Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Traan-afgeleide exosomale miR-15a als nieuw diagnostisch hulpmiddel voor diabetische retinopathie

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66687

⸱

30 december 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UM Eye Research Centre (UMERC), Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya, 2Department of Ophthalmology, Universiti Malaya Medical Centre, 3Department of Anaesthesiology and Department of Pathology, Johns Hopkins School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een protocol voor het verzamelen en detecteren van miR-15a uit tranen als een nieuw diagnostisch hulpmiddel voor diabetische retinopathie.

Samenvatting

Diabetische retinopathie (DR) is een belangrijke complicatie van diabetes mellitus en treft een aanzienlijk percentage van de diabetische bevolking. Vroege diagnose en interventie zijn cruciaal om onomkeerbaar gezichtsverlies te voorkomen. Huidige diagnostische methoden, hoewel effectief, hebben beperkingen. miRNA, een klein niet-coderend RNA dat de stabiliteit en/of translatie van een mRNA remt door te binden aan de 3'-niet-vertaalde regio's (3'-UTR's) van doel-mRNA's, wordt steeds vaker erkend als significant geassocieerd met diabetes en kan worden verkregen uit tranen. Deze studie onderzocht het potentieel van exosomale miR-15a afkomstig van traanvloeistof als een nieuwe diagnostische marker voor DR. Tranenmonsters werden verkregen van 135 diabetische patiënten (36 met diabetische retinopathie [DR] en 50 zonder DR) en 49 gezonde controles. Exosomen werden geïsoleerd en de expressieniveaus van exosomale miR-15a werden gemeten met behulp van druppeldigitale PCR (ddPCR). De resultaten toonden aan dat de expressie van exosomale miR-15a veranderd was bij diabetische en DR-patiënten vergeleken met gezonde personen. Deze bevindingen wijzen erop dat exosomale miR-15a, afkomstig van traanvloeistof, een rol kan spelen in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan diabetes en de complicaties daarvan. Bovendien heeft het potentieel als een niet-invasieve en betrouwbare diagnostische biomarker voor diabetische retinopathie, met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Inleiding

Diabetische retinopathie (DR) is een van de meest prominente microvasculaire complicaties van diabetes en bedreigt het zicht van miljoenen mensen wereldwijd. De wereldwijde prevalentie van DR uit bevolkingsgegevens van IDP Atlas 2019 werd geschat op 22,7% van de totale diabetespopulatie wereldwijd, waarbij het aantal nieuwe gevallen continu toeneemt, vooral in ontwikkelde enontwikkelingslanden. Klinisch wordt DR gekenmerkt door vroegstadium DR of niet-proliferatieve diabetische retinopathie (NPDR), laat stadium DR of proliferatieve diabetische retinopathie (PDR), en de aanwezigheid van macula-oedeem. Verhoogde vasculaire permeabiliteit en capillaire blokkade zijn twee veelvoorkomende pathologische veranderingen die bij NPDR worden waargenomen, en abnormale neovascularisatie van de iris, macula, oogschijve of netvlies wordt waargenomen in het geval van PDR 2,3. De progressie naar PDR, die mogelijk kan leiden tot glasvochtbloeding en netvliesloslating, kan aanzienlijke visuele beperkingveroorzaken 3. In alle gevallen kunnen pathologische veranderingen worden opgespoord door funduscopie of fundusfotografie door getrainde oogartsen4. Met de standaard fundusfotografiemethode kan diabetische retinopathie worden opgespoord met 78%-96% gevoeligheid en 86%-97% specificiteit5. Deze methode detecteert echter pas wanneer er schade aan het netvlies is ontstaan. Er is een onvervulde behoefte aan vroege detectie van DR vóór het begin van klinisch zichtbare netvliestekens, zoals blot-retinale bloedingen, microaneurysma's, exsudaten en proliferatie van nieuwe vaten.

