Methodenartikel

Isolatie, uitbreiding en differentiatie van fibro-adipogene voorlopers van het stekelige muismodel

DOI:

10.3791/66717

⸱

15 november 2024

 ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering and Department of Medical Genetics, University of British Columbia, 2Aspect Biosystems

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst de isolatie van fibro-adipogene voorlopercellen (FAP's) van skelet- en hartspierfibromen (Acomys) via enzymatische dissociatie en fluorescentie-geactiveerde celsortering. De FAP's die uit dit protocol worden verkregen, kunnen effectief worden uitgebreid en gedifferentieerd tot myofibroblasten en adipocyten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vanwege zijn uitzonderlijke reparatieprogramma is de stekelmuis een opkomend onderzoeksmodel voor regeneratieve geneeskunde. Fibro-adipogene voorlopercellen zijn weefselcellen die in staat zijn om te differentiëren in adipocyten, fibroblasten en chondrocyten. Fibro-adipogene voorlopercellen zijn van fundamenteel belang voor het orkestreren van weefselregeneratie, omdat ze verantwoordelijk zijn voor de hermodellering van de extracellulaire matrix na letsel. Deze studie richt zich op het onderzoeken van de specifieke rol van fibro-adipogene voorlopercellen bij hartherstel van stekelige muizen en regeneratie van skeletspieren. Daartoe is een protocol geoptimaliseerd voor de zuivering van fibro-adipogene voorlopercellen van stekelige muizen door middel van flowcytometrie van enzymatisch gedissocieerde skelet- en hartspieren. De populatie die uit dit protocol wordt verkregen, kan zich in vitro uitbreiden en kan worden gedifferentieerd naar myofibroblasten en adipocyten. Dit protocol biedt een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers om de onderscheidende eigenschappen van stekelmuis te onderzoeken en te vergelijken met de Mus musculus. Dit zal inzichten opleveren die het begrip van regeneratieve mechanismen in dit intrigerende model kunnen vergroten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aanvankelijk erkend om zijn uitzonderlijk fragiele huid en opmerkelijk vermogen om huidletsels te herstellen, heeft stekelmuis een superieur regeneratief vermogen aangetoond in verschillende orgaansystemen, zoals musculoskeletale, nier-, centrale zenuwstelsel- en cardiovasculaire, in vergelijking met Mus musculus 1,2.

Fibro-adipogene voorlopercellen (FAP's) zijn een subset van stromale cellen die zich in verschillende weefsels bevinden, waaronder skelet- en hartspieren. Deze cellen bezitten een uniek vermogen om zich in vivo en in vitro te binden aan fibrogene en adipogene afstammingslijnen 3,4. FAP's spelen een cruciale rol bij weefselregeneratie door de extracellulaire matrix te moduleren en de functies van andere celtypen die betrokken zijn bij het herstelproces te ondersteunen. In skeletspieren worden FAP's geactiveerd als reactie op letsel en vergemakkelijken ze spierstamceldifferentiatie en myogenese 5,6. Bij ischemisch letsel aan het hart leggen FAP's littekenweefsel af om de integriteit van het myocardium te behouden. In tegenstelling tot spieren worden cardiale FAP's chronisch geactiveerd en dragen ze bij aan pathologische remodellering 7,8.

Eerdere studies hebben aangetoond dat de extracellulaire matrix van stekelige muizen een andere samenstelling, structuur en eigenschappen heeft die regeneratie ondersteunen in vergelijking met Mus musculus 9,10. Bij spier- en hartletsel is opgemerkt dat FAP's bijdragen aan superieure genezing bij stekelmuis 11,12,13. Inzicht in het gedrag en de regulerende controle van FAP's en stroma van stekelige muizen kan licht werpen op het mechanisme achter hun regeneratieve capaciteiten. Hoewel FAP's uitgebreid worden bestudeerd in andere diermodellen, zoals in mus musculus14,15, zijn er momenteel geen gepubliceerde protocollen voor het isoleren van FAP's van stekelige muizen. Het ontwikkelen van een dergelijk protocol zou een belangrijke leemte in het veld opvullen en onderzoekers in staat stellen de cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan het regeneratieve potentieel van de stekelmuis.

