Methodenartikel

DNA-extractie en vergelijking tussen oude en verse necrofiele vliegmonsters

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66737

⸱

3 mei 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hainan Province Tropical Forensic Engineering Research Center, Department of Forensic Medicine, Hainan Medical University, Hainan Provincial Academician Workstation (tropical forensic medicine), 2Hainan Vocational College of Political Science and Law, Hainan Gongping Forensic Center, 3Department of Forensic Medicine, Hebei Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een protocol voor verse en oude necrofiele vlieg-DNA-extractie met behulp van een aangepaste gemeenschappelijke DNA-extractiekit.

Samenvatting

In totaal werden vijf monsters van Chrysomya megacephala-monsters geselecteerd - drie verse monsters, één monster dat 2 jaar in alcohol werd bewaard en één monster dat 2 jaar in droge verzegelde opslag werd bewaard, alleen beschermd tegen licht - om te onderzoeken of een bloed-DNA-extractiekit DNA van necrofiele vliegen kon extraheren en om te bepalen of alcohol het behoud van het DNA van necrofiele vliegen kon verlengen. Eerst werd de bloed-DNA-extractiekit gebruikt om DNA uit hun thoraxweefsels te extraheren. Vervolgens werden de zuiverheid en concentratie van het DNA onderzocht met behulp van een microplaatlezer en een fluorometer. Ten slotte werden PCR-amplificatie en elektroforese van het geëxtraheerde DNA gedaan met necrofiele vliegspecifieke primers die zich in de mitochondriale CO I-gensequentie bevinden. De resultaten toonden aan dat de DNA-zuiverheid van alle monsters groter was dan 2,0. De DNA-concentratie bleek van de volgende orde te zijn: verse monsters > met alcohol geconserveerde oude monsters > onbehandelde, oude monsters. Alle monsters hadden specifieke elektroforetische banden na PCR-amplificatie. Concluderend kan een bloed-DNA-extractiekit worden gebruikt om met succes DNA van necrofiele vliegen te extraheren, en de DNA-concentratie van verse vliegenmonsters is groter dan die van oude vliegenmonsters. De vliegen kunnen lange tijd in alcohol worden bewaard.

Inleiding

De gevolgtrekking van het tijdstip van overlijden is altijd een van de belangrijkste en moeilijke kwesties geweest die in de rechtspraktijk moeten worden opgelost. In de praktijk van de forensische wetenschap speelt het bepalen van het postmortale interval voor een strafzaak een cruciale rol bij het afleiden van het tijdstip van het misdrijf, het opsluiten van de verdachte en het verkleinen van de reikwijdte van het onderzoek. Traditionele methoden om het tijdstip van overlijden af te leiden zijn voornamelijk gebaseerd op vroege postmortale verschijnselen, die over het algemeen alleen kunnen worden gebruikt om het tijdstip van overlijden binnen 24 uur af te leiden. De lange tijd van overlijden kan echter niet worden bepaald door postmortale verschijnselen. Het wordt nu algemeen erkend in de forensische wetenschappelijke gemeenschap dat forensische entomologie het potentieel heeft om een effectieve methode te zijn om een langere tijd van overlijden af te leiden.

Necrofaag insecten zijn genoemd naar hun larven die zich voeden met lijken. Onder hen, wanneer er een lijk aanwezig is, zullen de volwassen necrofiele vliegen de eersten zijn die het lijk bereiken en hun eieren of larven leggen. De larven voeden zich met lijkweefsel en groeien uit tot poppen, die uitgroeien tot volwassenen. Necrofiele vliegen spelen een grote rol in de praktijk van de forensische wetenschap vanwege hun regelmatige levenscyclus en geografische verspreiding, bijvoorbeeld het aftrekken van het tijdstip van overlijden en het bepalen van de plaats van overlijden 1,2. De barrière voor het gebruik van necrofiele vliegen in de forensische praktijk is echter soortidentificatie. Morfologische methoden worden nog steeds gebruikt als de gezaghebbende methode voor soortidentificatie van necrofiele vliegen. Morfologische soortidentificatie vereist echter een hoge mate van integriteit van insecten. Als de vliegen zich in verschillende ontwikkelingsstadia bevonden, of als gevolg van morfologische veranderingen veroorzaakt door omgevingskeuzes, maken die allemaal morfologisch onderzoek moeilijker. Met name de morfologie van poppen en popschelpen, die het vaakst op de plaats delict worden aangetroffen, is nauwelijks herkenbaar. Dit, samen met de schaarste aan morfologische experts, maakt de morfoologische identificatie van soorten enorm moeilijk. Daarom is de toepassing van moleculair-biologische methoden voor soortidentificatie van vliegen naar voren gekomen, wat de moeilijkheid van morfologische identificatie vermindert en onafhankelijk is van ontwikkelingsfase 3,4,5,6,7.