De vooruitgang van moleculaire instrumenten leidde tot de ontdekking van exosomen als potentieel diagnostisch hulpmiddel voor diverse ziekten, waaronder kanker en hart- en vaatziekten 6,7. Exosomen zijn nanodeeltjes die gebonden zijn aan een lipide-dubbellaagmembraan die door de meeste cellen worden afgescheiden in hun extracellulaire vesikel (EV) ruimte. Deze exosomen kunnen worden vervoerd door biovloeistoffen zoals bloed, tranen, speeksel en urine, waardoor ze gemakkelijk toegankelijk zijn voor niet-invasieve of minimaal invasieve diagnostische procedures8. Ze dragen verschillende oorsprongscelmarkers, waaronder eiwitten, lipiden en nucleïnezuren. Van bijzonder belang zijn kleine niet-coderende RNA's die binnen EV's worden gedragen. Hoewel deze RNA's niet gecodeerd zijn voor eiwitten, spelen ze een cruciale rol in genregulatie en zijn ze betrokken bij veel fysiologische en pathologische processen, waaronder in de β alvleeskliercellen, die van groot belang zijn voor de ontwikkeling van diabetes 9,10.

Specifiek is aangetoond dat miR-15a een sterke associatie heeft met de ontwikkeling van diabetes, voornamelijk door de regulatie van insulineproductie en de functies van de bètacellen in de alvleesklier11. Onze groep heeft onlangs aangetoond dat miR-15a veranderd is in het plasma van diabetische retinopathie. Daarnaast is aangetoond dat miR-15a ook wordt afgescheiden door de bètacellen van de alvleesklier, en het reist via de bloedbaan naar het netvlies12. Traanvloeistof wordt beschouwd als een gemakkelijk toegankelijke vloeistof, die gemakkelijk uit het oog kan worden gehaald op een niet-invasieve en kosteneffectieve manier13. Het bevat een mengsel van verschillende eiwitten, lipiden, elektrolyten en andere moleculen, wat de fysiologische toestand van het oogoppervlak en omliggende weefsels, waaronder het netvlies14, weerspiegelt. Er is een hoger aantal miRNA's gedetecteerd in traanvloeistof dan in serum- en waterige humoroplossing15,16. De samenstelling van de tranen verandert als reactie op verschillende systemische aandoeningen, waaronder diabetes17. Sterker nog, traanvloeistofanalyse heeft veelbelovend potentieel voor monitoring en diagnose van andere niet-ooggerelateerde ziekten zoals multiple sclerose en borstkanker18,19. Met de directe link van diabetische retinopathie aan het oog is het relevanter om te kijken naar mogelijke diagnostische eigenschappen van traanvloeistof bij deze ziekte. Niveaus van IL-1RA, IL-8, IL-6 en TNF-α in de traanvloeistoffen van patiënten met diabetische retinopathie zijn waargenomen die veranderingen ondergaan, die ook variëren afhankelijk van de ernst van de ziekte20,21. In vergelijking met het traditionele funduscopieonderzoek biedt traanvloeistofanalyse voor diabetische retinopathie potentiële voordelen op het gebied van toegankelijkheid, niet-invasieve aard en specificiteit, en maakt het vroege detectie mogelijk vóór het begin vande ziekte.

Het hoofddoel van deze studie is daarom het onderzoeken van het potentieel van traanvloeistofafgeleide exosomale miR-15a als een nieuwe diagnostische marker voor diabetische retinopathie door middel van miRNA-isolatie en kwantificering uit traanvloeistoffen van de diabetische retinopathiepopulatie. Hiermee zou er een nieuwe detectiemethode voor diabetische retinopathie komen via traanvloeistofscreening, die al kan worden opgespoord voordat netvliescomplicaties optreden, waardoor vroege preventieve of therapeutische maatregelen mogelijk zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De studie werd uitgevoerd met goedkeuring van het Universiti Malaya Medical Centre Medical Research Ethical Committee (referentienummer: 20165-2446). Schriftelijke toestemming werd verkregen van alle menselijke proefpersonen voorafgaand aan de werving. In totaal werden 135 proefpersonen opgenomen uit de patiënten die de oogheelkundekliniek van het Universiti Malaya Medical Centre (UMMC), Kuala Lumpur, bezoeken. De inclusiecriteria omvatten patiënten die diensten kregen onder UMMC en tussen de 20 en 80 jaar oud waren. Patiënten die een actieve insulinebehandeling ondernamen, een voorgeschiedenis hadden van laser- of anti-VEGF-behandeling in de afgelopen 3 maanden, of regelmatig anti-bloedplaatjes of bloedverdunners kregen, werden uitgesloten van de studie. De proefpersonen werden vervolgens verdeeld in drie groepen: (1) gezonde controlegroep (Controle), (2) diabetisch zonder retinopathie (DM No DR), en (3) diabetisch met retinopathie (DR). Een samenvatting van het protocol is te vinden in Figuur 1. Details van de reagentia en apparatuur die in deze studie zijn gebruikt, zijn vermeld in de Materiaallijst.