Dit protocol beschrijft een robuust en reproduceerbaar protocol voor het isoleren, uitbreiden en onderscheiden van FAP's van skelet- en hartspier van stekelmuis. Het hier beschreven protocol levert hoogwaardige eencellige suspensies op die geschikt zijn voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Door gebruik te maken van rh-TGFβ1 of een compatibel in de handel verkrijgbaar medium, twee methoden die veel worden gebruikt om mus musculus FAP's16 te differentiëren, behouden de gesorteerde stekelige FAP's hun vermogen om te differentiëren langs respectievelijk de fibrogene afstamming en de adipogene afstamming (Figuur 1).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dieronderhoud en experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedkeuring van de University of British Columbia Animal Care Committee en de voorschriften van de University of British Columbia. De dieren werden gehuisvest in een afgesloten pathogeenvrije faciliteit onder standaardomstandigheden (12:12 licht-donkercyclus, 21-23 °C en 40%-60% vochtigheidsgraad) en kregen ad libitum een eiwitrijk muizendieet en water. Voor dit onderzoek werden volwassen (4 tot 6 maanden oud, 50-60 g) vrouwelijke en mannelijke Acomys dimidiatus muizen gebruikt. De details van alle gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel met materialen.

1. Oplossing en buffervoorbereiding

  1. Bereid 1x Fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) voor.
  2. Bereid PBS-EDTA door 4 ml 0,5 M EDTA (2 mM) en 996 ml 1x PBS te mengen, pH = 7,4.
  3. Bereid 250 mM CaCl2 voor door 2,7745 g CaCl2 toe te voegen aan 100 ml nucleasevrij water.
  4. Bereid de spijsverteringsbuffer voor: Meng 50 μg/ml liberase, 2,5 mM CaCl2 en 5% foetaal runderserum (FBS) in DMEM/F12.
  5. Bereid de FACS-buffer voor door 488 ml 1x PBS, 2 ml 0.5 M EDTA en 10 ml FBS te mengen.
  6. Bereid de levensvatbaarheidsbuffer voor door FACS-buffer te mengen met propidiumjodide (PI; 1 μg/ml).
  7. Bereid basismedia voor door DMEM/F12 te mengen met 5% FBS en 1% (v/v) pen/streptokokken.
  8. Bereid proliferatiemedia voor door DMEM/F12 te mengen met 10% FBS, 1% (v/v) pen/streptokokken en 2,5 ng/ml bFGF.
  9. Bereid fibrogene media voor door basismedia en 10 ng/ml rh-TGFβ1 te mengen,
  10. Bereid adipogene media (1x) voor door DMEM/F12 te mengen met 1% pen/streptokokken en een in de handel verkrijgbaar 10x adipogene differentiatiesupplement voor muizen.
  11. Bereid 4% PFA voor door 4% paraformaldehyde (w/v) toe te voegen aan 1x PBS.
  12. Bereid 0,3% PBS-Triton door 498,5 ml 1x PBS en 1,5 ml TritonX-100 te mengen.
  13. Bereid de Donkey-blokkerende buffer voor door 5% (v/v) Donkey-serum, 1% BSA (w/v) en 0,3% PBS-Triton te mengen.
  14. Bereid Donkey + MOM blocking buffer voor door 2,5 ml Donkey blocking buffer en 2 druppels MOM block te mengen.
  15. Bereid DAPI-kleuringsoplossing voor door 600 nM 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) te mengen in 1x PBS.