De eerste stap in de soortidentificatie van necrofiele vliegen op basis van moleculair-biologische methoden is de efficiënte extractie van DNA, terwijl gespecialiseerde kits voor DNA-extractie van insecten momenteel niet algemeen beschikbaar zijn. En hoe gewone bloedkits te gebruiken voor DNA-extractie van necrofiele vliegen wordt forensisch relevanter. Necrofiele vliegen die op de plaats delict worden aangetroffen, zijn vaak verminkt of hebben verval en DNA-degradatie ondergaan. Vliegenmonsters zijn niet onmiddellijk beschikbaar voor DNA-extractie na verkrijging, of indien mogelijk moeten volledige monsters worden bewaard vanwege de vereisten voor het bewaren van bewijsmateriaal. Op basis van de bovenstaande vereisten hebben we in deze studie de bloed-DNA-kit op basis van proteïnase K-vertering toegepast en drie verse Chrysomya megacephala-monsters (Diptera, Lepidoptera) geselecteerd (Figuur 1), een oud C. megacephala-monster dat twee jaar in alcohol is geplaatst, en een C. megacephala-monster dat gedurende twee jaar in lichtbeschermde opslag is geplaatst, elk van de vijf monsters gewogen, koos het thoraxweefsel van het insect voor DNA-extractie. Bij het vergelijken van de kwaliteit en zuiverheid van DNA geëxtraheerd uit de oude en nieuwe monsters, werden PCR-amplificatie en elektroforese van het geëxtraheerde DNA uitgevoerd met necrofiele vliegspecifieke primers die zich in de mitochondriale CO-gensequentie figure-introduction-1 bevinden.

Protocol

OPMERKING: In dit protocol werden in totaal vijf monsters van C. megacephala-monsters gebruikt: drie verse monsters (Fresh 1, Fresh 2 en Fresh 3), één monster dat 2 jaar in alcohol werd bewaard (oud 1) en één monster dat 2 jaar in droge verzegelde opslag werd bewaard, alleen beschermd tegen licht (oud 2). Monsters moeten worden geëtiketteerd volgens de experimentele vereisten.

1. Algemene opslag en bereidingen van monsters

  1. Monsterselectie en -voorbereiding
    NOTITIE: Zorg ervoor dat u in de zuurkast werkt wanneer u ethylacetaat aanbrengt om acrofaag vliegen uit te voeren. Verwijder de vloeistof van het oppervlak van de vlieg voordat u gaat wegen.
    1. Verse monsters: Plaats drie verzamelde vliegenmonsters in gasflesjes nadat u ze hebt gedood met ethylacetaat. Weeg en benoem de monsters als Fresh 1, Fresh 2 en Fresh 3 en gebruik ze onmiddellijk in experimenten.
      OPMERKING: De verse vliegmonsters in dit protocol hadden massa's van 56.8 mg, 49.3 mg en 52.1 mg.
    2. Oud monster 1: Verwijder door ethylacetaat gedode vliegmonsters en bewaar ze 2 jaar in met alcohol gevulde centrifugebuisjes in een luchtdichte verpakking, beschermd tegen licht bij kamertemperatuur. Weeg het monster na het adsorberen van de oppervlaktevloeistof met filtreerpapier; noem het Oud 1.
      OPMERKING: De massa van Old 1 was 42,3 mg in dit protocol.
    3. Oud monster 2: Haal het door ethylacetaat gedode vliegmonster eruit en bewaar het 2 jaar in een centrifugebuis in een luchtdichte verpakking, beschermd tegen licht bij kamertemperatuur. Weeg en noem het Oud 2.
  2. Voorbereiding voor extractie
    1. Voeg een kleine hoeveelheid vloeibare stikstof toe om een roestvrijstalen container af te koelen; Wacht tot alle vloeibare stikstof is verdampt.
    2. Doe een vliegenmonster in de container; Giet de vloeibare stikstof er langzaam in om te voorkomen dat de vloeibare stikstof opspat en het insectenmonster beïnvloedt.
    3. Vries de monsters in vloeibare stikstof in. Verwijder monsters nadat de vloeibare stikstof is verdampt.
    4. Scheid de thorax afzonderlijk, doe deze in een centrifugebuis van 2 ml en snijd in de kleinst mogelijke plakjes.
      OPMERKING: Snijd het monster in kleine stukjes zodat het volledig kan worden gesplitst en DNA in grote hoeveelheden kan worden vrijgegeven.
    5. Herhaal de bovenstaande stappen voor elke vlieg, vries ze afzonderlijk in en verwijder ze vervolgens in een nieuwe centrifugebuis om kruisbesmetting met DNA te voorkomen.