figure-protocol-1
Figuur 1: Een overzicht van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Voorbereiding van materialen    

  1. Leg een steriele basisverbandset klaar met twee pincetten, zes wattenbolletjes, vier gaaspads, een dienblad en een biohazard-zak.
  2. Giet 5 ml 0,9% natriumchloride irrigatieoplossing in een bak.
  3. Open een pakje reinigingsdoekjes voor oogleden en leg het op het steriele veld.
  4. Bereid een buis voor met 250 μL conserveermiddel.
  5. Vouw een Schirmer-strip op wigniveau terwijl hij nog in de verpakking zit voordat je de steriele strip op het steriele veld plaatst.
  6. Doe chirurgische handschoenen aan op een aseptische manier.
  7. Met een steriele pincet bevochtigt u de wattenbolletjes met 0,9% met steriele natriumchloride irrigatieoplossing.

2. Voorbereiding van menselijke proefpersonen    

  1. Laat het onderwerp comfortabel zitten en vraag om zijn/haar ogen te sluiten.
  2. Veeg de periorbitale huid vier keer af met wattenbolletjes die in een irrigatieoplossing zijn gedrenkt.
  3. Veeg de periorbitale huid af met een reinigingsdoekje voor oogleden.

3. Verzameling van menselijk traanvocht

  1. Verzamel traanvloeistoffen met de Schirmers-strip die bij de temporale inferieure fornix wordt geplaatst.
  2. Wanneer je de gedeeltelijk gevouwen strook op het rechteroog plaatst, vraag dan het onderwerp om naar links te kijken. Trek het onderste ooglid naar beneden om de onderste fornix bloot te leggen.
  3. Met een paar steriele tangen plaatst u een Schirmer-strip op de buitenste twee derde van de onderste conjunctivale fornix. Vermijd het contact met de strip op de huid om besmetting van het monster met zweet of andere materialen op de huid te voorkomen.
  4. Plaats een gaaspad onder de strip om huidcontact te voorkomen.
  5. Laat de tranen in de strip worden opgenomen tot het 20 mm punt of maximaal 5 minuten, afhankelijk van wat het eerst komt.
  6. Als de 20 mm niveaumarkering niet wordt gehaald, documenteer dan het scheurniveau op basis van de markeringen om het volume van de traanvloeistof te standaardiseren.
  7. Met een paar steriele pincetten verwijdert u voorzichtig de Schirmer-strip en plaatst u deze in een buis met 1x fosfaatbufferzoutoplossing (PBS).
  8. Plaats de buis in een koelbox voor transport naar het laboratorium.
  9. Maak het periorbitale oppervlak schoon door eventuele restjes van de huid weg te vegen.

4. Preprocessing van scheurmonsters    

  1. Vortex de buis met de Schirmer-strip werd 5 minuten op kamertemperatuur in PBS geweekt.
  2. Beweeg de buis 5 minuten op kamertemperatuur op een wippen.
  3. Centrifugeer de buis op 2000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
  4. Doe de oplossing over in een nieuwe buis, label en houd deze op -80 °C tot de verwerking later stroomaf.
  5. Gooi de resterende strook weg.

5. Exosoomisolatie

OPMERKING: RNA-isolatie wordt uitgevoerd met een commercieel verkrijgbare kit volgens het fabrikantprotocol (zie Materiaaltabel).

