten15,16. Pfizer verklaarde bijvoorbeeld in 2004 dat het in de afgelopen 10 jaar meer dan $ 2 miljard had uitgegeven aan medicijnontwikkelingen die veelbelovende effecten vertoonden in diermodellen, maar uiteindelijk faalden in geavanceerde teststadiabij mensen 17. Bovendien bootsen traditionele 2D-modellen de driedimensionale (3D) architectuur en de complexe geometrische structuur van vasculaire kanalen niet nauwkeurig na.

Met de vooruitgang in biofabricagetechnologieën zijn uitgebreide inspanningen gericht op het fabriceren van vasculaire kanalen en het recapituleren van 3D-architectuur. Vasculaire kanalen op microschaal kunnen effectief worden gefabriceerd in microfluïdische chips door gebruik te maken van zachte lithografie, wat een voordeel biedt van real-time analyse18,19. Alternatieve methoden, zoals hydrogelgieten of het wikkelen van celvellen rond een mal of doorn, kunnen worden gebruikt om vrijstaande buisvormige structuren met de gewenste diameter20,21 te maken. Deze methoden hebben echter beperkingen; Microfluïdische chips zijn bijvoorbeeld beperkt tot microkanaalconfiguraties en hydrogelgieten rond een mal repliceert niet effectief meerdere geometrieën.

Met de opkomst van de 3D-bioprinttechnologie22 is het mogelijk geworden om complexe geometrieën te repliceren door nauwkeurig verschillende hydrogelmaterialen op basis van extracellulaire matrix (ECM) af te zetten23,24. Sommige bioprintmethoden, zoals die waarbij gebruik wordt gemaakt van concentrisch gerangschikte spuitmonden, bijv. coaxiaal en triaxiaal25,26, kunnen geen gespleten buizen maken; Complexe structuren kunnen echter worden bereikt met opofferingspatroonmethoden27. Van geen van deze bioprintmethoden is aangetoond dat ze in vitro modellering met een hoge doorvoer mogelijk maken - een cruciale vereiste voor farmacologisch onderzoek bij het ontdekken van geneesmiddelen. Hierin presenteren we een methode voor het efficiënt fabriceren van endotheliale vasculaire kanalen met efficiënte controle over afmetingen.

We hebben een eenvoudige aanpak ontwikkeld met behulp van in de handel verkrijgbare platen met zes putjes, gecombineerd met een opofferingspatroonmethode waarbij een bioprinter vasculaire kanalen van de gewenste grootte en patronen fabriceert binnen een ECM-hydrogel. Menselijke navelstrengader-endotheelcellen (HUVEC's) werden gezaaid om deze kanalen te endothelialiseren en de functionaliteit van endotheel te evalueren door middel van een permeabiliteitstest. Dit ontwerp maakt pomploze perfusie mogelijk door mediareservoirs aan beide zijden van het kanaal te creëren en maakt gebruik van door zwaartekracht aangedreven stroming met behulp van een veelgebruikte 2D-rocker om de dynamische cultuur na te bootsen. Deze aanpak elimineert de noodzaak van peristaltische pompen en vergemakkelijkt de schaalbaarheid van dit platform voor toepassingen met een hoge doorvoer. Het computergestuurde karakter van 3D-bioprinttechnologie stroomlijnt ook het fabricageproces, waardoor de kans op fouten tijdens de productie wordt verkleind. Het VOP-model is veelbelovend als een waardevol hulpmiddel voor farmacologische tests bij het ontdekken van geneesmiddelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Genereren van G-code voor de bioprinter

  1. Om het afdrukpad te genereren en te visualiseren, gaat u naar een online G-code-simulatietool (bijv. NCviewer).
  2. Klik op het pictogram Nieuw bestand op de interface om een nieuw G-codebestand te maken.
  3. Genereer een afdrukpad door handmatig de G-code-commando's voor het opofferingskanaal en de siliciumkamer te schrijven. Gebruik de afmetingen van een standaard plaat met zes putjes als referentie voor het maken van de geometrie.
    OPMERKING: De G-code die hier wordt gebruikt, is gebaseerd op de Computer Numerical Control (CNC)-code. De functies van elke opdracht worden weergegeven in aanvullende tabel S1. Het plaatformaat met zes putjes werd gekozen vanwege de compatibiliteit met commerciële microplaatlezers en microscopie-opstellingen en het vermogen om voldoende mediavolumes te bevatten om de rijping van endotheel te ondersteunen, waardoor de noodzaak van frequente mediawisselingen tot een minimum wordt beperkt. Dit fabricageprotocol kan ook worden aangepast voor gebruik met andere standaard putplaten.
  4. Zodra de G-code is voltooid, klikt u op het pictogram Bestand opslaan op de interface om het bestand met de extensie .nc te downloaden.
    OPMERKING: Elk ander beschikbaar algoritme voor het genereren van G-codes kan worden gebruikt om de afdrukpaden te genereren. De geometrie van het vasculaire kanaal kan in deze G-code worden gemanipuleerd.