2. DNA-extractie

OPMERKING: Alle centrifugatiestappen moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (15-25 °C) in een microcentrifuge. Alle stappen moeten worden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de principes van asepsis en om kruisbesmetting te voorkomen.

  1. Weefsel lysis
    1. Voeg 180 μl weefsellysisbuffer toe aan een centrifugebuisje van 2 ml met een geknipt monster.
    2. Voeg 20 μl proteïnase K toe. Meng grondig door middel van werveling bij 3 000 tpm gedurende 10 s en incubeer bij 56 °C totdat de insectenweefsels volledig zijn gelyseerd.
      OPMERKING: Voeg meer proteïnase K toe als het weefsel niet volledig is verteerd. Lysis is meestal voltooid in 1-3 uur, kan ook de lysistijd 's nachts verlengen.
  2. DNA-precipitatie
    1. Vortex bij 3.000 tpm gedurende 15 s. Voeg 200 μL lysisbuffer toe aan het monster en meng grondig door middel van werveling bij 3.000 tpm gedurende 15 s.
    2. Voeg 200 μL ethanol (96-100%) toe en meng opnieuw grondig door 15 s met 3.000 tpm te vortexen.
      OPMERKING: Lysisbuffer en ethanol kunnen in één stap samen worden toegevoegd om tijd te besparen. Door toevoeging van lysisbuffer en ethanol kan zich een wit neerslag vormen.
  3. Spuit het mengsel in de DNA-adsorptiekolom in een verzamelbuisje van 2 ml. Centrifugeer bij 6.000 × g gedurende 1 minuut. Gooi de doorstroom- en opvangbuis weg.
  4. Plaats de DNA-adsorptiekolom van de vorige stap in een nieuw verzamelbuisje van 2 ml, voeg 500 μl eiwitverwijderingsbuffer toe en centrifugeer gedurende 1 minuut op 6.000 × g . Gooi de doorstroom- en opvangbuis weg.
  5. Breng de DNA-adsorptiekolom over in een nieuwe verzamelbuis van 2 ml, voeg 500 μl ontziltingsbuffer toe en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 20.000 × g om het membraan van de DNA-adsorptiekolom te drogen. Gooi de doorstroom- en opvangbuis weg.
    OPMERKING: Deze centrifugeerstap zorgt ervoor dat eventuele resterende ethanol wordt verwijderd vóór de volgende elution. Als er sprake is van versleping van ethanol, centrifugeer dan opnieuw bij 20.000 × g gedurende 1 minuut.
  6. Plaats de DNA-adsorptiekolom in een schone microcentrifugebuis van 2 ml, spuit 100 μl DNA-elutiebuffer rechtstreeks op het kolommembraan, incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en centrifugeer vervolgens gedurende 1 minuut bij 6.000 × g om te elueren.
    OPMERKING: Elutie met 100 μL (in plaats van 200 μL) verhoogt de uiteindelijke DNA-concentratie in het eluaat, maar vermindert ook de totale DNA-opbrengst. Om de DNA-opbrengst te maximaliseren, herhaalt u de elutie één keer zoals beschreven in stap 2.8.
  7. Bewaar de DNA-monsters bij 4 °C (maximaal 1 week) of -80 °C voor langdurige opslag.

