Methodenartikel

Demystificerende in vivo bioluminescentiebeeldvorming van een muismodel van de ziekte van Chagas voor onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66740

⸱

31 mei 2024

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas (ICB), Universidade de São Paulo, 2Drugs for Neglected Diseases initiative (DNDi) Latin America, 3Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e Imunologia, Universidade Federal de São Paulo, 4Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo

In dit artikel

Samenvatting

Het hier verstrekte protocol beschrijft de gedetailleerde stappen om onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen uit te voeren in een bioluminescent model van Trypanosoma cruzi-infectie , met een focus op gegevensverzameling, -analyse en -interpretatie. Er zijn ook procedures voor probleemoplossing en kwaliteitscontrole om technische problemen tot een minimum te beperken.

Samenvatting

Om de gevolgen voor de volksgezondheid van menselijke protozoaire ziekten zoals de ziekte van Chagas, leishmaniasis en menselijke Afrikaanse trypanosomiasis te beheersen en te verminderen, is het noodzakelijk de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen en vaccins te versnellen. Dit proces gaat echter gepaard met moeilijkheden zoals de zeer complexe biologie van parasieten en de pathogenese van ziekten en, zoals typisch voor verwaarloosde tropische ziekten, met een relatief beperkte financiering voor onderzoek en ontwikkeling. Voor de voortgang van het onderzoek naar deze aandoeningen zijn in-vitro - en in-vivo-onderzoeksmodellen die de belangrijkste kenmerken van infectie en ziekte voldoende kunnen reproduceren en tegelijkertijd een rationeel gebruik van middelen bieden, dus essentieel. Een voorbeeld is het in vivo bioluminescentiebeeldvorming (BLI) muismodel voor de ziekte van Chagas, dat een zeer gevoelige detectie biedt van licht met een lange golflengte dat wordt gegenereerd door Trypanosoma cruzi-parasieten die luciferase tot expressie brengen. Ondanks dat deze techniek de standaardbenadering wordt voor de werkzaamheid van geneesmiddelen in vivo-studies , kunnen onderzoeksgroepen nog steeds moeite hebben om het te implementeren vanwege een gebrek aan de juiste praktische training over het omgaan met apparatuur en de toepassing van kwaliteitscontroleprocedures, zelfs wanneer geschikte BLI-apparatuur direct beschikbaar is. Gezien dit scenario is dit protocol bedoeld om te begeleiden van het plannen van experimenten tot gegevensverzameling en -analyse, met details die de implementatie van protocollen vergemakkelijken in onderzoeksgroepen met weinig of geen ervaring met BLI, hetzij voor de ziekte van Chagas of voor andere muismodellen voor infectieziekten.

Inleiding

De ziekte van Chagas is endemisch in Latijns-Amerika en treft wereldwijd ongeveer zeven miljoenmensen1. Jaarlijks zijn meer dan 50.000 doden en economische verliezen van ongeveer 7 miljard dollar het gevolg van de invaliderende aard vandeze ziekte. De ziekte van Chagas wordt veroorzaakt door de protozoaire Trypanosoma cruzi, een heteroxenische hemoflagellaatparasiet die in staat is zoogdieren (wild en gedomesticeerd) en triatominevectoren (Hemiptera, Reduviidae)3 te infecteren in Noord- en Zuid-Amerika, waar de vectoriële overdracht is vastgesteld. Andere belangrijke infectieroutes zijn bloedtransfusie, orgaantransplantatie, orale (door inname van voedsel dat besmet is met een geïnfecteerde triatomine)4 en aangeboren overdracht. Niet-vectoriële transmissieroutes hebben bijgedragen aan de verspreiding van de ziekte van Chagas naar niet-endemische gebieden 3,5.

De ziekte van Chagas manifesteert zich in twee klinische fasen. De acute fase is in de meeste gevallen asymptomatisch. Symptomatische infecties worden meestal geassocieerd met niet-specifieke symptomen zoals koorts, vermoeidheid, myalgie, lymfadenopathie, splenomegalie en hepatomegalie. De acute fase wordt ook vaak geassocieerd met open parasitemie en systemische circulatie van parasieten. De dood kan optreden in maximaal 10% van de gediagnosticeerde gevallen, vooral in gevallen van orale infectie6. De chronische fase wordt vaak gekenmerkt door een lange periode van afwezigheid van symptomen. Na verloop van tijd vertoont ongeveer een derde van de tientallen jaren eerder geïnfecteerde patiënten cardiale manifestaties, meestal vergezeld van fibrose en myocardiale ontsteking, en/of gastro-intestinale stoornissen die meestal verband houden met de ontwikkeling van mega-oesofagus- en/of megacolonsyndromen 3,5,6.

De etiologische behandeling van de ziekte van Chagas bestaat uit slechts twee geneesmiddelen: benznidazol en nifurtimox. Deze antiparasitaire middelen zijn al meer dan 50 jaar beschikbaar en hebben een aanzienlijke toxiciteit en een beperkte werkzaamheid 5,7,8. Daarom is er een dringende behoefte om nieuwe, veilige en effectievere behandelingen te ontwikkelen voor patiënten met de ziekte van Chagas.

Meer geavanceerde en nauwkeurige technieken maken het nu mogelijk om antwoorden te krijgen op oude vragen die vooruitgang mogelijk maken in de zoektocht naar nieuwe behandelingen voor de ziekte van Chagas. In die zin heeft de wetenschappelijke gemeenschap veel baat bij genetisch gemodificeerde parasieten voor in vivo studies naar het verloop van de infectie en evaluatie van de werkzaamheid van geneesmiddelen 9,10,11,12. Een longitudinale test op basis van het bioluminescentiebeeldvormingssysteem (BLI) maakt evaluatie van de werkzaamheid tijdens en na het behandelingsregime mogelijk, wat leidt tot de identificatie van verbindingen met trypanocidale activiteit10,13. De BLI-methode biedt een directe meting van de parasitaire belasting, zowel in de bloedsomloop als in weefsels en organen, door de kwantificering van het licht dat wordt geproduceerd door de genetisch gemodificeerde T. cruzi CL Brener Luc::Neon-lijn11, die constitutief de roodverschoven vuurvlieg luciferase12 tot uitdrukking brengt.

Niettemin, bijna 10 jaar na de oprichting van het BLI-diermodel van de ziekte van Chagas en studies naar de werkzaamheid van geneesmiddelen, domineren slechts enkele onderzoeksgroepen deze techniek. Dit feit is niet alleen te wijten aan de verminderde toegang tot de juiste beeldvormingsapparatuur, maar ook aan het gebrek aan training en beschikbaarheid van gestructureerde, gedetailleerde protocollen. Deze methode biedt verschillende voordelen ten opzichte van andere benaderingen, die gebaseerd zijn op de beoordeling van parasitemie door microscopie, serologie of evaluatie van orgaan-/weefselinfecties door qPCR voor de detectie van parasiet-DNA, omdat het een beter welzijn van muizen mogelijk maakt en het gebruik van dieren vermindert door de mogelijkheid om in vivo robuustere en geïntegreerde gegevens te genereren. Bovendien is deze methode aantoonbaar gevoeliger, omdat het een gemakkelijke detectie van parasiethaarden in viscerale organen na medicamenteuze behandeling mogelijkmaakt10,12. Daarom is dit protocol bedoeld om onderzoeksgroepen op het gebied van parasitologie en andere infectieziekten te begeleiden bij het vaststellen van deze methodologie in hun laboratoria door de technische procedures in detail te beschrijven. Hier delen we de ervaring die is opgedaan door de implementatie van het BLI-model van de ziekte van Chagas in Brazilië, het eerste in zijn soort in Latijns-Amerika, als onderdeel van de inspanningen voor het ontdekken van geneesmiddelen die worden gecoördineerd door het Drugs for Neglected Diseases-initiatief (DNDi).

Protocol

Alle procedures die in dit protocol worden beschreven, zijn ingediend, goedgekeurd en uitgevoerd volgens de richtlijnen14 die zijn opgesteld door de Dierethische Commissie van het Instituto de Ciências Biomédicas van de Universidade de São Paulo: protocol CEUA ICB/USP no 5787250522.

1. Oplossingen

OPMERKING: Beschouw het vooraf geconiseerde toegediende volume van 10 ml/kg (200 μl voor een muis met een gewicht van 20 g)15,16. Bereid bijvoorbeeld een werkoplossing van 15 mg/ml voor om een dosering van 150 mg/kg dieren te bereiken.

  1. Hydroxypropylmethylcellulose suspensie voertuig (HPMC-SV)
    OPMERKING: De benodigde reagentia zijn 0,5% (w/v) hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), 0,4% (v/v) Tween 80 en 0,5% (v/v) benzylalcohol.
    1. Weeg voor 200 ml voertuigoplossing 1 g HPMC af en los op in 64 ml heet ultrapuur water. Roer gedurende 2 min.
    2. Voeg 120 ml ijskoud ultrapuur water toe en roer gedurende 1 uur. Voeg 1 ml benzylalcohol toe.
    3. Voeg vervolgens 0,8 ml Tween 80 toe met behulp van de omgekeerde pipetteertechniek en blijf roeren tot de oplossing transparant wordt.
    4. Pas de oplossing aan voor het uiteindelijke volume van 200 ml. Bewaar de HPMC-SV maximaal 3 maanden onder koeling (4 °C).
  2. Benznidazol
    1. Bereken de benodigde hoeveelheid samengestelde oplossing als volgt:
      Volume samengestelde oplossing = (aantal doses op elke dag x aantal dagen x aantal te behandelen muizen x toegediend volume in elke muis) + 30% extra.
    2. Weeg de benodigde hoeveelheid benznidazol (BZ) af, rekening houdend met de gewenste dosis. Voor curatieve behandeling bereikt een orale dosis van 100 mg/kg eenmaal daags gedurende 10 dagen een 100% genezing in het chronische CD-model17.
    3. Bereken op basis van het gewenste eindvolume de juiste hoeveelheid om een concentratie van 5% (v/v) DMSO te bereiken en los BZ volledig op in zuivere DMSO.
    4. Voeg het juiste volume van het voertuig toe aan een glazen buis om een concentratie van 95% (v/v) HPMC-SV te bereiken. Breng de BZ opgelost in DMSO over naar de glazen buis die HPMC-SV bevat. Homogeniseer de suspensie krachtig en bewaar deze bij 4 °C.
      Bijv.: Eindvolume van de BZ-formulering = 10 ml (stap 1.2.1)
      Hoeveelheid BZ = 100 mg (stap 1.2.2)
      5% DMSO = 0,5 ml (stap 1.2.3) en 95% HPMC-SV = 9,5 ml (stap 1.2.4)
    5. Vóór elke toediening van het geneesmiddel worden de formuleringen gedurende 5 minuten in een ultrasoon waterbad bij 37 °C geplaatst en krachtig gehomogeniseerd voordat het dier wordt gedoseerd.
  3. Cyclofosfamide
    1. Los de benodigde hoeveelheid cyclofosfamide op in ultrapuur water om een oplossing van 12,5 mg/ml te verkrijgen.
    2. Steriliseer de oplossing door filtratie en bewaar bij 4 °C.
  4. Giemsa vlek
    1. Los 0,6 mg Giemsa poederreagens op in 50 ml methanol. Voeg 25 ml glycerol toe en meng. Verwijder neerslag met filtreerpapier en een trechter. Bewaar de bouillonoplossing bij kamertemperatuur (RT), beschermd tegen licht.
    2. Bereid een werkoplossing voor door 10 ml Giemsa-oplossing te verdunnen in 90 ml Mix-Phosphate Buffer (20,5 M Na2HPO4, 65,4 M KH2PO4 bij pH 7,2).

