Dit artikel beschrijft een protocol voor verse en oude necrofiele vlieg-DNA-extractie met behulp van een aangepaste gemeenschappelijke DNA-extractiekit.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
DNA-extractie en vergelijking tussen oude en verse necrofiele vliegmonsters
* These authors contributed equally
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
In totaal werden vijf monsters van Chrysomya megacephala-monsters geselecteerd - drie verse monsters, één monster dat 2 jaar in alcohol werd bewaard en één monster dat 2 jaar in droge verzegelde opslag werd bewaard, alleen beschermd tegen licht - om te onderzoeken of een bloed-DNA-extractiekit DNA van necrofiele vliegen kon extraheren en om te bepalen of alcohol het behoud van het DNA van necrofiele vliegen kon verlengen. Eerst werd de bloed-DNA-extractiekit gebruikt om DNA uit hun thoraxweefsels te extraheren. Vervolgens werden de zuiverheid en concentratie van het DNA onderzocht met behulp van een microplaatlezer en een fluorometer. Ten slotte werden PCR-amplificatie en elektroforese van het geëxtraheerde DNA gedaan met necrofiele vliegspecifieke primers die zich in de mitochondriale CO I-gensequentie bevinden. De resultaten toonden aan dat de DNA-zuiverheid van alle monsters groter was dan 2,0. De DNA-concentratie bleek van de volgende orde te zijn: verse monsters > met alcohol geconserveerde oude monsters > onbehandelde, oude monsters. Alle monsters hadden specifieke elektroforetische banden na PCR-amplificatie. Concluderend kan een bloed-DNA-extractiekit worden gebruikt om met succes DNA van necrofiele vliegen te extraheren, en de DNA-concentratie van verse vliegenmonsters is groter dan die van oude vliegenmonsters. De vliegen kunnen lange tijd in alcohol worden bewaard.
Inleiding
De gevolgtrekking van het tijdstip van overlijden is altijd een van de belangrijkste en moeilijke kwesties geweest die in de rechtspraktijk moeten worden opgelost. In de praktijk van de forensische wetenschap speelt het bepalen van het postmortale interval voor een strafzaak een cruciale rol bij het afleiden van het tijdstip van het misdrijf, het opsluiten van de verdachte en het verkleinen van de reikwijdte van het onderzoek. Traditionele methoden om het tijdstip van overlijden af te leiden zijn voornamelijk gebaseerd op vroege postmortale verschijnselen, die over het algemeen alleen kunnen worden gebruikt om het tijdstip van overlijden binnen 24 uur af te leiden. De lange tijd van overlijden kan echter niet worden bepaald door postmortale verschijnselen. Het wordt nu algemeen erkend in de forensische wetenschappelijke gemeenschap dat forensische entomologie het potentieel heeft om een effectieve methode te zijn om een langere tijd van overlijden af te leiden.
Necrofaag insecten zijn genoemd naar hun larven die zich voeden met lijken. Onder hen, wanneer er een lijk aanwezig is, zullen de volwassen necrofiele vliegen de eersten zijn die het lijk bereiken en hun eieren of larven leggen. De larven voeden zich met lijkweefsel en groeien uit tot poppen, die uitgroeien tot volwassenen. Necrofiele vliegen spelen een grote rol in de praktijk van de forensische wetenschap vanwege hun regelmatige levenscyclus en geografische verspreiding, bijvoorbeeld het aftrekken van het tijdstip van overlijden en het bepalen van de plaats van overlijden 1,2. De barrière voor het gebruik van necrofiele vliegen in de forensische praktijk is echter soortidentificatie. Morfologische methoden worden nog steeds gebruikt als de gezaghebbende methode voor soortidentificatie van necrofiele vliegen. Morfologische soortidentificatie vereist echter een hoge mate van integriteit van insecten. Als de vliegen zich in verschillende ontwikkelingsstadia bevonden, of als gevolg van morfologische veranderingen veroorzaakt door omgevingskeuzes, maken die allemaal morfologisch onderzoek moeilijker. Met name de morfologie van poppen en popschelpen, die het vaakst op de plaats delict worden aangetroffen, is nauwelijks herkenbaar. Dit, samen met de schaarste aan morfologische experts, maakt de morfoologische identificatie van soorten enorm moeilijk. Daarom is de toepassing van moleculair-biologische methoden voor soortidentificatie van vliegen naar voren gekomen, wat de moeilijkheid van morfologische identificatie vermindert en onafhankelijk is van ontwikkelingsfase 3,4,5,6,7.