2. Afname van weefsel

  1. Euthanaseer het dier volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee. Voor stekelmuizen wordt isofluraan gevolgd door CO2 (20% van het volume van de kooi/min) en dislocatie van de wervelkolom om de dood te garanderen, aanbevolen.
  2. Plaats de muis op de dissectietafel in rugligging en spuit grondig met 70% ethanol om besmetting met muizenvacht te voorkomen.
  3. Maak een verticale incisie van 2-3 cm bij de ventrale middellijn en leg de ribbenkast en buikspier bloot. Snijd de spier bij het xiphoid-proces door met een weefselschaar en leg het middenrif bloot. Snijd het diafragma en de ribbenkast aan beide kanten door. Gebruik een hemostaat om de gesneden ribben vast te klemmen en af te pellen.
  4. Prik met een tissueschaar in het rechteratrium, plaats een naald van 23 G die is bevestigd aan een spuit van 20 ml in de top van het hart en doordrenk deze door langzaam 20 ml 2 mM PBS-EDTA te injecteren.
  5. Snijd het hart weg, spoel in koud 1x PBS in een petrischaaltje van 60 mm op ijs, verwijder de boezems en reinig het bloed zoveel mogelijk.
  6. Verwijder de huid boven het kniegewricht. Gebruik een fijne pincet om de fascia te verwijderen en isoleer de quadricepspier met een schaar door het dijbeen als leidraad te gebruiken. Leg in een apart petrischaaltje met koud 1x PBS.
  7. Herhaal stap 2.6 voor het andere been.

3. Vertering van weefsel

  1. Voeg 2 ml spijsverteringsbuffer toe aan een transportflacon van 5 ml voor het hart en 4 ml spijsverteringsbuffer aan een centrifugebuis van 15 ml voor twee quadricepspieren.
  2. Hak het zakdoekje met een tissueschaar op het deksel van het petrischaaltje in kleinere stukken dan 1 mm,3 stuks.
  3. Voeg gehakt weefsel toe aan hun respectievelijke spijsverteringsbuizen. Vortex gedurende 2 s op lage snelheid om te mengen.
  4. Incubeer bij 37 °C met zachte rotatie en schudden.
  5. Haal na 20 minuten de buisjes van de rotator en laat de weefselstukjes bezinken. Verwijder het supernatans met een P1000-pipet in 20 ml ijskoude FACS-buffer in centrifugebuisjes van 50 ml.
  6. Vul de spijsverteringsbuisjes bij met respectievelijk 2 ml en 4 ml spijsverteringsbuffer voor hart- en spiervertering en plaats ze voorzichtig draaiend en schuddend terug op 37 °C.
  7. Herhaal stap 3.5 tot en met stap 3.6 nog een keer na nog eens 20 minuten. Doe het supernatans in de betreffende centrifugebuis van 50 ml uit stap 3.5.
  8. Stop de vergisting na 60 min door de vergistingsbuffer te blussen met ijskoude FACS-buffer.
  9. Filtreer de digestiespensie en het supernatans door een celzeef van 40 μm bovenop centrifugebuisjes van 50 ml. Vul bij tot 40 ml met FACS-buffer.
  10. Centrifugeer de celsuspensie bij 500 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Decanteer het supernatans en resuspendeer de celpellet in 3 ml ACK-lysisbuffer. Incubeer 5 minuten op ijs en vul aan tot 40 ml met FACS-buffer.
  11. Centrifugeer op 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Decanteer de bovenliggende.
  12. Resuspendeer in 0,5 ml FACS-buffer en pipetter op en neer om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig worden verspreid.
  13. Filtreer de suspensie door een filter van 40 μm op 5 ml polystyreen buizen met ronde bodem en een celzeefkap.