2. Trypanosoma cruzi cultuur

  1. Werk in een biologische veiligheidskast (BSC), kweek 4 x 106 epimastigoten/ml T. cruzi CL Brener Luc::Neon11 in LIT-media (68,44 mM NaCl, 5,36 mM KCl, 112,7 mM Na2HPO4, 5 g/L trypton, 5 g/L leverinfusiebouillon, 0,03 M hemine, 4,16 mM glucose), aangevuld met 10% (v/v) foetaal runderserum (FBS), 100 μg/ml penicilline, 100 E/ml streptomycine en 150 μg/ml hygromycine als selectief geneesmiddel bij 28 °C. De parasieten bereiken meestal een stationaire fase in 3-4 dagen.
  2. Metacyclogenese induceren om infectieuze parasieten te verkrijgen door 3 x 108 epimastigoten in 10 ml Grace's Insect medium met 10% (v/v) FBS in 15 ml conische buisjes bij 28 °C gedurende 7-10 dagen te incuberen.
  3. Evalueer de differentiatiesnelheid door Giemsa-kleurende uitstrijkjes. Verdeel daarvoor 20 μL van de gedifferentieerde parasieten in een glasplaatje en laat 10 minuten drogen.
  4. Ga in een zuurkast verder met de monsterfixatie door het glasplaatje af te dekken met zuivere methanol en volledig te laten drogen (1-2 min). Dek het glasplaatje af met Giemsa werkoplossing gedurende 20 min.
  5. Was het glasplaatje voorzichtig af met gedestilleerd water. Tel in een microscoop het percentage metacyclische trypomastigoten. Als een differentiatiepercentage van ten minste 10 procent wordt bereikt, gaat u verder met de volgende stap.
  6. Centrifugeer de parasieten (120 x g gedurende 10 min) en resuspendeer de pellet met 10 ml DPBS. Centrifugeer nogmaals en resuspendeer de parasieten in 5 ml DMEM aangevuld met 10% (v/v) FBS, 100 μg/ml penicilline en 100 E/ml streptomycine.
  7. Voer in een kweekkolf van 25 cm2 de infectie uit van 1,66 x 105 LLC-MK2-cellen (nierepitheelcellen van Macaca mulatta) bij 37 °C in 5% CO2, in een bevochtigde incubator18.
  8. Weefselkweektrypomastigoten (TCT's) komen na 8-9 dagen vrij in het medium. Infecteer verse LLC-MK2-cellen monolagen met TCT's bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 1:40.

3. Analyse van de homogeniteit van de populatie Trypanosoma cruzi door middel van flowcytometer

  1. Verzamel TCT's van CL Brener Luc::Neon en CL Brener wild-type stammen, centrifugeer op 120 x g gedurende 10 minuten en resuspendeer de TCT's in DPBS. Pas de parasietdichtheid aan om 1 x 106/ml te bereiken.
  2. Ga verder met populatieanalyse door middel van een flowcytometer op basis van mNeonGreen-fluorescentie (bijv. 506/em. 517 nm)19, waarbij voor elk monster ten minste 20.000 gebeurtenissen worden verkregen.
    OPMERKING: Het fluorescerende populatiepercentage wordt verkregen door het wildtype te vergelijken met de getransfecteerde parasiet. Om door te gaan met de muizeninfectie, moet een minimum van 95% van de fluorescerende parasietenpopulatie van de CL Brener Luc::Neon-afstamming worden bereikt (aanvullende figuur 1).

4. Muizen experimentele infectie

OPMERKING: Om de hoeveelheid parasieten te verhogen, worden bloedbaantrypomastigoten (BT) vaak verkregen van immunodeficiënte muizen 10,13. Hier wordt chemische immunosuppressie van BALB/C-muizen gebruikt om BT te verkrijgen. Daarvoor wordt milde immunosuppressie bereikt met vier intraperitoneale injecties van cyclofosfamide (CTX) bij 62,5 mg/kg met tussenpozen van 96 uur, die gelijktijdig met T. cruzi-infectie wordt uitgevoerd.

  1. Dien 62,5 mg/kg steriele cyclofosfamide toe via intraperitoneale injectie (i.p.) 1 dag voor de T. cruzi-infectie .
  2. Infecteer elke muis met 1 x 104 TCT's in 0,2 ml DPBS via de intraperitoneale route. Aandacht voor het hoge risico op incidenten bij het omgaan met ziekteverwekkers en naalden. Voer de infectie uit in een BSC, draag handschoenen en een gelaatsscherm tijdens de hele procedure.
  3. Monitor de parasitemie dagelijks door directe observatie van de BT in het bloed (Pizzi-Brener-methode)20. Bij de piek van de parasitemie, ongeveer 13-17 dagen na infectie (dpi), voert u de bloedafname uit. Verdoof daarvoor muizen met 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine.
  4. Wanneer de muizen volledig zijn verdoofd21, gaat u verder met de hartpunctie met behulp van een spuit van 1 ml die is bevestigd aan een naald van 24 G X3/4 die 50 μl natriumcitraat 3,8% (w/v) bevat. Haal de stekker van de naald uit het stopcontact en plaats het bloed voorzichtig in een centrifugebuisje.
  5. Voer in een BSC een verdunning uit van een aliquot bloed in ammoniumchloride-kalium (ACK) lysisbuffer en tel de parasieten in de Neubauer-kamer. Herhaal deze procedure minstens twee keer, omdat kleine bloedstolsels het tellen van parasieten beïnvloeden.
    OPMERKING: Om telfouten te voorkomen, past u de verdunningsfactor aan om tellingen lager dan 30 en hoger dan 300 trypomastigoten in de Neubauer-kamer te voorkomen.
  6. Pas de parasietdichtheid aan tot 5 x 103 BT/ml door de benodigde hoeveelheid zuiver bloed in DPBS te mengen.
  7. Infecteer niet-immunosuppressieve BALB/c-muizen met 1 x 103 BT in 0,2 ml DPBS per muis (5 x 103 BT/ml) via intraperitoneale route met behulp van een naald van 26 G (smallere naalden leiden tot parasitaire lysis)22. Nadat het volume intraperitoneaal is geïnjecteerd, houdt u de naald 5 s in de muis om terugstroming te voorkomen.
  8. Plaats de geïnfecteerde muizen tijdelijk in een doos met een papieren handdoek om mogelijk lekken of bloeden te identificeren en breng de muizen vervolgens terug naar hun kooien.

5. In vivo beeldvorming

OPMERKING: De verklarende woordenlijst van de hier gebruikte termen is als volgt:

Beeldvormingssessie: Bioluminescentie-acquisitie uitgevoerd in alle groepen van een bepaald experiment op een bepaalde dag. Figuur 1A geeft een overzicht van de procedure.

Beeldvormingsronde: Procedure uitgevoerd in subgroepen van drie muizen, van D-luciferine-injectie tot herstel van de anesthesie. Het wordt aanbevolen dat elke experimentele groep 6 muizen bevat, vanwege de intrinsieke variabiliteit van de muizen in parasietbelasting en andere factoren die van invloed zijn op de BLI-kwantificering die hieronder worden beschreven.

Beeldvormingsacquisitie: foto-opnamen gemaakt door de beeldvormingsapparatuur om bioluminescentie te kwantificeren, wat resulteert in een beeldoverlay van een foto en de gekwantificeerde bioluminescentie weergegeven als een pseudokleurenschaal.

Beeldvormingsprocedure: Alle stappen die in deze sessie van het protocol worden besproken.