3. Detectie van DNA-concentratie

  1. Bepaal de waarden van OD 260 en OD 280 om de DNA-zuiverheid en nucleïnezuurconcentratie te vergelijken met de microplaatlezer. Herhaal dit drie keer op elk monster.
  2. Bepaal de concentratie van het geëxtraheerde DNA met behulp van de fluorometer met behulp van de bijbehorende kit, met drie replicaten voor elk monster.
    1. Neem 190 μl werkoplossing in twee centrifugebuisjes van 0,5 ml, neem elk 10 μl van Standaard #1 en Standaard #2, voeg ze toe aan de werkoplossingen en houd ze niet minder dan 15 minuten uit de buurt van licht.
      OPMERKING: Standaard #1 en Standaard #2 zijn nauwkeurig gekalibreerd voor een bepaalde concentratie DNA. Standaardoplossingen moeten nauwkeurig worden geconfigureerd om de vorming van een nauwkeurige standaardcurve te garanderen. Standaard #1 is een 0,2 ng/μL dubbelstrengs DNA (dsDNA) monster; standaard #2 is 2.000 ng/μL. De werkende oplossing is een kleurstof die specifiek bindt aan dsDNA.
    2. Neem 2 μl test-DNA en meng dit met 198 μl werkoplossing in een centrifugebuisje van 0,5 ml en houd het niet minder dan 15 minuten uit de buurt van licht.
      OPMERKING: Als de DNA-concentratie laag is, voeg dan 5 μl test-DNA toe met 195 μl werkoplossing.
    3. Schakel na 15 minuten het instrument in en selecteer dsDNA-concentratiemeting | Lange afstand. Test eerst standaard #1 en vervolgens standaard #2 om de standaardcurve te verkrijgen.
      OPMERKING: De standaardoplossing moet op dezelfde dag worden gebruikt nadat deze is geconfigureerd; Als u het te lang laat staan, resulteert dit in een grote fout in de standaardcurve.
    4. Plaats de te testen monsters één voor één in de analyseputjes, stel het DNA-piekvolume in op 2 μL, herhaal de meting drie keer, neem de gemiddelde waarde en registreer.

4. PCR en elektroforetische detectie

OPMERKING: De mitochondriale CO-gensequentie figure-protocol-1 met een lengte van 278 bp werd genomen voor PCR-amplificatie met voorwaartse primer C1-J-2495: CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG en omgekeerde primer C1-N-2800: CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC8, en vervolgens werd 2% agarosegelelektroforese uitgevoerd om het amplificatie-effect te verifiëren en de lengte van de amplificatieproducten werd geverifieerd.

  1. Stel 20 μL van het PCR-amplificatiesysteem in door 10 μL 2x Taq-mix, 1 μL van elke primer, 5 μL ddH2O en 3 μL sjabloon-DNA toe te voegen; Meng goed gedurende 10 s in een centrifuge.
  2. Gebruik de volgende PCR-cyclusparameters: predenaturatie 95 °C gedurende 10 min; denaturatie 95 °C gedurende 30 s, gloeien 48 °C gedurende 30 s, extensie 72 °C gedurende 45 s voor een totaal van 40 cycli; en laatste verlenging 72 °C gedurende 10 min.
  3. Onderwerp de producten na PCR aan 2% agarosegelelektroforese en plaats ze na elektroforese op een gelbeeldvormingssysteem voor fotoanalyse.

Resultaten

We gebruikten een microplaatlezer om de waarden van OD260 en OD280 van de geëxtraheerde DNA-oplossing te meten en verkregen vervolgens de OD260/OD280-waarden om de zuiverheid van het DNA te evalueren. De OD260/OD280 van alle verse monsters en oud monster 1 was groter dan 2. De OD260/OD280 van oude steekproef 2 had een maximale waarde van 2,187, hoewel het gemiddelde 1,753 was, en de drie metingen fluctueerden sterk als gevolg van de kleine (≤0,01) waarden van zowel de OD280 als de OD280 (Tabel 1). Op basis van de verkregen waarde van OD260 hebben we de concentratie van DNA geschat. De DNA-concentratie van de drie was van de orde: verse monsters > oud monster 1 > oud monster 2, gemeten met behulp van de microplaatlezer, maar het verschil tussen de verse monsters en de oude monsters was klein, slechts ~10-20 ng/μL (tabel 1), terwijl de DNA-concentratie van de drie verse monsters gemeten met een Qubit-fluorometer groter was dan die gemeten door de microplaatlezer met 125-130 ng/μL, met een verschil van 15 ng/μL in oud monster 1 en slechts 1,3 ng/μL in oud monster 2. De DNA-concentratie van de verse monsters > oude monster 1 > oud monster 2 (tabel 2).