De eerste stap in de soortidentificatie van necrofiele vliegen op basis van moleculair-biologische methoden is de efficiënte extractie van DNA, terwijl gespecialiseerde kits voor DNA-extractie van insecten momenteel niet algemeen beschikbaar zijn. En hoe gewone bloedkits te gebruiken voor DNA-extractie van necrofiele vliegen wordt forensisch relevanter. Necrofiele vliegen die op de plaats delict worden aangetroffen, zijn vaak verminkt of hebben verval en DNA-degradatie ondergaan. Vliegenmonsters zijn niet onmiddellijk beschikbaar voor DNA-extractie na verkrijging, of indien mogelijk moeten volledige monsters worden bewaard vanwege de vereisten voor het bewaren van bewijsmateriaal. Op basis van de bovenstaande vereisten hebben we in deze studie de bloed-DNA-kit op basis van proteïnase K-vertering toegepast en drie verse Chrysomya megacephala-monsters (Diptera, Lepidoptera) geselecteerd (Figuur 1), een oud C. megacephala-monster dat twee jaar in alcohol is geplaatst, en een C. megacephala-monster dat gedurende twee jaar in lichtbeschermde opslag is geplaatst, elk van de vijf monsters gewogen, koos het thoraxweefsel van het insect voor DNA-extractie. Bij het vergelijken van de kwaliteit en zuiverheid van DNA geëxtraheerd uit de oude en nieuwe monsters, werden PCR-amplificatie en elektroforese van het geëxtraheerde DNA uitgevoerd met necrofiele vliegspecifieke primers die zich in de mitochondriale CO-gensequentie 
bevinden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: In dit protocol werden in totaal vijf monsters van C. megacephala-monsters gebruikt: drie verse monsters (Fresh 1, Fresh 2 en Fresh 3), één monster dat 2 jaar in alcohol werd bewaard (oud 1) en één monster dat 2 jaar in droge verzegelde opslag werd bewaard, alleen beschermd tegen licht (oud 2). Monsters moeten worden geëtiketteerd volgens de experimentele vereisten.
1. Algemene opslag en bereidingen van monsters
- Monsterselectie en -voorbereiding
NOTITIE: Zorg ervoor dat u in de zuurkast werkt wanneer u ethylacetaat aanbrengt om acrofaag vliegen uit te voeren. Verwijder de vloeistof van het oppervlak van de vlieg voordat u gaat wegen.- Verse monsters: Plaats drie verzamelde vliegenmonsters in gasflesjes nadat u ze hebt gedood met ethylacetaat. Weeg en benoem de monsters als Fresh 1, Fresh 2 en Fresh 3 en gebruik ze onmiddellijk in experimenten.
OPMERKING: De verse vliegmonsters in dit protocol hadden massa's van 56.8 mg, 49.3 mg en 52.1 mg. - Oud monster 1: Verwijder door ethylacetaat gedode vliegmonsters en bewaar ze 2 jaar in met alcohol gevulde centrifugebuisjes in een luchtdichte verpakking, beschermd tegen licht bij kamertemperatuur. Weeg het monster na het adsorberen van de oppervlaktevloeistof met filtreerpapier; noem het Oud 1.
OPMERKING: De massa van Old 1 was 42,3 mg in dit protocol. - Oud monster 2: Haal het door ethylacetaat gedode vliegmonster eruit en bewaar het 2 jaar in een centrifugebuis in een luchtdichte verpakking, beschermd tegen licht bij kamertemperatuur. Weeg en noem het Oud 2.
- Verse monsters: Plaats drie verzamelde vliegenmonsters in gasflesjes nadat u ze hebt gedood met ethylacetaat. Weeg en benoem de monsters als Fresh 1, Fresh 2 en Fresh 3 en gebruik ze onmiddellijk in experimenten.
- Voorbereiding voor extractie
- Voeg een kleine hoeveelheid vloeibare stikstof toe om een roestvrijstalen container af te koelen; Wacht tot alle vloeibare stikstof is verdampt.
- Doe een vliegenmonster in de container; Giet de vloeibare stikstof er langzaam in om te voorkomen dat de vloeibare stikstof opspat en het insectenmonster beïnvloedt.