figure-protocol-1
Figuur 1: Verwerven van BLI-gegevens. (A) Diagram van de verwervingsworkflow die wordt toegepast voor onderzoek naar infectieziekten, met behulp van het bioluminescente muismodel van de ziekte van Chagas als voorbeeld. Muizen die besmet zijn met genetisch gemodificeerde T. cruzi worden geanalyseerd door middel van in vivo beeldvorming op de vastgestelde tijdstippen. Bij elke beeldvormingsronde worden groepen van maximaal drie muizen geïnjecteerd met 150 mg/kg enzymsubstraat (D-luciferine). Na 5 minuten wordt anesthesie toegediend in een dosis van 2,5% (v/v) isofluraan in zuurstof. Wanneer ze volledig onbeweeglijk zijn, worden muizen in een beeldvormingssysteem geplaatst en wordt de acquisitie gestart volgens de gedefinieerde instellingen. Na beeldvorming herstellen muizen van anesthesie en worden ze teruggebracht naar kooien. Veel voorkomende vragen en problemen die de onderzoekers kunnen hebben en tegenkomen tijdens de acquisitie zijn rood gemarkeerd. Dit schema is aangepast van Lewis et al. (2014)12 (gemaakt met BioRender.com: UD26KWEVS2). (B) In vivo kinetiek van D-luciferine/roodverschoven vuurvliegluciferase (PpyRE9h). Muizen met de T. cruzi parasitemie piek (n = 3) werden verdoofd en geïnjecteerd met 150 mg/kg D-luciferine. De beelden werden gedurende 1 uur gemaakt (belichtingstijd: 2 min; binning: 4). Boven: kwantificering van de ventrale totale flux (p/s) (linker Y-as, in rood) en als percentage van de hoogste gemiddelde meting (rechter Y-as, in blauw). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde (curves) en standaarddeviatie (gearceerd gebied). Onder: Verkregen beelden van het eerste (4 min), hoogste BLI-signaal (30 min) en laatste (62 min) tijdstippen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Controleer de groene balk in het venster Acquisitie om te controleren of de camera van het charge-coupled device (CCD) koud is (-90 °C). Klik op de balk (groen of rood) om de temperatuur te visualiseren.
    NOTITIE: Volgens de handleiding van de beeldvormingsapparatuur moeten de beeldvormingsapparatuur en software altijd ingeschakeld zijn om de CCD koud te houden.
  2. Controleer of de automatische achtergrondaanpassing is uitgevoerd. Klik hiervoor op Acquisitie > Achtergrond > Bekijk beschikbare Dark Charge. Er verschijnt een lijst met verschillende instellingscombinaties.
    OPMERKING: Deze procedure vermindert luminescentieruis. Als de gekozen configuratie resulteert in een waarde hoger dan 1000, op basis van de formule "belichtingstijd x (binning²)", dan mag donkere lading niet worden genegeerd. Afhankelijk van de softwareconfiguraties kan binning worden weergegeven als een getal (binningfactor) of een bereik van 'klein' naar 'groot'. De overeenkomst tussen het bereik en de binning-factor is te vinden in de handleiding van het apparaat.
  3. Als het activiteitenvenster (wit gebied onder aan de software) niet wordt weergegeven, schakelt u het in op de menuweergave > het activiteitenvenster.
  4. Stel het beeldvormingsgebied in door op Acquisitievenster > Gezichtsveld te klikken. Optie C (13,2 cm) krijgt 3 muizen en optie D (22 cm) krijgt 5 muizen.
  5. Selecteer de optie voor automatisch opslaan door op Acquisitie > Automatisch opslaan te klikken en selecteer of maak een nieuwe map voor elk tijdstip.
  6. Leg een matzwart papier op het beeldvormingsgebied en plaats de scheidingsglaasjes loodrecht tussen de inlaten. Als de fabrikant de dia's niet heeft geleverd, gebruik dan stukken (3 cm x 15 cm) matzwart papier.
  7. Pas het interne gebied van de beeldvormingskamer aan om de glazen neuskegels naar de anesthesie-inlaten te brengen. Gebruik kleine stukjes zwarte isolatietape om het anesthesiesysteem aan het platform te bevestigen (buiten het beeldgebied).
    OPMERKING: In sommige versies van beeldvormingsapparaten definieert een laser het beeldvormingsgebied. Als deze tool niet beschikbaar is, verkrijgt u afbeeldingen via de software om de partitioneringsdia's binnen het beeldvormingsgebied te controleren.
  8. Stel de isofluraanverdamper in op 2,5% (v/v) zuurstof voor de beeldvormings- en inductiekamers. Controleer aan de hand van de manometer of het gas door het systeem stroomt21.
    OPMERKING: Als er geen inhalatie-anesthesiesysteem op het beeldvormingsapparaat is aangesloten, zijn andere anesthesie-opties mogelijk, zoals injecteerbare xylazine en ketamine23. In dit geval is het herstel van muizen traag en is het risico op overlijden hoog24.
  9. Vul spuiten (naalden van 31 G) met D-luciferine (een uitgebreid protocol voor de bereiding van D-luciferine wordt door verschillende leveranciers verstrekt)25,26, bescherm ze tegen direct licht en bereid een paar plastic containers of extra kooien voor door de binnenkant af te dekken met keukenpapier.
  10. Houd een klok/horloge in de buurt om gemakkelijk de tijd bij te houden en een laboratoriumnotitieboekje om muizengroepen, luciferine-injectietijd en andere informatie tijdens de procedure te registreren.
  11. Weeg alle muizen en registreer hun gewicht. Markeer elke muis met een penstift of tatoeage op de staart. Zorg ervoor dat de identificatie van muizen goed zichtbaar is tijdens het hele experiment. Deze stap kan ook worden uitgevoerd op de dag voorafgaand aan de overname.
    OPMERKING: De markering mag geen groot lichaamsoppervlak in beslag nemen, omdat de inkt het bioluminescente signaal kan verstoren. Permanente markers van verschillende kleuren kunnen ook helpen om de groepen te onderscheiden.
  12. Om de Imaging-sessie te starten, registreert u een lichtgevend achtergrondbeeld (instellingen: Belichtingstijd: 5 min; Binning: 'large' of '16', f/stop: 1) van de beeldkamer zonder muizen. Deze procedure helpt bij het identificeren van automatisch lichtgevende lichtbronnen of ongewenste problemen met de apparatuur.
    OPMERKING: Omdat BLI gebaseerd is op enzymatische reactie, is tijd een essentieel kenmerk van het experiment. Controleer alle hierboven genoemde items en uitrustingsinstellingen voordat u begint met het hanteren van dieren.
  13. Injecteer 150 mg/kg (i.p.) D-luciferine in de eerste 3 muizen zonder de inwendige organen te bereiken. Plaats de muizen in de containerdoos om te beoordelen of D-luciferine lekt (felgele oplossing). Maak aantekeningen als dit gebeurt en registreer de muizengroep en de injectietijd van D-luciferine.
  14. Wacht 5 minuten en breng de muizen vervolgens over naar de anesthesie-inductiekamer. Zet het systeem aan. Het duurt ongeveer 3 minuten voordat muizen volledig verdoofd zijn (afwezigheid van reacties zoals schuddende poten, staart, enz.) 21. okt.
  15. Open de deur van het beeldvormingsapparaat, schakel de anesthesiestroom naar de beeldvormingskamer in en schakel tegelijkertijd de inductiekamer uit.
  16. Plaats elke muis in de positie van de neuskegels: van muis 1-3, van links naar rechts. Plaats de muizen voorzichtig met de buikzijde naar boven in het beeldvormingsgebied dat door de laser wordt weergegeven. Controleer tijdens de accommodatie de ID en positie van de muizen. Forceer de ingang van muizen die gedeeltelijk verdoofd zijn in neuskegels niet.
  17. Plaats de scheidingsglaasjes tussen de muizen en sluit de deur van de beeldvormingsapparatuur.
  18. Pas de acquisitie-instellingen in het software-acquisitievenster als volgt aan:
    1. Voor niet-geïnfecteerde muizen, belichtingstijd = 5 min / Binning = 'groot' of '16'
      (meest wiskundig gevoelige set configuraties om de drempelwaarden in te stellen).
    2. Voor geïnfecteerde muizen in het acute model: Belichtingstijd = 2 min/ Binning = 'gemiddeld' of '4'.
    3. Voor geïnfecteerde muizen in het chronische model: Belichtingstijd = 5 min/ Binning = 'groot' of '16'.
  19. Controleer of de injectietijd van D-luciferine ten minste 10 minuten voor aanvang van de acquisitie is uitgevoerd. Als dit niet het geval is, wacht dan de nodige tijd om de beelden te verkrijgen tijdens de piek van het luciferasesignaal (Figuur 1B); anders klikt u op Verwerven om de beeldvormingsacquisitie te starten.
  20. Het venster Afbeeldingslabels verschijnt nadat de afbeelding is gestart. Vul de vakken met de juiste informatie over elke groep, inclusief de injectietijd van luciferine, het experiment, de identificatie van muizen, het tijdstip en alle andere gewenste informatie die kan helpen bij het bijhouden van de gegevens. Deze informatie wordt opgenomen in het bestand met de maattabel.
  21. Controleer of het waarschuwingsteken Verzadigd beeld wordt weergegeven aan het einde van de beeldvormingsacquisitie. Verzadigde afbeeldingen zijn niet acceptabel. Als dit gebeurt, verminder dan de binning en verkrijg een nieuwe afbeelding. Maak aantekeningen om in overweging te nemen in de analyse.
  22. Zodra het beeld is verkregen, opent u de deur van de beeldvormingsmachine en draait u de muizen naar het dorsale aanzicht (met de achterkant naar boven). Voer de acquisitie opnieuw uit en label deze op de juiste manier.
  23. Aan het einde van deze beeldvormingsacquisitie schakelt u de anesthesiestroom uit. Haal de muizen voorzichtig uit de beeldvormingskamer en plaats ze in een container.
  24. Registreer het lichaamsgewicht van de muizen terwijl u het herstel van de anesthesie observeert. Noteer abnormaal gedrag of lichaamsafwijkingen die tijdens de procedure worden gevonden. Zodra de muizen weer in beweging komen, plaats je ze in hun kooien.
    OPMERKING: Controleer de BLI-intensiteit voor elk verkregen beeld. Nadat de acquisitie is afgelopen, worden het opgenomen bioluminescente beeld en de foto op de software weergegeven met een automatische schaal die niet in aanmerking mag worden genomen. Stel de schaal in die is gedefinieerd in gegevensanalyse (hieronder beschreven) in het venster Toolpalet .

6. Analyse van de gegevens

OPMERKING: Het bovenstaande protocol is gebaseerd op commerciële in vivo beeldvormingssoftware. Een softwarelicentievrije versie kan echter de meest elementaire analyse uitvoeren. Softwaredetails zijn te vinden in de Tabel met materialen.