DNA geëxtraheerd met de momenteel gebruikte extractiemethode bevat alle DNA-componenten uit verschillende bronnen in het monster. Dat betekent dat de DNA-oplossing niet alleen een oplossing was van genoom-DNA van vliegen. De primers om mitochondriale CO-genfragmenten figure-results-1 van vliegen specifiek te amplificeren, werden geselecteerd door de literatuur te raadplegen en geverifieerd door NCBI-Blast Primer. De resultaten toonden aan dat de voorwaartse primer C1-J-2495 en omgekeerde primer C1-N-2800 van het mitochondriale CO-gen figure-results-2 vliegspecifieke primers waren met sequentiepolymorfisme en veel vliegsoorten bedekten. De amplificatieresultaten toonden geen menselijke genen. Ze waren een paar betrouwbare DNA-biomarkers voor de identificatie van necrofiele vliegen en werden geselecteerd voor de verificatie van de resultaten van dit experiment.

Alle verschillende monsters vertoonden duidelijke elektroforetische banden met lengtes variërend van 250 bp-400 bp. De banden waren helderder in de verse monsters dan in de oude monsters, en de in alcohol geplaatste oude monsters (Figuur 2, Oud1) waren helderder dan de onbehandelde oude monsters (Figuur 2, Oud2), maar de oude monsters hadden ook twee banden in verschillende posities. De blanco besturing had geen banden (Figuur 2).

figure-results-3
Figuur 1: Afbeeldingen van Chrysomya megacephala vanuit verschillende hoeken. (A) Mannelijk; (B) vrouwelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 2: Elektroferogram van PCR-amplificatieproducten. De eerste drie banden van links zijn PCR-amplificatieproducten van DNA uit verse vliegenmonsters. De vierde elektroforetische band is het PCR-product van DNA van het oude vliegenmonster dat in alcohol is bewaard. De vijfde band is het PCR-product van DNA van het oude vliegenmonster zonder enige speciale conservering. De zesde band is een blanco besturingselement; het is schoon, wat bewijst dat er geen besmetting is opgetreden tijdens PCR-amplificatie. Helemaal rechts staat de DNA-ladder, waar we DNA-posities hebben gelabeld met lengtes van 250 bp en 400 bp. De elektroforetische banden van alle PCR-producten van de monsters lagen iets boven de 250 bp en onder de 400 bp ladderbanden. Deze positie komt overeen met de lengte van het doelgen van 278 bp. Het is voor het blote oog duidelijker dat de DNA-banden die verse monsters vertegenwoordigen, helderder zijn dan die van oude monsters. De oude monsters bestaan uit andere DNA-banden die daar aanwezig zijn in minder intense, niet-doelwitgenen, van verschillende lengtes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

MonsterVers1Vers2Vers3Oud1Oud2
OD260/OD2802.354±0.0362.245±0.027 Overige2.060±0.0382.143±0.012 Overige1.753±0.421
DNA (ng/μL)119,91±1,686 Overige116.084±4.96595.239±3.401 Overige86.845±6.14 Overige10.151±0.168 Overige

Tabel 1: Meten van DNA-zuiverheid en -concentratie met een microplaatlezer.

MonsterVers1Vers2Vers3Oud1Oud2
DNA (ng/μL)243.333±1.528237.667±2.082 Overige226.000±2.000101.000±0.00011.433±0.058

Tabel 2: DNA-concentratie meten met een fluorometer.

Discussie

DNA-extractie is de meest kritische schakel in de moleculaire identificatie van necrofiele vliegen, en de extractiemethode en de kwaliteit van het geëxtraheerde DNA hebben een directe invloed op de daaropvolgende detectie. In dit experiment hebben we met succes DNA geëxtraheerd van necrofiele vliegen met behulp van een gewone bloedkit, zonder de noodzaak om een speciale insecten-DNA-extractiekit aan te schaffen, waardoor DNA-extractie van insecten gemakkelijker te bereiken is.