4. Kleuring voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)

  1. Bereid voor controles in één kleur en fluorescentie-minus-één (FMO) 30 μl kleuringsbuffer (antilichamen verdund in FACS-buffer) in 2x de werkconcentratie in vooraf geëtiketteerde centrifugebuisjes van 1,5 ml. Raadpleeg Tabel 1 voor het instellen van de buffer voor antilichaamkleuring.
  2. Bereid enkele kleuren en FMO-bedieningselementen voor spieren en hart afzonderlijk voor.
  3. Breng 30 μl enkelkleurige kleur en FMO-controlekleuringsbuffer over op een plaat met 96 putjes. Vul aan met 20 μL FACS-buffer.
  4. Bereid voor het FACS-kleuringsmonster 0,5 ml kleuringsbuffer (antilichaam verdund in FACS-buffer) in 2x de werkconcentratie in centrifugebuisjes van 1,5 ml.
  5. Voeg 10 μL van de celsuspensie toe aan enkelkleurige en FMO-controleputjes. Voeg kleuringsbuffer toe aan de rest van de celsuspensie en repareer opnieuw.
  6. Incubeer bij 4 °C, beschermd tegen licht gedurende 30 min.
  7. Vul de putjes bij met 100 μL FACS-buffer en het monsterbuisje met 2 ml FACS-buffer.
  8. Centrifugeer op 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant.
  9. Herhaal stap 4.7 en 4.8.
  10. Resuspendeer de celpellet in de levensvatbaarheidsbuffer. 100 μL voor enkelkleurige en FMO-controles, 1 ml voor FACS-sorteermonsters.
  11. Bereid de verzamelbuisjes voor door 300 μl proliferatiemedia toe te voegen in centrifugebuisjes van 1,7 ml.

5. Fluorescentie-geactiveerde celsortering

  1. Poortstrategie: gebruik FSC vs. SSC (log) om vuil te verwijderen. Gebruik FSC-H vs. FSC-A naar gate singlets. Gebruik CD31 vs. PI om te poorten op levensvatbare en afstammingsnegatieve cellen. Gebruik PDGFRα om te gaten voor FAP's (Figuur 2).
  2. Sorteer in eerder voorbereide opvangkokers.

6. Weefselkweek

  1. Centrifugeer de verzamelde cellen bij 800 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  2. Verwijder het supernatans met een P1000-pipet. Pas op dat u de celkorrel niet verstoort.
  3. Resuspendeer de pellet in kweekmedia (250 μl/putje) en zaad bij 25k cellen/putje in een weefselkweekplaat met 48 putjes.
  4. Kweek in een incubator (37 °C, 5% CO2). Verander elke 3 dagen van media totdat de cellen 80% samenvloeiing bereiken.

7. Fibrogene differentiatie

  1. Zodra de cellen klaar zijn om te worden behandeld, plaatst u basismedia en 1x DPBS in een warm bad of op kamertemperatuur voordat u ze gebruikt.
  2. Aspiratie van de cultuurmedia.
  3. Spoel twee keer met 200 μL 1x DPBS.
  4. Spoel eenmaal af met 200 μL basismedia.
  5. Voeg 250 μL fibrogene of basische media toe aan de respectievelijke putjes.
  6. Breng de cellen terug naar de incubator (37 °C, 5% CO2).
  7. Stop de differentiatie na 48 uur.

8. Adipogene differentiatie

  1. Zodra de cellen klaar zijn om te worden behandeld, plaatst u basismedia, adipogene media en 1x DPBS in een warm bad of op kamertemperatuur voordat u ze gebruikt.
  2. Aspiratie van de cultuurmedia.
  3. Spoel twee keer met 200 μL 1x DPBS.
  4. Spoel eenmaal af met 200 μL basismedia.
  5. Voeg 400 μL adipogene of basisch media toe aan de respectievelijke putjes.
  6. Terug naar de incubator (37°C, 5% CO2).
  7. Verwijder elke 2 dagen 200 μL media met een pipet uit de putjes en voeg 200 μL verse adipogene of basische media toe.
  8. Stop de differentiatie op de 6edag voor FAP's van skeletspieren en de 14edag voor cardiale FAP's.