  1. Ontdooi de traanoplossing 10 minuten op ijs.
  2. Evenwichtig de spinkolom 15 minuten bij kamertemperatuur voordat je hem gebruikt.
  3. Verwijder de onderste uitlaat van de kolom en plaats deze op de meegeleverde afvalopvangplaat.
  4. Verwijder de bovenste afdichtingsmat en laat de opslagbuffer door de kolom passeren door zwaartekrachtkracht.
  5. Voeg 250 μL PBS toe en laat het door de kolom gaan.
  6. Herhaal stap 5.5.
  7. Breng een monster van 110 μL aan de bovenkant van elke kolom en laat het monster de kolom binnengaan.
  8. Breng de kolom over op een meegeleverde monsterverzamelplaat.
  9. Voeg 100 μL PBS toe en laat het door de kolom naar de monsterverzamelplaat gaan.
  10. Breng de kolom over op de afvalopvangplaat.
  11. Voeg 4x 200 μL PBS toe aan de kolom en laat het in de kolom komen om de vrije eiwitfractie van de eerste lading te verwijderen.
  12. Voeg 110 μL monster toe aan de kolom. Laat toe dat je de kolom binnengaat.
  13. Plaats de kolom op een monsterverzamelplaat. Voeg 100 μL PBS toe en laat het door de kolom gaan.
  14. Centrifugeer kort de monsterverzamelplaat op 100 x g gedurende 30 seconden. De geïsoleerde exosomen zijn nu klaar voor RNA-isolatie.

6. RNA-isolatie

OPMERKING: RNA-isolatie wordt uitgevoerd met een commercieel verkrijgbare kit volgens het fabrikantprotocol (zie Materiaaltabel).

  1. Onderwerp 200 μL van de geïsoleerde exosomen aan RNA-isolatie.
  2. Voeg 60 μL lysisbuffer toe aan de geïsoleerde exosomen. Vortex gedurende 5 seconden.
  3. Broed 3 minuten op kamertemperatuur.
  4. Voeg 20 μL remmerprecipitatiebuffer toe, vortex 20 s, en incubeer bij kamertemperatuur 3 minuten.
  5. Centrifugeer op 12.000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Breng het heldere, kleurloze supernatant over in een nieuwe tube.
  7. Voeg 1 volume isopropanol toe.
  8. Vortex 5 seconden en de oplossing overbrengen naar de mini-spinkolom die in de kit is geleverd.
  9. Centrifugeer op kamertemperatuur gedurende 15 seconden bij 8000 x g. Laat de flow erdoorheen vallen.
  10. Was de kolom met 700 μL RWT wasbuffer.
  11. Centrifugeer 15 seconden op 8000 x g. Gooi de doorstroming weg.
  12. Was de kolom met 500 μL RPE wash buffer.
  13. Centrifugeer 15 seconden op 8000 x g. Gooi de doorstroming weg.
  14. Voeg 500 μL 80% ethanol toe aan de mini-spinkolom van het monster.
  15. Centrifugeer 2 minuten op 8000 x g. Verwijder de doorstroom- en verzamelbuis.
  16. Plaats de mini-spinkolom in een nieuwe 2 mL opvangbuis.
  17. Centrifugeer de kolom en buis op 18.000 x g gedurende 5 minuten. Gooi de doorstroom en de opvangbuis weg.
  18. Plaats de mini-spinkolom in een nieuwe 1,5 mL buis en voeg 15 μL RNase-vrij water toe in het midden van het spinkolommembraan.
  19. Incubeer 3 minuten op kamertemperatuur.
  20. Centrifugeer op 18.000 x g gedurende 1 minuut om het RNA te elueren. RNA is klaar voor downstream verwerking.
  21. Voer Nanoparticle tracking-analyse uit voor kwaliteitscontrole en verificatie van de RNA-opbrengst.