Het oppervlak van vliegen is rijk aan chitine, vooral in de larvale en popstadia waar de epidermale chitine 60-70% kan bereiken, waardoor DNA-extractie van necrofiele vliegen moeilijkis9. We ontdekten tijdens het extractieproces dat als het monster nat was, hoewel we het monster voldoende hadden geschoven, het monster gelatineachtig bleef wanneer proteïnase K werd aangebracht voor vergisting. Dit voorkwam dat de toegevoegde vloeistof terugstroomde door de adsorptiekolom. Om dit probleem op te lossen, hebben we eerst vloeibare stikstof toegepast om de monsters snel in te vriezen om de vliegen broos en gemakkelijk te malen te maken, en ook gemakkelijk volledig verteerbaar. Als er geen vloeibare stikstof beschikbaar is voor vermaling en de efficiëntie van de DNA-extractie nog moet worden verbeterd, kunnen de vliegenmonsters ongeveer 48 uur in een geventileerde ruimte worden geplaatst. De monsters kunnen drogen voordat ze adequaat worden geschoren en vervolgens DNA-geëxtraheerd.

Aangezien de DNA-afbraak van oude monsters een grotere zorg was, werden in dit experiment vliegthoraxmonsters geselecteerd voor DNA-extractie vanwege het hoge thorax-DNA-gehalte. Het gebruik van de thorax is echter te verstorend voor de morfologische integriteit van de vlieg voor het volledige behoud van later bewijsmateriaal en de noodzaak van morfologische identificatie. De monsters zijn moeilijk te extraheren toen de thorax aan het rotten was. Als de monsters vers zijn, kan DNA-extractie van de voet en vleugel de voorkeur hebben. De voet en vleugel zijn symmetrisch en bilateraal verdeeld en meer volledige morfologische kenmerken kunnen worden behouden na extractie van weefsel van één kant. De concentratie DNA die uit de vleugel en de voet wordt geëxtraheerd is echter relatief laag, wat riskant is voor latere studies. Bovendien waren de monsters klein en verloren ze gemakkelijk10.

Bij gebruik van de DNA-extractiekit voor DNA-extractie waren de OD260/OD280-waarden gemeten door de microplaatlezer groter dan 2, behalve voor oud monster 2. Ten eerste kan worden vastgesteld dat het eiwit grondiger is verwijderd, maar er kan RNA-besmetting zijn, DNA-dubbelstrengs breuken als gevolg van herhaalde centrifugatie of DNA-degradatie in de oude monsters11. Ten tweede kan het er ook op wijzen dat alcohol de bewaring van RNA verlengt.

De DNA-concentratie wordt berekend op basis van de OD260-waarde van de microplaatlezer, terwijl de Qubit-fluorometer wordt gebruikt om eerst een standaardcurve vast te stellen en vervolgens de absorptiewaarde te meten om de DNA-concentratie te berekenen. Beide methoden kunnen de meting van de DNA-sporenconcentratie realiseren, maar elk heeft zijn voor- en nadelen: De microplaatlezer past OD260 toe om de DNA-concentratie te berekenen, maar de berekeningsmethode is ook een schatting. Als het monster wordt gemengd met een groot aantal nucleotiden of eiwitten en andere stoffen die ultraviolet licht kunnen absorberen, zal de fotometrische fout groter zijn, dus we moeten proberen ze van tevoren te verwijderen.

Microplaatlezers en UV-spectrofotometers gebruiken UV-absorptie voor detectie, die geen onderscheid kunnen maken tussen DNA, RNA, gedegradeerde nucleïnezuren, vrije nucleotiden en andere onzuiverheden, en de absorptie wordt ook sterk beïnvloed door de vervuiling van andere stoffen, waardoor de metingen relatief onbetrouwbaar zijn. Tijdens spiking-monsters, die meestal in druppels worden gemeten, worden de monsters direct gespiked zonder verdunning of verwerking, waardoor gelijktijdige meting van meerdere monsters en directe berekening van DNA-zuiverheid op basis van OD260/OD280-metingen mogelijk is. De Qubit-fluorometer daarentegen is ontworpen om alleen de concentratie van dubbelstrengs DNA te meten door twee standaardoplossingen met een bekende concentratie toe te passen om een standaardcurve vast te stellen en de kenmerken van fluorescerende kleurstoffen toe te passen die specifiek binden aan dubbelstrengs DNA. Elk monster moet echter afzonderlijk worden voorbehandeld en vervolgens afzonderlijk worden gemeten, wat omslachtig is voor batchmonstertoepassingen, en de zuiverheid van het geëxtraheerde DNA kan niet worden gemeten. In de specifieke toepassing van de twee kunnen worden geselecteerd op basis van hun eigen behoeften voor kwaliteitstesten van DNA 12,13,14.