2. Bereiding van offer- en siliconenkamerinkten

OPMERKING: Bronnen voor alle materialen die in dit protocol worden gebruikt, worden vermeld in de Materiaaltabel.

  1. Combineer twee soorten siliconenpolymeren, SE1700 en polydimethylsiloxaan (PDMS), in een verhouding van 10:2. Voeg uithardingsmiddel van elk polymeer toe in een verhouding van 10:1, polymeer tot uithardingsmiddel.
  2. Gebruik een planeetmenger om het polymeermengsel grondig te mengen en te ontgassen met 2.000 tpm.
  3. Breng het gemengde siliconenpolymeer met een spatel over in een wegwerpspuit van 10 ml. Centrifugeer de geladen spuit bij 400 × g gedurende 3 minuten bij 5 °C om een gelijkmatige consistentie te garanderen en luchtbellen tijdens het afdrukken te voorkomen.
    OPMERKING: De kamerinkt moet binnen 2 uur na toevoeging van de uithardingsmiddelen worden gebruikt om een optimale afdrukkwaliteit te garanderen. Bewaar de spuit bij 5 °C terwijl u zich voorbereidt op het afdrukken. Dit proces helpt het uitharden van de inkt te vertragen, wat anders de afdrukparameters kan veranderen.
  4. Weeg Pluronic F-127 (PF127) om een 40% (w/v) voorraadoplossing van PF127 in gedestilleerd water te bereiden.
  5. Meng de PF127-oplossing in een planeetmenger gedurende 3 minuten op 400 × g om homogeniteit te bereiken. Houd het gehomogeniseerde mengsel op 4 °C voor volledige oplossing van PF127.
  6. Bereid een trombinebouillonoplossing van 1.000 eenheden/ml in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS).
    OPMERKING: Bewaar trombinebouillonoplossing in aliquots van 100 μl om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen. De aliquots mogen niet langer dan 6 maanden bij -20 °C worden bewaard.
  7. Bereid vóór het afdrukken offerinkt voor door trombine te mengen in een verdunning van 1:10 met PF127 tot een uiteindelijke werkconcentratie van 36% (w/v) voor PF127 en 100 eenheden/ml voor trombine. Om 1 ml offerinkt te bereiden, mengt u 100 μl trombinebouillonoplossing met 900 μl PF127-bouillonoplossing.
    OPMERKING: Bij het voorbereiden van de offerinkt voor het bedrukken van een enkele plaat, is een totaal volume van 1 ml meer dan voldoende.

3. Fabricage proces

  1. Voordat u met het fabricageproces begint, behandelt u een plaat met zes putjes met zuurstof (O2) plasma met een sterkte van 100 watt gedurende 1 minuut.
  2. Volg de procedure die wordt beschreven in sectie 2 om zowel de opofferingsinkt als de siliconeninkt te bereiden, waarbij u ervoor zorgt dat de inkten vrij zijn van luchtbellen en homogeen gemengd zijn voor consistent afdrukken. Plaats de inkten voorzichtig in de printkop van de bioprinter. Stel de temperatuur van de kop van de bioprinter in op 37 °C voor de offerinkt en 5 °C voor de siliconeninkt.
  3. Bevestig een taps toelopend mondstuk van 22 G met dubbele schroefdraad op de siliconenspuit. Kies voor de opofferingsinkt de grootte van het spuitstuk op basis van de gewenste kanaaldiameter.
    OPMERKING: Hier hebben we drie maten spuitmonden gedemonstreerd: 18 G, 20 G en 22 G. Optimale afdrukparameters, waaronder afdrukdruk en printkopsnelheid, worden beschreven in Tabel 1.
  4. Laad de gewenste G-code en druk 3 s op de servo-ready-functie op de software-interface van de bioprinter. Plaats de plaat op de werktafel bij het startpunt van de G-code en klik op start om het afdrukproces te starten.
    OPMERKING: Doorgaans duurt de fabricage van één plaat met zes kamers ongeveer 1 uur en 10 minuten. Stap 3.4, waarbij de G-code wordt geladen en uitgevoerd, kan variëren afhankelijk van de specifieke bioprinter die wordt gebruikt. Zorg ervoor dat steriele omstandigheden worden gehandhaafd tijdens het gebruik van de bioprinter om besmetting te voorkomen.
  5. Plaats een deksel op de plaat en breng de plaat over naar een bevochtigde CO2 -incubator bij 37 °C gedurende 72 uur om de siliciumkamers uit te harden.
    NOTITIE: Hoewel het uitharden van silicium in de incubator langzamer kan plaatsvinden, mag de plaat niet in een droge oven worden geplaatst.