9. Immunokleuring

  1. Stop de differentiatietest door media op te zuigen en tweemaal te spoelen met 250 μl 1x PBS. Voer alle wasbeurten uit met een naald van 18 G die is bevestigd aan een spuit van 3 ml om celloslating te voorkomen.
  2. Voeg 250 μL 4% PFA per putje toe en incubeer gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Verwijder de PFA en spoel 3 keer gedurende 5 minuten telkens met 250 μL 1x PBS.
  4. Aspireer bij de laatste wasbeurt 1x PBS en voeg 250 μL Donkey + MOM-blokkeerbuffer toe.
  5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 min.
  6. Bereid primaire antilichaamkleuringsoplossing in Donkey blocking buffer (anti-SMA en anti-perilipine) voor een eindvolume van 100 μl per putje.
  7. Zuig de kleuringsputjes op. Laat de blokkeerbuffer van Donkey + MOM goed onder controle indien van toepassing.
  8. Voeg primaire antilichaamkleuringsoplossing toe in de respectieve putjes.
  9. 's Nachts bij 4 °C incuberen.
  10. De volgende dag 3 keer gedurende 5 minuten wassen met telkens 1x PBS.
  11. Bereid secundaire antilichaamkleuringsoplossing in de Donkey-blokkeringsbuffer met een eindvolume van 100 μl per putje.
  12. Zuig de laatste wasbeurt op en voeg secundaire antilichaamkleuringsoplossing toe in alle putjes.
  13. Incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur (monsters moeten vanaf dit punt tegen licht worden beschermd).
  14. Was 3 keer gedurende 5 minuten elke keer met 1x PBS.
  15. Zuig de laatste wasbeurt op en voeg 250 μL DAPI-kleuringsoplossing toe.
  16. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
  17. Verwijder de DAPI-kleuroplossing en was eenmaal gedurende 5 minuten met 1x PBS.
  18. Voeg 100 μL Fluoromount-G toe aan elk putje.
  19. Sluit de plaat af met het deksel en de paraffinefolie om verdamping tot een minimum te beperken. Bewaren bij 4 °C, beschermd tegen het licht tot de beeldvorming.
  20. Afbeelding met een microscoop (Figuur 3 en Figuur 4).
    OPMERKING: Ezelserum wordt gebruikt bij het blokkeren van buffer als een soortspecifieke blokkade tegen de door de ezel verhoogde secundaire antilichamen die in dit protocol worden gebruikt. Het muis-op-muis-blokkerende reagens wordt gebruikt tegen het primaire anti-SMA-antilichaam dat in de muis wordt opgewekt.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het schema voor dit protocol voor het isoleren en kweken van FAP's van skeletspieren en harten is samengevat in figuur 1. Voor weefselverzameling is de kleur van de lever die van kleur verandert van donkerrood naar lichtgeel meestal een indicatie van een succesvolle perfusie. Met de gespecificeerde leeftijdscategorieën van stekelmuis ligt het hartgewicht meestal rond de 200 mg, terwijl de quadricepspier rond de 350 mg ligt.

Tijdens elke verandering van de spijsverteringsbuffer in stap 3.5-3.7 lijkt de spijsverteringsbuffer in de spijsverteringsbuizen ondoorzichtig omdat cellen uit het weefsel worden vrijgegeven. Aan het einde van de vergisting moet de oplossing een relatief homogene brij zijn waarvan er nog wat weefselstukjes overblijven. Zorg ervoor dat u de digestie beëindigt voordat alle weefsels volledig zijn verteerd om oververtering te voorkomen, wat een negatieve invloed zal hebben op de levensvatbaarheid van de cellen en de kweekresultaten.

De verwachte stroomdiagrammen voor FACS zijn weergegeven in figuur 2. FAP's zullen naar verwachting ongeveer 2% van de levende en LIN-cellen vertegenwoordigen. Het percentage PI+-events is een indicator voor de kwaliteit van de monstervoorbereiding en moet minder dan 10% zijn. In deze studie worden doorgaans 150k FAP's per hart (alleen ventrikels) en 100k FAP's uit twee quadricepspieren verkregen.