De DNA-concentratie van verse monsters was groter dan die van oude monsters die in alcohol waren geplaatst en groter dan die van onbehandelde oude monsters, ongeacht of de DNA-concentratie werd gemeten door een microplaatlezer of een Qubit-fluorometer. Voor langdurige opslag kunnen de monsters worden ondergedompeld in alcohol om de groei van bacteriën en schimmels te voorkomen 15,16.

De verschillende meetmethoden hadden minder impact op de DNA-metingen van oude monsters zonder enige behandeling, waarschijnlijk omdat oude monsters meer werden afgebroken, vooral eiwitten en RNA kunnen allemaal sneller worden afgebroken dan DNA. Verse monsters hadden daarentegen meer eiwit en RNA en hadden daarom een grotere impact op de resultaten. Als alleen dubbelstrengs DNA-concentraties worden vergeleken, moeten we de resultaten van de Qubit-fluorometer gebruiken, en de resultaten van onze experimenten creëerden ook een significante DNA-concentratiegradiënt in de oude en nieuwe monsters.

Het DNA-gehalte van zowel verse als oude monsters na DNA-extractie kan worden gebruikt voor latere moleculair-biologische analyse. Net als in dit experiment waren de primers die waren geselecteerd voor het mitochondriale CO-gen figure-discussion-1 slechts 278 bp, en ze konden allemaal met succes worden geamplificeerd door DNA. Het mitochondriale CO-gen figure-discussion-2 is op zijn beurt een locus die bij vliegen wordt erkend vanwege zijn DNA-barcoderingspotentieel, waardoor necrofiele vliegsoorten kunnen worden geïdentificeerd door daaropvolgende sequencing-analyse17. De moleculaire biologie van langer bewaarde monsters kan met succes worden bereikt door primers te selecteren voor andere kortere DNA-sequenties. Merk op dat de elektroforetische banden van de oude monsters twee banden hadden met verschillende posities en kortere sequenties, waarschijnlijk als gevolg van niet-specifieke amplificatie van de primers veroorzaakt door de afbraak van het DNA in combinatie met de lage gloeitemperatuur.

In dit experiment werden echter minder monsters gedurende een lange periode bewaard om te voldoen aan de behoefte aan repetitieve experimenten, terwijl de resultaten alleen representatieve monsters vereisten. Daarom hebben we geen herhaalbaarheidstest uitgevoerd, die verkennend kan zijn voor het behoud van oude en nieuwe monsters, maar geen invloed heeft op de succesvolle extractie van necrofiele vliegmonsters.

Samenvattend kan het gebruik van een bloed-DNA-extractiekit ook helpen bij de extractie van necrofiel vliegen-DNA. Zowel oude als nieuwe monsters kunnen met succes worden geëxtraheerd en al het geëxtraheerde DNA kan worden gebruikt voor latere analyse. Alcohol is ook gunstig voor het langdurig bewaren van DNA-monsters van vliegen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) en door het Academician Innovation Platform Scientific Research Project van de provincie Hainan (YSPTZX202134).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Buffer AEQiagen172026832DNA elutiebuffer
Buffer ALQiagen172028374lysebuffer
Buffer ATLQiagen172028162weefsellysebuffer
Buffer AW1Qiagen172028760eiwitverwijderingsbuffer
Buffer AW2Qiagen57203108ontzoutingsbuffer
C1-J-2495Taihe BiotechnologyTW21109216voorwaartse primer
C1-N-2800Taihe BiotechnologyTW21109217achterwaartse primer
D2000 DNA ladderReal-Times(Beijing) BiotechnologyRTM415Meet de positie van elektroforetische banden
DNeasy Mini spin columnQiagen166050343DNA-adsorptiekolom
Dry Bath IncubatorMiulabDKT200-2Dgebruikt voor verwarming
MIX-30S Mini MixerMiulabMUC881206oscillerende actie
Proteinase KQiagen172026218Inactivatie van intracellulaire nucleasen en andere eiwitten
Qubit 3.0 FluorometerThermo Fisher Scientific2321611188
Speed Micro-CentrifugeScilogex9013001121centrifuge
Standard#1Thermo Fisher Scientific2342797
Standard#2Thermo Fisher Scientific2342797
Tanon 3500R Gel ImagerTanon16T5553R-455gelbeeld
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR Mix
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR Mix
Thermo CyclerZhuhai HemaVRB020Agewone PCR
Working SolutionThermo Fisher Scientific2342797