4. Hydrogelvoorbereiding en kanaalinbedding

  1. Bereid een conische buis van 50 ml voor met 20 ml 1x PBS. Breng 0,01 g lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP) in de conische buis om een 0,05% (m/v) LAP-oplossing te maken. Draai het totdat het poeder volledig is opgelost.
    NOTITIE: Wikkel de conische buis in folie om blootstelling aan licht te voorkomen. Bewaar de LAP-stockoplossing bij 4 °C.
  2. Voeg 3 g gelatinemethacrylaat (GelMA) en 0,2 g fibrinogeen toe aan 20 ml LAP-oplossing om een eindconcentratie van 15% GelMA en 1% fibrinogeen (aangeduid als GelFib) te bereiken. Plaats het mengsel in een waterbad van 37 °C en meng regelmatig met een draaikolk totdat de oplossing volledig is opgelost.
  3. Voeg na de fabricage, zoals beschreven in hoofdstuk 3, 300 μL voorverwarmde GelFib toe aan elke hydrogelkamer om het offerpatroon in te sluiten. Vernet de GelMA snel met ultraviolet (UV) licht met een golflengte van 405 nm met een intensiteit van 85 mW/cm2 gedurende 120 s. Herhaal deze procedure voor alle andere putjes.
    OPMERKING: Fibrinogeen verknoopt snel bij contact met het offerpatroon dat trombine bevat. We raden aan om hydrogel toe te voegen en voor elk putje afzonderlijk UV-verknoping uit te voeren om ongewenste gelering van GelMA bij kamertemperatuur te voorkomen. Bovendien moeten steriele omstandigheden worden gehandhaafd om besmetting tijdens het UV-uithardingsproces te voorkomen.
  4. Voeg 1 ml DPBS toe aan elke kant van het vasculaire kanaal in elk putje en houd de plaat gedurende 15 minuten op 4 °C om de PF127 vloeibaar te maken.
  5. Zuig na 15 minuten de DPBS af en herhaal stap 4.5 3x voor volledig wassen van PF127.
  6. Voordat u cellen in de kanalen introduceert, laat u DMEM F12 met 1% Matrigel gedurende 30 minuten door de kanalen perfuseren om de celhechting te verbeteren.

5. HUVEC-cultuur

  1. Verwarm het endotheelcelgroeimedium (ECGM) voor in een waterbad van 37 °C gedurende 30 min.
  2. Haal ondertussen een injectieflacon met ingevroren HUVEC's uit de stikstoftank, draai de dop van de flacon voorzichtig los en draai deze vervolgens weer vast om stikstof uit de draden te laten ontsnappen. Ontdooi de cellen onmiddellijk door de injectieflacon gedurende 2 minuten onder te dompelen in een waterbad van 37 °C, en zorg ervoor dat er een kleine hoeveelheid ijs in de injectieflacon achterblijft. Spoel de injectieflacon met 70% ethanol om besmetting te voorkomen.
    NOTITIE: Draag een veiligheidsbril bij het ophalen van cellen uit de stikstoftank. De dop van de injectieflacon moet tijdens dit proces boven het waterniveau worden gehouden.
  3. Maak een conische buis van 15 ml met 5 ml voorverwarmd ECGM. Breng met een micropipet de ontdooide cellen voorzichtig over van de injectieflacon in de conische buis. Om ervoor te zorgen dat er geen cellen achterblijven, voegt u 1 ml vers voorverwarmd medium toe aan de cryovial, spoelt u de binnenkant af en plaatst u de resterende cellen in de conische buis.
  4. Centrifugeer de conische buis bij 200 × g gedurende 3 minuten om een celpellet te verkrijgen. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de cellen in 10 ml vers medium, breng de cellen over in een T75-kolf en plaats de kolf in een bevochtigde CO2 -incubator van 37 °C.
    OPMERKING: Deze stap is belangrijk om dimethylsulfoxide dat aanwezig is in het vriesmedium in de cryovial te verwijderen door middel van centrifugeren.
  5. Ververs het medium om de dag totdat de cellen 80-90% samenvloeiing bereiken.