  1. Bestanden openen.
    1. Open de map die de verkregen gegevens van een bepaald beeldvormingstijdstip bevat door Menu Bestand > Browser te selecteren > Selecteer de map (Figuur 2A - Stap 1).
      OPMERKING: Er wordt een nieuw venster geopend in tabelformaat met alle verkregen gegevens die in het gekozen bestand zijn opgeslagen. Het toont het Click Number-teken , de afbeeldings-ID die automatisch door de software wordt gegeven (gegevens- en uurnummers), de informatie die door de onderzoeker wordt verstrekt in het venster Afbeeldingslabels tijdens de acquisitie en acquisitie-instellingen. Al deze gegevens helpen bij het sorteren van de afbeeldingen die in de analyse kunnen worden gebruikt, aangezien verzadigde afbeeldingen niet mogen worden gebruikt.
    2. Selecteer meerdere rijen die betrekking hebben op de gekozen afbeeldingen, inclusief de niet-geïnfecteerde besturingselementen. Noteer de afbeeldings-ID in het labnotitieboek, samen met de informatie die tijdens de beeldvormingssessie is geregistreerd.
    3. Stel de geselecteerde afbeeldingen samen door op Laden als groep te klikken. Met deze procedure wordt een nieuwe sequentieafbeelding gemaakt. Daarom is het mogelijk om functies voor alle afbeeldingen tegelijkertijd aan te passen. Sla de nieuwe sequentieafbeelding op in een nieuwe map die verschilt van de map die in stap 6.1 is gebruikt om de heranalyse van onbewerkte gegevens indien nodig te vergemakkelijken.
    4. Identificeer in de sequentieafbeelding de binning die voor elke afbeelding wordt gebruikt door te klikken op Opties > Weergave > Selecteer Binning Factor (Figuur 2A - Stap 2). De verkregen binning-factor wordt bovenaan elke afbeelding in de reeks weergegeven.
    5. Corrigeer alle binning-factoren naar hetzelfde getal. Dubbelklik hiervoor op de afbeelding die u wilt aanpassen. Kies in het venster Toolpalet > sectie Afbeelding aanpassen de juiste binningfactor (Figuur 2A - Stap 3) - zie stap 5.18 voor de keuze van de binningfactor. Voer deze procedure uit in alle afwijkende afbeeldingen.
      OPMERKING: Deze procedure heeft een directe invloed op de kwantificering van BLI (tabel 1) en wordt verder behandeld in de sectie Discussie.
  2. Schaal instellen.
    1. Onderscheid een geldig bioluminescerend signaal (boven 600 tellingen volgens de handleiding van het apparaat) op basis van de niet-geïnfecteerde controle. Dubbelklik daarvoor op de afbeelding van de niet-geïnfecteerde muizen. Selecteer vervolgens in de linkerbovenhoek van het nieuwe venster de optie Tellingen in het veld Eenheden . Pas vervolgens de kleurenschaal aan voor de minimumwaarde van 600. Het resulterende beeld zal de basislijn zijn om de minimale schaal in straling in te stellen.
    2. Als het sequentievenster actief is, selecteert u de optie Straling in het veld Eenheden . Pas de kleurenschaal en de kleurentabel in het gereedschappenpalet aan. Schakel daarvoor het vak Individueel uit in het gebied Limieten voor kleurenschaal .
    3. Markeer de vakjes Logaritmische Schaal en Handmatig (Figuur 2A - Stap 4). Stel de minimale schaalnummers in op basis van de niet-geïnfecteerde controle (zoals waargenomen in stap 6.8) en het gebied met het hoogste signaal als het maximum (zoals weergegeven in figuur 2A bij de pijlen).
      OPMERKING: In vivo 2D-lichtmesurament is een relatieve kwantificering. Er kunnen verschillende schaalwaarden worden gevonden als gevolg van verschillen in de versie en kalibratie van elk apparaat. Daarom konden de waarden die in de representatieve resultaten werden aangetoond, niet passen bij andere experimenten die op andere apparaten werden uitgevoerd en toch even geldig zijn volgens de interne controles (niet-geïnfecteerd en geïnfecteerd, niet behandeld).
    4. Nadat u voor alle afbeeldingen dezelfde schaal hebt ingesteld, dubbelklikt u op elke afbeelding, maximaliseert u het venster en exporteert u de afbeeldingsweergave in een afbeeldingsformaat (.jpg, .tiff, enz.) met behulp van de knop Afbeeldingen exporteren en de bestanden een treatment_miceID_time punt te noemen. (Figuur 2A - Stap 5). Voer deze procedure uit voor alle afbeeldingen.
  3. Metingen uitvoeren.
    1. Kies een afbeelding uit de reeks en dubbelklik erop. Klik in het venster Toolpalet > sectie ROI-tools op de knop Vierkant (Figuur 2B - Stap 1) en teken een rechthoek die de hele muis beslaat.
    2. Klik op de rand van de aangemaakte ROI en kopieer en plak dezelfde ROI voor elke muis (wat resulteert in drie ROI's in de afbeelding). Sla de ROI's op door op opslaan te klikken in het gedeelte ROI-tools. Pas de opgeslagen ROI's toe op alle afbeeldingen door het vakje Toepassen op volgorde aan te vinken en klik vervolgens op Laden. De opgeslagen ROI's worden gebruikt voor alle muizen in het hele experiment.
    3. Pas de ROI-positie in elke muis aan om het dier beter in het meetgebied te laten passen. Wanneer alle muizen zijn gelabeld, klikt u op de knop ROI meten (Figuur 2B - Stap 2). De tabel met ROI-metingen verschijnt. Selecteer Meettypes: Straling; Afbeeldingsattributen: alle mogelijke waarden; ROI Afmetingen: cm. Klik vervolgens op de knop Alles selecteren , gevolgd door de knop Kopiëren .
    4. Plak de gegevens rechtstreeks in een tabelanalysesoftware (spreadsheet). U kunt ook een bestand exporteren in .csv- of .txt-indeling.
  4. Werk aan de data.
    1. Organiseer in tabelanalysesoftware de gegevens in groepen (behandeling, controle niet-geïnfecteerd, niet-behandeld, enz.).
    2. De belasting van parasieten wordt weergegeven als bioluminescentie van het hele lichaam. Rangschik daarom de gegevens zodat ze overeenkomen met de ventrale en dorsale Total Flux-waarden van dezelfde muizen en tel ze op.
    3. Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie van de opgetelde waarden rekening houdend met elke groep (bijv.: aanvullende tabel 1). Zet de gegevens in grafische en statistische software.
    4. Bereid een paneel voor met bioluminescente afbeeldingen in een software voor het presenteren van afbeeldingen of dia's. Plaats elke muis in een kolom en elk tijdstip in de rij om een matrix voor de werkzaamheid van geneesmiddelen op te bouwen om de visualisatie en interpretatie van de gegevens te vergemakkelijken.
      OPMERKING: Er is een optie om de afbeeldingen rechtstreeks in de beeldvormingssoftware in te bouwen zonder stap 6.2.4 (Weergave > afbeeldingslay-outvenster) uit te voeren. De software-interface en tools beperken echter de organisatie van gegevens.

figure-protocol-2
Figuur 2: Gegevensanalysestappen van het instellen van beeldschalen tot het kwantificeren van luminescentie. (A) Living Image Software-weergave voor beeldgegevensverwerking. Stap 1: Upload de verkregen gegevens in een reeks met behulp van de browsertool. Stap 2: Identificeer de binning die voor elke acquisitie wordt gebruikt (verschijnt bovenaan de afzonderlijke afbeeldingen). Stap 3: Stel alle afbeeldingen van geïnfecteerde muizen in op dezelfde binning-factor en pas binning-factor 16 toe voor de niet-geïnfecteerde muizen. Stap 4: Stel de kleurenschaal handmatig in op basis van niet-geïnfecteerde muizen (paarse pijl), die op het scherm moeten worden gezien als niet-bioluminescent, en geïnfecteerde en niet-behandelde muizen op de hoogste bioluminescente brandpunten (rode pijl), die als rood moeten worden gezien. Stap 5: Om een afbeelding te verkrijgen die vrij is van schriftelijke informatie, dubbelklikt u op elke afbeelding en exporteert u de afbeelding met behulp van de knop Afbeeldingen exporteren . (b) Weergave van instrumenten voor de regio's van belang (ROI). Stap 1: Teken een ROI die volledig een muis bedekt en kopieer en plak dezelfde ROI voor elk dier. Sla de aangepaste ROI's op en pas ze toe op alle afbeeldingen in het experiment. Stap 2: Klik op de knop ROIs meten om de tabel te genereren die u als .csv of .txt wilt exporteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Procedure ex vivo

  1. Injecteer 150 mg/kg D-luciferine i.p. in de muis (één per ex vivo ronde) en wacht 3 minuten. Verdoof de muizen met 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine i.p.
  2. In een biologische veiligheidskast, wanneer de muis helemaal niet reageert op knijpen van de poten, snijdt u de huid van de muis om het buikvlies bloot te leggen (zonder de buikvliesholte te openen) en het weefsel van de linkeroksel. Ga verder met de verbloeding door de okselslagader en het bloedvat door te snijden.
  3. Verzamel het bloed met behulp van een pasteurpipet voor eenmalig gebruik. Perfuseer vervolgens 10 ml van 0,3 mg/ml D-luciferine in DPBS-oplossing door de linkerventrikel van het hart.
  4. Leg de geselecteerde organen op vooraf vastgestelde plekken op een petrischaal en week ze in 0,3 mg/ml d-luciferine-oplossing. Deze procedure moet binnen maximaal 30 minuten worden uitgevoerd.
  5. Verkrijg het lichtgevende beeld van de uitgesneden organen (hart, longen, thymus, lever, quadricepsspier, mesenterium, milt, nier, bijnier, visceraal vet, slokdarm, maag, dunne darm, blindedarm, dikke darm, hersenen, onderhuids vet, baarmoeder, gonadale vet, blaas en buikvlies) met behulp van 5 minuten belichtingstijd en binning 16, afhankelijk van de signaalintensiteit (verzadigde beelden zijn niet acceptabel)22.
    OPMERKING: Dezelfde procedure moet worden uitgevoerd in een niet-geïnfecteerde muis voorafgaand aan de geïnfecteerde muizen om de drempel in te stellen.

Resultaten

Met behulp van een adequaat muismodel op basis van transgene parasieten die luciferase constitutief tot expressie brengen, is het mogelijk om belangrijke menselijke T. cruzi-infectiekenmerken te reproduceren die minimale schade toebrengen aan de gastheer, waardoor de parasieten in realtime kunnen worden gevolgd door de BLI van het hele lichaam van de gastheer op een longitudinale (levenslange) manier, gedurende maximaal enkele maanden12.