- Vries de monsters in vloeibare stikstof in. Verwijder monsters nadat de vloeibare stikstof is verdampt.
- Scheid de thorax afzonderlijk, doe deze in een centrifugebuis van 2 ml en snijd in de kleinst mogelijke plakjes.
OPMERKING: Snijd het monster in kleine stukjes zodat het volledig kan worden gesplitst en DNA in grote hoeveelheden kan worden vrijgegeven. - Herhaal de bovenstaande stappen voor elke vlieg, vries ze afzonderlijk in en verwijder ze vervolgens in een nieuwe centrifugebuis om kruisbesmetting met DNA te voorkomen.
2. DNA-extractie
OPMERKING: Alle centrifugatiestappen moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (15-25 °C) in een microcentrifuge. Alle stappen moeten worden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de principes van asepsis en om kruisbesmetting te voorkomen.
- Weefsel lysis
- Voeg 180 μl weefsellysisbuffer toe aan een centrifugebuisje van 2 ml met een geknipt monster.
- Voeg 20 μl proteïnase K toe. Meng grondig door middel van werveling bij 3 000 tpm gedurende 10 s en incubeer bij 56 °C totdat de insectenweefsels volledig zijn gelyseerd.
OPMERKING: Voeg meer proteïnase K toe als het weefsel niet volledig is verteerd. Lysis is meestal voltooid in 1-3 uur, kan ook de lysistijd 's nachts verlengen.
- DNA-precipitatie
- Vortex bij 3.000 tpm gedurende 15 s. Voeg 200 μL lysisbuffer toe aan het monster en meng grondig door middel van werveling bij 3.000 tpm gedurende 15 s.
- Voeg 200 μL ethanol (96-100%) toe en meng opnieuw grondig door 15 s met 3.000 tpm te vortexen.
OPMERKING: Lysisbuffer en ethanol kunnen in één stap samen worden toegevoegd om tijd te besparen. Door toevoeging van lysisbuffer en ethanol kan zich een wit neerslag vormen.
- Spuit het mengsel in de DNA-adsorptiekolom in een verzamelbuisje van 2 ml. Centrifugeer bij 6.000 × g gedurende 1 minuut. Gooi de doorstroom- en opvangbuis weg.
- Plaats de DNA-adsorptiekolom van de vorige stap in een nieuw verzamelbuisje van 2 ml, voeg 500 μl eiwitverwijderingsbuffer toe en centrifugeer gedurende 1 minuut op 6.000 × g . Gooi de doorstroom- en opvangbuis weg.
- Breng de DNA-adsorptiekolom over in een nieuwe verzamelbuis van 2 ml, voeg 500 μl ontziltingsbuffer toe en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 20.000 × g om het membraan van de DNA-adsorptiekolom te drogen. Gooi de doorstroom- en opvangbuis weg.
OPMERKING: Deze centrifugeerstap zorgt ervoor dat eventuele resterende ethanol wordt verwijderd vóór de volgende elution. Als er sprake is van versleping van ethanol, centrifugeer dan opnieuw bij 20.000 × g gedurende 1 minuut. - Plaats de DNA-adsorptiekolom in een schone microcentrifugebuis van 2 ml, spuit 100 μl DNA-elutiebuffer rechtstreeks op het kolommembraan, incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en centrifugeer vervolgens gedurende 1 minuut bij 6.000 × g om te elueren.
OPMERKING: Elutie met 100 μL (in plaats van 200 μL) verhoogt de uiteindelijke DNA-concentratie in het eluaat, maar vermindert ook de totale DNA-opbrengst. Om de DNA-opbrengst te maximaliseren, herhaalt u de elutie één keer zoals beschreven in stap 2.8. - Bewaar de DNA-monsters bij 4 °C (maximaal 1 week) of -80 °C voor langdurige opslag.
3. Detectie van DNA-concentratie
- Bepaal de waarden van OD 260 en OD 280 om de DNA-zuiverheid en nucleïnezuurconcentratie te vergelijken met de microplaatlezer. Herhaal dit drie keer op elk monster.
- Bepaal de concentratie van het geëxtraheerde DNA met behulp van de fluorometer met behulp van de bijbehorende kit, met drie replicaten voor elk monster.
- Neem 190 μl werkoplossing in twee centrifugebuisjes van 0,5 ml, neem elk 10 μl van Standaard #1 en Standaard #2, voeg ze toe aan de werkoplossingen en houd ze niet minder dan 15 minuten uit de buurt van licht.