6. Endothelisatie van kanalen

  1. ECGM, DPBS, trypsineneutraliserende oplossing en trypsine ethyleendiaminetetra-azijnzuur (TE) voorverwarmen in een waterbad van 37 °C gedurende 30 min.
  2. Spoel bij 90% confluentie de cellen in een T75-kolf met 10 ml DPBS, voeg 1 ml 0,25% TE toe aan de kolf en incubeer deze gedurende 3 minuten.
  3. Tik zachtjes op de zijkanten van de kolf en voeg 5 ml trypsine-neutraliserende oplossing toe om de TE te neutraliseren. Breng de cellen over in een conische buis van 15 ml. Gebruik 5 ml vers ECGM om de resterende cellen te verzamelen en voeg ze toe aan de conische buis.
  4. Centrifugeer de conische buis bij 250 × g gedurende 3 minuten om de celpellet op te vangen.
  5. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in 1 ml vers ECGM. Tel de cellen met een hemocytometer en herhaal stap 6.4 om een celkorrel te verkrijgen. Resuspendeer 3 miljoen cellen in 90 μL vers ECGM.
  6. Voordat u de celsuspensie in het kanaal inbrengt, moet u het kanaal kort vacuüm zuigen om het lumen vrij te maken.
    NOTITIE: Vermijd langdurig aanzuigen van het kanaal om beschadiging van de integriteit te voorkomen.
  7. Laad het kanaal voorzichtig met een celsuspensie met een zaaidichtheid van 0,5 miljoen cellen per putje. Gebruik een micropipet om ~15 μL van deze suspensie toe te voegen om het kanaal te vullen.
    OPMERKING: De zaaidichtheid kan variëren afhankelijk van de grootte van het kanaal. Deze dichtheid is geoptimaliseerd voor een kanaal dat is geprint met een mondstuk van 20 G en een interne diameter van ongeveer 900 μm.
  8. Plaats de plaat 2 uur plat in de couveuse. Keer de plaat vervolgens om naar 180° en houd deze de volgende 2 uur in een vlakke positie.
  9. Was het kanaal na 4 uur met DPBS om niet-hechtende en dode cellen te verwijderen. Voeg 2 ml vers ECGM toe aan elk putje (1 ml aan elke kant van het kanaal). Start de dynamische cultuur op een wip bij een kantelhoek van 10° en 5 tpm door de plaat op de tuimelaar te plaatsen met de kanalen evenwijdig aan de schommelrichting. Ververs het groeimedium om de dag.
    OPMERKING: Dynamische cultuur verbetert de mediumuitwisseling tussen de reservoirs en kanalen en helpt de cellen 's nachts te prolifereren.

7. Beoordeling van de endotheelrijping

  1. ECGM en DPBS voorverwarmen in een waterbad van 37 °C gedurende 30 minuten en Cell Counting Kit-8 (CCK8) reagens bij kamertemperatuur.
  2. Maak een werkende oplossing van CCK8 door 100 μL CCK8-reagens te mengen met 1 ml vers ECGM voor elk putje. Terwijl u voor een plaat/6-kanaals werkt, bereidt u 600 μL CCK8-reagens voor door dit te combineren met 6 ml vers ECGM.
  3. Verwijder het groeimedium door te zuigen en spoel de kanalen af met DPBS. Voeg 1 ml CCK8-werkoplossing toe aan elk putje en laat de plaat 30 minuten plat in de incubator liggen. Start daarna de dynamische cultuur op een wip zoals beschreven in stap 6.9 en ga de volgende 3 uur door met dit proces.
  4. Verwijder na 3 uur de inhoud van elk putje door de plaat naar één kant te kantelen en leg ze op een nieuwe plaat met zes putjes. Spoel de kanalen af met DPBS en voeg vers medium toe.
    NOTITIE: Bedek de plaat met aluminiumfolie tot de absorptiemeting. Zorg voor een consistent reagensvolume in alle putjes om uniforme metingen te garanderen. Vermijd tijdens het pipetteren zorgvuldig het introduceren van luchtbellen, die de nauwkeurigheid van optische dichtheidsmetingen kunnen verstoren.
  5. Nadat u de plaat 15 s voorzichtig hebt geschud om een gelijkmatige menging van de kleuren te garanderen, gebruikt u een microplaatlezer om de absorptie bij 450 nm te meten.
  6. Herhaal deze procedure met vooraf gedefinieerde tijdsintervallen. Bereken de gemiddelde optische dichtheid voor elk tijdstip en teken een groeicurve uit in grafische software. Deze curve geeft de relatieve rijping van het endotheel in de tijd aan.