Figuur 3 toont een pilot-experiment dat het tijdsverloop van CL Brener Luc::Neon-infectie demonstreert vanaf dag 1 na infectie tot 150 dpi bij BALB/c-muizen. In de eerste 20 dpi neemt de bioluminescentie-afgeleide parasietenlast toe, typisch voor de parasitemiepiek, gevolgd door een sterke afname van de parasietenbelasting als gevolg van immuuncontrole van muizen. De acute fase van de infectie wordt dus beschouwd als de eerste 50 dpi. De chronische fase wordt gedefinieerd wanneer de infectie een constante bioluminescente snelheid bereikt, van 100-150 dpi.

figure-results-1
Figuur 3: Inzicht in het model. Kinetiek van Trypanosoma cruzi CL Brener Luc::Neoninfectie bij BALB/c muizen (n = 11). Bovenpaneel: ventrale en dorsale bioluminescente beelden van verschillende tijdstippen gedurende 150 dagen na infectie (dpi) met 1 x 10³ bloedbaantrypomastigoten door intraperitoneale injectie. Heatmap-schaal (in Log10) van bioluminescent signaal in straling (p/s/cm2/sr). Kleurcode: Paars = 5 x 103; rood = 1 x 107. Onderste paneel: kwantificering van bioluminescente signalen in Total Flux (p/s) van muizen met het hele lichaam. Gegevens worden uitgedrukt in gemiddelden (lijnen) en standaarddeviaties (gearceerde gebieden). Perioden die in dit muismodel zijn gedefinieerd voor acute en chronische fasen van infectie zijn oranje gemarkeerd. Luminescentiegemiddelde waarden van niet-geïnfecteerde muizen (n = 3) worden weergegeven als de drempel (lichtgrijze lijn). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De therapeutische resultaten kunnen ook worden voorspeld, aangezien de belangrijkste fasen van de infectie goed worden gereproduceerd in een muismodel. Daarom wordt BLI nu toegepast op translationele wetenschap door middel van proof-of-concept-studies die de besluitvorming over het werkzaamheidspotentieel en de voortgang van verbindingen in de ontwikkelingspijplijn ondersteunen10,27. In het acute muismodel moet de orale behandeling beginnen wanneer de infectie de parasitemiepiek bereikt (ongeveer 14-21 dpi), gekenmerkt door een hoog aantal trypomastigoten in de bloedbaan (ongeveer 1 x 105 trypomastigoten/ml - gegevens niet weergegeven) en systemische infectie. In de chronische fase begint de behandeling met muizen bij 100 dpi, wanneer de parasietbelasting relatief veel lager is, met stabiele subpatent parasitemie.

Om de toepassing van het hierboven beschreven protocol bij de evaluatie van antiparasitaire middelen aan te tonen, hebben we de werkzaamheid van de behandeling van benznidazol (BZ), het standaardgeneesmiddel dat wordt gebruikt voor de behandeling van de ziekte van Chagas, en posaconazol (Posa), een sterol-14α-demethylase (CYP51)-remmer die faalde in klinische onderzoeken voor de ziekte van Chagas, en waarvan ook is aangetoond dat het niet effectief is als antiparasitair middel tegen T. cruzi in vitro en in vivo, met inbegrip van in het in dit protocol beschreven BLI-model 13,18,28,29,30.

Voor het acute muismodel werden cohorten van 6 muizen per groep oraal behandeld met gavage31 gedurende 20 dagen met Posa in een dosis van 20 mg/kg of BZ in 100 mg/kg, eenmaal daags. Muizen werden ook gedurende 5 dagen behandeld met BZ in 100 mg/kg eenmaal daags om het effect van korte behandelingen te evalueren. Na eliminatie van de verbinding (10 dagen na het einde van de behandeling) waren de BLI-negatieve muizen immunosuppressie, een aandoening die terugval van de infectie bevordert wanneer er geen parasitologische genezing wordt bereikt (Figuur 4A). Posa-behandeling resulteerde in een vermindering van 99,49% ± 0,27% (gemiddelde ± standaarddeviatie) van de bioluminescentie-afgeleide parasietenlast aan het einde van de behandeling en bleef op vergelijkbare niveaus van niet-geïnfecteerde muizen tijdens de eliminatieperiode van de geneesmiddelverbinding (behalve muis #3, met een voorbijgaand signaal bij 40 dpi, en muis #2, die een zwakke BLI-plek vertoonde bij 44 dpi). Vergeleken met de niet-behandelde groep verminderde BZ-behandeling gedurende 20 dagen 100% ± 0,01% van de bioluminescentie-afgeleide parasietenlast aan het einde van de behandeling. Daarentegen leidde de korte behandeling met BZ gedurende 5 dagen tot een vermindering van 99,98% ± 0,03% bij 19 dpi (vergelijkbaar met het drempelniveau). In dit geval was de BLI-reductie echter van voorbijgaande aard en in de daaropvolgende acquisities vertoonden alle muizen infectiereactivering (Figuur 4B).

figure-results-2
Figuur 4: Proof-of-concept experimentontwerp en resultaten verkregen met bioluminescentiebeeldvorming in het acute model van de ziekte van Chagas. (A) Schematische grafiek van het tijdlijnproces in een muismodel voor acute ziekte van Chagas voor preklinische onderzoeken voor de beoordeling van de werkzaamheid van het middel. Zwarte stippen: beeldvorming van tijdpunten. Medicijnfles en oranje balk: respectievelijk begin en einde van de behandeling. Spuitpictogram: cyclofosfamide-injecties. DPI: dag na infectie. Kleurcode: grijs = onbehandelde infectie; oranje = behandelingsperiode; blauw = eliminatiefase van de verbinding; geel = immunosuppressieperiode. (B) Tijdsverloop van de behandeling van Trypanosoma cruzi. Linkerpaneel: ventrale bioluminescentiebeelden van BALB/c-muizen (i) niet-behandeld of behandeld gedurende 20 dagen met (ii) posaconazol (Posa) in 20 mg/kg, (iii) benznidazol (BZ) in 100 mg/kg behandeld gedurende 20 dagen en (iv) BZ in 100 mg/kg behandeld gedurende 5 dagen met (n = 6/groep). Alle behandelingen werden eenmaal per dag oraal toegediend via een maagsonde (10 ml/kg). De heatmap op schaal10 geeft de intensiteit van het bioluminescente signaal aan van laag niveau (blauw) tot hoog (rood). Rechter grafiek: kwantificering van bioluminescentiebeeldvormingsgegevens over het hele lichaam. Gegevens worden uitgedrukt in gemiddelden (lijnen) en standaarddeviaties (gearceerde gebieden). Sleutel: Medicijnkolf: start van de behandeling (14 dpi); oranje balk: einde van de behandeling (18 dpi/33 dpi); injecties met spuitpictogram cyclofosfamide (vanaf dag 44-53); oranje stip: muis geanalyseerd volgens de ex vivo-procedure ; § gegevens uitgesloten vanwege lekkage van D-luciferine in de urine. (C) Ex vivo procedure voor de opsporing van T. cruzi foci in organen en weefsels. De plaatverdeelsleutel wordt onderaan de afbeelding weergegeven (gemaakt met BioRender.com: ZY26LG8AOF). Dezelfde stralingsschaal als weergegeven in het vivo-paneel . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In dit model kan een antiparasitaire behandeling de parasietenbelasting verminderen tot onder de BLI-detectielimiet van 1000 parasieten. Muizen verschijnen dus als BLI-negatief10. Om ervoor te zorgen dat een parasitologische genezing is bereikt, is het noodzakelijk om immunosuppressie van muizen te bevorderen met behulp van een behandeling met cyclofosfamide29,32. Muizen die na medicamenteuze behandeling nog steeds een niet-detecteerbare parasitaire belasting hebben, worden BLI-positief na immunosuppressie. Dit effect wordt uitgebreider aangetoond door de Posa-behandeling in het acute model, die de terugval van parasieten bevordert. In dit experiment werd de ex vivo-procedure uitgevoerd op muizen met het laagste bioluminescente signaal om het tropisme van het parasitaire weefsel te evalueren (Figuur 4C). Niet-behandelde muizen vertonen sterke bioluminescente signalen, vooral in het maagdarmkanaal (TGI) en bijbehorende weefsels zoals visceraal vet en mesenterium. Bovendien was de huid een plaats die verband hield met persistentie van parasieten. Muizen die met Posa werden behandeld, vertoonden bioluminescente vlekken met een lagere intensiteit die meer beperkt waren tot de dikke darm, het mesenterium en het visceraal vet. Aan de andere kant wordt bij muizen die worden behandeld met een curatief behandelingsregime, zoals BZ 100 mg/kg gedurende 20 dagen, geen bioluminescent signaal gedetecteerd, zelfs niet bij immunosuppressie. Daarom, gezien het bevorderen van de voorwaarden voor een bioluminescent signaal dat boven het drempelniveau van 1000 parasieten10 stijgt, en het verhogen van de gevoeligheid door de viscerale organen bloot te leggen, wordt aangenomen dat BZ 100 mg/kg gedurende 20 dagen een steriele genezing biedt. De beoordeling van steriele genezing werd eerder gevalideerd door verschillende technieken 10,13,17,33,34.

Een vergelijkbare onderzoeksopzet werd toegepast op het chronische model (Figuur 5A), waarin muizen (n = 6/groep) op dag 100 na infectie werden behandeld. Op dit punt werden Posa 20 mg/kg, BZ 100 mg/kg of 10 mg/kg eenmaal daags oraal toegediend gedurende 20 dagen. Na de eliminatieperiode van het geneesmiddel waren de BLI-negatieve muizen immunosuppressief. Om steriele genezing te beoordelen, werden muizen die aan het einde van de immunosuppressiefase nog steeds BLI-negatief waren, bovendien onderworpen aan een ex vivo-analyse .