OPMERKING: Standaard #1 en Standaard #2 zijn nauwkeurig gekalibreerd voor een bepaalde concentratie DNA. Standaardoplossingen moeten nauwkeurig worden geconfigureerd om de vorming van een nauwkeurige standaardcurve te garanderen. Standaard #1 is een 0,2 ng/μL dubbelstrengs DNA (dsDNA) monster; standaard #2 is 2.000 ng/μL. De werkende oplossing is een kleurstof die specifiek bindt aan dsDNA. - Neem 2 μl test-DNA en meng dit met 198 μl werkoplossing in een centrifugebuisje van 0,5 ml en houd het niet minder dan 15 minuten uit de buurt van licht.
OPMERKING: Als de DNA-concentratie laag is, voeg dan 5 μl test-DNA toe met 195 μl werkoplossing. - Schakel na 15 minuten het instrument in en selecteer dsDNA-concentratiemeting | Lange afstand. Test eerst standaard #1 en vervolgens standaard #2 om de standaardcurve te verkrijgen.
OPMERKING: De standaardoplossing moet op dezelfde dag worden gebruikt nadat deze is geconfigureerd; Als u het te lang laat staan, resulteert dit in een grote fout in de standaardcurve. - Plaats de te testen monsters één voor één in de analyseputjes, stel het DNA-piekvolume in op 2 μL, herhaal de meting drie keer, neem de gemiddelde waarde en registreer.
- Neem 190 μl werkoplossing in twee centrifugebuisjes van 0,5 ml, neem elk 10 μl van Standaard #1 en Standaard #2, voeg ze toe aan de werkoplossingen en houd ze niet minder dan 15 minuten uit de buurt van licht.
4. PCR en elektroforetische detectie
OPMERKING: De mitochondriale CO-gensequentie met een lengte van 278 bp werd genomen voor PCR-amplificatie met voorwaartse primer C1-J-2495: CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG en omgekeerde primer C1-N-2800: CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC8, en vervolgens werd 2% agarosegelelektroforese uitgevoerd om het amplificatie-effect te verifiëren en de lengte van de amplificatieproducten werd geverifieerd.
- Stel 20 μL van het PCR-amplificatiesysteem in door 10 μL 2x Taq-mix, 1 μL van elke primer, 5 μL ddH2O en 3 μL sjabloon-DNA toe te voegen; Meng goed gedurende 10 s in een centrifuge.
- Gebruik de volgende PCR-cyclusparameters: predenaturatie 95 °C gedurende 10 min; denaturatie 95 °C gedurende 30 s, gloeien 48 °C gedurende 30 s, extensie 72 °C gedurende 45 s voor een totaal van 40 cycli; en laatste verlenging 72 °C gedurende 10 min.
- Onderwerp de producten na PCR aan 2% agarosegelelektroforese en plaats ze na elektroforese op een gelbeeldvormingssysteem voor fotoanalyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We gebruikten een microplaatlezer om de waarden van OD260 en OD280 van de geëxtraheerde DNA-oplossing te meten en verkregen vervolgens de OD260/OD280-waarden om de zuiverheid van het DNA te evalueren. De OD260/OD280 van alle verse monsters en oud monster 1 was groter dan 2. De OD260/OD280 van oude steekproef 2 had een maximale waarde van 2,187, hoewel het gemiddelde 1,753 was, en de drie metingen fluctueerden sterk als gevolg van de kleine (≤0,01) waarden van zowel de OD280 als de OD280 (Tabel 1). Op bas...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
DNA-extractie is de meest kritische schakel in de moleculaire identificatie van necrofiele vliegen, en de extractiemethode en de kwaliteit van het geëxtraheerde DNA hebben een directe invloed op de daaropvolgende detectie. In dit experiment hebben we met succes DNA geëxtraheerd van necrofiele vliegen met behulp van een gewone bloedkit, zonder de noodzaak om een speciale insecten-DNA-extractiekit aan te schaffen, waardoor DNA-extractie van insecten gemakkelijker te bereiken is.