8. Permeabiliteit test

  1. Verwijder het medium uit een interessant putje.
    OPMERKING: Voor de permeabiliteitstest wordt aanbevolen om elk putje afzonderlijk te verwerken om te voorkomen dat andere kanalen uitdrogen, wat hun vasculaire permeabiliteit zou kunnen veranderen.
  2. Bereid 6 ml 0,1 mg/ml-oplossing van FITC-geconjugeerd dextran door 70 kDa FITC-dextran op te lossen in DPBS.
    OPMERKING: Bereid een 20 mg/ml bouillonoplossing van FITC dextran door 100 mg FITC dextran op te lossen in 5 ml DPBS. Nadat de oplossing voorzichtig is gewerveld, aliquot 500 μl in buisjes van 1,5 ml om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen. Deze aliquots kunnen maximaal 6 maanden bij -20 °C worden bewaard. Alvorens de test uit te voeren, verdunt u de stockoplossing tot een werkconcentratie van 0,1 mg/ml.
  3. Plaats de plaat stevig op de microscooptafel en pas de vergroting van het objectief aan in de fasecontrastmodus om een duidelijk zicht te garanderen van de kanaalwand in het interessegebied, samen met de gel in de buurt, binnen het gezichtsveld.
    OPMERKING: Probeer voor een effectieve beoordeling van de permeabiliteit het gebied van de gel rond het interessegebied in het gezichtsveld te maximaliseren; Dit aspect is essentieel voor een nauwkeurige monitoring van Dextran transport.
  4. Nadat u op het gewenste gebied hebt scherpgesteld, schakelt u over van fasecontrast naar fluorescentiemodus. Voeg onder het tabblad beeldacquisitie FITC toe aan het breedveldkanaal en verkrijg een afbeelding voordat u dextranoplossing toevoegt om de achtergrondfluorescentie-intensiteit te berekenen. Voeg vervolgens 1 ml FITC dextran werkoplossing toe aan de ene kant van het kanaal en laat de oplossing naar de andere kant van de put stromen, aangedreven door het hydrostatische drukverschil.
  5. Verkrijg afbeeldingen met vooraf bepaalde tijdsintervallen - vaker voor kanalen met een hoge permeabiliteit en minder vaak voor kanalen met een lagere permeabiliteit.