Bij chronische infectie leidde behandeling met Posa in een dosis van 20 mg/kg tot een afname van 95,03% ± 6,18% van de bioluminescentie-afgeleide parasietenlast aan het einde van de behandeling en bleef op vergelijkbare niveaus van niet-geïnfecteerde muizen tijdens de eliminatieperiode van het geneesmiddel. Na de immunosuppressie vertoonde de meerderheid van de muizen een variabel niveau van BLI-signaal en -verdeling (Figuur 5B). Uit de ex vivo-procedure bleek dat één BLI-negatieve muizen voor het hele lichaam die met Posa werden behandeld, een bioluminescente vlek in de dikke darm hadden die kon worden gedetecteerd via ex vivo-onderzoek (figuur 5C).

figure-results-3
Figuur 5: Opzet van het geneesmiddelenbeoordelingsexperiment en resultaten behaald in het chronische model van Trypanosoma cruzi-infectie door middel van bioluminescentiebeeldvorming. (A) Schematische grafiek van het experimentontwerp van een muismodel met chronische ziekte van Chagas. Zwarte stippen: beeldvorming van tijdpunten. Medicijnfles en oranje balk: respectievelijk begin en einde van de behandeling. Spuitpictogram: cyclofosfamide-injecties. Dpi: dag na infectie. Kleurcode: Grijs = niet-behandelde infectie; oranje = behandelingsperiode; blauw = eliminatiefase van de verbinding; geel = immunosuppressie; lila = terugval. (B) Longitudinale evaluatie van de werkzaamheid van de behandeling in het chronische model van de ziekte van Chagas. Linkerpaneel: ventrale BLI van BALB/c-muizen (i) niet behandeld of gedurende 20 dagen behandeld met (ii) posaconazol (Posa) in een dosis van 20 mg/kg; iii) benznidazol (BZ) in een dosis van 100 mg/kg, en (iv) BZ in een dosis van 10 mg/kg (n = 6/groep). Alle behandelingen werden eenmaal per dag oraal toegediend via een maagsonde. Rechter grafiek: som van de ruwe gegevens van de ventrale en dorsale totale flux. Sleutel: medicijnkolf: start van de behandeling (102 dpi); oranje balk: einde van de behandeling (121 dpi); Gele balk en spuitpictogram: Cyclofosfamide-injecties (vanaf dag 131-142). Oranje stip: muis geanalyseerd volgens de ex vivo-procedure . ! Muis stierf tijdens de narcose. figure-results-4 Muis vertoont buikafwijkingen. Heatmap-schaal (Log10) geeft de bioluminescentie-intensiteit in de stralingseenheid aan van laag niveau (3 × 105 als blauw) tot hoog (1 × 107 als rood). (C) Ex vivo analyse van T. cruzi tropisme in weefsel. Bioluminescentiedetectie van weggesneden organen van immunosuppressieve in vivo BLI-negatieve muizen na behandeling met Posa en BZ bij 100 mg/kg of muizen met het laagste signaal in niet-behandelde en BZ bij 10 mg/kg-groepen. De plaatverdeelsleutel wordt onderaan de afbeelding weergegeven (gemaakt met BioRender.com: ZY26LG8AOF). De stralingsschaal is gelijk aan het in vivo paneel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Behandeling met BZ in een dosis van 100 mg/kg verminderde de bioluminescentie tot drempelwaarden (93,87% ± 2,14%) bij 122 dpi en verder tot het einde van het experiment. Rekening houdend met ex vivo-analyse , bereikte BZ een genezingspercentage van 100% (6/6 muizen), aangezien geen enkele muizen een terugkeer van bioluminescent signaal vertoonde, zelfs niet wanneer immunosuppressie en inwendige organen werden onderzocht. Dat betekent een gebrek aan terugval. Desalniettemin resulteerde het BZ-behandelingsregime met een lagere concentratie in een lichte vermindering van de bioluminescentie (85,95% ± 18,43%), maar geen genezing, aangezien muizen op alle volgende tijdstippen detecteerbare bioluminescente signaalbrandpunten bleven vertonen. Dit model maakt dus een kwantitatief onderscheid mogelijk tussen ineffectieve behandelingen (posaconazol en suboptimale behandeling met benznidazol) en effectieve behandelingen (optimale dosering en behandelingsduur met benznidazol).

Aanvullende figuur 1: Pre-infectieanalyse van de expressie van luciferase in de T. cruzi-populatie door meting van de fluorescentie van het reportergen mNeonGreen. Flowcytometrie van mNeonGreen fluorescerend eiwit constitutief tot expressie gebracht door de CL Brener Luc::Neon parasiet. Genormaliseerd histogram van het aantal parasieten (Y-as) door mNeonGreen-fluorescentie-intensiteit (X-as). Interne legende toont de geanalyseerde stam en vorm, fluorescentiemediaan en percentage van de fluorescentiepopulatie. Gate-lijnen worden gedefinieerd door de CL Brener wildtype (WT) stam als niet-fluorescerende controle. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Voorbeeld van een analysetabel in BLI-meting. Onbewerkte gegevens verkregen uit kwantificering van bioluminescentiebeeldvorming van dag 19 na infectie in het acute model dat wordt gebruikt in de representatieve resultaten weergegeven in figuur 4B. Beschrijving van de groepen: Controle als niet-geïnfecteerde muizen (n = 3/groep); vehiculum als niet-behandelde geïnfecteerde muizen; posaconazol (Posa) in een dosis van 20 mg/kg gedurende 20 dagen; benznidazol (BZ) in een dosis van 100 mg/kg gedurende 20 dagen; BZ bij 100 mg/kg behandeld gedurende 5 dagen (n = 6/groep). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Bioluminescentiebeeldvorming is een baanbrekende methode waarmee een rapportgen kan worden gedetecteerd met behulp van een zichtbaar en infraroodspectrum van elektromagnetische straling. Daarom zijn er geen radioactief gelabelde markers nodig om uw monster te traceren35. BLI is geschikt voor knaagdiermodellen en andere kleine diersoorten. Het is zeer nuttig voor preklinische studies omdat het veiliger is en meerdere beeldrondes mogelijk maakt, waardoor het dier minimaal ongemak ondervindt. Bovendien is in vivo beeldvorming zeer flexibel vanwege de mogelijkheid om bioluminescentie, fluorescentie en andere technieken zoals positronemissietomografie te combineren36.

Optische beeldvorming wordt beheerst door optische fysische eigenschappen, zoals absorptie en verstrooiing. Alle weefsels absorberen en verstrooien licht van verschillende golflengten op een andere manier37. Een cruciale stap is het selecteren van een reporter-gen zonder rekening te houden met de uitgezonden golflengte van het licht dat door de chemische reactie wordt geproduceerd. Hoewel het expressieniveau van een reporter-gen in vitro hoog kan zijn in bioluminescente tests, worden dezelfde expressieniveaus mogelijk niet bereikt bij het overgaan naar de in vivo-setting. In dit protocol gebruikten we de roodverschoven Photinus pyralis luciferase (PpyRE9H)38 codon-geoptimaliseerde versie voor trypanosomatiden9, die licht uitstraalt bij 617 nm, een van de meest geschikte voor in vivo studies39. Golflengten langer dan 600 nm worden minder geabsorbeerd en verstrooid door lichaamseigen chromoforen, vooral hemoglobine en melanine. Zo kunnen rode lichten door enkele centimeters weefsel worden doorgelaten, waardoor de fotonen de CCD-camera zelfs vanuit viscerale weefsels kunnen bereiken39,40.

Een punt van zorg bij beeldvormingsinstellingen is het ontbreken van een uitgebreid begrip van hun functie en effecten. Binning, een voorbewerkingstechniek, combineert de informatie die is verkregen door aaneengesloten detectoren tot een grotere pixel. Dit proces verbetert de signaal-ruisverhouding, waardoor achtergrondruis wordt verminderd en de gevoeligheid wordt verbeterd. Het vermindert echter de nauwkeurigheid van de ruimtelijke resolutie, wat resulteert in een gepixeld beeld41,42. Deze afweging is een belangrijke overweging in uw beeldvormingsstrategie.

Op basis van het Target Product Profile en Target Candidate Profile voor de ziekte van Chagas34, is de proof-of-concept-studie gericht op gevoeligheid om T. cruzi te detecteren en te helpen vaststellen of een nieuw kandidaat-geneesmiddel een steriele genezing kan bereiken (vertegenwoordigd door het ontbreken van terugval na verschillende immunosuppressierondes). Daarom voeren we de BLI uit met de hoogste binning-factor zonder de afbeelding te oververzadigen. Wanneer de afbeelding oververzadigd raakt, wordt een nieuwe acquisitie uitgevoerd met een lagere binning-factor. Tijdens de analyse wordt een wiskundige correctie toegepast op de afbeeldingen die een andere binning vereisten. Op deze manier moeten de uiteindelijke gegevens worden gepresenteerd met behulp van dezelfde binning. Tabel 1 toont de verschillende waarden die zijn verkregen wanneer onderscheidende binning-factoren werden toegepast in hetzelfde beeld en dezelfde ROI's.

Tabel 1: Invloed van binning-instellingen op de BLI-kwantificering. Kwantificering van drie ROI's op het beeld van acuut model (d13) en chronisch model (d118), geanalyseerd in verschillende binning-factoren. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Vanwege het huidige scenario van de ziekte van Chagas in de kliniek, zijn de inspanningen voor het ontdekken van geneesmiddelen gericht op het volledig elimineren van parasieten (parasitologische genezing)27,34. Daarom bevat het in vivo preklinische protocol benaderingen die de beperkingen van de technische gevoeligheid van BLI overwinnen. Een van de benaderingen is het behandelen van de muizen met cyclofosfamide om de immuunrespons te verminderen die de parasietbelasting regelt. Een andere strategie is het verminderen van de diepte van het weefsel en het verwijderen van lagen spieren, huid en vacht die het lichtpad naar de camera belemmeren. Via de ex vivo-procedure kunnen kleine bioluminescente vlekken worden gedetecteerd, die parasietenhaarden onder de in vivo BLI-drempel onthullen, zoals weergegeven in figuur 5C in het ex vivo resultaat van muizen die met Posa zijn behandeld.

Het ontwerpen van een proefexperiment om het model zelf en de infectiedynamiek te evalueren, is cruciaal voor het opzetten van een nauwkeurig experiment voor de beoordeling van de werkzaamheid van antiparasitaire geneesmiddelen. Zo kan de onderzoeker van tevoren de juiste BLI-instellingen en het infectieverloop bepalen. In een verkennend experiment is een hulpmiddel dat nuttig kan zijn bij het definiëren van de acquisitie-instellingen de 'Autoexposure'. Met deze tool stelt de onderzoeker de prioriteit van drie instellingen vast (belichtingstijd, binning en F/Stop) om het best mogelijke beeld te verkrijgen. In het bijzonder moet de onderzoeker ervoor zorgen dat beelden worden verkregen binnen het dynamische bereik van de CCD-camera, zonder oververzadiging of onderbelichting, wat kan worden gecontroleerd door de minimum- en maximumlimieten van de schaal en de autobelichtingsfunctie (Menu Edit > Preferences > Tab Acquisition > Tab Autoexposure). In dit protocol werd het diafragma van de camera ingesteld op de maximale waarde (F/Stop: 1) en werden verschillende belichtingstijden en binning-factoren gedefinieerd voor acute en chronische modellen. Deze instellingen geven de tijd voorspelbaarheid om verschillende beeldrondes tegelijkertijd uit te voeren. Aangezien de reportermethode gebaseerd is op een enzymatische reactie, beïnvloeden zowel de biodistributie van het substraat in de muis als de luciferasekinetiek het bioluminescente signaal en dus de kwantificering van de infectie (Figuur 1B). Bijgevolg introduceert het verkrijgen van beelden op verschillende momenten van enzymatische kinetiek gegevensvariabiliteit die niet kan worden verklaard of gecorrigeerd en beïnvloedt het de berekening van de totale flux (fotonen/seconde) of straling (fotonen/seconde/cm2/steradiaal). Bovendien vertoont T. cruzi-infectie dynamische ruimtelijke positionering bij muizen (verschillende gebieden en weefsels, diepte en parasietbelasting). Daarom kan het vaststellen van een waarde van het aantal te verkrijgen tellingen zwakkere signaalbronnen missen (laag aantal parasieten op een bepaalde plek dieper in het weefsel) als de bron van een ander sterker signaal voldoet aan de gedefinieerde criteria voor automatische blootstelling.