Referenties

  1. Amendt, J., Richards, C. S., Campobasso, C. P., Zehner, R., Hall, M. J. Forensic entomology: applications and limitations. Forensic Sci Med Pathol. 7 (4), 379-392 (2011).
  2. Wydra, J., Matuszewski, S. The optimal post-eclosion interval while estimating the post-mortem interval based on an empty puparium. Forensic Sci Med Pathol. 17 (2), 192-198 (2021).
  3. Mazzanti, M., Alessandrini, F., Tagliabracci, A., Wells, J. D., Campobasso, C. P. DNA degradation and genetic analysis of empty puparia: genetic identification limits in forensic entomology. Forensic Sci Int. 195 (1-3), 99-102 (2010).
  4. Odeniran, P. O., et al. molecular identification and distribution of Trypanosome-transmitting Dipterans from cattle settlements in Southwest Nigeria. Acta Parasitol. 66 (1), 116-128 (2021).
  5. Wells, J. D., Stevens, J. R. Application of DNA-based methods in forensic entomology. Annu Rev Entomol. 53, 103-120 (2008).
  6. Kotrba, M., et al. DNA barcoding in forensic entomology-establishing a DNA reference library of potentially forensic relevant arthropod species. J Forensic Sci. 64 (2), 593-601 (2019).
  7. Weedon, M. N., et al. Use of SNP chips to detect rare pathogenic variants: Retrospective, population based diagnostic evaluation. BMJ. 372, 214(2021).
  8. Cai, J. -F., et al. The availability of mitochondrial DNA cytochrome oxidasegene for the distinction of forensically important flies in China. Acta Entomologica Sinica. 48 (3), 380-385 (2005).
  9. Khayrova, A., Lopatin, S., Varlamov, V. Obtaining chitin, chitosan and their melanin complexes from insects. Int J Biol Macromol. 167, 1319-1328 (2021).
  10. Guo, Y. Q., et al. Comparison of three DNA extracting methods from different parts of common necrophagous flies. J Henan Univ Sci Tech (Med Sci). 36 (02), 130-133 (2018).
  11. Du, H., Xie, H., Ma, M., Igarashi, Y., Luo, F. Modified methods obtain high-quality DNA and RNA from anaerobic activated sludge at a wide range of temperatures. J Microbiol Methods. 199, 106532(2022).
  12. Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J Vis Exp. (48), e2699(2011).
  13. Masago, K., et al. Comparison between fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of DNA and RNA extracted from frozen and FFPE tissues from lung cancer patients: A real-world use of genomic tests. Medicina (Kaunas). 57 (12), 1375(2021).
  14. Ponti, G., et al. The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients. Clin Chim Acta. 479, 14-19 (2018).
  15. Adams, Z. J., Hall, M. J. Methods used for the killing and preservation of blowfly larvae, and their effect on post-mortem larval length. Forensic Sci Int. 138 (1-3), 50-61 (2003).
  16. Fliegerova, K., et al. Effect of DNA extraction and sample preservation method on rumen bacterial population. Anaerobe. 29, 80-84 (2014).
  17. Rodrigues, B. L., Galati, E. A. B. Molecular taxonomy of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae) with emphasis on DNA barcoding: A review. Acta Trop. 238, 106778(2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum


Formal Correction: Erratum: DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples
Posted by JoVE Editors on 8/12/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66737

Trefwoorden

Necrofiele vliegenChrysomya megacephalaBlood DNA KitDNA zuiverheidDNA concentratiealcoholconserveringPCR amplificatiegelelektroforesemicroplaatlezer

Gerelateerde artikelen