Eenmaal in de plaat hechten cellen zich doorgaans binnen 72 uur, bereiken ze binnen 5 dagen 80% confluentie en vertonen ze typische fibroblastmorfologie met projecties (Figuur 5).

figure-results-1
Figuur 1: Schematische weergave van het protocol en de geschatte tijd die nodig is voor elke stap. Weefselafname: 10 min per muis. Weefselvertering: 1,5-2 uur. Celkleuring: 45 min-75 min. Fluorescentie-geactiveerde celsortering: 2 uur. Uitbreiding van fibro-adipogene voorlopercellen (FAP): 4 dagen. FAP-differentiatie: 48 uur voor fibrogene differentiatie, 6 dagen voor adipogene differentiatie voor FAP's van skeletspieren en 14 dagen voor cardiale FAP's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatieve FACS-grafieken voor FAP-isolatie van skeletspieren (boven) en harten (onder). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: FAP-differentiatie van de skeletspier van stekelige muizen. (A) Controle van fibrogene differentiatie. (B) Fibrogene differentiatie. (C) Controle van adipogene differentiatie. (D) Adipogene differentiatie. Perilipin (groen), SMA (magenta), DAPI (blauw), schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Cardiale FAP-differentiatie bij stekelige muizen. (A) Controle van fibrogene differentiatie. (B) Fibrogene differentiatie. (C) Controle van adipogene differentiatie. (D) Adipogene differentiatie. Perilipin (groen), SMA (magenta), DAPI (blauw), schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Helderveldbeelden van FAP's van stekelige muizen in skeletspieren (A) en hart (B) na 5 dagen kweek, vóór differentiatie. Schaalbalk = 360 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

BesturingselementenCD31 SCPDGFRα SCCD31 FMOPDGFRα FMOMonster
CD31-antilichaam+--++
PDGFRα-antilichaam-++-+

Tabel 1: Schematische handleiding voor het instellen van cocktails voor het kleuren van antilichamen voor controles en monsters. SC = enkelvoudige kleurcontrole, FMO = fluorescentie min één controle, + = met het overeenkomstige antilichaam, - = zonder het overeenkomstige antilichaam.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stekelige muizenweefsels zijn gevoeliger voor de spanningen bij weefseldissociatie, en er zijn verschillende aspecten van dit protocol die gericht zijn op het minimaliseren van stress om de levensvatbaarheid van cellen te verbeteren. Seriële enzymatische dissociatietechniek wordt gebruikt voor monstervoorbereiding om de vereiste concentratie van het enzym te verlagen. Naarmate de enzymatische vertering vordert, neemt de enzymatische activiteit af. Door het te vervangen door verse enzymen kan een consistente enzymatische activiteit gedurende de hele spijsvertering beter worden bereikt en worden hoge concentraties van het enzym vermeden. Bovendien wordt het veranderen van de verteringsbuffer om de reeds vrijgekomen cellen in de oplossing te oververteren vermeden. Ten tweede wordt ACK-lysisbuffer gebruikt om rode bloedcellen te verwijderen. Hoewel het hart verbloede en doorbloede is, bevat het nog steeds rode bloedcellen omdat het een sterk gevasculariseerd orgaan is. Door verontreinigende rode bloedcellen te verwijderen, wordt de tijd die nodig is voor FACS geminimaliseerd om celafbraak te voorkomen. Ten slotte is het belangrijk om snel en ijverig te werken van stap 2.1 naar stap 6.4 en de beste praktijken voor het werken met cellen te volgen, zoals voorzichtig pipetteren en zoveel mogelijk op ijs blijven. Sommige details zijn zelfs in het audiovisuele formaat moeilijk weer te geven en kunnen een bepaald ervaringsniveau vereisen.