9. Meting van de fluorescentie-intensiteit in ImageJ

  1. Meet in de ImageJ-beeldanalysesoftware de intensiteit op het begintijdstip (It1), de gemiddelde intensiteit die op het latere tijdstip (It2) wordt waargenomen en de intensiteit als gevolg van achtergrondruis (Ib), zoals hieronder beschreven. Gebruik vergelijking (1) om de permeabiliteitscoëfficiënt (Pd) te berekenen. T1 en T2 verwijzen naar de begin- en latere tijdstippen van beeldacquisitie.
    figure-protocol-1(1)
    1. Start ImageJ en open de afbeelding die op het eerste tijdstip is verkregen.
    2. Stel de schaal in ImageJ in. Navigeer naar Analyseren | Schaal instellen. Voer de bekende schaal en meeteenheid in.
    3. Selecteer het rechthoekgereedschap en teken een rechthoek over het gebied van de gel waar de fluorescentie-intensiteitsmeting vereist is.
    4. Navigeer naar Analyseren | Stel Metingen in en zorg ervoor dat de gemiddelde grijswaarde is aangevinkt.
      OPMERKING: Deze optie meet de gemiddelde intensiteit binnen het geselecteerde gebied. Andere parameters kunnen worden geselecteerd als dat nodig is voor de gegeven analyse.
    5. Navigeer met het gebied nog steeds geselecteerd naar Analyseren | Meet of druk gewoon op M. Wacht tot een resultatenvenster wordt geopend met de gemiddelde fluorescentie-intensiteit en eventuele andere geselecteerde parameters.
    6. Voer drie metingen uit en bereken de gemiddelde fluorescentie-intensiteitswaarde in een spreadsheet.
    7. Herhaal deze procedure voor de beelden die zijn vastgelegd op het volgende tijdstip t2, evenals de beelden die zijn gemaakt vóór de toevoeging van de dextraanoplossing voor de berekening van de fluorescentie-intensiteit op het latere tijdstip, om de achtergrondfluorescentie te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het VOP-platform, met flexibiliteit in grootte en patroon, werd vervaardigd met een multi-head bioprinting-systeem. Kanalen, zowel hol als perfusiebestendig, werden bezaaid met HUVEC's om endothelialisatie te vergemakkelijken en werden vervolgens beoordeeld met een permeabiliteitstest (figuur 1A). Om de productiecapaciteit van deze methode op meerdere schalen te demonstreren, hebben we drie verschillende configuraties geprint: recht, gespleten en ingewikkeld...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Door gebruik te maken van de precisie, automatisering en computergestuurde aard van 3D-bioprinttechnologie, hebben we een gestroomlijnde methode ontwikkeld voor het vervaardigen van vasculaire kanalen in standaard zesputsplaten, die werden gekozen vanwege hun compatibiliteit met commerciële microplaatlezers en microscoopbeeldvormingsopstellingen. Het ontwerp van de plaat is geschikt voor kanalen met meerdere formaten en een voldoende volume media voor de groei van grotere kanalen, terwij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen concurrerende financiële belangen zijn.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Research Foundation of Korea (NRF) die werden gefinancierd door de Koreaanse regering (Ministerie van Wetenschap en ICT, MSIT) [Nr. NRF-2019R1C1C1009606; Nr. 2020R1A5A8018367; en nee. RS-2024-00423107]. Dit onderzoek werd ondersteund door het Bio and Medical Technology Development Program van de NRF-subsidies die werden gefinancierd door de MSIT [nr. NRF-2022M3A9E4017151 en nr. NRF-2022M3A9E4082654]. Dit werk werd ondersteund door het Technology Innovation Program [nr. 20015148] en het Alchemist Project [nr. 20012378] gefinancierd door het ministerie van Handel, Industrie en Energie (MOTIE, Korea). Dit werk werd ook ondersteund door het Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture and Forestry (IPET) via het Agriculture and Food Convergence Technologies Program for Research Manpower development, gefinancierd door het Ministerie van Landbouw, Voedsel en Plattelandszaken (MAFRA) [Nr. RS-2024-00397026].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 mL Serologische PipetteSPLSPL 91010
10 mL spuit Shinchang Medical
15 mL conische buisSPL50015
3D Bioprinter T&R Biofab3DX-Printer
6-well plate SPL37206
Biologische veiligheidskastenCHC LABPCHC-777A2-04, 
Brightfield Inverted MicroscopesLeicaDMi1
Cell Counting Kit (CCK8)GlpBioGK10001
Cell Counting Kit (CCK8)GlpBioGK10001
Cell Culture Flask 75TSPL70075
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mLCorning354230
Gedestilleerd water
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO, Cell Culture GradeSigma aldrichD2438
Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a KitDOWDC-184
DOWSIL SE 1700 Clear W/C 1.1 KG Kit DOW2924404
D-PBS - 1xWelgeneLB001-01
Endotheelcelgroeimedium MV 2 (klaar voor gebruik)PromocellC-22022
Eppendorf Micro pipet(1000,200,100,20,10)eppendorf
Ethyl Alcohol 99.9%DuksanD5
ExcelMicrosoft
Fibrinogeen uit runderplasmaSigma AldrichF8630-1G
FITC Dextran 70 kDaSigma Aldrich46945-100MG-F
Fluorescente kralen (1,0 μm, groen)Sigma AldrichL1030-1ML