7. cDNA-synthese

  1. Voer cDNA-synthese uit met commercieel verkrijgbare kits volgens de protocollen van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
  2. Bereid de mastermix voor volgens Tabel 1 in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
  3. Meng de oplossing door op en neer te pipetten.
  4. Pipette 5,1 μL van de master in 0,1 μL PCR-buizen.
  5. Voeg 9,9 μL sample toe aan de toegewezen buis met de mastermix.
  6. Plaats de PCR-buizen in een thermocycler en laat ze draaien volgens Tabel 2.
    OPMERKING: Het cDNA is klaar voor verdere analyse.
ComponentVolume/reactie
10x RT-buffer1,5 μL
100M dNTP-mix0,15 μL
RNAse-remmer (200U/μL)0,19 μL
Multiscribe RT-enzym (50U/μl)1 μl
20x RT Primer0,75 μL
RNAse vrij water1,51 μL
Voorbeeld9,9 μL
Totaal volume15 μL

Tabel 1: Bereiding van de PCR-mastermix die wordt gebruikt voor cDNA-synthese uit het geïsoleerde RNA.

StepTemperatuurDuur
Omgekeerde transcriptie16 °C30 min
42 °C30 min
Stop85 °C5 min
Houd vast4 °C

Tabel 2: Thermocyclische condities voor de cDNA-synthese.

8. Digitale druppel PCR

OPMERKING: Digitale druppel-PCR (ddPCR) wordt uitgevoerd met commercieel verkrijgbare kits die de protocollen van de fabrikant volgen (zie Materiaaltabel).

  1. Bereid de mastermix voor ddPCR voor in een 1,5 mL microcentrifugebuis volgens Tabel 3.
  2. Pipet 19,8 μL mastermix in 0,1 μL PCR-buizen. Voeg 2,2 μL aan samples toe en meng goed door het mengsel 10 keer op en neer te pipetten.
  3. Breng 20 μL van het monstermengsel over in de monsterbaan van de ddPCR-cartridge.
  4. Voeg 50 μL olie toe aan de oliebaan van de cartridge.
  5. Bevestig een pakking aan de cartridge met de haak op de plaat.
  6. Plaats de cartridge in de druppelgeneratiemachine. Een klikgeluid geeft een correcte invoeging van de cartridge in de druppelgeneratiemachine aan.
  7. Breng zorgvuldig alle gegenereerde druppels over in putten van een plaat met 96 putjes. Voeg minstens één well of no template control well toe als negatieve controle.
  8. Seal de plaat af met een doorboorbare folie in een plaatsealermachine (zie Materiaaltabel).
  9. Plaats de plaat in een thermocycler en voer het uit volgens Tabel 4.
  10. Breng de plaat over in de druppellezer om te tellen voor positieve en negatieve druppels.
  11. Kwantificeer het kopieernummer/mL met behulp van het kopieernummer/20 μL-waarde dat uit de run wordt gegenereerd.
ComponentVolume/reactie
2x ddPCR Supermix voor Sondes (geen dUTP)10 μL
20x slaghoedjes/sonde1 μL
Voorbeeld7 μL
RNAse vrij water2 μL
Totaal volume20 μL

Tabel 3: Bereiding van de PCR-mastermix gebruikt voor ddPCR.

StepTemperatuurDuurRampCyclus
Enzymactivatie95 °C10 min~2 °C/s per stap1
Denaturatie94 °C30 s40
Gloeien60 °C1 min40
Enzymdeactivatie98 °C10 min1
Houd vast4 °CN.v.t.N.v.t.