Een lastige functie van Living Image-software is het weergeven van de verkregen afbeelding in een automatische kleurenschaal. Er is geen optie om de schaal vooraf in te stellen om automatisch een gloednieuw verworven beeld weer te geven volgens de geselecteerde schaalwaarden (zie protocolstap 6.2). Deze situatie dwingt de onderzoeker om de afbeeldingen één voor één handmatig te wijzigen in de gekozen max- en min-waarden. Als gevolg hiervan hebben de niet-ervaren en niet goed opgeleide gebruikers niet de juiste uitlezing tijdens de acquisitiesessie en kunnen ze de gegevens misleiden of op dat moment belangrijke informatie verliezen. Daarvoor is het proefexperiment nuttig.

Een van de meest gestelde vragen over het proof-of-concept experimentontwerp is hoe de duur van de behandeling en de dosis moeten worden gekozen. Voor nieuwe chemische entiteiten worden deze parameters meestal gedefinieerd door de potentie en selectiviteit van de verbinding in vitro, in combinatie met gegevens die zijn gegenereerd door onderzoeken naar geneesmiddelmetabolisme en farmacokinetiek (DMPK) en verdraagbaarheid die zijn uitgevoerd voorafgaand aan het in vivo testen op werkzaamheid. Samenvattend, na het identificeren van verbindingen die in staat zijn om selectief de parasiet in cellen te doden, worden de eerste ADME-experimenten (absorptie, distributie, metabolisme en uitscheiding) in vitro uitgevoerd om onder andere de waterige oplosbaarheid, celpermeabiliteit en metabole stabiliteit van verbindingen te schatten. Als verbindingen een goede balans van in vitro eigenschappen vertonen (meestal gedefinieerd in doelkandidaatprofielen), worden deze kandidaten voortgezet naar in vivo farmacokinetiek (PK) studies bij gezonde muizen, die de blootstelling aan de verbinding in het bloed (en mogelijk ook in weefsels) schetsen en een algemeen idee geven van de verdraagbaarheid bij verschillende dosisniveaus17, 34,43. Idealiter is het doel van de PK-beoordeling bij de meeste infectieziekten het bepalen van de haalbaarheid om vrije plasmaconcentraties (gecorrigeerd voor plasma-eiwitbinding) te bereiken die boven de EC50/EC90-concentraties 44 liggen - de effectieve concentratie die respectievelijk 50% of 90% van de parasieten doodt of ten minste de groei remt - gedurende een voldoende lange periode. Als er voldoende blootstelling wordt bereikt bij een bepaald dosisniveau, kan dit regime worden gebruikt tijdens de werkzaamheidsonderzoeken met behulp van het Chagas BLI-model. Voor onderzoek naar de herpositionering van geneesmiddelen moeten in-vitro- en in-vivofarmacokinetische gegevens beschikbaar zijn. Een goed begin voor het herprofileren van geneesmiddelen zijn chemische databases zoals PubChem45, die erkende gegevens leveren die kunnen worden omgezet in muizen met behulp van allometrische schaling46 om veilige en niet-toxische behandelingsregimes te schatten die moeten worden getest. Dat is echter niet altijd het geval. PK-studies zijn nog steeds een over het hoofd gezien gebied in de academische wetenschap en maar weinig farmaceutische bedrijven publiceren hun PK-resultaten. De wetenschappelijke gemeenschap voor het ontdekken van geneesmiddelen beveelt aan om in vivo PK-beoordeling op te nemen, samen met in de werkzaamheidstests van geneesmiddelen (farmacodynamiek)47. Daarom is preklinische beeldvorming compatibel met gelijktijdige metingen van verbindingen, en deze bijbehorende aanpak verbetert de robuustheid van de gegevens.

Bovendien worden de hantering, het gewicht en de gezondheidstoestand van de muizen gedurende het hele experiment gecontroleerd. Tekenen van toxiciteit en bijwerkingen zoals voorovergebogen zitten, beven, evenwichtsverlies, onwil om te bewegen, terughoudendheid om te eten of te drinken, uitputting of andere afwijkingen die in de groep voorkomen of bij individuele aandoeningen bij muizen, moeten worden geregistreerd en gerapporteerd in preklinische onderzoeken. Een van de doelen van optische beeldvorming is het waarborgen van het welzijn van de dieren. Daarom moeten humane eindpunten worden toegepast bij muizen met pijnsignalen die worden beschreven in de 'Grimace-schaal48. Ook werden muizen wekelijks gewogen tijdens de BLI-acquisitie en, vaker, tijdens de dosering van geneesmiddelen en CTX-behandeling. Volgens de dierenwelzijnsvoorschriften moeten muizen die meer dan 20% van het lichaamsgewicht verliezen, onmiddellijk op humane wijze worden geëuthanaseerd.

Het bioluminescente model van T. cruzi is nu het state-of-the-art experimentele model voor het ontdekken en ontwikkelen van nieuwe behandelingen voor de ziekte van Chagas. Een model dat de belangrijkste kenmerken van de T. cruzi-infectie en de ziekte van Chagas49 repliceert, waardoor real-time monitoring van parasitemie en differentiatie van verbindingen met verschillende werkzaamheidsprofielen die verband houden met bekende werkingsmechanismen mogelijk is. BLI is een techniek die de assertiviteit vergroot bij het identificeren van geïnfecteerde weefsels. Het maakt de nauwkeurige selectie van geïnfecteerde weefsels mogelijk om te worden gebruikt in een breed scala aan benaderingen, waaronder alle klassieke methoden die al zijn toegepast in T. cruzi-onderzoek 50,51. Bovendien stelt het onderzoekers in staat om geavanceerde technologieën te verkennen en nieuwe te ontwikkelen33. Daarnaast zorgt BLI voor verbetering van het dierenwelzijn en rationeler gebruik volgens de 3V-principes10,35, in één keer.

Verschillende onderzoeksgroepen die zich richten op verwaarloosde tropische ziekten zijn geplaatst in landen waar in vivo beeldvormingsapparatuur niet beschikbaar is. Om het huidige scenario te overwinnen, bevorderen nieuwe internationale netwerken zoals Global BioImaging en de bijbehorende consortia acties om open toegang te bieden tot kernfaciliteiten voor beeldvorming en de opleiding van personeel en beeldvormingswetenschappers te verbeteren52,53. Deze initiatieven, samen met gebruiksvriendelijke gebruikersprotocollen zoals deze, kunnen voorwaarden scheppen die high-end technologieën voor alle onderzoekers democratiseren. De implementatie van deze methode in de preklinische ontdekking van geneesmiddelen bood een solide uitlezing van de werkzaamheid en voorspellende waarde van de klinische uitkomst, waardoor de ontdekking van geneesmiddelen voor de ziekte van Chagas werd vergemakkelijkt.

Openbaarmakingen

Auteurs hoeven geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Amanda Franscisco, John Kelly en Fanny Escudié voor het geven van BLI-training en ondersteuning bij het testen op de werkzaamheid van geneesmiddelen, John Kelly en Simone Calderano voor het verstrekken van parasieten en Gabriel Padilla voor ondersteuning bij dierstudies. A.C.S ontving een CAPES PSDE Scholarship voor een opleiding aan de London School of Hygiene and Tropical Medicine (Verenigd Koninkrijk). De auteurs willen ook het Flow Cytometry and Imaging Research (FLUIR) Platform van de Core Facility for Scientific Research - University of Sao Paulo (CEFAP-USP) bedanken voor de technische ondersteuning bij de analyse van de IVIS Spectrum-apparatuur, en het Laboratory of Genetics and Sanitary Control ICB-USP voor de post-experimentatietests voor kwaliteitscontrole van muizen als specifiek pathogeenvrij. Dit project werd gefinancierd door DNDi. DNDi is dankbaar voor haar donateurs, publiek en privaat, die sinds de oprichting in 2003 alle activiteiten van DNDi hebben gefinancierd. Een volledige lijst van de donateurs van DNDi is te vinden op https://dndi.org/about/donors/.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BD LSRFortessa™ X-20 Cell AnalyzerBD Biosciences
Weighing Balance (animal facility)Beschikbaar bij verschillende leveranciers
IVIS Spectrum In Vivo Imaging SystemRevvity (voorheen PerkinElmer)
FlowJ Software v10.7.1BD Biosciences
Living Image Software voor Spectrum v4.7.1Revvity (voorheen PerkinElmer)Licentievrije analysesoftware genaamd 'Aura Imaging' kan worden gebruikt voor de meest basale functies die worden geleverd door Spectral Instruments Imaging (Bruker-bedrijf) (https://spectralinvivo.com/software/)
Microsoft Office-softwareMicrosoft
GraphPad Prism v8.4.0GraphPad Software Inc.
DMEM Low GlucoseVitrocellD0025
NatriumbicarbonaatSigma-AldrichS5761-500G
Foetaal bovien serum (FBS)Gibco16000-044
Penicilline-StreptomycineGibco15140-122
Trypsine 0,5% EDTAGibco25300-062
LIT-mediumIn-house
Hygromycine B (50 mg/mL)Gibco10687010
Grace′s Insect MediumSigma-Aldrich G9771
HEPESSigma-Aldrich 54457
IVISBrite d-luciferine kaliumzoutRevvity (voorheen PerkinElmer)122799Ook te gebruiken: VivoGlo Luciferine, in vivo grade (Promega/P1043); D-Luciferine, Monokaliumzout (Thermo Scientific/88293) of PierceD-Luciferine, Mononatrium* zout (Thermo Scientific/88291); D-Luciferine, Kaliumzout (GoldBio/LUCK of eLUCK); D-Luciferine, Natrium* zout (GoldBio/LUCNA of eLUCNA) *Natrium- of kaliumzoutverschillen hebben minimale invloed op de oplosbaarheid, maar hebben geen invloed op de in vivo-prestaties. 
DPBSGibco21600-044
Cyclofosfamide (CTX)Sigma-AldrichC0768-5g
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD5879
(Hydroxypropyl)methylcellulose (HPMC)Sigma-Aldrich09963-25G
BenzylalcoholSigma-Aldrich402834
Tween 80Sigma-Aldrich P1754-1L
BenznidazolELEA
Posaconazol (Noxafil commerciële formulering)Schering-Phough
GiemsaBeschikbaar bij verschillende leveranciers
gavagenaald (roestvrij staal recht) - 22GAAton CA2003
1 mL spuit en 31G naaldBeschikbaar bij verschillende leveranciers
1 mL spuit en verwisselbare 26G naaldBeschikbaar bij verschillende leveranciers
1 mL spuit en verwisselbare 24G X¾ naaldBeschikbaar bij verschillende leveranciers
Steriele spuitfilter 0,2 µmBeschikbaar bij verschillende leveranciers
A4 matzwart papier 120gr of dikkerPaper Color/ Canson (Beschikbaar bij verschillende leveranciers)
aluminiumfolieBeschikbaar bij verschillende leveranciers
Neubauer-kamerBeschikbaar bij verschillende leveranciers