GelMA-poeder (Gelatine metacrylaat) 50 g3D Materials 20JT29
Gibco, Recovery Cell Culture Freezing Medium, 50 mLGibco
HUVECs (Human Umbillical Vein Endotheelcellen)Promocell
ImageJ softwareNIH
IncubatorThermo SCIENTIFICForma STERI-CYCLE i160 CO2 Incubator
Invitrogen, Live/dead viability/cytotoxicity Kit (voor zoogdiercellen)Thermo FisherL3224
Lithium Fenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) fosfaatpoeder Tokoyo Chemical Industry CO.85073-19-4 
Marienfeld Superior, TelkamerdekselMarienfeld Superior
Marienfeld Superior, Hemocytometer, celtelkamerMarienfeld SuperiorHSU-0650030
MicrocentrifugeeppendorfCentrifuge 5920 R
NCViewer.com
StikstoftankWORTHINGTON INDUSTRIESLS750
Omnicure UV LaserEXCELITASSERIES 1500
Parafilm MamcorPM-996
Penicilline-streptomycine-oplossing (100x)GenDEPOTCA005-010
Planetaire mixerTHINKY CORPORATION, japanARE-310
PlasmabehandelingsmachineFEMTO SCIENCECUTE-1MPR
Pluronic F-127Sigma aldrichP2443-250G
Voorbereide buffer, (P2007-1) 10x PBSBiosesangPR4007-100-00
ReagensopslagkastZIO FILTER TECHSC2-30F-1306D1-BC
Real time Live cell Imaging MicroscopeCarl ZEISS
KoelkastSAMSUNGRT50K6035SL
ROCKER 2D digitalIKA4003000
LepelCacheBySL-SCO7001-EA
sigma, Trypsine-EDTA oplossing, 0,25%Sigma aldrichT4049-100ML
Natriumdodecylsulfaat (SDS)Thermo Fisher scientific151-21-3
SpruitspuittipFISNAR3051806
TellerControl Company C23-147-050
Conische mondstuk (18 G)MushashiTPND-18G-U
Conische mondstuk (22 G)MushashiTPND-22G-U
Conische mondstuk 20 GMusashiTPND-20G-U
Trombine uit runderplasmaSigma AldrichT7326-1KU
Timer, 4-kanaalsETLSL.Tim3005
Trypan Blauw oplossing 0,4%Gibco15250061
Trypsine Neutralizing SolutionPromocellC-41120
UG 24 mL UG zalfpotYamayuNo. 3-53
UG 58 mL UG zalfpotYamayuNo. 3-55
WaterbadDAIHAN ScientificWB-11
WeegmachineSartoriusbce2241-1skr
```

Referenties

  1. O'Connor, C., Brady, E., Zheng, Y., Moore, E., Stevens, K. R. Engineering the multiscale complexity of vascular networks. Nat Rev Mater. 7 (9), 702-716 (2022).
  2. Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends Mol Med. 27 (4), 314-331 (2021).
  3. Claesson-Welsh, L. Vascular permeability-the essentials. Ups J Med Sci. 120 (3), (2015).
  4. Wautier, J. -L., Wautier, M. -P. Vascular Permeability in Diseases. Int. J. Mol. Sci. 23 (7), (2022).
  5. Higashi, Y., Kihara, Y., Noma, K. Endothelial dysfunction and hypertension in aging. Hypertens Res. 35 (11), (2012).
  6. Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: current concepts and clinical implications. Front Med (Lausanne). 8, 798958(2022).
  7. Park, W., Lee, J. -S., Gao, G., Kim, B. S., Cho, D. -W. 3D bioprinted multilayered cerebrovascular conduits to study cancer extravasation mechanism related with vascular geometry. Nat Commun. 14 (1), 7696(2023).
  8. Sun, H. -J., Wu, Z. -Y., Nie, X. -W., Bian, J. -S. Role of endothelial dysfunction in cardiovascular diseases: the link between inflammation and hydrogen sulfide. Front Pharmacol. 10, 1568(2020).
  9. Yuan, Y., Sun, J., Dong, Q., Cui, M. Blood-brain barrier endothelial cells in neurodegenerative diseases: Signals from the "barrier.". Front Neurosci. 17, 1047778(2023).
  10. Hadi, H. A., Suwaidi, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Vasc Health Risk Manag. 3 (6), 853-876 (2007).
  11. De Vriese, A. S., Verbeuren, T. J., Van de Voorde, J., Lameire, N. H., Vanhoutte, P. M. Endothelial dysfunction in diabetes. Br J Pharmacol. 130 (5), 963-974 (2000).
  12. Wang, K., et al. Inflammatory environment promotes the adhesion of tumor cells to brain microvascular endothelial cells. Front Oncol. 11, 691771(2021).
  13. Tiwary, S., et al. Metastatic brain tumors disrupt the blood-brain barrier and alter lipid metabolism by inhibiting expression of the endothelial cell fatty acid transporter Mfsd2a. Sci Rep. 8 (1), 8267(2018).
  14. Chauhan, V. P., Stylianopoulos, T., Boucher, Y., Jain, R. K. Delivery of molecular and nanoscale medicine to tumors: transport barriers and strategies. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2 (1), 281-298 (2011).
  15. Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC Basic Transl Sci. 4 (7), 845-854 (2019).
  16. Morgan, S. J., et al. Use of animal models of human disease for nonclinical safety assessment of novel pharmaceuticals. Toxicol Pathol. 41 (3), 508-518 (2013).
  17. Rotman, D. Can Pfizer deliver. MIT Technology Review. , Available from: https://www.technologyreview.com/2004/02/01/233321/can-pfizer-deliver/ (2004).
  18. Raasch, M., et al. Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions. Biofabrication. 7 (1), 015013(2015).
  19. Xu, Z., et al. Design and construction of a multi-organ microfluidic chip mimicking the in vivo microenvironment of lung cancer metastasis. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (39), 25840-25847 (2016).
  20. Strobel, H. A., et al. Assembly of tissue-engineered blood vessels with spatially controlled heterogeneities. Tissue Eng Part A. 24 (19-20), 1492-1503 (2018).