Tabel 4: Thermocyclische condities voor de ddPCR.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Standaardcurve
Er werd een standaardcurve ontwikkeld om het exacte volume scheuren te bepalen dat van elke patiënt werd verzameld. In feite werden verschillende volumes conserveermiddelbereiken tussen 3 μL en 25 μL blootgesteld aan Schirmer-strips. En de afstand van het natte gebied op de Schirmer werd waargenomen. De procedure werd drie keer herhaald voor elke ingreep, en de gemiddelde waarde werd berekend. Een standaardcurve van het volume van de verzamelde scheuren...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Funduscopieonderzoek, optische coherentietomografie en fluoresceïne-angiografie zijn momenteel beschikbare detectietechnieken voor het opsporen van diabetische retinopathie. De drie technieken worden vaak samen gebruikt om een uitgebreide beoordeling te maken van verschillende netvlies- en choroïdale aandoeningen. Funduscopie is een klinisch onderzoek dat routinematig wordt uitgevoerd tijdens de beoordeling van diabetische retinopathie. Deze methode wordt uitgevoerd door getrainde oogart...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door het Alcon Research Institute (IF011-2020) en de FOM UMSC Care Postdoctoral Research Grant 2021.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.9% w/v Sodium ChlorideAin Medicare Sdn BhdGB16165967618
1x Phosphate Buffer SalineThermo Fisher Scientific10010-023
Applied Biosystems TaqMan MicroRNA Reverse Transcription KitApplied Biosystems4366596
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)BioRad Laboratories1863024
ddPCR 96-Well PlatesBioRad Laboratories12001925
DG8 CartridgesBioRad Laboratories1864008
DG8 GasketsBioRad Laboratories1863009
Droplet Generation Oil for ProbesBioRad Laboratories1863005
Exospin-96 Exosome Isolation KitCell Guidance SystemsEX07-96
miRNeasy Serum/Plasma Advanced KitQiagen 217204
PX1 PCR Plate SealerBioRad Laboratories1814000
QX100 droplet digital PCR SystemBioRad LaboratoriesQX100
QXDx Droplet Generator BioRad Laboratories12001049
Schirmer StripOptitechSCH-100
T100 Thermal CyclerBioRad Laboratories1861096
Taqman MicroRNA Assay MTOMED 20 (Assay ID: 000389 )Applied Biosystems4440887Target Sequence: UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG

Referenties

  1. Teo, Z. L., et al. Global prevalence of diabetic retinopathy and projection of burden through 2045: Systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 128 (11), 1580-1591 (2021).
  2. Sayin, N., Kara, N., Pekel, G. Ocular complications of diabetes mellitus. World J Diabetes. 6 (1), 92-108 (2015).
  3. Wang, W., Lo, A. C. Y. Diabetic retinopathy: Pathophysiology and treatments. Int J Mol Sci. 19 (6), 1816(2018).
  4. Yang, Z., Tan, T. E., Shao, Y., Wong, T. Y., Li, X. Classification of diabetic retinopathy: Past, present and future. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1079217(2022).
  5. Goh, J. K. H., et al. Retinal imaging techniques for diabetic retinopathy screening. J Diabetes Sci Technol. 10 (2), 282-294 (2016).
  6. Parizadeh, S. M., et al. Circulating exosomes as potential biomarkers in cardiovascular disease. Curr Pharm Des. 24 (37), 4436-4444 (2018).
  7. Nair, S., Tang, K. D., Kenny, L., Punyadeera, C. Salivary exosomes as potential biomarkers in cancer. Oral Oncol. 84, 31-40 (2018).
  8. Dellar, E. R., Hill, C., Melling, G. E., Carter, D. R. F., Baena-Lopez, L. A. Unpacking extracellular vesicles: RNA cargo loading and function. J Extracell Biol. 1 (5), e40(2022).
  9. Fluitt, M. B., Kumari, N., Nunlee-Bland, G., Nekhai, S., Gambhir, K. K. miRNA-15a, miRNA-15b, and miRNA-499 are reduced in erythrocytes of pre-diabetic African-American adults. Jacobs J Diabetes Endocrinol. 2 (1), 014(2016).
  10. Belgardt, B. F., et al. The microRNA-200 family regulates pancreatic beta cell survival in type 2 diabetes. Nat Med. 21 (6), 619-627 (2015).
  11. Sun, L. L., et al. MicroRNA-15a positively regulates insulin synthesis by inhibiting uncoupling protein-2 expression. Diabetes Res Clin Pract. 91 (1), 94-100 (2011).
  12. Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxid Redox Signal. 27 (13), 913-930 (2017).
  13. Posa, A., et al. Schirmer strip vs. capillary tube method: Non-invasive methods of obtaining proteins from tear fluid. Ann Anat. 195 (2), 137-142 (2013).
  14. Ohashi, Y., Dogru, M., Tsubota, K. Laboratory findings in tear fluid analysis. Clin Chim Acta. 369 (1), 17-28 (2006).
  15. Nakagawa, A., Nakajima, T., Azuma, M. Tear miRNA expression analysis reveals miR-203 as a potential regulator of corneal epithelial cells. BMC Ophthalmol. 21 (1), 377(2021).
  16. Chan, H. W., et al. A pilot study on microRNA profile in tear fluid to predict response to anti-VEGF treatments for diabetic macular edema. J Clin Med. 9 (9), 2920(2020).
  17. Barmada, A., Shippy, S. A. Tear analysis as the next routine body fluid test. Eye (Lond). 34 (10), 1731-1733 (2020).
  18. Tomečková, V., et al. Experimental analysis of tear fluid and its processing for the diagnosis of multiple sclerosis. Sensors (Basel). 23 (11), 5251(2023).
  19. Daily, A., et al. Development and validation of a short-term breast health measure as a supplement to screening mammography. Biomark Res. 10 (1), 76(2022).
  20. Quevedo-Martínez, J. U., et al. Pro-inflammatory cytokine profile is present in the serum of Mexican patients with different stages of diabetic retinopathy secondary to type 2 diabetes. BMJ Open Ophthalmol. 6 (1), e000717(2021).
  21. Sorkhabi, R., Ahoor, M. H., Ghorbani Haghjo, A., Tabei, E., Taheri, N. Assessment of tear inflammatory cytokines concentration in patients with diabetes with varying severity of involvement. Exp Eye Res. 224, 109233(2022).
  22. Adigal, S. S., et al. Human tear fluid analysis for clinical applications: Progress and prospects. Expert Rev Mol Diagn. 21 (8), 767-787 (2021).
  23. Mackay, D. D., Garza, P. S., Bruce, B. B., Newman, N. J., Biousse, V. The demise of direct ophthalmoscopy: A modern clinical challenge. Neurol Clin Pract. 5 (2), 150-157 (2015).
  24. Saeedi, P., et al. Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045: Results from the International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edition. Diabetes Res Clin Pract. 157, 107843(2019).
  25. Kong, L., et al. Significance of serum microRNAs in pre-diabetes and newly diagnosed type 2 diabetes: A clinical study. Acta Diabetol. 48, 61-69 (2011).
  26. Baldeón, R. L., et al. Decreased serum level of miR-146a as sign of chronic inflammation in type 2 diabetic patients. PLoS One. 9 (12), e115209(2014).
  27. Liang, Y. Z., et al. Identification of neuroendocrine stress response-related circulating microRNAs as biomarkers for type 2 diabetes mellitus and insulin resistance. Front Endocrinol (Lausanne). 9, 132(2018).
  28. Wan, S., et al. Increased serum miR-7 is a promising biomarker for type 2 diabetes mellitus and its microvascular complications. Diabetes Res Clin Pract. 130, 171-179 (2017).
  29. Santovito, D., et al. Plasma microRNA signature associated with retinopathy in patients with type 2 diabetes. Sci Rep. 11 (1), 4136(2021).