In celcultuur is de initiële zaaidichtheid van cruciaal belang voor optimale celexpansie. FAP's in de schaal communiceren op een paracriene manier en stimuleren de groei via uitgescheiden groeifactoren. In omstandigheden met een lage zaaidichtheid ontvangen de cellen niet voldoende signalen voor groei en zullen ze ofwel niet uitzetten of extra kweektijd nodig hebben om de juiste samenvloeiingsniveaus te bereiken voor stroomafwaartse toepassingen. Dit is ook de reden waarom slechts de helft van de media wordt veranderd tijdens elke mediaverandering in adipogene differentiatie. Het is belangrijk om wat geconditioneerde media achter te laten die de groeifactoren van pre-adipocyten bevatten die cruciaal zijn voor hun differentiatie.

Tijdens de immunokleuring is het belangrijk om voorzichtig te zijn bij het toevoegen of verwijderen van buffers om celloslating te minimaliseren. Met name in stap 9.1 zijn de cellen het meest geneigd om los te laten voorafgaand aan de fixatie. Handmatige aspiratie, zoals met een pipet of een naald en spuit, wordt aanbevolen, maar het gebruik van krachtige vacuümaspirators wordt afgeraden.

Een beperking van dit protocol is dat PDGFRα een algemene marker is van de FAP's, en dat er meer markers nodig zijn om de unieke subtypes van FAP's te onderscheiden17. Subtypes zoals DPP4+-voorlopercellen zoals FAP's en CD10+ adipogene FAP's zijn betrokken bij zowel de ziekte als de homeostatische context 18,19,20. FAP-subsets komen waarschijnlijk ook voor bij stekelmuis. Ze kunnen in verschillende verhoudingen voorkomen, ander cellulair gedrag vertonen of andere fysiologische functies hebben in vergelijking met overeenkomstige mus musculus FAP-subsets. Verdere optimalisatie van FAP-subtype-specifieke markers in stekelige muizen zal nodig zijn om de details van stekelige muizen FAP's te onderzoeken.

Samenvattend beschrijft dit protocol een robuuste en reproduceerbare methode voor het isoleren, cultiveren en onderscheiden van skeletspier- en cardiale FAP's van stekelmuis. De stekelmuis komt in een stroomversnelling als een nieuw hyperregeneratief diermodel. FAP's en het stroma zijn sterk betrokken bij het handhaven van spier- en harthomeostase en dragen bij aan orgaandisfunctie in meerdere chronische ziektemodellen 5,7. Het karakteriseren van FAP's van stekelige muizen kan het mechanisme achter hun opmerkelijke regeneratieve vermogen ophelderen en de weg vrijmaken voor nieuwe strategieën in de regeneratieve geneeskunde.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflict bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen Andy Johnson en Justin Wong, UBC flow core, bedanken voor hun expertise en hulp bij het optimaliseren van het FACS-protocol, evenals het personeel van de dierenfaciliteit van het UBC Biomedical Research Center voor de zorg voor stekelige muizen. Figuur 1 is gemaakt met behulp van Biorender. Figuur 2 is gemaakt met behulp van FlowJo software.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5M EDTAInvitrogen15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubesVWR87003-294
15 mL centrifuge tubeFalcon352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco14190-144
20 mL syringeBD309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)InvitrogenD3571
40 μm cell strainerFalcon352340
48 well flat-bottom tissue culture plateFalcon53078
5 mL polypropyleneFalcon352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer capFalcon352235
5 mL syringeBD309646
50 mL centrifuge tubeFalcon352070
60 mm Petri dishFalcon353002
96 well V-bottom tissue culture plateCorning3894
Acomys dimidiatus muizen (stekelmuizen)vriendelijk ter beschikking gesteld door Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-kalium (ACK) lysing bufferGibcoA10492-01
Anti-perilipin (1:100)SigmaP1873
Anti-SMA (1:100)Invitrogen14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)Abcamab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 GBD305195
BD PrecisionGlide Needle 23 GBD305145
Bovine serum albuminSigmaA7906-100g
BV605 CD31 (1:500)BD biosciences744359
CaCl2Sigma-AldrichC4901
CentrifugeEppendorf5810R
DMEM/F12Gibco11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)InvitrogenA31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000)InvitrogenA31573
Donkey serumSigmaS30-100ML
FACS sorter - MoFlo Astrios 5 lasersBeckman coulterB52102
Fetal bovine serumGemini100-500
Fine scissorsFST14058-11
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
ForcepsFST11051-10
HemostatFST91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF)Gibco13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1)eBiosciences14-8348-62
Incubator - Heracell 160i CO2ThermoFisher51033557
Inverted microscope - RevolveECHOn/a
LiberaseRoche5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x SupplementSTEMCELL technologies5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagentVector LaboratoriesMKB-2213
ParaformaldehydeSigmaP1648-500g
Penicillin-StreptomycinGibco15140–122
PicoLab Mouse Diet 20LabDiet3005750-220
Propidium iodide (PI)InvitrogenP3566
Transport vial 5mL tubeCaplugs Evergreen222-3005-080
Triton X-100Sigma9036-19-5