Referenties

  1. WHO fact sheet. Chagas disease (also known as American trypanosomiasis). WHO, World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/chagas-disease-(american-trypanosomiasis) (2023).
  2. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infect Dis. 13 (4), 342-348 (2013).
  3. Bern, C. Chagas' disease. N Engl J Med. 373 (5), 456-466 (2015).
  4. Shikanai-Yasuda, M. A., Carvalho, N. B. Oral transmission of Chagas disease. Clin Infect Dis. 54 (6), 845-852 (2012).
  5. Lidani, K. C. F., et al. Chagas disease: From discovery to a worldwide health problem. Front Public Health. 7, 166(2019).
  6. Perez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
  7. Field, M. C., et al. Anti-trypanosomatid drug discovery: An ongoing challenge and a continuing need. Nat Rev Microbiol. 15 (7), 447(2017).
  8. Kratz, J. M. Drug discovery for chagas disease: A viewpoint. Acta Trop. 198, 105107(2019).
  9. McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase. PLoS Negl Trop Dis. 7 (11), e2571(2013).
  10. Lewis, M. D., Francisco, A. F., Taylor, M. C., Kelly, J. M. A new experimental model for assessing drug efficacy against Trypanosoma cruzi infection based on highly sensitive in vivo imaging. J Biomol Screen. 20 (1), 36-43 (2015).
  11. Costa, F. C., et al. Expanding the toolbox for Trypanosoma cruzi: A parasite line incorporating a bioluminescence-fluorescence dual reporter and streamlined CRISPR/Cas9 functionality for rapid in vivo localisation and phenotyping. PLoS Negl Trop Dis. 12 (4), e0006388(2018).
  12. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cell Microbiol. 16 (9), 1285-1300 (2014).
  13. Francisco, A. F., et al. Limited ability of posaconazole to cure both acute and chronic Trypanosoma cruzi infections revealed by highly sensitive in vivo imaging. Antimicrob Agents Chemother. 59 (8), 4653-4661 (2015).
  14. du Sert, N. P., et al. The arrive guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 18 (7), e3000410(2020).
  15. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  16. Turner, P. V., Pekow, C., Vasbinder, M. A., Brabb, T. Administration of substances to laboratory animals: equipment considerations, vehicle selection, and solute preparation. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 614-627 (2011).
  17. Francisco, A. F., et al. Nitroheterocyclic drugs cure experimental Trypanosoma cruzi infections more effectively in the chronic stage than in the acute stage. Sci Rep. 6, 35351(2016).
  18. Moraes, C. B., et al. Nitroheterocyclic compounds are more efficacious than CYP51 inhibitors against Trypanosoma cruzi: implications for Chagas disease drug discovery and development. Sci Rep. 4, 4703(2014).
  19. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nat Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  20. de Araújo-Jorge, T. C., de Castro, S. L. Chagas Disease: Manual for Animal Experimentation. , FIOCRUZ Publisher. Rio de Janeiro. (2000).
  21. JoVE. JoVE Science Education Database. Anesthesia Induction and Maintenance. JoVE. , (2023).
  22. Taylor, M. C., et al. Exploiting genetically modified dual-reporter strains to monitor experimental Trypanosoma cruzi infections and host-parasite interactions. Methods Mol Biol. 1955, 147-163 (2019).
  23. Keyaerts, M., et al. Inhibition of firefly luciferase by general anesthetics: effect on in vitro and in vivo bioluminescence imaging. PLoS One. 7 (1), e30061(2012).
  24. Jiron, J. M., et al. Comparison of isoflurane, ketamine-dexmedetomidine, and ketamine-xylazine for general anesthesia during oral Procedures in rice rats (Oryzomys palustris). J Am Assoc Lab Anim Sci. 58 (1), 40-49 (2019).
  25. GoldBio. GoldBio Luciferin In Vivo Handbook - a detailed method for Luciferin preparation and administration for model animals. GoldBio Protocol. , Available from: https://goldbio.com/documents/1068/Luciferin%20in%20vivo%20handbook.pdf (2013).
  26. Revity. Preparation of IVISbriteTM D-Luciferin for in vitro and in vivo bioluminescent assays. Revvity Standard Operate Procedure (Tech Notes). , Available from: https://resources.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/SOP_LuciferinPrep_InVitroInVivo_BLI-Assays.pdf (2023).
  27. Chatelain, E., Scandale, I. Animal models of Chagas disease and their translational value to drug development). Expert Opin Drug Discov. 15 (12), 1381-1402 (2020).
  28. Khare, S., et al. Antitrypanosomal treatment with benznidazole is superior to posaconazole regimens in mouse models of Chagas disease. Antimicrob Agents Chemother. 59 (10), 6385-6394 (2015).
  29. Bustamante, J. M., Craft, J. M., Crowe, B. D., Ketchie, S. A., Tarleton, R. L. New, combined, and reduced dosing treatment protocols cure Trypanosoma cruzi infection in mice. J Infect Dis. 209 (1), 150-162 (2014).
  30. Molina, I., et al. Randomized trial of posaconazole and benznidazole for chronic Chagas' disease. N Engl J Med. 370 (20), 1899-1908 (2014).
  31. JoVE. Science Education Database. Compound Administration II. JoVE. , (2023).
  32. Pukhalsky, A. L., Toptygina, A. P., Viktorov, V. V. Immunosuppressive action of cyclophosphamide in mice: Contribution of some factors to determination of strain differences. Int J Immunopharmacol. 15 (4), 509-514 (1993).
  33. Francisco, A. F., et al. Comparing in vivo bioluminescence imaging and the Multi-Cruzi immunoassay platform to develop improved Chagas disease diagnostic procedures and biomarkers for monitoring parasitological cure. PLoS Negl Trop Dis. 16 (10), e0010827(2022).
  34. Kratz, J. M., et al. The translational challenge in Chagas disease drug development. Mem Inst Oswaldo Cruz. 117, e200501(2022).
  35. Youn, H., Hong, K. -J. In vivo noninvasive small animal molecular imaging. Osong Public Health Res Perspect. 3 (1), 48-59 (2012).
  36. Refaat, A., et al. In vivo fluorescence imaging: success in preclinical imaging paves the way for clinical applications. J Nanobiotechnology. 20 (1), 450(2022).
  37. Pirovano, G., Roberts, S., Kossatz, S., Reiner, T. Optical imaging modalities: Principles and applications in preclinical research and clinical settings. J Nucl Med. 61 (10), 1419-1427 (2020).
  38. Branchini, B. R., Southworth, T. L., Khattak, N. F., Michelini, E., Roda, A. Red- and green-emitting firefly luciferase mutants for bioluminescent reporter applications. Anal Biochem. 345 (1), 140-148 (2005).
  39. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. J Biomed Opt. 10 (4), 041210(2005).
  40. O'Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. Mennel, L., et al. A photosensor employing data-driven binning for ultrafast image recognition. Sci Rep. 12 (1), 14441(2022).
  42. Yoo, Y., Im, J., Paik, J. Low-light image enhancement using adaptive digital pixel binning. Sensors. 15 (7), 14917-14931 (2015).
  43. Moraes, C. B., et al. Accelerating drug discovery efforts for trypanosomatidic infections using an integrated transnational academic drug discovery platform. SLAS Discov. 24 (3), 346-361 (2019).
  44. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharm Stat. 10 (2), 128-134 (2011).
  45. Kim, S., et al. PubChem 2023 update. Nucleic Acids Res. 51, D1 D1373-D1380 (2023).
  46. Sharma, V., McNeill, J. H. To scale or not to scale: the principles of dose extrapolation. Br J Pharmacol. 157 (6), 907-921 (2009).
  47. Barrow, J. C., Lindsley, C. W. The importance of PK-PD. J Med Chem. 66 (7), 4273-4274 (2023).
  48. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  49. Lewis, M. D., Kelly, J. M. Putting infection dynamics at the heart of Chagas disease. Trends Parasitol. 32 (11), 899-911 (2016).
  50. Brener, Z. Therapeutic activity and criterion of cure on mice experimentally infected with Trypanosoma cruzi. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 4, 389-396 (1962).
  51. Cummings, K. L., Tarleton, R. L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Mol Biochem Parasitol. 129 (1), 53-59 (2003).
  52. Keppler, A., Grebnev, G., Reis, Y. Global BioImaging. , . (2024).
  53. Pfander, C., et al. Euro-BioImaging - Interdisciplinary research infrastructure bringing together communities and imaging facilities to support excellent research. iScience. 25 (2), 103800(2022).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Trypanosoma cruziin vivo beeldvormingparasitaire lastluciferase reporterlongitudinale monitoringantiparasitaire middelen
Demystificerende in vivo bioluminescentiebeeldvorming van een muismodel van de ziekte van Chagas voor onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.