  30. Smit-McBride, Z., et al. Unique molecular signatures of microRNAs in ocular fluids and plasma in diabetic retinopathy. PLoS One. 15 (7), e0235541(2020).
  31. Sun, Y., Liu, W., Zuo, C. Regulatory role of miRNA-23a in diabetic retinopathy. Exp Ther Med. 22 (6), 1-9 (2021).
  32. Wong, W. K. M., et al. MicroRNA profiling from tears as a potential non-invasive method for early detection of diabetic retinopathy. Methods Mol Biol. 2678, 117-134 (2023).
  33. Amorim, M., et al. Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis. Front Med (Lausanne). 9, 873483(2022).
  34. Arroyo, C. A. -D., et al. Diurnal variation on tear stability and correlation with tear cytokine concentration. Cont Lens Anterior Eye. 45 (6), 101705(2022).
  35. Patel, S., Mittal, R., Kumar, N., Galor, A. The environment and dry eye: Manifestations, mechanisms, and more. Front Toxicol. 5, 1173683(2023).
  36. Benito, M. J., et al. Intra- and inter-day variation of cytokines and chemokines in tears of healthy subjects. Exp Eye Res. 120, 43-49 (2014).
  37. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing. Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).
  38. Shoji, J., Aso, H., Inada, N. Clinical usefulness of simultaneous measurement of the tear levels of CCL17, CCL24, and IL-16 for the biomarkers of allergic conjunctival disorders. Curr Eye Res. 42 (5), 677-684 (2017).
  39. Gijs, M., et al. Pre-analytical sample handling effects on tear fluid protein levels. Sci Rep. 13 (1), 1317(2023).
  40. Vandermeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
  41. Benlloch-Navarro, S., et al. Lipid peroxidation is increased in tears from the elderly. Exp Eye Res. 115, 199-205 (2013).
  42. Li, K., Chen, Z., Duan, F., Liang, J., Wu, K. Quantification of tear proteins by SDS-PAGE with an internal standard protein: A new method with special reference to small volume tears. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (6), 853-862 (2010).
  43. Grigor'eva, A. E., et al. Exosomes in tears of healthy individuals: Isolation, identification, and characterization. Biochem (Moscow) Suppl B Biomed Chem. 10 (2), 165-172 (2016).
  44. Hu, L., et al. Discovering the secret of diseases by incorporated tear exosomes analysis via rapid-isolation system: iTEARS. ACS Nano. 16 (8), 11720-11732 (2022).
  45. Ter-Ovanesyan, D., et al. Framework for rapid comparison of extracellular vesicle isolation methods. eLife. 10, e70725(2021).
  46. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. J Extracell Vesicles. 10 (11), e12145(2021).
  47. Aqrawi, L. A., et al. Proteomic and histopathological characterisation of sicca subjects and primary Sjögren's syndrome patients reveals promising tear, saliva and extracellular vesicle disease biomarkers. Arthritis Res Ther. 21 (1), 181(2019).
  48. Aqrawi, L. A., et al. Identification of potential saliva and tear biomarkers in primary Sjögren's syndrome, utilizing the extraction of extracellular vesicles and proteomics analysis. Arthritis Res Ther. 19 (1), 14(2017).
  49. McKay, T. B., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D., Ciolino, J. B. Extracellular vesicles secreted by corneal epithelial cells promote myofibroblast differentiation. Cells. 9 (5), 1080(2020).
  50. Atienzar-Aroca, S., et al. Oxidative stress in retinal pigment epithelium cells increases exosome secretion and promotes angiogenesis in endothelial cells. J Cell Mol Med. 20 (8), 1457-1466 (2016).
  51. Liu, J., et al. Roles of exosomes in ocular diseases. Int J Nanomedicine. 15, 10519-10538 (2020).
  52. Kenny, A., et al. Proteins and microRNAs are differentially expressed in tear fluid from patients with Alzheimer's disease. Sci Rep. 9 (1), 15437(2019).
  53. Wijesinghe, P., et al. MicroRNAs in tear fluids predict underlying molecular changes associated with Alzheimer's disease. Life Sci Alliance. 6 (6), e202201757(2023).
  54. Urbizu, A., Arnaldo, L., Beyer, K. Obtaining miRNA from saliva-Comparison of sampling and purification methods. Int J Mol Sci. 24 (3), 2386(2023).
  55. Cirillo, P. D. R., Margiotti, K., Mesoraca, A., Giorlandino, C. Quantification of circulating microRNAs by droplet digital PCR for cancer detection. BMC Res Notes. 13 (1), 351(2020).
  56. Sangalli, E., et al. Circulating microRNA-15a associates with retinal damage in patients with early stage type 2 diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 254(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Traanexosomenbiomarkers in traanvochtdroplet digitale PCRexosoomisolatiemicroRNA-profileringnanoparticle trackingniet-invasieve diagnostiekpreventie van visusverlies
Traan-afgeleide exosomale miR-15a als nieuw diagnostisch hulpmiddel voor diabetische retinopathie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.