  21. Atchison, L., Zhang, H., Cao, K., Truskey, G. A. A Tissue engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome using human iPSC-derived smooth muscle sells. Sci Rep. 7 (1), 8168(2017).
  22. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  23. Gold, K. A., et al. 3D bioprinted multicellular vascular models. Adv Healthc Mater. 10 (21), 2101141(2021).
  24. Tabriz, A. G., Hermida, M. A., Leslie, N. R., Shu, W. Three-dimensional bioprinting of complex cell laden alginate hydrogel structures. Biofabrication. 7 (4), 045012(2015).
  25. Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Adv. Funct. Mater. 27 (33), 1700798(2017).
  26. Cho, W. -W., Ahn, M., Kim, B. S., Cho, D. -W. Blood-lymphatic integrated system with heterogeneous melanoma spheroids via in-bath three-dimensional bioprinting for modelling of combinational targeted therapy. Adv Sci (Weinh). 9 (29), 2202093(2022).
  27. Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  28. Polacheck, W. J., Kutys, M. L., Tefft, J. B., Chen, C. S. Microfabricated blood vessels for modeling the vascular transport barrier. Nat Protoc. 14 (5), 1425-1454 (2019).
  29. Li, H., et al. Expanding sacrificially printed microfluidic channel-embedded paper devices for construction of volumetric tissue models in vitro. Biofabrication. 12 (4), 045027(2020).
  30. Gao, G., Park, J. Y., Kim, B. S., Jang, J., Cho, D. Coaxial cell printing of freestanding, perfusable, and functional in vitro vascular models for recapitulation of native vascular endothelium pathophysiology. Adv Healthc Mater. 7 (23), 1801102(2018).
  31. Farasatkia, A., Kharaziha, M., Ashrafizadeh, F., Salehi, S. Transparent silk/gelatin methacrylate (GelMA) fibrillar film for corneal regeneration. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 120, 111744(2021).
  32. Duong, V. T., et al. Double-layered blood vessels over 3 mm in diameter extruded by the inverse-gravity technique. Biofabrication. 15 (4), 045022(2023).
  33. Luo, L., et al. Application of bioactive hydrogels combined with dental pulp stem cells for the repair of large gap peripheral nerve injuries. Bioact Mater. 6 (3), 638-654 (2021).
  34. Zhu, M., et al. Gelatin methacryloyl and its hydrogels with an exceptional degree of controllability and batch-to-batch consistency. Sci Rep. 9 (1), 6863(2019).
  35. Wang, Y., et al. Development of a photo-crosslinking, biodegradable GelMA/PEGDA hydrogel for guided bone regeneration materials. Materials. 11 (8), 1345(2018).
  36. Han, Y., et al. Biomimetic injectable hydrogel microspheres with enhanced lubrication and controllable drug release for the treatment of osteoarthritis. Bioact Mater. 6 (10), 3596-3607 (2021).
  37. Bupphathong, S., et al. Gelatin methacrylate hydrogel for tissue engineering applications-a review on material modifications. Pharmaceuticals. 15 (2), 171(2022).
  38. Wu, Z., et al. Microfluidic printing of tunable hollow microfibers for vascular tissue engineering. Adv Mater Technol. 6 (8), 2000683(2021).
  39. Medina-Leyte, D. J., Domínguez-Pérez, M., Mercado, I., Villarreal-Molina, M. T., Jacobo-Albavera, L. Use of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) as a model to study cardiovascular disease: a review. Appl. Sci. 10 (3), 938(2020).
  40. Khattak, S. F., Bhatia, S. R., Roberts, S. C. Pluronic F127 as a cell encapsulation material: utilization of membrane-stabilizing agents. Tissue Eng. 11 (5-6), 974-983 (2005).
  41. Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  42. Kim, S. -J., et al. Bioprinting methods for fabricating in vitro tubular blood vessel models. Cyborg Bionic Syst. 4, 0043(2023).
  43. Maji, S., Lee, M., Lee, J., Lee, J., Lee, H. Development of lumen-based perfusable 3D liver in vitro model using single-step bioprinting with composite bioinks. Mater Today Bio. 21, 100723(2023).
  44. Pauty, J., et al. A vascular permeability assay using an in vitro human microvessel model mimicking the inflammatory condition. Nanotheranostics. 1 (1), 103-113 (2017).
  45. van Duinen, V., et al. 96 perfusable blood vessels to study vascular permeability in vitro. Sci Rep. 7 (1), 18071(2017).
  46. Pink, D. B. S., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS ONE. 7 (3), e33760(2012).
  47. Filippi, M., et al. Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue. AAdv Healthc Mater. 12 (18), 2300151(2023).
  48. Zhang, F., Lin, D. S. Y., Rajasekar, S., Sotra, A., Zhang, B. Pump-less platform enables long-term recirculating perfusion of 3D printed tubular tissues. Adv Healthc Mater. 12 (27), 2300423(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

3D-bioprintenvasculaire weefselmodellenendotheelcellenhydrogelkanalenperfuseerbare vatenimmunokleuring CD31modellering van bloedvaten
High-throughput bioprinting-methode voor het modelleren van vasculaire permeabiliteit in standaard zeswellsplaten met maat- en patroonflexibiliteit
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.