Het oppervlak va...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) en door het Academician Innovation Platform Scientific Research Project van de provincie Hainan (YSPTZX202134).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Buffer AE | Qiagen | 172026832 | DNA elutiebuffer |
| Buffer AL | Qiagen | 172028374 | lysebuffer |
| Buffer ATL | Qiagen | 172028162 | weefsellysebuffer |
| Buffer AW1 | Qiagen | 172028760 | eiwitverwijderingsbuffer |
| Buffer AW2 | Qiagen | 57203108 | ontzoutingsbuffer |
| C1-J-2495 | Taihe Biotechnology | TW21109216 | voorwaartse primer |
| C1-N-2800 | Taihe Biotechnology | TW21109217 | achterwaartse primer |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Meet de positie van elektroforetische banden |
| DNeasy Mini spin column | Qiagen | 166050343 | DNA-adsorptiekolom |
| Dry Bath Incubator | Miulab | DKT200-2D | gebruikt voor verwarming |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillerende actie |
| Proteinase K | Qiagen | 172026218 | Inactivatie van intracellulaire nucleasen en andere eiwitten |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | 2321611188 | |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Standard#1 | Thermo Fisher Scientific | 2342797 | |
| Standard#2 | Thermo Fisher Scientific | 2342797 | |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gelbeeld |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | gewone PCR |
| Working Solution | Thermo Fisher Scientific | 2342797 |
Referenties
- Amendt, J., Richards, C. S., Campobasso, C. P., Zehner, R., Hall, M. J. Forensic entomology: applications and limitations. Forensic Sci Med Pathol. 7 (4), 379-392 (2011).
- Wydra, J., Matuszewski, S. The optimal post-eclosion interval while estimating the post-mortem interval based on an empty puparium. Forensic Sci Med Pathol. 17 (2), 192-198 (2021).
- Mazzanti, M., Alessandrini, F., Tagliabracci, A., Wells, J. D., Campobasso, C. P. DNA degradation and genetic analysis of empty puparia: genetic identification limits in forensic entomology. Forensic Sci Int. 195 (1-3), 99-102 (2010).
- Odeniran, P. O., et al. molecular identification and distribution of Trypanosome-transmitting Dipterans from cattle settlements in Southwest Nigeria. Acta Parasitol. 66 (1), 116-128 (2021).
- Wells, J. D., Stevens, J. R. Application of DNA-based methods in forensic entomology. Annu Rev Entomol. 53, 103-120 (2008).
- Kotrba, M., et al. DNA barcoding in forensic entomology-establishing a DNA reference library of potentially forensic relevant arthropod species. J Forensic Sci. 64 (2), 593-601 (2019).
- Weedon, M. N., et al. Use of SNP chips to detect rare pathogenic variants: Retrospective, population based diagnostic evaluation. BMJ. 372, 214(2021).
- Cai, J. -F., et al. The availability of mitochondrial DNA cytochrome oxidasegene for the distinction of forensically important flies in China. Acta Entomologica Sinica. 48 (3), 380-385 (2005).
- Khayrova, A., Lopatin, S., Varlamov, V. Obtaining chitin, chitosan and their melanin complexes from insects. Int J Biol Macromol. 167, 1319-1328 (2021).
- Guo, Y. Q., et al. Comparison of three DNA extracting methods from different parts of common necrophagous flies. J Henan Univ Sci Tech (Med Sci). 36 (02), 130-133 (2018).
- Du, H., Xie, H., Ma, M., Igarashi, Y., Luo, F. Modified methods obtain high-quality DNA and RNA from anaerobic activated sludge at a wide range of temperatures. J Microbiol Methods. 199, 106532(2022).
- Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J Vis Exp. (48), e2699(2011).
- Masago, K., et al. Comparison between fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of DNA and RNA extracted from frozen and FFPE tissues from lung cancer patients: A real-world use of genomic tests. Medicina (Kaunas). 57 (12), 1375(2021).
- Ponti, G., et al. The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients. Clin Chim Acta. 479, 14-19 (2018).
- Adams, Z. J., Hall, M. J. Methods used for the killing and preservation of blowfly larvae, and their effect on post-mortem larval length. Forensic Sci Int. 138 (1-3), 50-61 (2003).
- Fliegerova, K., et al. Effect of DNA extraction and sample preservation method on rumen bacterial population. Anaerobe. 29, 80-84 (2014).
- Rodrigues, B. L., Galati, E. A. B. Molecular taxonomy of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae) with emphasis on DNA barcoding: A review. Acta Trop. 238, 106778(2023).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples
Posted by JoVE Editors on 8/12/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66737