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gaire, J., et al. Spiny mouse (Acomys): An emerging research organism for regenerative medicine with applications beyond the skin. NPJ Regen Med. 6, 1(2021).
  2. Sandoval, A. G. W., Maden, M. Regeneration in the spiny mouse, Acomys, a new mammalian model. Curr. Opin. Genet. Dev. 64, 31-36 (2020).
  3. Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. A. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: Collaborators or saboteurs. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
  4. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. J Cell Sci. 124, 3654-3664 (2011).
  5. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).
  6. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 122 (12), 143-152 (2010).
  7. Soliman, H., et al. Pathogenic Potential of Hic1-Expressing Cardiac Stromal Progenitors. Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).
  8. Hall, C., Gehmlich, K., Denning, C., Pavlovic, D. Complex relationship between cardiac fibroblasts and cardiomyocytes in health and disease. J Am Heart Assoc. 10, 1-15 (2021).
  9. Gawriluk, T. R., et al. Comparative analysis of ear-hole closure identifies epimorphic regeneration as a discrete trait in mammals. Nat Commun. 71 (7), 1-16 (2016).
  10. Seifert, A. W. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561(2012).
  11. Koopmans, T., et al. Ischemic tolerance and cardiac repair in the spiny mouse (Acomys). NPJ Regen Med. 6, 78(2021).
  12. Peng, H., et al. Adult spiny mice (Acomys) exhibit endogenous cardiac recovery in response to myocardial infarction. NPJ Regen Med. 6, 74(2021).
  13. Maden, M., et al. Perfect chronic skeletal muscle regeneration in adult spiny mice, Acomys cahirinus. Sci Rep. 8, 8920(2018).
  14. Riparini, G., Simone, J. M., Sartorelli, V. FACS-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle. J Vis Exp. (184), e63983(2022).
  15. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods Mol Biol. 1556, 179-189 (2017).
  16. Molina, T., Fabre, P., Dumont, N. A. Fibro-adipogenic progenitors in skeletal muscle homeostasis, regeneration and diseases. Open Biol. 11 (12), 210110(2021).
  17. Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions. Skelet Muscle. 111 (11), 1-25 (2021).
  18. Fitzgerald, G., et al. MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle. Commun Biol. 61 (6), 1-21 (2023).
  19. Babaeijandaghi, F., et al. DPPIV+ fibro-adipogenic progenitors form the niche of adult skeletal muscle self-renewing resident macrophages. Nat Commun. 141 (14), 1-10 (2023).
  20. Schutz, P. W., Cheung, S., Yi, L., Rossi, F. M. V. Cellular activation patterns of CD10+ fibro-adipogenic progenitors across acquired disease states in human skeletal muscle biopsies. Free Neuropathol. 5, 3-3 (2024).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fibro adipogene progenitorcellenflowcytometrieenzymatische digestieregeneratie van de hartspierregeneratie van skeletspierencel sorterenweefseldissociatieexpansie van progenitorcellenremodellering van de extracellulaire matrix

Gerelateerde artikelen